KR20170140601A - 농림수산부산물 추출액 복합제재를 이용한 젖소용 사료첨가제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 농림수산부산물 추출물을 이용한 가축 사료첨가제 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 혈중 산화스트레스를 감소시키고 젖소의 유량 또한 증대되는 사료첨가제로 매우 적합한 농림수산부산물을 유효성분으로 포함하는 가축 사료첨가제 조성물을 제공하고, 폐기되는 부산물을 사용함으로써 환경오염 개선 및 사료제조 비용의 절감에 기여하는 장점이 있다.

Description

농림수산부산물 추출액 복합제재를 이용한 젖소용 사료첨가제 조성물{A feed additive comprising agricultural, forestry and marine products extract}

본 발명은 농림수산부산물을 이용한 추출액 복합제재를 이용한 젖소용 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.

국내 축산업은 과거와는 달리 그 사육호수가 점점 감소하는 반면에 사육 규모는 대형화되었다. 또한 사료원료의 90% 이상을 외국 수입에 의존하고 있어 농가 경영수지의 대부분을 사료비에 지출하고 있어 농가의 부담이 상당히 가중된 상태로, 이는 축산물의 가격불안정의 큰 요인으로 작용하고 있다. 따라서 국내에서는 저비용의 고품질 축산물을 생산하기 위해 각종 부산물을 사료자원으로 재활용하기 위한 시도가 활발히 이루어지고 있는데, 이는 사료자원 확보뿐만 아니라 환경오염 감소 등 다양한 측면에서 바람직한 것으로 보고되고 있다(조석진 2011, 곽완섭 2003).

농촌경제연구원의 보고에 따르면 우리나라의 농산물 현황에 있어 주 재배작목인 벼는 1995년에 비해 2005년에는 재배면적이 1.1% 감소하였으나, 생산량은 0.9% 증가하였으나, 이에 따른 농림부산물 발생량은 벼의 경우 단위면적당(10a) 771kg(짚과 왕겨포함)으로 부산물이 가장 많이 발생하고 있다. 임산 부산물은 2004년 숲가꾸기사업으로 주벌, 간벌, 수종갱신으로 각각 69.16, 638, 51.42m3발생하여 간벌이 대부분을 차지하였다. 또한 해양수산부의 수산통계에 따르면 2012년도 국내 수산물 생산량은 약 318만톤으로 식품가공 후 부산물 발생량은 원료의 약 40%에 달하며 머리, 내장 등의 생선 부산물은 연간 약 100만톤 정도가 버려지고 있다.

지난 세기동안 지구온난화에 의해 지구의 평균기온은 1.4℉ 상승하였으며 이러한 현상은 앞으로 지구의 기상과 기후를 변화시킬 것으로 예상되고 있다. 우리나라의 경우 2000년대 전국의 평균기온은 1970년대에 비해 8월은 0.4℃, 여름철은 0.3℃ 상승을 보였으며, 특히 최저기온은 8월이 0.7℃, 여름철이 0.5℃ 높아져 상승세가 뚜렷하게 나타나고 있다. 젖소의 사육환경은 정상적인 성장과 생산능력을 위한 중요한 조건적 요소로, 고온의 환경에 의한 스트레스는 유생산과 번식능력을 저하시키는 원인으로 알려져 있다. 우리나라에서 주로 사육되는 홀스타인종은 추위에는 비교적 강한 반면 더위에 취약한 특성을 가지고 있어, 고온스트레스에 의한 피해가 더욱 크다고 볼 수 있다. 특히 유질저하와 유량 감소로 인한 피해는 농가의 수익성에 큰 영향을 주는 경제적 요소로 고온환경에 대비한 사료첨가제 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자는 환경오염을 야기시키는 농산, 임산, 수산업의 부산물인 폐마늘알갱이, 잣나무 부산물 및 폐미역을 활용하여 이들 각 추출액의 조합을 통해 고온환경에 대한 젖소의 스트레스저감 사료첨가제 개발로 축산물의 생산성 증진 및 안전성 확보를 도모하고자 하였다.

