KR20170133622A - 금 나노입자를 이용한 단백질 응집의 예측 방법 및 이를 이용한 신속한 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

금 나노입자를 이용한 단백질 응집의 예측 방법 및 이를 이용한 신속한 약물 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노입자를 이용한 단백질 응집의 예측 방법 및 이를 이용한 신속한 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 금 나노입자를 탐침(프로브)으로 사용하여 치매의 원인 단백질인 아밀로이드 베타 펩타이드 (Amyloid β (1-40), Amyloid β (1-42)) 및 루게릭병의 원인 단백질인 SOD1(superoxide dismutase1)의 산성 조건에서 단백질 응집과정을 확인한 결과, 금 나노입자가 첨가되지 않은 대조군에 비해 단량체(monomer)로부터 성숙된 단백질 응집체로의 성장 단계를 금 나노입자 용액의 색변화(분홍색→ 자주색→ 보라색 또는 남색)를 통해 초고속으로 실시간 확인이 가능하였고, 고온 조건 및 화학 물질 첨가 등의 다양한 단백질 응집 형성 조건에서도 적용이 가능하였으며, 또한 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 직접 또는 간접적으로 저해하는 효과가 있다고 알려진 10가지 후보 약물을 선정하여 단백질 응집 저해제 스크리닝을 진행해 본 결과, 예방제 또는 치료제로써 단백질 응집 저해 효과가 있는 약물을 육안으로 빠르게 선별해 낼 수 있어, 본 발명의 방법은 고가의 장비 없이 단백질 응집 구조 및 정도를 초고속으로 실시간 육안 모니터링할 수 있으므로 단백질 구조를 분석하는데 소요되는 시간과 비용을 절감하여, 기존의 단백질 구조 분석 방법에 대한 대안적 활용이 가능한 방법으로써, 단백질 응집의 키네틱(kinetic) 및 메커니즘(mechanism) 연구와 같은 분자 생물학적 및 생화학적 연구에 적용 가능할 뿐만 아니라 단백질 구조 변성 질환을 일으키는 단백질 응집을 저해할 수 있는 신약 후보 물질을 대량으로, 초고속 스크리닝을 가능하게 하여 약물개발 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

금 나노입자를 이용한 단백질 응집의 예측 방법 및 이를 이용한 신속한 약물 스크리닝 방법{Methods for colorimetric determination of protein aggregation and its application to ultrafast drug screening using gold nanoparticles}
본 발명은 금 나노입자를 이용하여 단백질 응집 구조 및 정도의 변화를 예측하고, 이를 이용해 단백질의 응집을 저해하는 약물을 신속하게 탐색하는 방법에 관한 것으로, 단백질 응집을 일으키는 원인 단백질을 단백질 응집 조건에서 금 나노입자와 반응시켜, 초고속으로 단백질 응집체를 형성하는 동시에, 그 응집체의 응집 구조를 따라 끼어들어가는(embedding) 나노입자의 분포 및 형태로 인해 나타나는 금 나노입자 용액의 색 변화를 육안으로 관찰함으로써 단백질의 응집 구조 및 응집 정도를 예측하고, 이를 이용하여 단백질의 응집을 저해하는 약물을 신속하게 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
비정상적 단백질의 응집 및 세포 내/외 축적은 노화와 연관된 신경퇴행성 질환 및 알코올 간 질환 등 단백질 구조 변성 질환의 주요 원인으로 여겨지고 있다. 그러나 이러한 단백질 구조 변화를 연구하기 위한 종래의 방법은 긴 배양시간, 복잡한 샘플 전처리 단계 및 고가의 장비를 요구하기 때문에, 원인 단백질의 응집과정을 실시간 모니터링하고, 응집된 구조를 빠르게 확인하기에는 한계가 있다.
단백질 구조 변성질환의 원인 단백질은 초기 단량체(monomer) 형태에서 생리학적 단백질 응집 조건이 주어지면 올리고머(oligomer), 중간체(intermediate)를 거쳐 성숙된 단백질 응집체로 성장한다. 이 과정은 수 일에서 수 개월, 또는 그 이상의 시간이 걸리는 과정이다. 이 과정에서 올리고머는 응결핵(nucleus) 역할을 하게 되는데, 응결핵이 만들어 지는 단계가 율속단계(rate-limiting step)이라고 알려져 있다(도 1). 이와 같이 자연적으로 단백질 응집체를 형성하기에는 오랜 시간이 걸리기 때문에 단백질 응집 현상을 실험하기 위해서는 많은 시간이 요구된다.
