KR20170125447A - 저온 플라즈마 분사 장치를 이용한 암세포의 선택적 세포사멸 방법 및 이를 이용한 종양 치료 방법 - Google Patents
저온 플라즈마 분사 장치를 이용한 암세포의 선택적 세포사멸 방법 및 이를 이용한 종양 치료 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 저온 플라즈마 분사 장치를 이용한 암세포의 선택적 세포사멸 방법 및 이를 이용한 종양 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 암세포에 ATR과 PARP1 억제제를 동시에 처리한 후, 일주기성리드의 동기화를 수행한 다음 저온 상압 플라즈마 처리 시, 종래 저온 상압 플라즈마만 처리한 경우에 대비하여 약 10배 이상 암세포 사멸을 극대화 시킬 수 있으므로, 향후 종양 치료 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 저온 플라즈마 분사 장치를 이용한 암세포의 선택적 세포사멸 방법 및 이를 이용한 종양 치료 방법에 관한 것이다.
전기적인 방전으로 인해 생성되는 전하를 띄는 양이온과 전자들의 집단인 플라즈마는 차세대 에너지원으로 주목받아 여러 산업의 다양한 분야에 응용되고 있다. 그 예로 수은등, 형광등, 네온사인, 반도체 공정, PDP, 초고온 핵융합 등에 이용되고 있고, 최근에는 의생명분야에 적용시키기 위한 연구가 진행되고 있다.
플라즈마는 넓은 영역에서 균일한 밀도로 만들기 위해 기존에는 압력을 낮춘 진공 챔버 내에서 발생시켰으나 근래에는 전극의 간격을 줄임으로써 상압(atmospheric pressure) 정도의 비교적 높은 압력에서도 방전을 일으킬 수 있어 기존의 저압 방전과는 달리 진공 챔버 및 이에 따른 펌프 장치가 필요하지 않기 때문에 플라즈마 발생에 필요한 비용이 적으며 일상적인 기체압력 범위에서 사용할 수 있으므로 그 응용성이 매우 높고 유기물 가공 및 생체에도 응용 가능하다는 장점이 있다.
특히, 이러한 상압 플라즈마를 이용한 바이오-메디컬(Bio-medical) 응용 분야에 대한 연구가 진행되기 시작하면서 비평형 상태의 플라즈마가 사람 세포 또는 조직에 미치는 영향에 대한 관심이 높아지고 있다. 그러나 플라즈마가 화상 등으로 생긴 피부손상 치유 나 암세포와 같은 악성 세포의 제거 및 사멸, 미용을 위한 피부개선, 뼈나 치아의 법랑질(Enamel) 성분 회복 등에 영향을 미친다고 알려져 있지만 어떠한 메커니즘을 통해 손상된 세포의 회복, 암세포의 사멸을 유도하는지 연구된 바가 없다. 단지 최근 들어 바이오-메디컬 응용을 위한 상압 저온 마이크로 플라즈마 분사장치를 개발하거나, 대기압 플라즈마를 이용하여 미생물이 오염된 대상을 살균 하는 방법이 고안되었다.
또한 플라즈마는 고온 플라즈마와 저온 플라즈마로 나눌 수 있는데 고온 플라즈마의 경우에는 의학적으로 이용할 경우 세포에 열 손상을 가하기 때문에 저온 플라즈마인 글로우 방전(glow discharge)을 사용한다.
이와 같은 저온 플라즈마 장치의 개발은 세포나 조직에 열적인 손상을 주지 않는 장점을 가지고 있어, 많은 연구진들이 이 장치를 이용하여 암을 치료하는 연구에 적용하고자 시도하고 있다.
최근 백혈병, 악성 흑색종, 방광암과 같은 암세포에서 플라즈마를 조사했을 때, 암세포의 사멸(세포자살, 세포괴사)이 증가한다는 사실이 보고되고 있고, 저온 상압 플라즈마는 플라즈마의 다양한 활성종이 암세포의 괴사나 세포자살 등을 유도하여 세포를 사멸시킬 수 있으나, 암세포의 사멸되는 효과가 크지 않아 암세포의 사멸 효과를 증가시킬 방안이 요구되고 있다.