한국공개특허 10-2015-0049196

따라서 본 발명의 목적은 마늘, 잣나무 및 미역 추출물을 포함하는 고온 스트레스에 대한 저항성을 갖는 사료첨가제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 사료를 젖소에 급여하여 젖소의 우유 생산량을 증진시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마늘, 잣나무 및 미역 추출물을 포함하는 고온 스트레스에 대한 저항성을 갖는 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 마늘은 가공시 발생되는 부산물로 마늘의 알갱이 또는 뿌리 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 잣나무는 잣구과 가공시 발생되는 부산물로 잣나무 구과 부산물, 구과실편 또는 외종피일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미역은 미역 가공시 발생되는 부산물로 미역의 잎, 줄기 또는 포자엽일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미역, 잣나무 및 미역 추출물은 0.5~2: 0.5~2: 0.5~2으로 혼합된 혼합 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 고온 스트레스는 온습도지수(THI)가 70~80일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 사료를 젖소에 급여하여 젖소의 우유 생산량을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 사료에 포함되는 조성물의 농도는 사료 kg당 0.010~0.020 중량%일 수 있다.

본 발명은 농림수산부산물 추출물을 이용한 가축 사료첨가제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 사료첨가제는 혈중 산화스트레스를 감소시키고 젖소의 유량 또한 증대되는 이점이 있고, 폐기되는 부산물을 사용함으로써 환경오염 개선 및 사료제조 비용의 절감에 기여하는 장점이 있다.

도 1은 Western blot을 이용한 LPS로 유도된 소 유래 상피세포(MAC-T)에 대한 본원발명의 농수산부산물 추출액 복합제재의 항염증 효과측정 결과 그래프이다.

본 발명에서는 마늘, 잣나무, 미역 추출물을 사료첨가제로 사용함으로써 고온 스트레스 조건 하에서의 젖소의 혈중 산화스트레스 감소 및 유량 생산량 증가를 확인함으로써, 상기 추출액이 고온스트레스 저감용 사료첨가제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 부산물은 제품의 생산과정에서 필연적으로 파생되는 원료를 일컫는다. 이들 부산물을 목적제품에 비해 중요성이 떨어져 대부분 소각하거나 땅에 매립되어 심각한 환경문제를 유발시키고 있다. 이를 사료자원으로 활용한다면 폐기물 처리 비용과 사료비를 절감할 수 있을뿐더러 환경오염을 방지할 수 있다.

본 발명에서 용어, "함유하는(comprising)" 또는 "포함하는(comprising)"은 포함하는 것에 한정되지 않으며, 일예로 다른 첨가제, 성분, 지수 또는 단계와 같은 것을 제외하지 않는다.

본 발명에서 용어, “마늘 부산물”또는 “폐마늘알갱이”는 마늘 가공시 발생되는 부산물로 마늘의 알갱이 또는 뿌리를 포함하는 것이며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “잣나무 부산물”는 잣구과 가공시 발생되는 부산물로 잣나무 구과 부산물, 구과실편 또는 외종피 등을 포함하는 것이며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “미역 부산물”또는 “폐미역”은 미역 가공시 발생되는 부산물로 미역의 잎, 줄기 또는 포자엽 등을 포함하는 것이며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “추출물”은 각 부산물의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 추출물은 추출 후 액상의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 마늘의 천연, 잡종 또는 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 마늘의 껍질, 줄기, 열매 또는 뿌리뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.

본 발명의 상기 마늘 추출물은 바람직하게는 마늘의 알갱이 또는 뿌리를 포함한 추출물일 수 있고, 보다 바람직하게는 마늘 부산물의 알갱이 또는 뿌리 추출물일 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 잣나무의 천연, 잡종 또는 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 잣구과 가공시 발생되는 부산물로 잣나무 구과 부산물, 구과실편 또는 외종피 등을 포함하는 잣구과, 지상부, 또는 뿌리뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.

본 발명의 상기 잣나무 추출물은 바람직하게는 잣나무 구과의 잣구과 가공시 발생되는 부산물로 잣나무 구과 부산물, 구과실편 또는 외종피 등을 포함하는 것으로부터 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 미역의 천연, 잡종 또는 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 미역의 잎, 줄기 또는 포자엽 뿐만 아니라 미역의 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.

본 발명의 상기 미역 추출물은 바람직하게는 미역의 잎, 줄기 또는 포자엽 추출물일 수 있고, 보다 바람직하게는 폐미역의 잎, 줄기 또는 포자엽 추출물일 수 있다.

