KR20170132004A - 한국인 아토피피부염 환자의 유전자 돌연변이 동시 검출용 프라이머, 프로브 및 방법 - Google Patents

한국인 아토피피부염 환자의 유전자 돌연변이 동시 검출용 프라이머, 프로브 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국인 아토피피부염 환자의 유전자 돌연변이 동시 검출용 프라이머, 프로브 및 방법에 관한 것이다.

Description

한국인 아토피피부염 환자의 유전자 돌연변이 동시 검출용 프라이머, 프로브 및 방법 {Primers and probes for detecting mutations in the Korean patients with atopic dermatitis simultaneously and their application methods}
본 발명은 한국인 아토피피부염 환자의 유전자 돌연변이 동시 검출용 프라이머, 프로브 및 방법에 관한 것이다.
아토피 피부염이란 환자 자신이 기관지 천식, 알레르기 비염 등의 다른 아토피 질환을 가지고 있거나 가족 중에 아토피 질환이 있는 사람에서, 영유아 또는 소아에서 발생하여 성인에 이르기까지 재발하는 심한 가려움증과 특징적인 피부병변의 분포를 나타내는 만성 습진성 피부질환을 말한다.
아토피 피부염은 피부증상의 진행에 따라 급성, 아급성, 만성의 피부 병변을 나타낸다. 급성기에는 작은 물집이 생겨서 진물이 흐르고 홍반과 부종이 동반된 발진을 보이며 때로는 세균감염으로 인해 누런 가피를 형성하기도 하며, 아급성기에는 진물이 멈추고 각질이 혼재되며 판 형태의 피부병변을 나타내다가, 만성기에는 반복적으로 긁고 문지름으로 인해서 피부가 두꺼워지고 피부주름이 선명해지는 태선화 병변을 보인다.
아토피피부염은 산업이 발달하고 핵가족화가 이루어지는 서구화된 나라에서 더욱 흔하게 나타나는 질환으로 소아는 10-20%, 성인은 1-3% 정도의 유병률을 보이는데, 최근 급격한 증가추세를 보이는 우리나라의 경우도 이와 유사한 유병률을 나타내고 있으며 환자들에게 관찰되는 여러 가지 합병증 및 사회에 대한 부적응 등이 문제가 되고 있다[Yu JS, Lee CJ, Lee HS, Kim J, Han Y, Ahn K, Lee SI. Prevalence of atopic dermatitis in Korea: Analysis by using national statistics. J Korean Med Sci 2012;27:681-685]. 아토피피부염 환자의 70-80% 정도에서 아토피 질환의 가족력이 있을 만큼 아토피피부염은 선천적인 소인이 매우 중요하게 작용하지만, 우리나라에서와 같이 급격한 서구화 및 산업화와 함께 아토피피부염의 발생이 현저하게 증가하는 것은 후천적인 요인도 강력하게 영향을 미치고 있음을 의미한다.
필라그린 유전자(FLG)의 기능소실 돌연변이(loss of function mutation)가 북서유럽국가의 백인 아토피피부염 환자에서 매우 중요하게 관여함이 2006년에 보고된 이후에는 선천적인 피부장벽 손상이 전통적으로 중요시되던 비정상적인 알레르기 반응을 밀어내고 아토피피부염의 1차적인 원인으로 대두되었다[Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao Y, Liao H, Lee SP, Goudie DR, Sandilands A, Campbell LE, Smith FJ, O'Regan GM, Watson RM, Cecil JE, Bale SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ, Fleckman P, Lewis-Jones S, Arseculeratne G, Sergeant A, Munro CS, El Houate B, McElreavey K, Halkjaer LB, Bisgaard H, Mukhopadhyay S, McLean WH. Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet 2006;38:441-446]. 아토피피부염의 정확한 병태생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않으나 유전적 소인과 함께 면역학적, 비면역학적 기전이 관여하리라고 생각되고 있다. 즉, 손상된 피부장벽과 비정상적인 면역반응이 합해져서 아토피피부염의 발생에 기여한다. 아토피피부염에서 나타나는 비정상적인 면역반응은 외부 항원에 대한 감작 증가, 혈청 IgE 증가, 급성기에 Th2 사이토카인 증가, cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA)이 발현된 T 림프구 (세포)의 증가, 랑게르한스 세포와 염증성 수지상 표피세포에서 FcεRI 발현 증가 등이 있다. 피부장벽이 손상되면 외부 항원 및 균의 침투를 막기 위하여 피부에서는 각질형성세포와 항원전달세포 등을 통하여 즉각적인 선천면역 반응이 일어나고 후천면역 반응도 이어지는데, 아토피피부염 환자에서는 선천면역계와 후천면역계가 비정상적으로 반응하여 알레르기 염증 반응이 발생한다.
아토피피부염의 주된 면역반응 변화는 IgE의 증가와 보조 T 세포 유형1 (T helper type 1 cell; Th1 세포)/ Th2 세포의 불균형이다[Meagher LJ, Wines NY, Cooper AJ. Atopic dermatitis: Review of immunopathogenesis and advances in immunosuppressive therapy. Australas Dermatol 2002;43:247-254]. Th1 세포는 활성이 감소하므로 Th1 세포에 의해 유도되는 사이토카인인 인터루킨(IL)-2, 인터페론(IFN)-γ는 감소하고, Th2 세포는 활성이 증가하므로 이에 의해 유도되는 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 등은 증가 한다(그림 1). 또한 피부 조직의 염증 및 손상에 의해 IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, 과립구 대식세포 집단 자극 인자 (Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)의 과잉 발현이 일어나며, 염증성 사이토카인인 IL-8도 증가 한다[Mutou Y, Ibuki T, Kojima S. Immunomodulatory effects of ultraviolet B irradiation on atopic dermatitis in NC/Nga mice. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2007;23:135-144; Kimata H, Lindley I. Detection of plasma interleukin-8 in atopic dermatitis. Arch Dis Child 1994;70:119-1224].