Murakami T., et. al., Chemical kinetics and reactive species in atmospheric pressure helium-oxygen plasmas with humid-air impurities. Plasma sources science & technology. 2013, 22, 1-29.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 암세포의 사멸을 증진시킬 수 있는 저온 플라즈마 분사 장치를 이용한 암세포의 선택적 세포사멸 방법 및 이를 이용한 종양 치료 방법을 제공하는 것이다.
1. 암세포에 키나아제 억제제를 처리하는 제1 단계;
정상세포의 일주기리듬(circadian rhythm)의 동기화를 수행하는 제2 단계; 및
상기 단계 1의 암세포 및 단계 2의 정상세포 배양 시 교류 전원을 이용한 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 제어하는 제3 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 ATR 억제제, PARP-1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 5 내지 10 μM 처리하는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 제2 단계의 일주기리듬의 동기화는 17 내지 22 ZT(자이트게버) 주기에서 수행되는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 제2 단계의 일주기리듬의 동기화는 유전적으로 동기화 결함이 있는, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포 및 마우스 흑색종 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포와 일주기리듬의 동기화를 수행하는 것인 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
6. 위 1에 있어서, 제3 단계의 상기 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 400 내지 600 SCCM의 헬륨 가스 플로우, 3 내지 6 SCCM의 산소 가스 플로우, 1 내지 2 kV의 인가전압, 40 내지 60 kHz 및 8 내지 12% 듀티비인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
7. 위 1에 있어서, 상기 저온 상압 플라즈마 발생장치의 플라즈마 발생원으로부터 암세포까지의 거리를 5 내지 7 cm로 세팅하는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
8. 위 1에 있어서, 상기 암세포는 저온 상압 플라즈마에 15 내지 25초로 노출시키는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
9. 위 1에 있어서, 암세포는 피부암(skin caner), 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐선암(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포성암(hepatocellular cancer), 위암(gastric or stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
10. 인간을 제외한 동물에 키나아제 억제제를 투여하고, 정상세포의 일주기리듬의 동기화를 수행하는 제1 단계; 및
상기 제1 단계 수행 후, 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마를 처리하는 제2 단계를 포함하는, 종양 치료방법.
11. 위 10에 있어서, 상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 ATR 억제제 및 PARP-1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 종양 치료방법.
12. 위 10에 있어서, 제2 단계의 상기 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 400 내지 600 SCCM의 헬륨 가스 플로우, 3 내지 6 SCCM의 산소 가스 플로우, 1 내지 2 kV의 인가전압, 40 내지 60 kHz 및 8 내지 12% 듀티비인, 종양 치료방법.
13. 위 10에 있어서, 상기 저온 상압 플라즈마 발생장치의 플라즈마 발생원으로부터 동물까지의 거리를 5 내지 7 cm로 세팅하는 것인, 종양 치료방법.
14. 위 10에 있어서, 상기 동물은 저온 상압 플라즈마에 5일 내지 7일 동안 24시간 간격으로 1회, 매회 20초 내지 30초로 노출시키는 것인, 종양 치료방법.
15. 위 10에 있어서, 종양은 피부암(skin caner), 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐선암(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포성암(hepatocellular cancer), 위암(gastric or stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 종양 치료방법.
본 발명에 따라, 암세포에 ATR과 PARP1 억제제를 동시에 처리한 후, 생물학적 주기를 동기화한 다음 저온 상압 플라즈마 처리 시, 종래 저온 상압 플라즈마만 처리한 경우에 대비하여 매우 우수한 수율로 암세포 사멸을 극대화 시킬 수 있으므로, 향후 종양 치료 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 암 세포에 NTP를 처리하는 동안 산소 가스의 첨가에 따른 세포사멸의 증진 효과를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 NTP 및 NTPO induce genomic DNA lesions and breaks를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 Activation of the ATR-CHK1 pathway in response to NTP-induced DNA damage response를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 Reinforced DNA breaks in plasma treatment with a PARP inhibitor.를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 Inhibition of PARP1 augments apoptosis during NTP and NTPO treatment를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 Circadian oscillation of PARP1 activity in normal fibroblasts를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 PARP1 activity dictates circadian toxicity of NTP and NTPO in normal cells를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 NTP 및 NTPO induce genomic DNA lesions and breaks를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 Activation of the ATR-CHK1 pathway in response to NTP-induced DNA damage response를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 Reinforced DNA breaks in plasma treatment with a PARP inhibitor.를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 Inhibition of PARP1 augments apoptosis during NTP and NTPO treatment를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 Circadian oscillation of PARP1 activity in normal fibroblasts를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 PARP1 activity dictates circadian toxicity of NTP and NTPO in normal cells를 나타내는 도면이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 암세포의 선택적 세포사멸 방법을 제공한다:
암세포에 키나아제 억제제를 처리하는 제1 단계;
정상세포의 일주기리듬(circadian rhythm)의 동기화를 수행하는 제2 단계; 및
상기 단계 1의 암세포 및 단계 2의 정상세포 배양 시 교류 전원을 이용한 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 제어하는 제3 단계.