본 발명에서 상기 마늘 추출물, 잣나무 추출물, 미역 추출물을 추출하는데에 사용되는 추출방법으로는 특별히 제한되지 아니하여, 당해 기술 분야에서 공지된 수증기 증류법을 이용한 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 수집 된 각 부산물(폐마늘알갱이, 잣 구과, 미역부산물)은 스팀을 이용한 수증기 증류법으로 추출액을 얻었다. 1공정은 추출방법은 각 해당재료를 100 리터 용량의 오일 추출기에 마늘 부산물 10 kg, 잣 구과 30kg, 미역 부산물 10kg을 투입하였고, 수증기를 통과 시켜 1시간 경과 후 5kg의 결과물을 얻었다. 2단계 공정은 1공정에서의 추출물을 100 리터 용량의 교반기에 추출물 5kg과 교환수 50kg를 주입 후 정제 아라비아검 분말 1kg을 잘 용해되도록 서서히 투입하여 전량 용해를 확인 후 덱스트린 분말 1kg을 다시 소량씩 투입하여 균일하게 전량 용해시킨다. 다만 소수성인 잣 구과 오일 성분은 100g을 재차 투입 혼합한다. 본 발명의 용이한 혼합을 위해 소수성인 오일은 천연 유화제를 사용하여 1차 예비 유화를 한 후에 본 혼합과정에 투입한다. 필요에 따라 100 메쉬 금망으로 여과하여 분무 후 최종적으로 추출액을 얻었다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 마늘, 잣나무 및 미역 추출물을 0.5~2: 0.5~2: 0.5~2으로 혼합된 혼합 추출물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 온습도지수(THI)가 70~80인 고온 스트레스 조건 하에서 저항성을 가질 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 특히 가축의 혈중 산화스트레스를 감소시키는 효과를 발휘하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는 홀스타인 성우 40두(1일 평균 유량 37.4kg, 평균, 비유단계 115, 평균 산차 2.4)를 대상으로 40일 간의 실험을 통해 젖소의 혈중 생리적 지표 조사에 대한 본 발명의 사료첨가제 효과를 평가하였다. 구체적으로, 처리구(사료첨가제 사료 급여군)와 대조구를 각 20두로 나누어 40일간 시험한 결과, 대조구는 시험개시일과 시험종료일의 혈중 TBARS 농도를 비교 시 산화스트레스 시 발생하는 TBARS 수치가 증가된 반면, 처리구에서는 시험개시일 대비 유의적 차이를 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 이 때, 시험기간 40일 동안의 온습도지수(THI) 또한 함께 측정하였고 시험기간 40일 중 27일이 THI 값으로 72~78을 보임을 확인하여 시험기간 40일 간은 홀스타인 성우에게 고온 스트레스를 유발시킬 수 있는 환경이었음을 동시에 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 포함하는 사료를 젖소에 급여하여 젖소의 우유 생산을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 특히 가축의 유량을 증대시켜 우유의 생산량을 증가시키는 효과를 발휘하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는 홀스타인 성우 40두(1일 평균 유량 37.4kg, 평균, 비유단계 115, 평균 산차 2.4)를 대상으로 40일 간의 실험을 통해 젖소의 산유량에 대한 본 발명의 사료첨가제 효과를 평가하였다. 구체적으로, 처리구(사료첨가제 사료 급여군)와 대조구를 각 20두로 나누어 40일간 시험한 결과, 대조구는 시험개시일과 시험종료일의 평균산유량의 변화에 있어 유의적 차이를 보이지 않은 반면, 복합제재 처리구는 40일 간의 시험기간동안 시험개시일 대비 총 산유량에서도 유의적 증가 결과가 나타남을 확인하였다(p<0.05). 또한 고온환경 (THI, > 76)의 홀스타인 성우의 평균 산유량의 변화에 있어 대조구는 시험개시일 대비 약 2.26%의 평균산유량이 감소한 반면, 처리구는 시험개시일과 비교하여 약 7.87%의 평균산유증가를 보임을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 사료에 포함되어 급여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 젖소에게 급여하기 위한 것일 수 있으며, 젖소의 종류로 홀스타인 프레지언 종, 저지(Jersey) 종, 건지 종(Guernsey), 에어셔(Ayrshire) 종 및 브라운스위스(Brown Swiss)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.

본 발명에서, 상기 사료첨가제는 바람직하기로 사료에 혼합되어 급여되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게 혼합되는 사료첨가제의 농도는 사료 kg 당 0.010~0.020 중량% 인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제 조성물을 포함하는 사료를 젖소에 급여하여 젖소의 우유 생산을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 고온 스트레스 저항성 사료첨가제 조성물은 특히 젖소에게 급여할 수 있으며, 본 발명의 사료첨가제 조성물을 젖소에 급여함으로써 젖소의 혈중 산화스트레스를 감소시키고 우유의 생산이 증가되는 이점이 있다.