상기 문제점을 개선하기 위해 금속 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명 현상 (Localized surface plasmon resonance, LSPR)을 이용하여, 금 나노입자를 단백질 응집체 형성에 탐침(프로브)으로 사용할 경우, 단백질의 응집 과정 동안 금 나노입자는 응집 반응의 촉매 역할을 함으로써 단백질의 응집 반응 속도를 가속화시키며, 응집된 단백질 구조를 따라 네트워크를 형성하게 된다. 단백질 응집체에 끼어들어간(embedding) 금 나노입자는 응집 형태(예: 섬유형(fibril) 또는 무정형(amorphous))에 따라 입자 수와 입자간 거리가 다르게 분포하게 되어 단백질의 응집 단계를 색으로 나타낼 수 있는 광학신호전달자로서의 역할을 동시에 수행하게 된다. 예를 들어, 단백질의 응집 정도가 올리고머 정도인 경우, 금 나노입자 용액의 색이 분홍색(pink), 중간체는 자주색 (purple), 무정형적 응집체는 보라색(violet), 가는 섬유형 응집체는 남색(deep-blue)을 띤다. 이와 같은 원리에 의해 단백질 응집체의 구조 성장 단계를 금 나노입자 용액의 색 변화를 통해 예측 가능하다(도 1).
단백질 응집을 예측하는 방법에 대한 선행기술로서, 대한민국 등록특허 10-1003124에는 금 나노입자와 단백질 응집체에 각각 아비딘(또는 스트렙타비딘), 바이오틴을 결합하여 사용하는 베타 아밀로이드의 응집 저해제 스크리닝 방법에 대해 개시하였으나, 상기 방법은 당업계의 숙련자를 필요로 하고, 스크리닝 결과를 얻는데 1일 내지 3일이 걸린다는 점에 한계가 있으며, 대한민국 등록특허 10-0958184는 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 현상(LSP)을 이용한 바이오센서에 대해 개시하였으나, 이미 응집된 Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) 단백질 시료를 측정 대상 단백질(SOD1)이 미리 컨쥬게이션 된 금 나노입자와 혼합하여 기 응집된 단백질의 응집 정도를 색 변화로 확인하는 것으로 본 발명과는 접근 방식이 상이하다.
이에, 본 발명자들은 고가의 장비 없이 생체내에서 있음 직한 다양한 실험조건에서 단백질 응집 구조 및 응집 정도를 실시간 육안으로 모니터링 할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하던 중, 금 나노입자를 탐침(프로브)으로 사용하여 치매의 원인 단백질인 아밀로이드 베타 펩타이드 (Amyloid β (1-40), Amyloid β (1-42)) 및 루게릭병의 원인 단백질인 SOD1(superoxide dismutase1)의 산성 조건에서 단백질 응집과정을 확인한 결과, 금 나노입자가 첨가되지 않은 대조군에 비해 단량체(monomer)로부터 성숙된 단백질 응집체로의 성장 단계를 금 나노입자 용액의 색변화(분홍색→ 자주색→ 보라색 또는 남색)를 통해 초고속으로 실시간 확인이 가능하였고, 고온 조건 및 화학 물질 첨가 등의 다양한 단백질 응집 형성 조건에서도 적용이 가능하였으며, 또한 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 직접 또는 간접적으로 저해하는 효과가 있다고 알려진 10가지 후보 약물을 선정하여 단백질 응집 저해제 스크리닝을 진행해 본 결과, 예방제 또는 치료제로써 단백질 응집 저해 효과가 있는 약물을 육안으로 빠르게 선별해 낼 수 있음을 관찰하여, 금 나노입자와 단백질 시료가 함께 응집체를 형성하면서 초고속으로 응집체 형성하여 관찰 시간이 짧을 뿐만 아니라, 단순히 단백질 시료의 응집 여부 판단에 그치지 않고 단백질 응집 단계를 실시간 육안 모니터링을 할 수 있음을 확인하여, 본 발명의 금 나노입자를 이용한 단백질 응집을 예측하는 방법은 단백질 응집을 저해할 수 있는 약물의 신속한 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 금 나노입자를 이용하여 단백질 응집체의 구조 및 응집 정도를 육안으로 예측하는 방법을 이용하여 신속하게 원인 단백질의 응집을 저해하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 금 나노입자를 단백질 단량체(monomer)를 포함하는 단백질 용액과 혼합하는 단계;
2) 상기 1)의 혼합 용액에서, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 상기 혼합 용액의 색 변화를 확인하는 단계를 포함하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 금 나노입자를 단백질 단량체를 포함하는 단백질 용액과 혼합하여 나노입자를 둘러싼 단백질 올리고머를 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 혼합 용액에 후보 약물을 처리하고, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 후보 약물을 처리하지 않은 용액에 비해 약물을 처리한 용액의 색 변화를 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 단백질 단량체를 포함하는 단백질 용액과 후보 약물을 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 