본 발명의 암세포의 선택적 세포사멸 방법에 따르면, 종래 이중 가닥 DNA 절단뿐만 아니라, 높은 돌연 변이율을 효율적으로 발생시켜 주로 유도되는 방사선 치료뿐만 아니라, 종래 저온 상압 플라즈마만을 처리한 암세포 사멸 효과가 약 6배 가량 증가함을 실험예들을 통해 입증되었다.
본 발명의 상기 암세포에 키나아제 억제제를 처리하는 제1 단계를 수행함에 있어서, 상기 키나아제 억제제는 ATR 억제제 및 PARP-1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
바람직한 예로는 ATR 억제제 및 PARP-1 억제제를 병용투여할 수 있다.
본 발명에 따른 암세포의 선택적 세포사멸 방법에서, ATR 및 PARP-1 경로를 타겟으로 하는, ATR 억제제 및 PARP-1 억제제를 함께 투여함에 따라, ATR이 매개된 세포 주기 체크 포인트 및 PARP-1 의존성 DNA 회복을 유도 할 수 있다.
이러한 상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 5 내지 10 μM 처리할 수 있다.
또한 본 발명의 정상세포의 일주기리듬(circadian rhythm)의 동기화를 수행하는 제2 단계를 수행함에 있어서, 상기 일주기리듬의 동기화는 17 내지 22 ZT(자이트게버) 주기에서 수행할 수 있고, 상기 일주기리듬의 동기화는 유전적으로 동기화 결함이 있는 마우스 배아 섬유아세포(Cry1/2 knockout, Per1/2 knockout), 인간 섬유아세포, 마우스 흑색종 세포 등과 일주기리듬을 동기화하는 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
한편, 생물학적 주기성 타이밍(일주기리듬) 시스템은 세포주기, DNA 회복 및 세포 사멸을 포함한 거의 모든 세포 생리학에서 24 시간 변화를 유도하는 분자 시계로 구성된다. 종래 이러한 생물학적 주기성 타이밍 시스템을 치료에 적용하는, 시간-치료학은 생체 리듬에 따른 치료 관리를 통한 약물의 내성 및/또는 효율을 개선시키는 것을 목적으로 하고 있다. 그러나 이러한 누적 데이터에도 불구하고, 암 치료의 타이밍, 효능 및 관련 부작용 모두에 영향을 미칠 수 있는 임상 실험에서 일반적으로 사용되는 변수가 없다는 문제점이 있다.
그러나 본 발명에서는 일주기리듬의 동기화 전에 PARP-1 억제제를 투여하여 주기성 활성을 NTPO로 유도시켜 DNA 손상 응답에 따른 세포 생존율을 크게 낮추는 효과를 확인한 바 있다.
한편, 상기 일주기리듬의 동기화 수행 전에, 암세포를 siRNA 이중 가닥으로 트랜스펙션하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 상기 암세포의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥을 형성하는 완전한 형태로서, 인 비트로(in vitro)에서 siRNA를 직접 합성한 뒤 트랜스펙션(transfection)을 통해 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR-유도 siRNA 발현 카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수 있다.
siRNA를 제조하는 방법으로, 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99:5515-5520, 2002), 인 비트로(in vitro) 전사를 이용하여 합성하는 방법 (Brummelkamp TR et al., Science, 296:550-553, 2002), 인 비트로 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 RNaseIII 패밀리 효소를 이용하여 절단하는 방법(Paul CP et al., Nature Biotechnology, 20:505-508, 2002) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 "저온 상압 (대기압) 플라즈마"는 열적 변화 없이 대상 물체에 대한 화학적 반응성은 크면서 비교적 에너지가 안정하고 반응하는 물질의 표면에서만 작용하기 때문에 상호 작용하는 물질의 상태를 변화시키거나, 손상시키지 않는 장점을 가지고 있다.