이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.

통계분석

항산화 및 항염증효과 분석을 통해서 얻어진 성적들은 means±SEM으로 표현 하였고, 젖소 사양시험 분석을 통해서 얻어진 성적들은 means±SD로 표현하였다. JMP 5.0 software package (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 student’s t 검정 및 Tukey HSD test를 이용하여 두 그룹 및 다중그룹간의 5% 수준에서 유의성 검정을 각각 실시하였다. 유량, 행동지수 및 유질은 복합제재 처리와 온/습도 지수 변수요인에 따른 Two-way ANOVA 분석을 통해 5% 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

< 실시예 1> 본 발명의 사료첨가제를 제조하기 위한 농림수산부산물( 폐마늘알갱이 , 잣 구과, 미역부산물)의 수집 및 추출물의 제조

S기업의 산하 대형마트에서 판매되고 있는 미리 선별 및 가공 된 마늘알갱이를 제외한 폐기처분 되는 폐마늘알갱이(뿌리 포함, 껍질 비포함)를 수집하여 추출액을 얻기까지 냉동보관(-80)을 하였다. 잣나무 부산물은 참여기업인 피러스가 가평 및 홍천 지역에서 잣 탈곡 후 남은 부산물을 수집 후, 보관 및 건조 작업의 일련의 과정을 거친 잣 구과를 추출 시 이용하였다. 미역부산물은 미역 채취시기에 추수 및 선별된 미역을 제외한 미역줄기(미역 포자 포함)를 바로 냉장보관(-80) 하였다.

상기와 같이 수집 된 각 부산물(폐마늘알갱이, 잣 구과, 미역부산물)은 스팀을 이용한 수증기 증류법으로 추출액을 얻었다. 1공정은 추출방법은 각 해당재료를 100 리터 용량의 오일 추출기에 마늘 부산물 10 kg, 잣 구과 30kg, 미역 부산물 10kg을 투입하였고, 수증기를 통과 시켜 1시간 경과 후 5kg의 결과물을 얻었다. 2단계 공정은 1공정에서의 추출물을 100 리터 용량의 교반기에 추출물 5kg과 교환수 50kg를 주입 후 정제 아라비아검 분말 1kg을 잘 용해되도록 서서히 투입하여 전량 용해를 확인 후 덱스트린 분말 1kg을 다시 소량씩 투입하여 균일하게 전량 용해시킨다. 다만 소수성인 잣 구과 오일 성분은 100g을 재차 투입 혼합한다.본 발명의 용이한 혼합을 위해 소수성인 오일은 천연 유화제를 사용하여 1차 예비 유화를 한 후에 본 혼합과정에 투입한다. 필요에 따라 100 메쉬 금망으로 여과하여 분무 후 최종적으로 추출액을 얻었다.

<실시예 2> 본 발명의 농림수산부산물 추출액의 기능성 평가

2-1. 샘플 준비

추출원액 각각을 멸균된 0.45-μm bottle top filter (Corning)로 여과한 후, 여액을 즉시 실험에서 사용하였다. ABTS cation scavenging activity assay 및 western blot analysis를 통한 추출액 복합제재의 항산화 및 항염증효과를 평가하기하기 위해 각 추출액을 1~2: 1~2: 1~2 볼륨비로 혼합 후, 이를 PBS로 희석하여 6.25, 3.12, 1.56 및 0.78% (v/v) 시험샘플을 사용하였다. 상기 조작은 무균 상태에서 실시하였다.

2-2. 세포배양

본 발명에서 사용한 세포주는 소 유선상피세포유래의 MAC-T 세포를 이용하였고, 이를 항염증 실험에 이용하였다. 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(1% penicillin/streptomycin), 인슐린 5?g/ml(insulin), 프로게스테론 1?g/ml(progesterone)를 첨가한 배양액을 사용하여 5% CO₂ 환경에서 세포배양을 실시하였다. 세포가 약 90% confluence가 되었을 때, DMEM, 1% FBS 배양액으로 교체 후 12시간 동안 다시 배양하였다.