혼합 용액에 금 나노입자를 처리하고, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 후보 약물을 처리하지 않은 용액에 비해 약물을 처리한 용액의 색 변화를 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 금 나노입자를 탐침(프로브)으로 사용하여 치매의 원인 단백질인 아밀로이드 베타 펩타이드 (Amyloid β (1-40), Amyloid β (1-42)) 및 루게릭병의 원인 단백질인 SOD1(superoxide dismutase1)의 산성 조건에서 단백질 응집과정을 확인한 결과, 금 나노입자가 첨가되지 않은 대조군에 비해 단량체(monomer)로부터 성숙된 단백질 응집체로의 성장 단계를 금 나노입자 용액의 색변화(분홍색→ 자주색→ 보라색 또는 남색)를 통해 초고속으로 실시간 확인이 가능하였고, 이는 고온 조건 및 화학 물질 첨가 등의 다양한 단백질 응집 형성 조건에서도 적용이 가능하였으며, 또한 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 직접 또는 간접적으로 저해하는 효과가 있다고 알려진 10가지 후보 약물을 선정하여 단백질 응집 저해제 스크리닝을 진행해 본 결과, 예방제 또는 치료제로써 단백질 응집 저해 효과가 있는 약물을 육안으로 빠르게 선별해 낼 수 있으며, 고가의 장비 없이 육안으로 결과 파악이 가능한 것이기 때문에 상당한 시간 및 비용 절감 효과를 가진다. 이와 같은 시간과 비용 절감 효과는 기존의 단백질 구조 분석 방법에 대안적 활용이 가능한 방법으로써 단백질 응집의 키네틱(kinetic) 및 메커니즘(mechanism) 연구와 같은 분자 생물학적 및 생화학적 연구에 적용 가능하고, 더 나아가 단백질 구조 변성 질환을 일으키는 단백질 응집을 저해할 수 있는 신약 후보 물질을 대량으로, 초고속 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 생리학적 단백질 응집 조건에서 비정상 단백질의 응집 과정과 금 나노입자를 매개로 초고속 단백질 응집 과정에 대한 모식도 및 그 응집 정도를 파악하게 하는 금 나노입자 용액의 선명한 색을 나타낸 도이다.
도 2는 육안 관찰을 통해 단백질 응집 구조 및 정도를 예측하고, 신약 후보 물질을 스크리닝하는데 효과적인 최적의 구형 금 나노입자 크기가 존재함을 나타내는 도이다.
도 3은 금 나노입자를 매개로 단백질 응집 단계 및 정도를 나타내는 용액의 색 변화를 10분 동안 모니터링한 스펙트럼 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 산성 조건에서 2분 이내에 두드러진 스펙트럼 변화와 대상 단백질의 농도 및 종류에 의존하는 색 변화 반응을 나타낸 도이다.
도 5는 암시야 현미경을 통해 단백질의 응집 구조가 용액이 나타내는 색에 부합될 수 있다는 것을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명으로 단백질 응집체의 구조를 예측한 것과 기존의 단백질 구조 분석방법으로 단백질 응집 구조에 대한 분석이 서로 상응함을 나타낸 도이다.
도 7은 알츠하이머의 원인 펩타이드인 아밀로이드 베타뿐만이 아니라 루게릭병의 발명 원인 단백질 중 하나인 SOD1(superoxide dismutase 1)에 확장 적용시킬 수 있음을 나타낸 도이다.
도 8은 대표적인 단백질 응집 조건인 산성조건뿐만 아니라 생체내의 다양한 단백질 응집 조건(온도 상승, 화학물질의 첨가)에도 본 발명이 적용될 수 있음을 나타낸 도이다.
도 9는 단백질의 응집을 저해하는 조건을 모니터링하는 방법과 이를 활용하여 단백질 응집을 저해할 수 있는 신약 후보 물질을 탐색하는 방법이 환자 개인별 맞춤 의학(Personalized medicine)에 적용될 수 있음을 나타내는 도이다.
도 10은 단백질 구조변성 질환을 위한 신약 후보 물질 스크리닝 방법 중 치료제로서 효과가 있는 물질을 선별하는 방법을 나타내는 도이다.
도 11은 단백질 구조변성 질환을 위한 신약 후보 물질 스크리닝 방법 중 예방제로서 효과가 있는 물질을 선별하는 방법을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 금 나노입자를 단백질 단량체(monomer)를 포함하는 단백질 용액과 혼합하는 단계;
2) 상기 1)의 혼합 용액에서, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 상기 혼합 용액의 색 변화를 확인하는 단계를 포함하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법을 제공한다.
상기 금 나노입자는 다양한 크기 및 모양(구형, 삼각형, 막대형, 별모양 등)일 수 있으며, 직경이 5 내지 100 nm인 구형 금 나노입자인 것이 바람직하고, 10 내지 50 nm인 구형 금 나노입자인 것이 더욱 바람직하다. 금 나노입자의 표면은 시트르산염으로 처리될 수 있으며, 혼합 용액 내의 금 나노입자의 농도는 육안으로 결과를 용이하게 관찰하기 위해서는 최소 0.5 nM 이상이 바람직하고, 0.5 nM 내지 1 nM 인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 금 나노입자는 510 nm 내지 530 nm에서 최대 흡광 피크를 가지는 것이 바람직하다.