본 발명의 암세포의 선택적 세포사멸 방법에 사용된 저온 상압 플라즈마 발생 장치의 노출 조건은 400 내지 600 SCCM의 헬륨 가스 플로우, 3 내지 6 SCCM의 산소 가스 플로우, 1 내지 2 kV의 인가전압, 40 내지 60 kHz 및 8 내지 12% 듀티비일 수 있다.
또한 상기 저온 상압 플라즈마 발생장치의 플라즈마 발생원으로부터 암세포까지의 거리를 5 내지 7 cm로 세팅하는 것일 수 있다.
플라즈마 노출 조건은 배양 세포로의 플라즈마 노출 횟수 및 시간을 의미하고, 또한 상기 암세포는 저온 상압 플라즈마에 5일 내지 7일 동안 24시간 간격으로 1회, 매회 20초 또는 30초로 노출시킬 수 있다.
종합적으로 살펴보면, 본 발명에 따라 일주기리듬의 동기화를 수행하고, 저온 상압 플라즈마를 처리하면서 산소를 공급함에 따라, 일주기리듬의 동기화를 수행하지 않은 경우와 대비하여 약 2.5배 가량 우수한 것으로 확인됨에 따라 암세포 사멸을 극대화 시킬 수 있어, 암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시험관내 암세포의 선택적 세포 사멸 방법 수행 시, 저온 상압 플라즈마 발생장치를 이용함에 따라 암세포는 피부와 유방암과 같은 피상적 암에 쉽게 적용할 수 있고, 뿐만 아니라, 내부에서 발생하는 암을 포함하여 거의 모든 종류의 암의 치료에 적용할 수 있다.
상기 암세포는 예를 들어, 피부암(skin caner), 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐선암(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포성암(hepatocellular cancer), 위암(gastric or stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 암세포의 선택적 세포사멸 방법에 따르면, 종래 이중 가닥 DNA 절단뿐만 아니라, 높은 돌연 변이율을 효율적으로 발생시켜 주로 유도되는 방사선 치료뿐만 아니라, 종래 저온 상압 플라즈마만을 처리한 암세포 사멸 효과가 약 6배 가량 증가함을 실험예들을 통해 입증됨에 따라, 본 발명은 인간을 제외한 동물에 키나아제 억제제를 투여하고, siRNA 이중 가닥으로 트랜스펙션한 후, 일주기리듬의 동기화를 수행하는 제1 단계; 및 상기 제1 단계 수행 후, 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마를 처리하는 제2 단계를 포함하는, 종양 치료방법에 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 ATR 억제제 및 PARP-1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 ATR 억제제와 PARP-1 억제제를 동시에 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 단계의 상기 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 400 내지 600 SCCM의 헬륨 가스 플로우, 3 내지 6 SCCM의 산소 가스 플로우, 1 내지 2 kV의 인가전압, 40 내지 60 kHz 및 8 내지 12% 듀티비일 수 있다.
상기 저온 상압 플라즈마 발생장치의 플라즈마 발생원으로부터 동물까지의 거리를 5 내지 7 cm로 세팅하는 것이 바람직하다.
또한 상기 동물은 저온 상압 플라즈마에 5일 내지 7일 동안 24시간 간격으로 1회, 매회 20초 내지 30초로 노출 시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 종양은 피부암(skin caner), 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐선암(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포성암(hepatocellular cancer), 위암(gastric or stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
실시예 1
(1) 단계 1: 플라즈마 처리
종래 보고된 플라즈마 제트 장치를 사용하여 세포에 처리하였다. 펄스 직류 플라즈마 제트의 일반적인 구동 조건은 인가 전압 1.6 kV, 반복 주파수 50 kHz, 및 듀티비(duty ratio)는 10%를 포함한다. 동작 가스(헬륨) 및 반응 기체(산소) 유량은 각각 500 및 5 SCCM(SCCM은 표준 온도와 압력에서 분당 입방 센티미터를 의미한다). 상기 세포를 돼지 피부(porcine skin, Sigma-Aldrich)의 젤라틴으로 코팅된 12 mm의 현미경 커버 글라스 상에 배양하고, NTP가 발생되거나 산소 기체가 흐르지 않는 헬륨으로 처리하였다. 노출된 커버 글라스는 새로운 배지를 포함하는 12-웰 플레이트로 옮기고, 5% CO2를 공급한 습윤 인큐베이터에서 배양하였다. 필요에 따라, 상기 세포는 플라즈마를 처리하기 1시간 전에 ATR(VE821 또는 VE822 또는 ETP46464), ATM(KU55933), DNA-PK(NU7026), 또는 PARP-1(AZD2281)에 선택적인 억제제를 5 또는 10 μM로 처리하고, 세포를 수확할 때까지 유지한다. 상기 억제제는 Selleck Chemicals에서 구입하였다.