T 림프구 (세포)는 항체 형성에 관여하고 아토피피부염 병변에 Th 세포가 주로 침윤된다. Th 세포는 기능에 따라 Th1 세포와 Th2 세포로 구분할 수 있는데 급성기의 아토피피부염에서는 Th2 세포가 우세하게 나타난다. Th1 세포는 IL-2, IFN-r, TNF 등을 생산하여 대식세포(macrophage)를 활성화시켜서 지연형 면역반응을 유발하며, 반대로 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 등을 생산하여 IgE 합성을 증가시키고 비만세포(mast cells)와 호산구(eosinophils) 분화를 유도하여 즉시형 면역반응을 유발한다. 급성기의 아토피피부염에서 Th2 면역반응이 우세한 이유는 IL-4 수용체 유전자의 다형성과 같은 유전적 요인이 관여하고 항원노출 시 증가되는 사이토카인이나 항원전달세포들이 Th2 면역 반응을 우세하게 나타내는데 기여하기 때문이라고 알려져 있다. 또한, Th2 세포에 의해서 생성된 사이토카인은 B 림프구(세포)의 생성과 분화를 유도하고 Th1 세포 활성을 억제한다. 손상된 피부장벽을 통하여 외부 항원이 표피 내로 침투하게 되면 수지상 세포가 항원을 인식하여 Th2 세포를 활성화 시킨다. 활성화된 Th2 세포에서 IL-4, 5, 10, 13, 17, 31 등의 사이토카인이 분비되며, IL-4, 13에 의해 B 세포가 활성화되어 IgE가 분비된다. IL-5에 의해 호산구가 모여들며, 분비된 IgE가 비만세포와 호염구의 IgE 수용체에 결합한 후 히스타민, 중성 단백질분해효소 (neutral protease), 프로스타글란딘 D2, 류코트리엔 C4/D4/E4 등의 다양한 염증매개물질을 분비시켜 아토피피부염의 임상증상을 만든다. 이렇게 급성기 아토피피부염에서 우세한 Th2 세포와 세포 독성 T 세포는 granzyme B를 발현하여 피부의 염증 반응에 관여 한다[Choi EH, Yoon NY. Pathogenesis of Atopic Dermatitis. J Korean Med Assoc. 2014;57:218-225].
정상피부와 비교했을 때 아토피피부염의 급성 및 만성 병변 모두에서 IL-4, IL-5, IL-13 등의 mRNA 발현이 증가되지만 만성병변에서는 IL-4와 IL-13 mRNA 발현은 적고 IL-5와 IL-12 mRNA 발현 및 anti-eosinophil cationic protein (ECP) antibody eosinophil은 증가되어 있다. 그러므로 아토피피부염의 만성병변 발생에는 IL-5, IL-12의 발현과 호산구의 침윤이 관여한다는 것을 알 수 있으며, IL-12가 급성병변의 Th2 반응이 만성병변의 Th1 반응으로 전환되는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IL-18은 IL-12와 함께 Th1 세포로부터 IFN-γ의 생성을 촉진하는 사이토카인이며 IL-18과 IL-12 사이에도 서로 촉진시키는 상관관계를 가진다[Aral M, Kocturk SA, Kastal U, et al. The relationship between serum levels of total IgE, IL-18, IL-12, IFN-γ and disease severity in children with atopic dermatitis. Mediators Inflamm 2006;2006:73098]. Th2 사이토카인인 IL-4, 5, 13 등은 표피분화단백질인 로리크린(loricrine), 인볼루크린(involucrin), 필라그린(filaggrin) 발현을 억제하고 항균펩타이드 생성도 감소시킨다. 유전학적인 측면에서는 사이토카인 관련 유전자에 변이가 발생하면 여러 Th2 염증반응에 영향을 주어 아토피피부염을 유발할 수 있다. 최근 IL-4, IL-4 수용체, IL-13 등의 유전자 변이와 아토피피부염과의 상관성이 보고되었다[Choi EH, Yoon NY. Pathogenesis of Atopic Dermatitis. J Korean Med Assoc. 2014;57:218-225].
아토피피부염의 대부분을 차지하는 외인성 아토피피부염은 외부항원 및 혈청 면역글로불린 E (immunoglobulin E; IgE) 증가와 연관된 면역기전에 의해 발생되는데 특정 알레르겐에 대한 즉시형 면역반응보다는 T 세포 이상에 의한 지연형 면역반응이 관여한다고 보고되고 있다. 아토피피부염 환자에서 세포매개성 면역기능 장애가 IgE 증가와 관련 있음이 밝혀지면서 즉시형 면역반응 외에도 지연형 면역반응이 아토피피부염의 병인에 관여됨을 주장하는 보고들이 증가하고 있다. 아토피피부염 환자에서 세포매개성 면역반응 장애는 약 80%까지 발생하는 것으로 알려져 있으며, 바이러스 및 피부사상균 등에 의한 피부감염증에 대해 감수성이 증가되었고, 접촉 알레르겐에 대한 감수성은 감소된 경향을 보인다.