상기 단백질은 Amyloid β(Aβ), Superoxide dismutase(SOD), α-synuclein, Prion 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 금 나노입자와 단백질 용액의 혼합 비율은 단백질의 농도에 따라 최적의 혼합 비율이 달라질 수 있으며, 금 나노 입자의 목수에 대한 단백질의 몰 수의 비는 100 내지 2000인 것이 바람직하고, 1000인 것이 더욱 바람직하다. 단백질의 농도는 생체에서 주로 존재하는 농도(physiologically relevant concentration)로 알려진 1μM 에서 1000 μM 사이의 마이크로 몰 수준이 바람직하다.
또한, 상기 단백질 응집은 온도 또는 pH의 변화, 또는 중금속 또는 화학물질의 첨가로 인해 유도되는 것을 특징으로 하고, 상기 단백질 응집체의 구조 성장 단계는 단량체로부터 올리고머(oligomer), 중간체(intermediate), 무정형(amorphous) 응집체 또는 가는 섬유형(fibril) 응집체로 진행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 색 변화는 단백질의 응집 정도가 올리고머인 경우에는 분홍색(pink), 중간체인 경우는 자주색(purple), 무정형인 경우는 보라색(violet), 또는 가는 섬유형인 경우는 남색(deep-blue)을 나타내는 것을 특징으로 하고, 금 나노입자 고유의 피크(intrinsic peak)인 520 nm에서의 흡광도에 대한 단백질 응집의 지표 피크(indicator peak)인 650 nm에서의 흡광도의 비율인 상대적 흡광도(relative absorbance)를 통해 계산되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 금 나노입자를 이용하여 생체내에 있음직한 단백질 응집 조건에서 단량체로부터 성숙된 단백질 응집체로의 구조 성장 단계를 실시간 모니터링해본 결과, 금 나노입자가 첨가 되지 않은 대조군에 비해, 금 나노입자를 사용한 경우 현저하게 단백질 응집 시간이 단축되어었고 (도 3 및 4 참조), 이러한 금 나노입자 용액의 색 변화가 단백질의 응집 구조 및 응집 정도를 반영한다는 사실을 확인하였다(도 5 내지 7 참조). 또한, 단백질 응집 유발 조건인 산성(예: pH 2), 고온(예: 45 ℃), 및 화학물 첨가 (trifluoroethanol, TFE)의 조건에서도 적용가능함을 확인하였다(도 8 참조).
따라서, 기존의 단백질 구조 분석에 소요되는 시간과 비용 절감하여 기존의 단백질 구조 분석 방법에 대안적 활용이 가능한 방법으로써, 고가의 장비 없이 단백질 응집 구조 및 응집 정도를 초고속으로 실시간 모니터링하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 금 나노입자를 단백질 단량체를 포함하는 단백질 용액과 혼합하여 나노입자를 둘러싼 단백질 올리고머를 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 혼합 용액에 후보 약물을 처리하고, 단백질 올리고머의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 후보 약물을 처리하지 않은 용액에 비해 약물을 처리한 용액의 색 변화를 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 단백질 단량체를 포함하는 단백질 용액과 후보 약물을 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 혼합 용액에 금 나노입자를 처리하고, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 후보 약물을 처리하지 않은 용액에 비해 약물을 처리한 용액의 색 변화를 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방물질 스크리닝 방법을 제공한다.
단백질 응집을 저해하는 약물 스크리닝 방법은 앞서 제안한 단백질 응집체의 구조 및 성장 단계를 모니터링하는 방법을 기초로 한다. 구체적으로, 만약 선정된 후보 약물이 단백질 응집을 저해하는 효과가 있다면, 후보 약물과 단백질 단량체의 결합 친화력(binding affinity)에 따라 단백질 단량체에 결합하기 때문에, 응집을 일으킬 수 있는 단량체의 양을 감소시키므로 단백질 응집 현상이 약화된다. 따라서, 저해재로써 효과가 있는 후보 약물을 처리한 경우, 금 나노입자 용액의 색이 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 낮은 응집 단계의 색을 띠게 되며, 금 나노입자 고유의 흡광 파장 대비 단백질 응집체 형성 후의 금 나노입자의 상대적 흡광도(relative absorbance)를 측정하면, 대조군에 비해 그래프가 아래쪽에 나타나게 된다. 