2-3. ABTS cation radical scavenging activity assay를 통한 항산화 효과 측정

ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) 7.2 mM과 과황화칼륨(potassium persulfate) 2.6 mM을 실온, 암소(암 조건)에서 24시간 동안 반응시켜 ABTS cation(+)을 형성시킨 후 이 용액을 734 nm에서 흡광도(OD) 값이 0.7-0.8이 되도록 PBS로 희석시켜 사용하였다. 96-well plate에 희석된 ABTS+ 용액 90?l에 시료 10 ?l을 첨가하여 실온, 암소에서 10분 동안 반응시킨 후 흡광도 값을 734 nm에서 측정하였다. 대조구로서 아스코르브산(L-ascorbic acid; 0.01, 0.1, 1.0 mg/ml)를 사용하였으며 blank 값으로 증류수를 사용하였다. 측정된 흡광도를 이용하여 1-(OD blank - OD sample)/OD blank의 수식으로 라디컬(radical) 소거 능력을 수치화하였다.

잣 구과, 폐마늘알갱이 및 미역부산물의 각 추출액을 1~2:1~2:1~2 볼륨비로 조합하여 항산화능 수준을 조사 한 결과, 1:2:1 조합비의 복합제재를 제외한 각 추출액 조합에 따른 복합제재의 항산화능 수준은 유의적으로 차이를 보이지 않음을 확인하였다(표 1 참조).

본원발명의 농림수산부산물 추출액 복합제재의 항산화능 측정결과

			희석비율(%, v/v)					아스코르브산(mg/ml)
	혼합비	undiluted	0.625	0.312	0.156	0.078		1.0	0.1	0.01
복합 제재	1:1:1	84±11.3b,AB	6±2.8d	3±9.6d	0.4±1.0d	0		96±0.7a	54±5.0c	10±13.3d
	2:1:1	87±4.2a,A	8±5.9c	9±4.6c	0.4±5.0c	0		96±0.7a	54±5.0b	10±13.3c
	1:2:1	69±4.7b,B	0	0	0	0		96±0.7a	54±5.0b	10±13.3c
	1:1:2	85±0.8b,AB	0	0	0	0		96±0.7a	54±5.0c	10±13.3d

Each values are expressed as means±SEM(n=4). ^a,b,cvalues different among diluted group in a row are significantly different(P<0.05, by turkey HSD test). ^A,B,Cvalues different among mixture rate in a column are significantly different(P<0.05, by turkey HSD test).

2-4. Western blot analysis를 통한 항염증 효과 측정

96-well plate에 MAC-T 세포를 5 x 10⁵/well로 접종한 후 복합제재 시료 (최종농도 0.078%, v/v)를 처리하여 6시간 배양 후 lipopolisaccharide E. coli O111:B4 (LPS; 0, 1 μg/ml) 를 포함한 세포배양액 100 μl를 처리 후 12시간 배양하였다. 이들 각 시료를 RIPA-buffer 136 containing 50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium 137 deoxycholate, 0.1% SDS, and a protease inhibitor mixture (2 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL 138 leupeptin, 1 μg/mL pepstatin A, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM sodium 139 fluoride and 1 mM sodium orthovanadate)로 cell lyse 시킨 후, Bradford reagent를 통해 단백질 농도를 분석하였다. Protein samples (30 μg per treatment)을 10% SDS-PAGE를 이용하여 분리 후, 니트로셀로로스 멤브레인에 이동시켰다. 5% non-fat milk buffer로 블록 시킨 후 1차 항체 (1:4,000)를 첨가하여 배양하였다. 배양된 멤브레인을 세척 후, 2차 항체 (1:4,000)를 첨가하여 이를 ECL detection reagents를 통해 가시화 시켰다.

상기 실시예 2-3의 표 1의 결과에 따라 항산화능 수준에 유의적 차이를 보이지 않은 추출액 조합비와 추출 비용을 고려하여 도출한 조합비인 1:1:1 복합제재를 이용하여 LPS로 유도된 소 유래 상피세포에 처리 후 항염증 효과를 평가하였다.

웨스턴블랏(Western blot) 분석 결과, 우선 LPS를 소 유래 상피세포에 처리 시 cox-2 발현이 증가함을 확인하였다. 동일 조건의 세포에 복합제재를 처리한 결과 그 발현이 현저하게 감소되었으며, 그 감소 수준은 LPS 비자극 소 상피세포의 발현 수준까지 감소하는 것을 확인하였다(도 1 참조).

따라서, 항산화(표 1 참조) 및 항염증(도 1 참조) 효과를 보이는 조합비(1:1:1)인 복합제재를 사양시험을 통해 사료첨가제로서의 기능성이 가장 적합함을 검증 및 도출하였다.