아토피피부염과 같이 복합적이고 다양한 유전 양상을 보이는 질환에서 원인 유전자를 특정 하는 것은 쉽지 않다. 현재까지 알려진 유전질환의 원인을 규명하는데 가장 좋은 도구는 모든 유전자에 존재하는 polymorphic markers를 찾는 것이다. 같은 알레르기 질환인 기관지 천식에서 IL-4의 promoter 부위에 염기서열 하나가 바뀐 것을 찾아낸 것이 가장 대표적이며, 이후 SNP(single nucleotide polymorphism)에 대한 연구가 본격화되고 있다. 특정 집단에서 정상인의 DNA 상에 존재하는 염기서열 중의 하나가 변이되어, 그 빈도가 1% 이상인 것을 SNP라 하는데, 이러한 SNP가 유전자 다형성의 90%를 차지하고 있어 그 중요성이 크다고 할 수 있다[양준모. 아토피피부염의 유전체 연구. 천식 및 알레르기. 2003;23:5-15]. SNP에 대한 결과는 개개인이 모두 다르게 나올 수 있으며, 이것은 임상소견과 SNP 결과 사이의 상관관계를 분석함으로서 규명될 수 있다. 현재까지 SNP는 주로 시퀀싱을 통해서 이루어지고 있지만 면역에 관련되어 있는 여러 종류의 사이토카인을 확인하기 위해서는 해당되는 부위를 각각 확인해야 하는 번거로움이 있으며 시간과 비용의 문제가 발생한다. 이러한 단점을 보완하고자 Reverse blot hybridization assay(REBA)를 통하여 아토피피부염을 유발하는 각 유전자에서 발생빈도가 높은 유전자부위를 선택하여 각각의 돌연변이의 여부를 한 번에 확인하고자 하였다. 이 방법은 아토피피부염 환자의 돌연변이 여부는 물론 나아가서 신생아에서 아토피피부염의 발병을 예측 할 수 있도록 도움을 주는 유용한 방법이라 생각된다.
[관련 특허문헌]
대한민국 특허공개번호 제1020090103175호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 아토피피부염 환자의 돌연변이 여부는 물론 나아가서 신생아에서 아토피피부염의 발병을 예측 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 프라이머 및 프로브를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 42에 기재된 서열로 이루어진 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 상기 조성물은 아토피피부염의 돌연변이 유무를 검출하기 위한 것인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 서열번호 43 내지 서열번호 80에 기재된 서열로 이루어진 프라이머 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프로브 조성물 및 상기 본 발명의 프라이머 조성물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 환자의 유전자 상의 유전자 돌연변이 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 환자는 한국인인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현 예에 있어서, 상기 유전자 돌연변이는 DEFB1 유전자 C2266T, 및 G1241T 부위; TNF; KDR; IL4 유전자의 C33T, 및 C590T 부위; IL5 유전자의 T4597A; IL5RA 유전자의 T26838A; IL9 유전자의 G4091A;, IL9R 유전자의 T6944C; IL10 유전자의 A592C, 및 T819C; IL12RB1 유전자의 T17016A, 및 C119T; IL13 유전자의 T1055C; IL13RA1 유전자의 G4763T, C15529A, C52737G, 및 T70223G; IL18의 C3549T, 및 유전자 FcERIa인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프로브 조성물 및 상기 본 발명의 프라이머 조성물을 유효성분으로 포함하는 아토피피부염 환자의 유전자 상의 유전자 돌연변이 동시 검출용 키트를 제공한다.
또 본 발명은 a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
b) 프라이머로서 상기 본 발명의 조성물을 사용하여, 상기 DNA로부터 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계; 및
c) 상기 본 발명의 올리고머 프로브가 부착되어 있는 막과, 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드형성시키는 리버스 블랏 하이브리드형성 단계;를 포함하는 아토피피부염 환자의 유전자 상의 유전자 돌연변이 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 산물은 TNF는 111bp, KDR은 140bp, FCERIa는 129bp, 인터루킨(IL) 4 C33T는 110bp, C590T는 120bp, IL5 T4597A는 140bp, IL5RA T26838A는 146bp, IL10 A592C는 125bp, T819C는 133bp, IL12 T17016A는 138bp, IL9 G4091A는 110bp, IL12 C119T는 111bp, IL9 G4091A는 110bp, IL9R T6944C는 140bp, IL10 A592C는 125bp, T819C는 133bp, IL13 T1055C는 91bp, IL13RA1 G4763T는 100bp, C15529A는 133bp, C52737G는 137bp, T70233G는 127bp, DEFB1 C2266T는 125bp, G1241T는 146bp, IL12RB1 T17016A는 138bp, C119T는 111bp, IL18 C3549T는 130bp 인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 표면에 카르복실기를 갖는 막(membrane); 및
상기 본 발명에 기재된 올리고머 프로브;를 포함하되,
상기 올리고머 프로브는 5' 말단에 아미노기가 부착되어 있으며, 상기 올리고머 프로브의 5' 말단에 부착된 아미노기와 상기 막 표면의 카르복실기가 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 올리고머 프로브가 부착된 아토피피부염 환자의 유전자 상의 유전자 돌연변이 동시 검출용 막을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 한국인 아토피피부염 환자에서 연관이 있다고 알려진 선천성 면역관련 유전자 DEFB1 (C2266T, G1241T), TNF, KDR, 사이토카인인 IL4 (C33T, C590T), IL5 (T4597A), IL5RA (T26838A), IL9 (G4091A), IL9R (T6944C), IL10 (A592C, T819C), IL12RB1 (T17016A, C119T), IL13 (T1055C), IL13RA1 (G4763T, C15529A, C52737G, T70223G), IL18 (C3549T), IgE관련 FcERIa (-66T>C) 총 21 개 돌연변이에 관여하는 유전자 부위를 검색하여 염기서열을 수집하여, 표적으로 하는 각각의 유전자들이 공통으로 가지는 염기서열 부위에서 2쌍의 primer를 디자인하였고, 2쌍의 primer 내부에 존재하는 특이 부위에서 각각의 표적 유전자 부위를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 디자인한 것이다.