그러나 만약 후보 약물이 효과가 없다면, 단백질 응집 현상을 약화시킬 수 없으므로, 후보 약물을 처리 하지 않은 대조군과 뚜렷한 색 차이를 보이지 않을 뿐만 아니라 상대적 흡광도 또한 비슷하거나 높게 나타나게 된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 퇴행성 뇌질환에 대해 치료제로서 효과가 있는 물질을 선별하기 위해서, 후보 약물로써 아세틸콜린(acetylcholine), 알부민(albumin), 카페인(caffeine), 카테킨(catechin), 커큐민(curcumin), 글루타티온(glutathione), 레스베라트롤(resveratrol), 루틴(rutin), 실리비닌(silibinin), 트레할로오스(trehalose)를 사용하였다. 또한, 단백질 응집이 어느 정도 진행된 모델 시스템을 사용해야 하므로, 의도적으로 올리고머(oligomer) 형태가 되도록 원인 단백질을 응집시키기 위해, 먼저 금 나노입자와 단백질 단량체를 9:1 부피비율로 2시간 이상 반응 시켰고, 그 다음 후보 약물을 단백질 단량체와 같은 비율로 처리한 뒤, 단백질 응집 조건으로 응집을 유발하였다. 이때 금 나노입자, 원인 단백질, 후보 약물, 단백질 응집 조건의 부피비율은 9:1:1:2가 바람직하며, 원인 단백질과 동일한 부피의 후보 약물들을 처리하고, 단백질 응집 조건에 노출시켜 선별된 후보 약물들이 효과가 있는지 금 나노입자 용액의 색 변화 및 스펙트럼 분석을 관찰한 결과, 단백질의 혼합 비율과 단백질 응집 유발 조건에 따라 아세틸콜린, 알부민, 글루타티온, 루틴 등 다양한 약물 후보에서 효과가 있음을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 퇴행성 뇌질환에 대해 예방제로서 작용할 수 있는 약물을 선별하기 위해서는 응집되지 않은 단백질 단량체가 후보 약물과 먼저 반응해야 하기 때문에, 우선적으로 단백질 단량체와 후보 약물을 10분 동안 반응 시킨 후, 금 나노입자를 처리하고 단백질 응집 조건에 노출시켜 상기의 후보 약물들이 효과가 있는지 관찰한 결과, 단백질의 혼합 비율과 단백질 응집 유발 조건에 따라 알부민, 카테킨, 커큐민, 글루타티온, 루틴, 실리비닌 등 다양한 약물 후보에서 효과가 있음을 확인하였다(도 11 참조).
상기를 통해, 본 발명은 생체내에 있음직한 단백질 응집 조건에서 단백질의 응집을 저해하는 약물을 초고속으로 탐색할 수 있는 스크리닝 방법으로, 만약 선정된 후보 약물이 퇴행성 뇌질환의 예방제 또는 치료제로써 효과가 있는 경우, 후보 약물이 첨가 되지 않은 대조군에 비해 낮은 응집 단계의 색을 나타내고, 반면 선정된 후보 약물이 효과가 없다면, 단백질 응집 현상을 약화 시킬 수 없으므로 후보 약물을 처리 하지 않은 대조군과 뚜렷한 색 차이를 보이지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 단백질 구조 변성 질환을 일으키는 단백질 응집을 저해할 수 있는 신약 후보 약물을 대량으로, 초고속 스크리닝하기위한 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 구형 금 나노입자 합성
단백질의 응집 구조 및 정도를 관찰하고, 단백질 응집 저해제로서 기능할 수 있는 약물을 탐색하기 위해, 구형 금 나노입자는 염화 금산(HAuCl4) 전구체로, 시트르산 나트륨(sodium citrate)을 표면 안정제로 사용하여 열을 가하면서 환원시켜 합성하는 '수열합성방법'으로 제조하였다. 나노입자의 크기는 표면안정제의 양을 통해 조절하였다.
구체적으로, 직경이 20 nm의 구형 금 나노입자를 합성하는 방법은 아래와 같다.
HAuCl4 1 g 을 증류수 20 ㎖에 녹인 저장용액과 시트르산 나트륨 1 g 을 증류수 100 ㎖에 녹인 용액을 제조한 후, 증류수 198.27 ㎖ 에 HAuCl4 저장용액(stock solution) 0.2 ㎖을 넣고 끓을 때까지 교반하면서 가열하였고, 용액이 끓기 시작하면 시트르산 나트륨 용액 1.53 ㎖를 첨가하였다. 이를 통해, 용액의 색이 옅은 노란색에서 어두운 회색으로 변하고, 용액 내에서 환원이 충분히 이루어져 색이 자주색으로 변하였을 때, 가열을 멈추고 상온에서 냉각시켰다.
< 실험예 1> 금 나노입자를 이용한 치매와 루게릭병의 원인 단백질 응집 구조 및 정도 확인
상기 <실시예 1>에서 합성된 20 nm의 구형 금 나노입자를 치매 및 루게릭병의 원인 단백질 응집 구조 및 응집 정도를 확인하는데 사용 가능한지 알아보고자, 치매의 원인 펩타이드로 잘 알려진 아밀로이드 베타 (1-40)(Amyloid β(1-40)), 아밀로이드 베타 (1-42) (Amyloid β (1-42)) 펩타이드 및 루게릭병의 원인 단백질로 잘 알려진 과산화물 제거 효소 (SOD1, superoxide dismutase1)를 이용하여 하기 실험을 수행하였다. 이때 금 나노입자, 원인 단백질, 단백질 응집 조건의 부피비율은 9:1:1로 수행하였다.