< 실시예 3> 사양실험을 통한 본원발명의 농림수산부산물 추출액 이용 사료 첨가제의 기능성 평가

3-1. 본원발명의 사료첨가제 준비

상기 실시예 1에서 수증기증류법으로 얻어진 각 해당재료의 추출액을 1 : 1 : 1 볼륨비로 혼합하여 Total Mixed Ration(TMR) 제조 시 첨가하였으며, 이때 복합제재의 최종농도는 TMR kg 당 0.016%가 되도록 하였다. 기초사료(TMR)는 NRC(2001) 사양표준에 맞추거나 상회하도록 급여하였다.

3-2. 시험구 배치

총 72두의 착유 중인 프레지언 종 홀스타인 성우 중 총 40두를 유량(1일평균유량 37.4kg), 비유기(평균비유단계 115), 산차(평균 산차 2.4) 등을 고려하여 처리구별 20두씩 대조구와 복합제재 (0.016%/kg feed) 처리구로 나누어 40일간 급여시험을 실시하였다. 각 급여시험기간 동안 대조구 및 복합제재 함유 사료는 오전(8:30)에 제공하였으며, 물은 자유 배식 시켰다.

본 사양시험은 건국대학교 부속실습목장에서 진행 되었으며, 모든 실험은 "건국대학교 동물실험윤리위원회 (KU16053)"에 의거하여 수행하였다.

3-3. 온/습도 지수 (THI) 분석

건국대학교 부속 실험목장에 설치 된 온습도 모니터링 기계를 통해 시험개시일(0일, 2015년 5월 24일)부터 시험종료일(2015년 7월 3일) 40일간 매일 측정을 하였다. 외기 모니터링 장치를 통해 측정 된 일일 건구온도(℃)와 상대습도(%)을 농림부 모델인 THI 공식(표 2)에 적용하여 산출하였다. 시험기간 중 THI 값은 최저 64, 최고 78로 평균 73의 수준을 나타냈다.

THI 공식

THI= (1.8xT+32) - [(0.55-0.0055xRH) x (1.8xT-26)] (T, temperature; RH, relative humidity)

3-4. 행동모니터링

귀표(Ear tag)(cow manager BV, nederland)를 장착하여 각 그룹별 20두의 홀스타인에 대한 반추횟수율, 사료섭취율을 시험개시일부터 시험종료일까지 매일 기록하여 측정하였다.

3-5. 산유량 측정 및 유질 분석

매회 산유량 측정은 1일 2회 (오전 4시 및 오후 4시) 착유한 산유량을 합산하였으며, 시험개시일부터 시험종료일까지 40일간 매일 개체별 산유량을 기록하였다. 아울러 시험개시일(0일)과 종료일(40일)에 각 그룹별로 우유를 샘플링하여 유질을 분석하였다.

총 40일간 복합제재 함유 사료첨가제를 급여한 결과, 시험개시일(0일)대비 시험종료일(40일)의 평균 산유량이 유의적 증가를 나타냄을 확인하였고, 본원발명의 복합제재는 유중 성분에 변화를 주지 않는 것으로 확인하였다(표 3 참조).

본원발명의 농림수산부산물 추출액 복합제재 함유 사료첨가제 급여에 따른 홀스타인의 산유량 및 유질 변화 측정결과

	대조구			복합제재 처리구
	0 d	40 d		0 d	40 d
Milk yield, kg/day
	37.9±1.86	37.4±0.28		37.0±1.81	39.4±0.25*
Milk composition
Fat, %	4.07±0.513	4.03±0.674		4.15±0.452	4.16±0.766
Protein, %	3.19±0.201	3.14±0.231		3.23±0.280	3.23±0.295
Lactose, %	4.78±0.174	4.82±0.180		4.80±0.105	4.85±0.151
SnF, %	8.54±0.244	8.71±0.250		8.57±0.304	8.82±0.303
MUN, mg/dl	18.8±2.80	15.6±1.96		18.9±3.36	16.1±1.97
Aceton, mM	0.08±0.038	0.06±0.035		0.08±0.024	0.05±0.036
BHB, mM	0.02±0.017	0.03±0.020		0.02±0.020	0.02±0.017
Casein-β, %	2.34±0.167	2.39±0.193		2.38±0.225	2.47±0.244

Each values are expressed as means±SD(n=20). *indicates significant difference between zero vs 40 days in each group (P<0.05, by student's t test).