본 발명의 경우에 프로브의 wild와 mutant는 모두 필요하며, 환자나 정상 대조군이 해당 유전자부분에 homo-hetero type의 구분을 확인하고 homo나 hetero에서 같이 나오는 그룹들도 있기 때문에 정상(wild)-0, 변이 (mutant)-1, 양쪽 다 있는 부분 (wild-mutant mix)-2이런식으로 정리가 되어 통계처리를 하게 된다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
PCR 증폭결과
분리한 genomic DNA를 이용하여 DEFB1 C2266T와 G1241T 에서 125bp와 146bp, TNF 111bp, KDR 140bp, FCERIa 129bp, interlukin (IL) 4 C33T 110bp, C590T 120bp, IL5 T4597A 140bp, IL5RA T26838A 146bp, IL9 G4091A 110bp, IL9R T6944C 140bp, IL10 A592C 125bp, T819C 133bp, IL12 T17016A 138bp, C119T 111bp, IL13 T1055C 91bp, IL13RA1 G4763T 100bp, C15529A 133bp, C52737G 137bpp, T70233G 127bp, IL18 C3549T 130bp의 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다(그림 2).
각 probe에 대한 변이 여부 결과
제공받은 혈액 DNA를 이용하여 제작된 각 probe의 특이도 검사를 실시하였으며 변이여부에 해당되는 검체에 대해서는 sequencing을 통하여 일치도를 확인하였다(그림 3a 내지 3g).
임상검체를 이용한 PCR - REBA의 유용성 평가
원주세브란스기독병원 피부과에서 제공받은 총 151 검체 (아토피피부염환자 69 검체, 비아토피 정상인 82 검체)를 통하여 PCR-REBA를 수행하였다 (그림 4a 및 b).
아토피피부염환자의 평균 연령은 18.6세 (SD±10.9)였으며, 정상대조군의 평균연령은 30.9세(SD±12.8)로 나타났다. 아토피피부염환자에서 면역반응관련 유전자 부위에 따른 변이 여부의 전체 결과를 보면 다음과 같다(표 1).
gene position n, (%) Total
WT WT-MT mix MT
TNF 65 (94.2) 2 (2.9) 2 (2.9) 69
KDR 53 (76.8) 16 (23.2) 69
FcERIa -66T>C 65 (94.2) 4 (5.8) 69
DEFB1 G1241T 35 (50.7) 34 (49.3) 69
C2266T 7 (10.1) 50 (72.6) 12 (20.3) 69
IL4 C33T 20 (29) 49 (71) 69
C590T 20 (29) 49 (71) 69
IL5 T4597A 16 (23.2) 37 (53.6) 16 (23.2) 69
IL5RA T26838A 27 (39.1) 42 (60.9) 69
IL9 G4091A 63 (91.3) 5 (7.2) 1 (1.5) 69
IL9RA T6944C 6 (8.7) 35 (50.7) 28 (40.6) 69
IL10 A592C 24 (34.8) 45 (65.2) 69
T819C 23 (33.3) 46 (66.7) 69
IL12RB1 T17016A 22 (31.9) 47 (68.1) 69
C119T 50 (72.5) 19 (27.5) 69
IL13 T1055C 8 (11.5) 50 (72.6) 11 (15.9) 69
IL13RA G4763T 21 (30.5) 9 (13) 39 (56.5) 69
C15529A 36 (52.2) 10 (14.5) 23 (33.3) 69
C52737G 36 (52.2) 10 (14.5) 23 (33.3) 69
T70223G 39 (56.6) 7 (10.1) 23 (33.3) 69
IL18 C3549T 48 (69.6) 21 (30.4) 　 69
표 1은 아토피피부염 환자의 면역반응관련 각 유전자 부위에 따른 변이 여부
IL4 (C33T, C590T)에서 가장 많은 변이 (71%)를 보였으며, IL13RA (G4763T)와 IL9RA (T6944C)에서 각각 56.5%와 40.6%의 유전자 변이가 나타남을 확인할 수 있었다 (표 1).
아토피피부염환자 69검체 중 각 유전자 부위에서 변이가 1에서 7까지 다양하였으며, 아토피피부염 환자에서 평균 5개 (SD±1.7)의 유전자 변이가 나타났고, 주로 IL4, IL5, IL9RA1, IL13RA 부위에서 확인되었다.
정상인 82검체에 대한 결과는 다음과 같다(표 2). IL4를 제외하고, 나머지 유전자 부위에서는 WT와 WT-MT mix이 빈도가 MT의 빈도보다 높게 나타났다.
gene position n (%) Total
WT WT-MT mix MT
TNF 68 (82.9) 10 (12.2) 4 (4.9) 82
KDR 68 (82.9) 14 (17.1) 82
FcERIa -66T>C 74 (90.2) 8 (9.8) 82
DEFB1 G1241T 34 (41.5) 48 (58.5) 82
C2266T 4 (4.9) 58 (70.7) 20 (24.4) 82
IL4 C33T 1 (1.2) 22 (26.8) 59 (72) 82
C590T 1 (1.2) 22 (26.8) 59 (72) 82
IL5 T4597A 22 (26.8) 29 (35.4) 31 (37.8) 82
IL5RA T26838A 32 (39) 50 (61) 82
IL9 G4091A 68 (82.9) 14 (17.1) 82
IL9RA T6944C 8 (9.8) 36 (43.9) 38 (46.3) 82
IL10 A592C 42 (51.2) 40 (48.8) 82
T819C 42 (51.2) 40 (48.8) 82
IL12RB1 T17016A 46 (56.1) 36 (43.9) 82
C119T 57 (69.5) 22 (26.8) 3 (3.7) 82
IL13 T1055C 7 (8.6) 53 (64.6) 22 (26.8) 82
IL13RA G4763T 30 (36.6) 16 (19.5) 36 (43.9) 82
C15529A 32 (39) 17 (20.7) 33 (40.3) 82
C52737G 32 (39) 16 (19.5) 34 (41.5) 82
T70223G 32 (39) 16 (19.5) 34 (41.5) 82
IL18 C3549T 66 (80.5) 16 (19.5) 　 82
표 2는 비아토피 정상인에서 면역반응관련 각 유전자 부위에 따른 변이 여부
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 아토피피부염을 유발하는 각 유전자에서 발생빈도가 높은 유전자부위를 선택하여 각각의 돌연변이의 여부를 한 번에 확인할 수 있었고, 본 방법을 통하여 아토피피부염 환자의 돌연변이 여부는 물론 나아가서 신생아에서 아토피피부염의 발생을 예측할 수 있도록 도움을 주는 유용한 방법이라 생각된다.