(2) 단계 2: 세포 배양, siRNA 트랜스펙션, 및 일주기리듬의 동기화
야생형 마우스 배아 섬유아세포(WT-MEF)와 CRY1 및 CRY2 2중 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포(CRYDKO MEF, a gift from Dr. KJ Kim, Seoul National University)를 10% 소 태아 혈청(Hyclone 社)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone 社)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Hyclone 社)에서 배양 하였다. 인간 폐암 A549 및 흑색 SK-MEL 2 세포는 10% 소태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 및 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 피루브산 나트륨(Gibco 社) 및 1% 비필수 아미노산(Gibco 社)이 보충된 Eagle최소필수배양액(Hyclone 社)에서 각각 배양 하였다. 필요에 따라, 상기 세포는 Lipofectamine® 2000(Invitrogen 社)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 XPA(Dharmacon 社)을 타겟으로 하는 siRNA 이중 가닥으로 트랙스픽션하였다. 플라즈마는 48시간 동안 배양한 후에 처리하였고, 일주기리듬의 동기화를 위해, MEF 세포는 종래 보고된 바와 같이 처리하여 배양 하였다.
실험예 1: 면역 형광법(Immunofluorescence)
형광 항체법을 수행하기 위해, 세포를 4% 포름알데히드(Sigma-Aldrich 사)로 10분 동안 상온에서 고정하고, 0.5% Triton™ X-100(Bio Basic 사)로 세포 침투를 가능하게 하였다. 8-OxoG(Abcam), phospho-histone H2AX(Ser139; Millipore), phospho-CHK1(Ser345), phospho-P53(Ser15), PARP1, cleaved-caspase 3(Cell Signaling Technology), 및 poly-ADP-ribose(Enzo Life Sciences)에 특이적 항체를 단백질의 시각화를 위해 사용하였다. 이미지는 NIS-Elements 4.0 니콘 이미징 소프트웨어가 장착된 형광 현미경(Nikon 사)을 사용하여 관찰하였다. 정량분석을 위해, 최소 500개 세포를 각각 3개의 독립적인 실험을 수행하여 분석하였다.
실험예 2: 면역블러팅법(Immunoblotting)
수확된 세포를 1X 용해 버퍼((20 mM Tris-HCl pH 6.8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 프로테아제 억제제 칵테일, 및 10% Triton™ X-100)) 100 ㎕에 재현탁하고, 초음파(SONICS 사)를 사용하여 파쇄하였다. 총 단백질(30 μg)은 10% SDS 폴리 아크릴아미드 겔로 전기영동을 수행하고, 전기영동 챔버(Bio-RAD Laboratories 社)를 사용하는 니트로셀룰로스 블로팅 막으로 이동시켰다. 멤브레인은 XPA(Kamiya Biomedical Company 社), CRY1, BMAL1(Santa Cruz Biotech 社), 및 GAPDH(Cell Signaling Technology 社)에 대한 항원으로 면역블러팅법을 이용하여 분석하였다.