Abbreviations:SnF, Solid-not-Fat; MUN, Milk urea nitrogen; BHB, beta-hydroxybutyrate

3-6. 혈중 생리적 지표 조사

혈액샘플은 사료(오전 8:30)를 급여하고 3시간이 지난 후, 성우의 경정맥을 통해 혈청과 전혈 튜브에 채취하였다. 혈청 분리를 위해 채혈 된 튜브를 원심분리(15분, 3,000 rpm)를 후 각 혈청 샘플을 Biochemistry Analyzer(Diamond Diagnostics, MA, USA) 및 ELISA분석방법을 통해 혈중 대사산물(metabolic parameters) 변화 및 산화스트레스 (total antioxidant(TAC), glutathione(GSH) 및 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)) 수준을 각각 조사하였다. 아울러 각 전혈 튜브는 혈액 분석기(Vetscan HM2, Abaxis, USA)를 통해 혈중 혈액성상(hematology)을 평가하였다.

그 결과, 대조구와 처리구의 혈중 대사산물 및 혈액성상 항목에서 시험개시일 대비 시험종료일에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 확인하였다. 또한 산화스트레스 지표 결과에 따르면, 처리구의 TAC, GSH 및 TBARS 수준은 시험개시일과 시험종료일에 아무런 변화를 보이지 않은 반면, 대조구의 TBARS는 시험개시일 대비 시험종료일에 유의적으로 증가함을 확인하였다.

이러한 결과는 표 1의 결과와 더불어 항산화능을 보유한 복합제재 처리구는 고온환경을 경험한 홀스타인의 산화스트레스에 대한 항상성 유지에 도움이 되는 것으로 보여짐을 확인하였다.

본원발명의 농림수산부산물 추출액 복합제재 함유 사료첨가제 급여에 다른 홀스타인의 혈중 생리적 지표 변화 측정결과

	대조구		복합제재 처리구
	0 d	40 d	0 d	40 d
Metabolic parameters
BUN, mg/dl	16.4±1.44	16.5±0.75	15.1±0.54	14.8±0.77
albumin, g/dl	2.3±0.08	2.2±0.19	2.5±0.08	2.3±0.10
glucose, mg/dl	32.2±5.62	27.7±8.21	36.2±3.42	32.2±7.94
NEFA, mmol/l	269.7±14.30	236.1±45.86	296.7±21.30	257.7±35.58
triglyceride, mg/dl	14.6±1.02	15.5±4.13	13.6±5.02	14.7±4.16
γ-GTP, IU/l	32.6±9.08	27.6±12.85	31.6±9.08	26.0±10.36
creatine, mg/dl	0.84±0.032	0.74±0.324	0.74±0.052	0.75±0.027
Hematology
WBC, 4-12K/uL	15.43±1.285	15.75±1.005	12.22±1.202	11.57±0.985
lymphocyte, 2.5-7.5 K/uL	9.50±1.145	10.35±1.081	7.21±0.915	6.40±0.778
monocyte, 0-0.84 K/uL	1.27±0.168	0.89±0.151	1.03±0.146	0.87±0.118
granulocyte, 0.6-6.7 K/uL	4.66±0.307	5.10±0.661	3.98±0.350	4.30±0.360
Oxidative stress level
TAC, μM	140.4±3.64	144.0±3.78	138.7±3.78	145.2±2.92
GSH, μM	88.2±9.75	82.2±9.48	75.3±2.24	85.5±8.75
TBARS, μM	0.78±0.173	1.01±0.085*	0.65±0.042	1.10±0.283

Each values are expressed as means±SD(n=20). *indicates significant difference between zero vs 40 days in each group (P<0.05, by student's t test).

Abbreviations: BUN, blood urea nitrogen; NEFA, non-esterified fatty acid; ?-GTP, gamma-glutamyl transpeptidase; WBC, white blood cell; TAC, total antioxidant capacity; GSH, glutathione; TBARS, thiobarbituric acid reactive substances.

3-7. 본원발명의 농림수산부산물 추출액 복합제재 함유 사료첨가제 급여에 따른 고온스트레스 홀스타인의 산유량, 유질 및 행동변화

시험기간 중 적온환경(THI, < 72)과 고온환경(THI, > 76)별 평균산유량, 유질 및 행동변화를 조사하였다.