도 1은 아토피 피부염과 연관된 T 세포의 유형
도 2는 REBA Atopy-ID를 위한 PCR 증폭산물의 결과
lane 1-2 : TNF 111bp, KDR 140bp, FCERIa 129bp, interlukin (IL) 4 C33T 110bp, C590T 120bp, lane 3-4: IL5 T4597A 140bp, IL5RA T26838A 146bp, lane 5-6, IL10 A592C 125bp, T819C 133bp, IL12RB1 T17016A 138bp, lane 7-8: IL9 G4091A 110bp, IL12RB1 C119T 111bp, lane 9-10: IL9 G4091A 110bp, T6944C 140bp, IL10 A592C 125bp, T819C 133bp, lane 11-12: IL13 T1055C 91bp, IL13RA G4763T 100bp, C15529A 133bp, C52737G 137bp, T70233G 127bp, lane 13-14: DEFB1 C2266T 125bp, G1241T 146bp, IL12RB1 T17016A 138bp, C119T 111bp, lane 15-16: IL18 C3549T 130bp, DEFB1 C2266T와 G1241T 125bp와 146bp, TNF 111bp, KDR 140bp, FCERIa 129bp
도 3은 제작된 probe의 특이도 검증을 위한 sequencing 결과
도 4는 아토피피부염 환자의 임상검체 REBA Atopy-ID 결과
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 재료 및 genomic DNA 추출
연세대학교 원주의과대학 원주세브란기독병원 피부과에서 의뢰된 혈액 78 검체와 중앙대학교병원 피부과에서 제공받은 17 검체를 대상으로 실시하였다. 제공된 혈액은 QIAamp Blood kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 사용설명서에 따라 핵산을 분리하였다. 분리된 핵산은 REBA Atopy screening을 수행하기 위한 PCR의 주형으로 사용되었다.
실시예 2. REBA Atopy -ID의 유전자 수집 및 분석
미국 국립생물정보센터 (National center for biotechnology information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Genbank 에서 표적으로 하는 PCR primer와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 아토피피부염의 정확한 돌연변이 유무를 위해 한국인 아토피피부염 환자에서 연관이 있다고 알려진 면역반응 관련 유전자부위를 선택하여 제작하였다. 즉, 선천성 면역관련 유전자 DEFB1 (C2266T, G1241T), TNF, KDR, 사이토카인관련 IL4 (C33T, C590T), IL5 (T4597A), IL5RA (T26838A), IL9 (G4091A), IL9R (T6944C), IL10 (A592C, T819C), IL12RB1 (T17016A, C119T), IL13 (T1055C), IL13RA1 (G4763T, C15529A, C52737G, T70223G), IL18 (C3549T), IgE관련 FcERIa (-66T>C) 총 21 개 돌연변이에 관여하는 유전자 부위를 검색하여 염기서열을 수집하였다(표 1). 멀티얼라인 (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin)을 수행한 후 표적으로 하는 각각의 유전자들이 공통으로 가지는 염기서열 부위에서 2쌍의 primer를 디자인하였고, 그 중 reverse primer에는 PCR-REBA법을 위해 biotin을 5‘말단에 붙였다. 그리고 2쌍의 primer 내부에 존재하는 특이 부위에서 각각의 표적 유전자 부위를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 디자인하였고 각 올리고뉴클레오타이드 프로브에는 얇은 막과 펩타이드 결합을 할 수 있도록 하기 위해 5’말단에 amine기를 붙였다. 디자인한 primer와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 바이오니아(대전, 한국)에 합성을 의뢰하였다.