구체적으로, 96 well plate에 20 nm의 구형 금 나노입자 용액 90 ㎕를 넣은 뒤, Amyloid β(1-40), Amyloid β(1-42) 또는 SOD1 10 ㎕를 각각 처리한 후, 대표적인 단백질 응집 유발 조건인 산성 조건을 만들어 주기 위해 0.03 M HCl 20 ㎕를 처리하였다. 그런 다음, 상기 용액의 색을 육안 관찰하고, 자외-가시광 분광기(UV-Vis spectrophotometer) 및 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 통한 스펙트럼 분석 및 암시야 현미경(dark-field microscopy)을 이용하여 이미지 분석을 수행하였다.
그 결과 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 2분 이내에 두드러진 스펙트럼 변화와 함께 원인 단백질의 농도 및 종류에 의존하는 색 변화를 육안으로 관찰하였다. 단백질의 응집 정도가 올리고머(oligomer)인 경우, 금 나노입자 용액의 색이 분홍색(pink), 중간체는 자주색 (purple), 무정형적 응집체는 보라색(violet), 가는 섬유형 응집체는 남색(deep-blue)을 나타냄을 확인하였다.
또한, 상기 색 변화는 스펙트럼 분석을 통해서 정량화가 가능하였으며, 단백질 응집체가 형성된 경우 측정된 흡광 스펙트럼에서 상대적 흡광도 (relative absorbance)를 계산하였다. 보통 상대적 흡광도는 금 나노입자 고유의 픽 (intrinsic peak)인 520 nm에서의 흡광도에 대한 단백질 응집의 지표 피크(indicator peak)인 650 nm에서의 흡광도의 비를 계산하여 사용한다.
또한, 암시야 현미경을 통해 상기 금 나노입자 용액이 나타내는 색 변화가 원인 단백질의 응집 구조를 반영함을 육안으로 확인하였고(도 5), 기존의 단백질 구조 분석 방법인 원편광이색성 분광법 (CD spectroscopy, circular dichroism spectroscopy)으로 분석한 결과와 비교하였을 때, 금 나노입자의 존재가 원인 단백질 본연의 응집 구조를 형성하는데에 큰 영향을 미치지 않는다는 사실을 확인하여, 기존의 단백질 구조 분석 방법과 상호 보완적인 방법이 될 수 있음을 확인하였다(도 6).
또한, 루게릭병의 원인 단백질인 과산화물 제거 효소(SOD1, superoxide dismutase1)를 이용한 실험을 통해, SOD1 단백질의 응집 구조를 예측할 수 있어, 다양한 단백질의 구조 변성 질환에도 활용될 수 있음을 확인하였으며(도 7), 대표적인 단백질 응집 유발 조건인 산성 조건뿐만 아니라 다양한 단백질 응집 유발 조건(온도, pH, 중금속, 화학 물질 등)에도 확장 적용될 수 있음을 확인하였다(도 8).
< 실험예 2> 치매의 원인 펩타이드인 Amyloid β의 응집 저해제로서 효과가 있는 후보 약물 중 치료제로서 효과가 있는 물질의 선별
치매의 원인 단백질인 아밀로이드 베타 펩타이드의 응집을 저해하는 효과가 있다고 알려진 10가지 후보 약물; 아세틸콜린(acetylcholine), 알부민(albumin), 카페인(caffeine), 카테킨(catechin), 커큐민(curcumin), 글루타티온(glutathione), 레스베라트롤(resveratrol), 루틴(rutin), 실리비닌(silibinin), 트레할로오스(trehalose)을 선정하여 하기 실험을 수행하였다. 치료제로서 효과가 있는 물질을 선별하기 위해 단백질 응집이 어느 정도 진행된 모델 시스템을 사용해야 하므로, 먼저 단백질의 응집이 진행되도록 한 후, 올리고머의 형태로 제조하였다.
구체적으로, 환자의 생체 내 두 가지 종류의 Amyloid β의 양을 고려하여 실험을 수행하였고, 먼저 Amyloid β (1-40)만 있는 경우의 실험 방법은 하기와 같다.
금 나노입자, 원인 단백질, 후보 약물, 단백질 응집 조건의 부피비율은 9:1:1:2로 하였고, 이를 위해 상기 <실시예 1>에서 합성된 20 nm의 구형 금 나노입자 용액 90 ㎕과 10 μM Amyloid β(1-40) 10 ㎕을 96 well plate에 넣은 후, 상온에서 12시간 동안 응집시켰다.
그런 다음, 대조군을 제외하고 선정된 10가지 후보 약물을 농도별로 처리한 뒤, 두 가지 단백질 응집 유발 조건에 대해 실험을 진행하였다. 첫 번째, 대표적인 단백질 응집 유발 조건인 산성조건을 만들어주기 위해 대조군을 포함한 모든 금 나노입자 용액에 0.03 M HCl을 20 ㎕씩 처리하였다. 30분 후, 용액의 색을 육안으로 관찰하고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 통해 스펙트럼 분석을 수행하였다. 두 번째, 퇴행성 뇌질환 환자의 생체 내 단백질 응집 유발 조건을 모사한 극한 조건을 만들어 주기 위해, 45℃ 에서 30분 동안 배양한 뒤, 대조군을 포함한 모든 금 나노입자 용액에 5 mM 구리 이온 10 ㎕ 및 0.03M HCl 10 ㎕를 처리하였다. 30분 후, 용액의 색을 육안으로 관찰하고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 통해 스펙트럼 분석을 수행하였다.