그 결과, 먼저 대조구의 결과를 보면 적온환경의 평균산유량 변화는 시험개시일 대비 시험종료일에 -0.31% 감소율을 보이며, 고온환경에서는 시험개시일 대비 시험종료일에 평균산유량이 -2.26%로 대폭적 감소율을 보였다. 이러한 감소율 형태는 반추횟수율 항목에도 동일한 결과를 나타냈다.

복합제재 처리구 내 THI 수치별 결과를 보면 적온환경의 홀스타인의 평균산유량은 복합제재 급여로 증가(+6.94%) 하는 경향을 보였을 뿐만 아니라, 고온환경에 따른 스트레스 상황에서도 시험개시일 대비 평균산유량이 증가율(+7.97%) 형태를 보임을 확인하였다.

동일한 환경에서 그룹 간 비교 시, 적온환경의 평균산유량 변화에 있어 대조구 대비 처리구에서 유의적 증감율을 보였으며, 고온환경에 따른 스트레스를 경험한 홀스타인의 평균산유량 증/감율 변화에 있어서도 대조구 대비 처리구에서 유의적으로 증가하는 결과를 확인하였다.

본원발명의 농림수산부산물 추출액 복합제재 함유 사료첨가제 급여에 따른 고온스트레스 홀스타인의 산유량, 유질 및 행동변화

	대조구		복합제재 처리구		P value
	온습도 지수(THI)				Diet (D)	THI (T)	D x T
	< 72	> 76	< 72	> 76
Milk yield, kg/day
0 d	37.9±1.85		37.0±1.81
40 d	37.5±0.50	36.9±0.83	38.8±0.48	39.2±0.76	0.0051	0.8715	0.4432
increment, %	-0.31	-2.26†	+6.94#	+7.87#	0.0018	0.8431	0.6110
Milk somatic cells, 1,000/mL
0 d	141±217.2		90±141.1
40 d	166±54.6	216±687.3	105±40.0	102±142.9	0.2593	0.7650	0.7342
increment, %	+56.92	-11.22	+47.26	+99.76	0.4437	0.9057	0.3622
Behavior patterns
Ruminants, %
0 d	40.5±1.26		38.9±1.46
40 d	39.5±0.36	37.9±0.43*	40.8±0.39	38.6±0.79	0.0322	0.0917	0.9263
increment, %	-1.82	-5.28	+6.65#	+0.58	0.0089	0.0780	0.6255
Eating, %
0 d	25.1±1.72		24.4±1.76
40 d	23.1±0.49	23.3±0.72	22.9±0.54	21.5±0.85	0.0510	0.0944	0.3257
increment, %	-7.11	-4.85	-2.25	-7.66	0.8311	0.7438	0.4257

Each values are expressed as means±SD (n=20). *indicates significant difference between zero and 40 d in each group (P < 0.05, by student's t test). ^#indicates significant difference between control and PGBE in same THI values (P < 0.05, by student's t test). ^†indicates significant difference between THI value in each group (P < 0.05, by student's t test).

종합적으로, 복합제재 함유 사료첨가제(0.016%/kg feed)는 고온환경(THI, > 76) 스트레스 상황에도 홀스타인 성우의 산화스트레스에 대한 항상성 유지와 행동패턴 조절 효과를 보이는 것으로 확인하였다. 아울러 고온환경에 따른 스트레스 상황에서도 홀스타인 성우의 산유량 증진 효과를 보여 우수한 고온 스트레스저감 사료첨가제로서 활용될 수 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 마늘, 잣나무 및 미역 추출물을 포함하는 고온 스트레스에 대한 저항성을 갖는 사료첨가제 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 마늘은 가공시 발생되는 부산물로 마늘의 알갱이 또는 뿌리인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 잣나무는 잣구과 가공시 발생되는 부산물로 잣나무 구과 부산물, 구과실편 또는 외종피 인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 미역은 미역 가공시 발생되는 부산물로 미역의 잎, 줄기 또는 포자엽인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 미역, 잣나무 및 미역 추출물은 0.5~2: 0.5~2: 0.5~2으로 혼합된 혼합 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물
6. 제1항에 있어서,
   상기 고온 스트레스는 온습도지수(THI)가 76이상 인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 사료를 젖소에 급여하여 젖소의 우유 생산을 증진시키는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 사료에 포함되는 조성물의 농도는 사료 kg당 0.010~0.020 중량% 인 것을 특징으로 하는 방법.

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