피부 장벽 (Skin barrier) 면역 반응 (Immune response)
　유전자 　유전자부위 유전자 유전자부위
KLK 7 DEFB1 (2) C2266T
Spink5 (11) A210G G1241T
G316A TNF
A603T KDR
A800G FcεRIa
A1103G Interleukin (IL) 4 (2) C590T
A1156G C33T
C1188T IL 5 T4597A
G1258A IL-5RA T26838A
T1851C IL9 G4091A
A2015C IL9R T6944C
G2475T IL10 (2) A592C
Filaggrin (2) 3321delA T819C
　 K4022X IL12RB1 (2) T17016A
C119T
IL13 T1055C
IL13RA1 (4) G4763T
C15529A
C52737G
T70223G
IL18 C3549T
Total 14 21
표 3은 REBA Atopy - ID로 검사가 가능한 유전자 부위
Gene (SNP) Position Probe Sequence (5'-3') 서열번호
DEFB1 C2266T WT GAGACGGAGTGCGGTTTTGTC 1
rs5743399 C2266T MT (C→T) GAGACGGAGTGTGGTTTTGTCAC 2
DEFB1 G1241T WT ATCTCTGTTTCTCTGTGTCTCTCTACTGTC 3
rs5743409 MT (G→T) ATCTCTGTTTCTCTTTGTCTCTCTACTGTC 4
IL4 C590T WT GAGAACATTGTCCCCCAGTGCT 5
rs2243250 MT (C→T) GAGAACATTGTTCCCCAGTGCTG 6
IL9 G4091A WT AAACTGATGTGACGGGAGGGTAGT 7
rs31563 MT (G→A) GAAACTGATGTGACAGGAGGGTAGTAAT 8
IL9R T6944C WT AACCCATCCCTACCCCTGTCAG 9
rs3093467 MT (T→C) CCATCCCCACCCCTGTCAG 10
IL10 A592C WT AACCGCCTGTACTGTAGGAAGCC 11
rs1800872 MT (A→C) ACCGCCTGTCCTGTAGGAAGC 12
IL13 T1055C WT TCAGTTGAACTGTCCCTCGCG 13
rs20541 MT (T→C) TCAGTTGAACCGTCCCTCGC 14
IL13RA1 G4763T WT GTGGAAGAAGTTTTGTTCGGTCAGA 15
rs 6603441 MT (G→T) GTGGAAGAAGTTTTTTTCGGTCAGAG 16
IL13RA1 C15529A WT GCAATAGGAATTCTTTGTTTCCACAAG 17
rs2247035 MT (C→A) TGCAATAGGAATTATTTGTTTCCACAAG 18
IL13RA1 C52737G WT TTGGCCAACCACATCACGC 19
rs 2265753 MT (C→G) TTGGCCAACCAGATCACGCA 20
IL13RA1 T70223G WT CCTTTCAAAGCCATTTTAGGCTGTT 21
rs2254672 MT (T→G) CTTTCAAAGCCATTGTAGGCTGTTAG 22
IL18 C3549T WT AGCTGGGAGTTACGGGATGAAAGAT 23
rs795467 MT (C→T) AGCTGGGAGTTATGGGATGAAAGAT 24
TNF G308A WT TTTTGAGGGGCATGGGGAC 25
rs1800629 MT (G→A) TTTTGAGGGGCATGAGGACG 26
KDR 17205G>A WT AACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGA 27
rs2305948 MT (G→A) AACTATAGATGGTATAACCCGGAGTGAC 28
FCERIa -66T>C WT GGGTTAACCAGATATGATACAGAAAACATT 29
rs2251746 MT (T→C) GGTTAACCAGATATGACACAGAAAACATTT 30
IL4 C33T WT TAAACTAATTGCCTCACATTGTCACTGC 31
rs2070874 MT (C→T) ATAAACTAATTGTCTCACATTGTCACTGCA 32
IL5 T4597A WT ATTTATTTATTTATTTGAAATGGAATCTCGCT 33
rs 2522411 MT (T→A) ATTTATTTAATTATTTGAAATGGAATCTCGCT 34
IL5RA T26838A WT CCAACATCTAGCTCTATGTTATAAGCTAGAGATG 35
rs 334809 MT (T→A) CCAACATCTAGCTCTATGTTATAAGCTAGAGATG 36
IL10 T819C WT TGTACAGGTGATGTAATATCTCTGTGCCT 37
rs 1800871 MT (T→C) TTGTACAGGTGATGTAACATCTCTGTGC 38
IL12RB1 T17016A WT CTTTTTTTTCAGTCTTTTCTCCTTGCTCA 39
rs 393548 MT (A→T) CTTTTTTTTCTGTCTTTTCTCCTTGCTCAG 40
IL12RB1 C119T WT TCTACGTGGATCCGATGGAGCC 41
rs 436857 　 MT (C→T) TACGTGGATCTGATGGAGCCG 42
표 4는 사용된 probe 염기서열
Gene (SNP) Position Sequence (5'-3') 서열번호 PCR product (bp)
TNF 477-F ACCACAGACCTGGTCCCCAAA 43 111bp
588-R* GGTCTTCTGGGCCACTGACTGAT 44
KDR 17118-F CAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACC 45 140bp
17258-R* AATGTGCTGTTCTTCTTGGTCATCAG 46
FCERIa -66T>C TGGGCACCATCCTGAATATTATCTCT 47 129bp
1250-R* TGCTGGAGAGATCTAAGGCTTCAAA 48
C33T-F GAGATATCTTTGTCAGCATTGCATCGT 49 110bp
rs2070874 C33T-R* GAAGCAGTTGGGAGGTGAGACCC 50
IL4 C590T-F ACCCAAACTAGGCCTCACCTGATAC 51 120bp