실험예 3: 유전자 혜성 분석(Comet assay)
DNA 손상은 Comet Assay® Kit(Trevigen)를 사용하여 측정하였다. 간략하게 살펴보면, 플라즈마 처리 24시간 후, 상기 세포는 1: 10(v/v) 비율로 37 의 저융점 아가로스와 혼합하였다. 상기 세포 현탁액(75 μL)을 현미경 혜성(comet) 슬라이드(MF)에 분산하고 40분 동안 4 에서 유지 하였다. 상기 세포는 4 에서 용해하고, 실온에서 DNA 이중가닥 해체가 가능한 200 mM의 NaOH 및 1 mM의 EDTA를 포함하는 알칼리 용액에서 40 분 동안 배양 하였다. 상기 슬라이드를 수평 전기 시스템에 넣고 실행 하였다. 그 다음, 상기 슬라이드를 천천히 5분마다 dH2O에 두 번, 5 분 동안 70 % 에탄올에 침지시킨 후, 실온에서 밤새 건조시켰다. 유전자 혜성 점수를 기록하기 전에 DNA를 SYBR®을 이용하여 녹색으로 시각화하는 형광 현미경을 이용하여 대조 하였다. 세포 후면에 나타나는 꼬리 모멘트는 Comet Assay Score software Project(CASP) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
실험예
4: 말단
데옥시뉴클레오티드
전달효소
dUTP
닉 말단 표지화(
TUNEL
) 분석
DNA 단편화를 측적하기 위해, Click-iT® TUNEL Alexa Fluor® Imaging Assay(Invitrogen)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 세포를 상온에서 10분 동안 4% 포름알데히드로 고정하고, 상온에서 20 분 동안 PMS내의 0.5 % 트리톤 ™ X-100으로 세포 침투를 가능하게 하였다. 세포는 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소 반응 혼합물 내에서 37 에서 60 분 동안 배양 하였다. 세포를 2분마다 1X TBST로 2회 세척하였고, 그 다음 Click-iT® 반응 혼합물로 상온에서 30분 동안 배양하였다. 세포핵을 상온에서 15 분 동안 Hoechst 33342(Sigma-Aldrich 사)와 대조하고, 이미지는 형광 현미경으로 촬영하였다.
통계
실험적 유의수준(p-value)은 표준편차(Standard deviation : SD)로 표현되며, 값 SD로 나타낸다. 통계적 분석은 GraphPad Prism 5로 수행되었고, 각 그룹의 차이는 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001으로 간주된다.
결과
도 1A에 나타낸 바와 같이, NTP를 처리한 경우와 비교해 보면, NTPO를 처리한 경우에 A549 및 SK-MEL2(흑색종) 인간 암 세포에서 cleaved-caspase 3가 활성화된 세포가 3배 더 많은 것으로 확인되었고, 도 1B에 나타낸 바와 같이, TUNEL 양성 세포가 2배 더 많이 생성되었음이 확인되었다. 이러한 결과는 NTP 치료 시, 산소 가스를 주입함에 따라 세포 사멸을 증진시킬 수 있다.
또한, 도 2A에 나타낸 바와 같이, A548 및 SK-MEL 두 세포 모두에서 DNA 절단용 일반적 마커, 인산화된 변종 히스톤 H2AX(γH2AX)이 NTP-노출 세포 및 NTPO-노출 세포 모두 2시간 후에 사라진 반면, 가스(헬륨) 제어에 노출된 세포에서는 거의 γH2AX 인산화가 나타나지 않았다.
또한 NTP가 처리된 세포 및 NTPO가 처리된 세포 내의 DNA 절단 결과로써 유전자 혜성 분석 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, NTPO가 γH2AX 인산화를 2배 더 강하게 만들어내는 것으로 정량 분석 되었고, 또한 도 1A 및 1B의 NTP 보다 3배 더 많은 혜성 모양의 핵을 만드는 것으로 확인되었다.
나아가 도 2C에 나타낸 바와 같이, NTP 및 NTPO를 처리한 경우에서 염색된 8 OxoG 세포의 핵뿐만 아니라 세포질이 확인되었다.
한편, 포유동물에서 세포에 전초기 센서로서 제공되는 ATR, ATM 및 DNA-PK 키나제는 유전자 독성 스트레스에 응답하여 DNA 복구를 위한 시간을 확보하기 위해 세포주기와 동기화한다. A549 및 SKMEL2 세포에 ATR(ETP 46464), ATM(KU55933) 및 DNA-PK(NU7026)에 특이적인 억제제로 전처리 후, NTP 및 NTPO를 처리한 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, ATR(ETP 46464)가 전처리된 경우에서 인산화가 확인되지 않았고, 또한 도 3B에 나타낸 바와 같이, 앞서 NTP 처리 중에 산소 가스를 흘려준 결과 CHK1 인산화가 확인되었다.