위와 같은 방법으로 Amyloid β(1-42)만 있는 경우는 10 μM Amyloid β(1-42) 10 ㎕를, Amyloid β(1-40)와 Amyloid β(1-42)가 1:1로 혼합되어있는 경우는 두 개의 Amyloid β용액 10 μM을 동량 혼합한 용액 10 ㎕를 이용하여 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 대표적인 단백질 응집 유발 조건인 산성 조건에서 본 발명자들이 선정한 후보 약물 중 Amyloid β(1-40)만 있는 경우는 선정한 모든 약물에서 약효를 관찰 할 수 있었고, Amyloid β(1-42)만 있는 경우는 아세틸콜린, 알부민, 루틴, 트레할로오스에서 약효를 확인할 수 있었으며, Amyloid β(1-40)와 Amyloid β(1-42)가 1:1로 혼합되어있는 경우에는 아세틸콜린, 알부민, 루틴이 효과적인 것을 육안으로 관찰 할 수 있었다. 한편, 퇴행성 뇌질환 환자의 생체 내 단백질 응집 유발 조건을 모사한 극한 조건에서는 본 발명자들이 선정한 후보 약물 중 Amyloid β(1-40)만 있는 경우는 알부민, 글루타티온, 루틴에서 약효를 관찰 할 수 있었고, Amyloid β(1-42)만 있는 경우는 알부민, 카페인, 글루타티온, 루틴에서 약효를 확인 할 수 있었으며, Amyloid β(1-40)와 Amyloid β (1-42)가 1:1로 혼합되어있는 경우에는 알부민, 글루타티온, 루틴이 효과적인 것을 육안으로 관찰 할 수 있었고, 스펙트럼 분석 결과에서, 선정된 후보 약물 중 효과가 있는 물질은 대조군보다 그래프가 아래쪽에 나타남을 확인하였다(도 10).
이를 통해, 환자의 상태마다 효과적인 약물의 구성이 다를 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> 단백질 응집 저해제로서 효과가 있는 후보 약물 중 예방제로서 효과가 있는 물질의 선별
상기 <실험예 2>와 마찬가지로 모델 시스템으로써 치매의 원인 단백질인 아밀로이드 베타 펩타이드를 이용하고, <실험예 2>의 10가지 후보 약물들로 예방제로서 효과가 있는 물질을 선별하기 위한 실험을 진행하였다.
후보 약물 중 예방 효과가 있는 물질을 스크리닝하기 위해서는 원인 단백질이 후보 약물과 먼저 반응해야 하므로, 먼저 아밀로이드 베타 펩타이드와 선정된 10가지 후보 약물을 1:1 부피로 10분 동안 반응시킨 뒤, 금 나노입자를 처리하고, 단백질 응집 조건을 만들어 주었다. 이때 금 나노입자, 원인 단백질, 후보 약물, 단백질 응집 조건의 부피비율은 9:1:1:2로 하였고, 단백질 응집 유발 조건에 따라 처리 직후부터 24시간 이내로 관찰하였다.
구체적으로, 환자의 생체 내 두 가지 종류의 Amyloid β의 양을 고려하여 실험을 수행하였고, 먼저 Amyloid β(1-40)만 있는 경우의 실험 방법은 하기와 같다.
먼저, 96 well plate를 이용해 상온에서 10분동안 10 μM Amyloid β(1-40) 10 ㎕과 선정된 10가지 약물 후보물질 10 ㎕을 농도별로 각각 반응시킨다. 그 다음 상기 <실시예 1>에서 합성된 20 nm의 구형 금 나노입자를 90 ㎕ 처리한 뒤, 두 가지 단백질 응집 유발 조건에 대해 실험을 진행하였다. 첫 번째, 대표적인 단백질 응집 유발 조건인 산성조건을 만들어주기 위해 대조군을 포함한 모든 금 나노입자 용액에 0.03 M HCl을 20 ㎕씩 처리하였다. 30분 후, 용액의 색을 육안으로 관찰하고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 통해 스펙트럼 분석을 수행하였다. 두 번째, 퇴행성 뇌질환 환자의 생체 내 단백질 응집 유발 조건을 모사한 극한 조건을 만들어 주기 위해, 45℃ 에서 30분 동안 배양한 뒤, 대조군을 포함한 모든 금 나노입자 용액에 5 mM 구리 이온 10 ㎕ 및 0.03M HCl 10 ㎕를 처리하였다. 30분 후, 용액의 색을 육안으로 관찰하고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 통해 스펙트럼 분석을 수행하였다.