rs2243250 C590T-R GCATAGAGGCAGAATAACAGGCAGA 52
IL5 414-F CAGCCTCCTGAGCAAAGCCTT 53 140bp
rs 2522411 554R* TAGCGCCACTGCACTCTAGCCT 54
IL5RA 26784-F TCAGGACATCTAGGTTTTTAGCTACGG 55 146bp
rs 334809 26910-R* CAATGCTGCACTCTAAGCAGTCTCTG 56
IL10 4153-F AGGAAACCAAATTCTCAGTTGGCA 57 133bp
rs 1800871 4271-R* AGGTAGTGCTCACCATGACCCCT 58
IL10 A592C-F TGGAAACATGTGCCTGAGAATCCT 59 125bp
rs1800872 A592C-R CCAAGCAGCCCTTCCATTTTACT 60
IL12RB1 16956-F ACTTTGACTTGCCTTAGGGATGGG 61 138bp
rs 393548 17064-R1* GTCCCCACTCCGGAACACATTG 62
IL12RB1 17168-F GCAGGTGGCAGAGAGGCTCC 63 111bp
rs 436857 17279-R* GCCTGGACAGCAGGAAGAGGA 64
IL13 T1055C-F TCAATAGTCAGGTCCTGTCTCTGCAA 65 91bp
rs20541 T1055C-R AGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGAC 66
IL13RA1 4721-F AGGCAGCGCCCGGAGTG 67 100bp
rs 6603441 4821-R CTCCCAAGGCTGGACACCTG 68
IL13RA1 15516-F GGTGCTCCCTGGTACTAGCTCAGTTT 69 133bp
rs2247035 15649-R TCATTCCCTCTTCTAACTCTACCTTTTCC 70
IL13RA1 52665-F TTGGTTTGTTTGGCTGGAGTGG 71 137bp
rs 2265753 52801-R CTCTCCAATGCTCCTCATCATGCT 72
IL13RA1 70148-F GAAATCAGTGTTGGCCATGATGAC 73 127bp
rs2254672 70275-R GAAACTCTAATACCCAAGGAGTCATTCTACC 74
DEFB1 C2266T-F GGCTTCCAGGTCACAGGTATGTG 75 125bp
rs5743399 C2266T-R* TTGGTTGTAGTGAGCCGAGATCG 76
DEFB1 G1241T-F CTGTCTCCTTCTTTCTGTCTCTCTGAATC 77 146bp
rs5743409 G1241T-R* AGACAGAGGAAGAGACAGAGACATGCA 78
IL18 C3549T-F CCAGGCCAGAACTTCCCCTTC 79 130bp
rs795467 C3549T-R TTAGCTAGGAATGAAAGAGCAGAGAAG 80 　
표 5는 사용된 primer 염기서열
실시예 3. Multiplex PCR
혈액검체에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 상용화된 Prime Taq Premix (2X) (Genet Bio, 논산, 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. Prime Taq Premix (2X)의 조성은 primer Taq polymerase 1unit/10㎕, 2X reaction buffer, 4mM MgCl2, enzyme stabilizer, sedment, loading dye, pH 9.0, 0.5mM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP이다. PCR을 위한 각 조성은 Prime Taq premix (2X) 10㎕, 한 쌍의 10 pmole primer를 각각 1㎕, ultrapure water 3㎕, 각 균주의 genomic DNA 5㎕로 총량을 20㎕로 하였다. PCR 반응은 초기 변성과정을 위해 95℃ 5분, 일차 증폭을 위해 95℃ 30초, 60℃ 30초 반응을 10번 반복, 2차 증폭을 위해 95℃ 30초, 54℃ 30초 반응을 40번 반복 후 완전한 신장반응을 위해 72℃ 10분간 반응시켰다. PCR 반응이 완료된 PCR 산물은 2% TBE (Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) agarose gene (W/V ratio)에서 100 bolt로 20분간 전기영동하여 ethidium bromide에 10분간 염색 후 자외선 투과조명기로 100-200bp 사이의 PCR 산물의 증폭여부를 확인하였다.
실시예 4. REBA Atopy -ID의 수행
증폭한 PCR 산물을 이용한 REBA Atopy-ID는 제조자가 제시한 실험조건을 이용하여 시행하였으며 실험방법은 다음과 같다. PCR 산물에 동량의 Denaturation solution (0.2N NaOH, 0.2mM EDTA)을 섞어 실온에 5분간 반응시켜 이중가닥의 PCR 반응산물을 단일가닥으로 변성하였다. 반응하는 동안 각각의 42 유전자 특이 올리고뉴클레오타이드 프로브 (wild-mutant 타입)가 부착된 얇은막 REBA Atopy-ID membrane(M&D, Korea)에 2X SSPE/0.1% SDS으로 희석시켜 minitray에 넣은 후 55℃ 에서 30분간 반응시키고, WS (washing solution)을 이용하여 62℃에서 10분간 두 번 씻어준 후 1:2000 (v/v)으로 희석한 alkaline phosphatase-labeled streptavidin conjugate (Roche, Mannheim, Germany)을 처리하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 Strip을 CDS (Conjugate Dilution Solution)로 실온에 1분간 2회 세척하고, alkaline phosphatase에 반응하는 발색용 기질 용액인 NBT/BCIP (Roche, Germany)에 10분간 감광시킨후 검출 여부를 판단하였다.