이러한 결과를 바탕으로 본 발명에서는 NTP 처리 효율을 향상시킬 수 있는 방법을 찾기 위해, A549 및 SK-MEL2 세포 둘다 PARP-1에 선택적인 저해제(AZD2281)를 처리한 경우, NTP 및 NTPO로 γH2AX 인산화가 상당히 증가한 것을 알 수 있었고(도 4A 참조), 특히, 일반적으로 잘 감지되지 않는 γH2AX의 인산화는 가스 컨트롤에서도 측정되었고, 반면, NER 메커니즘에 대한 주요 인자인, 녹다운 XPA에 의해 NER 경로를 블록킹한 결과, NTP 또는 NTPD 처리한 경우에서 γH2AX 인산화에 명백한 변화가 검출되지 않았다(도 4B 참조).
PARP-1 활성의 약리학적 억제는 NTP 또는 NTPD 처리 24시간 후, cleaved-caspase 3 염색(도 5A 참조) 및 TUNEL 활성 측정(도 5B 참조)결과로부터 세포 사멸 신호가 증가한 것으로 확인되었다.
또한, 도 5A에 나타낸 바와 같이, ATR 또는 PARP-1 저해제 존재 하에서 NTP 효율은 통상적으로 NTPO와 세포 사멸 효과와 동일하고, 이는 도 5B에 나타낸 바와 같이, ATR 또는 PARP-1 저해제의 첨가에 의해 더 증가된다.
중요한 것은, 도 5C에서도 확인된 바와 같이, ATP와 PARP-1 저해제를 동시에 투여 했을 때, NTP-유도 세포 저해 시, 중요한 상승 효과가 감지되었으나, 그 효과는 오직 NTPO-유도 세포 사멸하는 동안에는 미비한 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 PARP-1 활성이 정상 마우스 세포에서 일주기성 리듬을 갖는 것을 보여준다.
NTP 또는 NTPO로 유도된 유전 독성을 갖는 정상 세포에서의 PARP-1의 역할을 확인하기 위해, 활동성 일주기 시계를 갖는 마우스 배아 섬유 아세포(WT-MEF) 및 시토크롬 1 및 2의 중심 시계 요소의 손실로 인한 비활동성 시계를 갖는 마우스 배아 섬유 아세포(CRYDKO-MEF)를 이용한 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, 포르스콜린 처리는 WT-MEF 내의 시계 활동에 대한 판독 결과로서, 시계가 컨트롤된 유전자 BMAL1의 활발한 24시간 주기의 진동을 발현시켰으나, CRYDKO-MEF에서는 확인되지 않았다.
중요한 것은, 도 6B에 나타낸 바와 같이, 총 PAR 레벨들로부터 추론된 PARP-1 활성은 WT-MEF에서 일주기성 리듬을 나타내었지만, CRYDKO-MEF에서는 그렇지 않은 것으로 확인되었고, 반면, PARP-1 반면 단백질 수준은 변화가 없었다.
또한 시계 활동이 플라즈마 처리 시, PARP-1 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, PAR 신호가 각각 최대 및 최소로 나타난 ZT08(ZT0: 포르스콜린 처리 시, 자이트게버(zeitgeber) 0 시간) 및 ZT20에서 세포에 NTP 또는 NTPO를 처리한 결과, 도 6C에 나타낸 바와 같이, 포스콜린으로 유도된 경우에서 일주기리듬의 동기화가 확인되었다. 나아가 도 6D에 나타낸 바와 같이, WT-MEF에서는 PAR이 양성으로 나타난 세포가 ZT20보다 ZT08에서 5배 더 많은 것으로 확인된 반면, NTP 또는 NTPD 처리한 후, 차등 주기성 PARP-1 활성은 CRYDKO-MEF에서 검출되지 않았고, ZT에 상관없이 PAR-양성 세포 수가 유사한 것으로 확인되었다.