위와 같은 방법으로 Amyloid β (1-42)만 있는 경우는 10 μM Amyloid β (1-42) 10 ㎕를, Amyloid β(1-40)와 Amyloid β(1-42)가 1:1로 혼합되어있는 경우는 두 개의 Amyloid β 용액 10 μM을 동량 혼합한 용액 10㎕를 이용하여 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 본 발명자들이 선정한 후보 약물 중 Amyloid β (1-40)만 있는 경우는 아세틸콜린, 알부민, 카테킨, 커큐민, 루틴, 실리비닌에서 효과가 관찰 되었고, Amyloid β (1-42)만 있는 경우는 알부민, 카테킨, 커큐민, 루틴, 트레할로오스에서 약효를 확인할 수 있었으며, Amyloid β (1-40)와 Amyloid β (1-42)가 1:1로 혼합되어있는 경우에는 알부민, 루틴, 실리비닌이 효과적인 것을 육안으로 관찰 할 수 있었다. 한편, 퇴행성 뇌질환 환자의 생체 내 단백질 응집 유발 조건을 모사한 극한 조건에서는 본 발명자들이 선정한 후보 약물 중 Amyloid β (1-40)만 있는 경우는 알부민, 카테킨, 글루타티온, 루틴에서 약효를 관찰 할 수 있었고, Amyloid β (1-42)만 있는 경우는 알부민, 카페인, 카테킨, 글루타티온, 루틴에서 약효를 확인 할 수 있었으며, Amyloid β (1-40)와 Amyloid β (1-42)가 1:1로 혼합되어있는 경우에는 알부민, 글루타티온, 루틴이 효과적인 것을 육안으로 관찰 할 수 있었고, 마이크로플레이트 리더기 (microplate reader)를 통한 스펙트럼 분석한 결과를 통해서도, 선정된 후보 약물 중 효과가 있는 물질은 대조군 그래프보다 아래쪽에 그래프가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).
이를 통해, 환자의 상태에 따라 효과적인 약물의 구성이 다를 수 있음을 알 수 있다.

Claims (11)

1) 금 나노입자를 단백질 단량체(monomer)를 포함하는 단백질 용액과 혼합하는 단계;
2) 상기 1)의 혼합 용액에서, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 상기 혼합 용액의 색 변화를 확인하는 단계를 포함하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 직경이 5 내지 100 nm인 구형 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 510 nm 내지 530 nm 에서 최대 흡광 피크를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 Amyloid β(Aβ), Superoxide dismutase(SOD), α-synuclein, Prion 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 금 나노입자와 단백질 용액의 혼합은 금 나노 입자의 몰 수에 대한 단백질의 몰 수의 비가 100 이상인 것을 특징으로 하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단백질 응집은 온도 또는 pH의 변화, 또는 중금속 또는 화학물질의 첨가로 인해 유도되는 것을 특징으로 하는 단백질의 응집체 구조 성장 단계를 실시간 모니터링 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단백질 응집체의 구조 성장 단계는 단량체로부터 올리고머(oligomer), 중간체(intermediate), 무정형(amorphous) 응집체 또는 가는 섬유형(fibril) 응집체로 진행되는 것을 특징으로 하는 단백질 응집체의 구조 성장 단계를 실시간 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 색 변화는 단백질의 응집 정도가 올리고머인 경우에는 분홍색(pink), 중간체인 경우는 자주색(purple), 무정형인 경우는 보라색(violet), 또는 가는 섬유형인 경우는 남색(deep-blue)을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질 응집체의 구조 성장 단계를 실시간 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 색 변화는 금 나노입자 고유의 피크(intrinsic peak)인 520 nm에서의 흡광도에 대한 단백질 응집의 지표 피크(indicator peak)인 650 nm에서의 흡광도의 비율인 상대적 흡광도(relative absorbance)를 통해 계산되는 것을 특징으로 하는 단백질 응집체의 구조 성장 단계를 실시간 모니터링하는 방법.
1) 금 나노입자를 단백질 단량체를 포함하는 단백질 용액과 혼합하여 나노입자를 둘러싼 단백질 올리고머를 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 혼합 용액에 후보 약물을 처리하고, 단백질 올리고머의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 후보 약물을 처리하지 않은 용액에 비해 약물을 처리한 용액의 색 변화를 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료물질 스크리닝 방법.
1) 단백질 단량체를 포함하는 단백질 용액과 후보 약물을 혼합하는 단계;
2) 단계 1)의 혼합 용액에 금 나노입자를 처리하고, 단백질 단량체의 응집을 유도하는 단계; 및
3) 후보 약물을 처리하지 않은 용액에 비해 약물을 처리한 용액의 색 변화를 비교하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방물질 스크리닝 방법.
KR1020160064591A 2016-05-26 2016-05-26 금 나노입자를 이용한 단백질 응집의 예측 방법 및 이를 이용한 신속한 약물 스크리닝 방법 KR101897865B1 (ko)

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