<110> YONSEI UNIVERSITY WONJU INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Primers and probes for detecting mutations in the Korean patients with atopic dermatitis simultaneously and their application methods <130> P16-0235 <160> 80 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 1 gagacggagt gcggttttgt c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 2 gagacggagt gtggttttgt cac 23 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 atctctgttt ctctgtgtct ctctactgtc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 atctctgttt ctctttgtct ctctactgtc 30 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 gagaacattg tcccccagtg ct 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 gagaacattg ttccccagtg ctg 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 aaactgatgt gacgggaggg tagt 24 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 gaaactgatg tgacaggagg gtagtaat 28 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 aacccatccc tacccctgtc ag 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 10 ccatccccac ccctgtcag 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 11 aaccgcctgt actgtaggaa gcc 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 accgcctgtc ctgtaggaag c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 13 tcagttgaac tgtccctcgc g 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 14 tcagttgaac cgtccctcgc 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 gtggaagaag ttttgttcgg tcaga 25 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 gtggaagaag 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ttttgagggg catggggac 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 ttttgagggg catgaggacg 20 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 aactatagat ggtgtaaccc ggagtga 27 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 28 aactatagat ggtataaccc ggagtgac 28 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 29 gggttaacca gatatgatac agaaaacatt 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 30 ggttaaccag atatgacaca gaaaacattt 30 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 taaactaatt gcctcacatt gtcactgc 28 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 32 ataaactaat tgtctcacat tgtcactgca 30 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 atttatttat ttatttgaaa tggaatctcg ct 32 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 34 atttatttaa ttatttgaaa tggaatctcg ct 32 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 35 ccaacatcta gctctatgtt ataagctaga gatg 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 36 ccaacatcta gctctatgtt ataagctaga gatg 34 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 37 tgtacaggtg atgtaatatc tctgtgcct 29 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 38 ttgtacaggt gatgtaacat ctctgtgc 28 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 39 cttttttttc agtcttttct ccttgctca 29 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 40 cttttttttc tgtcttttct ccttgctcag 30 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 41 tctacgtgga tccgatggag cc 22 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 42 tacgtggatc tgatggagcc g 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 accacagacc tggtccccaa a 21 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ggtcttctgg gccactgact gat 23 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cagcataaga aacttgtaaa ccgagacc 28 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 aatgtgctgt tcttcttggt catcag 26 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 tgggcaccat cctgaatatt atctct 26 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tgctggagag atctaaggct tcaaa 25 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gagatatctt tgtcagcatt gcatcgt 27 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gaagcagttg ggaggtgaga ccc 23 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 acccaaacta ggcctcacct 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cttccatttt act 23 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 actttgactt gccttaggga tggg 24 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gtccccactc cggaacacat tg 22 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gcaggtggca gagaggctcc 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gcctggacag caggaagagg a 21 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 tcaatagtca ggtcctgtct ctgcaa 26 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aggtggccca gtttgtaaag gac 23 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 aggcagcgcc cggagtg 17 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ctcccaaggc tggacacctg 20 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 ggtgctccct ggtactagct 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78 agacagagga agagacagag acatgca 27 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ccaggccaga acttcccctt c 21 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 ttagctagga atgaaagagc agagaag 27

Claims (15)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 42에 기재된 서열로 이루어진 프로브 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아토피피부염의 돌연변이 유무를 동시에 검출하기 위한 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 서열번호 43 내지 서열번호 80에 기재된 서열로 이루어진 프라이머 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 아토피피부염의 돌연변이 유무를 동시에 검출하기 위한 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항의 프로브 조성물 및 제3항의 프라이머 조성물을 유효성분으로 포함하는 아토피피부염 환자의 유전자 상의 돌연변이 동시 검출용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 환자는 한국인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유전자 돌연변이는 DEFB1 유전자 C2266T, 및 G1241T 부위; TNF; KDR; IL4 유전자의 C33T, 및 C590T 부위; IL5의 T4597A; IL5RA의 T26838A; IL9의 G4091A;, IL9R의 T6944C; IL10의 A592C, 및 T819C; IL12RB1의 T17016A, 및 C119T; IL13의 T1055C; IL13RA1의 G4763T, C15529A, C52737G, 및 T70223G; IL18의 C3549T, 및 FcERIa인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 프로브 조성물 및 제3항의 프라이머 조성물을 유효성분으로 포함하는 아토피피부염 환자의 유전자 상의 돌연변이 동시 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자 돌연변이는 DEFB1 유전자 C2266T, 및 G1241T 부위; TNF; KDR; IL4 유전자의 C33T, 및 C590T 부위; IL5의 T4597A; IL5RA의 T26838A; IL9의 G4091A;, IL9R의 T6944C; IL10의 A592C, 및 T819C; IL12RB1의 T17016A, 및 C119T; IL13의 T1055C; IL13RA1의 G4763T, C15529A, C52737G, 및 T70223G; IL18의 C3549T, 및 FcERIa인 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제8항에 있어서, 상기 환자는 한국인인 것을 특징으로 하는 키트.
  11. a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    b) 프라이머로서 제3항의 조성물을 사용하여, 상기 DNA로부터 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계; 및
    c) 제1항의 조성물의 올리고머 프로브가 부착되어 있는 막과, 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드형성시키는 리버스 블랏 하이브리드형성 단계;를 포함하는 아토피피부염 환자의 유전자 상의 유전자 돌연변이 동시 검출 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 유전자 돌연변이는 DEFB1 유전자 C2266T, 및 G1241T 부위; TNF; KDR; IL4 유전자의 C33T, 및 C590T 부위; IL5의 T4597A; IL5RA의 T26838A; IL9의 G4091A;, IL9R의 T6944C; IL10의 A592C, 및 T819C; IL12RB1의 T17016A, 및 C119T; IL13의 T1055C; IL13RA1의 G4763T, C15529A, C52737G, 및 T70223G; IL18의 C3549T, 및 FcERIa인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 환자는 한국인인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 증폭 산물은 TNF는 111bp, KDR은 140bp, FCERIa는 129bp, 인터루킨(IL) 4 C33T는 110bp, C590T는 120bp, IL5 T4597A는 140bp, T26838A는 146bp, IL10 A592C는 125bp, T819C는 133bp, IL12 T17016A는 138bp, IL9 G4091A는 110bp, IL12 C119T는 111bp, IL9 G4091A는 110bp, IL9R T6944C는 140bp, IL10 A592C는 125bp, T819C는 133bp, IL13 T1055C는 91bp, IL13RA1의 G4763T는 100bp, C15529A는 133bp, C52737G는 137bp, T70233G는 127bp, DEFB1 C2266T는 125bp, G1241T는 146bp, IL12 T17016A는 138bp, C119T는 111bp, IL18 C3549T는 130bp인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 표면에 카르복실기를 갖는 막(membrane); 및
    제1항에 기재된 올리고머 프로브;를 포함하되,
    상기 올리고머 프로브는 5' 말단에 아미노기가 부착되어 있으며, 상기 올리고머 프로브의 5' 말단에 부착된 아미노기와 상기 막 표면의 카르복실기가 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 올리고머 프로브가 부착된 아토피피부염 환자의 유전자 상의 유전자 돌연변이 동시 검출용 막.
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