따라서, 도 7A 및 도 7B에 나타낸 바와 같이, NTP 또는 NTPO 처리에 따른 세포 생존능력은 WT-MEF의 경우에 ZT20에서 보다 ZT08에서 사멸 세포의 수가 더 적은 것으로 확인되었고, 반면, CRYDKO-MEF의 사멸 세포의 수는 ZT08 및 ZT20에서 NTP 또는 NTPO로 처리된 세포는 비슷한 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 정상 세포 손상의 부작용을 최소화하기 위해 환자의 일주기 리듬이 NTP 또는 NTPO 처리 시 고려될 필요가 있음을 의미한다.
종합적으로 살펴보면, 암세포의 경우 NTP로 유도되거나 또는 NTPO 유도된 DNA 손상은 ATR-매개 세포 주기 체크포인트와 PARP-1에 의존하는 회복 경로를 활성화시켜 생존을 도모함을 규명함으로써, NTP 또는 NTPO를 활용한 암치료 효율을 증대시키기 위한 방안으로 ATR과 PARP-1의 저해제를 단독 또는 동시 처리할 수 있고, 치료시 발생될 수 있는 암세포 주변에 위치하는 정상세포의 손상을 최소화하기 위한 방안으로 PARP-1의 일주기리듬이 정상세포에 존재함을 인지하고, PARP-1의 활성이 높은 자이트게버(ZT)에 암치료를 수행함으로써 정상세포의 손실을 최소화할 수 있는 플라즈마-시간항암요법에 적용할 수 있다.
Claims (15)
- 암세포에 키나아제 억제제를 처리하는 제1 단계;
정상세포의 일주기리듬(circadian rhythm)의 동기화를 수행하는 제2 단계; 및
상기 단계 1의 암세포 및 단계 2의 정상세포 배양 시 교류 전원을 이용한 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마의 노출 조건을 제어하는 제3 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 ATR 억제제 및 PARP-1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 5 내지 10 μM 처리하는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 제2 단계의 일주기리듬의 동기화는 17 내지 22 ZT(자이트게버) 주기에서 수행되는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 제2 단계의 일주기리듬의 동기화는 유전적으로 동기화 결함이 있는, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포 및 마우스 흑색종 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포와 일주기리듬의 동기화를 수행하는 것인 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
제3 단계의 상기 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 400 내지 600 SCCM의 헬륨 가스 플로우, 3 내지 6 SCCM의 산소 가스 플로우, 1 내지 2 kV의 인가전압, 40 내지 60 kHz 및 8 내지 12% 듀티비인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 저온 상압 플라즈마 발생장치의 플라즈마 발생원으로부터 암세포까지의 거리를 5 내지 7 cm로 세팅하는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 암세포는 저온 상압 플라즈마에 15 내지 25초로 노출시키는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 청구항 1에 있어서,
암세포는 피부암(skin caner), 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐선암(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포성암(hepatocellular cancer), 위암(gastric or stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 시험관내 암세포의 선택적 세포사멸 방법.
- 인간을 제외한 동물에 키나아제 억제제를 투여하고, 정상세포의 일주기리듬의 동기화를 수행하는 제1 단계; 및
상기 제1 단계 수행 후, 저온 상압 플라즈마 발생장치에서 발생하는 저온 상압 플라즈마를 처리하는 제2 단계를 포함하는, 종양 치료방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 제1 단계의 상기 키나아제 억제제는 키나아제 억제제는 ATR 억제제 및 PARP-1 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 종양 치료방법.
- 청구항 10에 있어서,
제2 단계의 상기 저온 상압 플라즈마의 노출 조건은 400 내지 600 SCCM의 헬륨 가스 플로우, 3 내지 6 SCCM의 산소 가스 플로우, 1 내지 2 kV의 인가전압, 40 내지 60 kHz 및 8 내지 12% 듀티비인, 종양 치료방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 저온 상압 플라즈마 발생장치의 플라즈마 발생원으로부터 동물까지의 거리를 5 내지 7 cm로 세팅하는 것인, 종양 치료방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 동물은 저온 상압 플라즈마에 5일 내지 7일 동안 24시간 간격으로 1회, 매회 20초 내지 30초로 노출시키는 것인, 종양 치료방법.
- 청구항 10에 있어서,
종양은 피부암(skin caner), 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 선암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoidmalignancy), 편평세포암(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐선암(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암(squamous carcinoma of the lung), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포성암(hepatocellular cancer), 위암(gastric or stomach cancer), 위장관암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 종양 치료방법.
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