KR20170118317A

KR20170118317A - LAMP 기반의 miRNA 검출 방법

Info

Publication number: KR20170118317A
Application number: KR1020160045910A
Authority: KR
Inventors: 전효성; 김지정
Original assignee: 주식회사 엠모니터
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2017-10-25
Also published as: KR101887742B1

Abstract

본원은 LAMP 기반의 시료 중의 miRNA 존재를 신속하게 검출할 수 있는 방법, 키트 및 조성물을 개시한다. 본원에 따른 방법은 검출대상 miRNA를 플라미스미드에 클로닝하여 이를 시료와 함께 LAMP 반응에 사용하고, 시료 중에 존재하는 잠재적인 miRNA를 가속 프라이머 중의 하나로 대체 사용하여, miRNA가 존재하는 경우, 그렇지 않은 시료보다 반응이 신속히 진행되어 특정 miRNA의 존재를 신속하고 간편하게 검출할 수 있다.

Description

LAMP 기반의 miRNA 검출 방법 {LAMP based method for detecting miRNA}

본원은 LAMP 방식을 이용하여 시료 중의 특정 miRNA의 존재를 신속하게 분석할 수 있는 기술에 관한 것이다.

마이크로RNA (microRNA; miRNA)는 세포에 존재하는 noncoding RNA로 20-25개의 뉴클레오타이드로 이루어진 짧은 단일 가닥염기(single-strand nucleotide)이며 인간의 경우 약 1500개의 마이크로RNA 유전자가 있는 것으로 알려져 있다.

마이크로RNA의 생성은 RNA 중합효소 II (RNA polymerase II)에 의해 전사되는 전구물질인 pri-miRNA로부터 유래된다. pri-miRNA는 5' 말단에 cap과 3‘말단에 poly A tail을 가지고 있으며 pri-miRNA는 Drosha라는 리보핵산분해효소 III (ribonuclease III)에 의해 절단되고 이중나선 DNA의 결합단백인 DGCR8(DiGeorge critical region 8)에 의해 머리핀 모양의 pre-miRNA로 가공된다. 중간물인 pre-miRNA는 nuclear export factor인 exportin5 Ran-GTP에 의해 세포질로 이동되어 두 번째 절단효소인 Dicer와 TRBP (transactivating response RNA binding protein)에 의해서 20-25개의 뉴클레오타이드로 구성된 이중가닥의 마이크로RNA로 처리된다. 이중가닥 중, 한가닥은 분해되고 Ago(Argonaute)와 결합하여 RISC (RNA-induced silencing complex)를 구성한다. TRBP는 Ago와 microRNA의 결합을 유도하여 마이크로RNA가 표적유전자의 발현을 조절할 수 있도록 한다. 일반적으로 마이크로RNA는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성을 낮추거나 번역율을 낮추어 표적 유전자의 발현을 억제한다. 마이크로RNA는 전체 유전자의 30% 이상을 조절함으로써, 발달, 분화, 세포증식 세포사멸과 같은 기본적인 생명현상에서 중요한 역할을 하고 있다.

따라서 기존에 암에 대한 연구는 단백질을 코딩하는 유전자에 초점을 맞추었으나 최근 단백질을 코딩하지 않는 유전자도 암 형성에 중요한 역할을 한다는 것이 발견되었다. 일반적으로 마이크로RNA는 최소 증폭영역, 이형접합성의 상실 (loss of heterozygocity), 취약부위 (fragile site), 그리고 종양유전자나 종양억제유전자의 내부나 그 근방의 절단점 부위 등 암과 관련된 유전체 영역에 위치하고 있다. 인간의 종양에서 암 발생 혹은 종양 억제 기능과 연관된 마이크로RNA의 발현이 비정상적으로 증가한다는 증거가 많아지고 있다. 종양에서 마이크로RNA는 종양억제 유전자의 기능 저해, 종양유전자의 발현 증가, 세포 주기 및 사멸 조절 등 다양한 기전을 통하여 종양을 발생하는 쪽으로 작용할 수 있고(예: miR-17-92) 반대로 oncogene을 억제하는 종양억제 효과를 나타내기도 한다(예: let-7). 마이크로RNA로 암의 예후 및 예측에 대한 생물학적 표지자로서 마이크로RNA의 잠재적 가치는 Schetter 등의 최근 연구에서 나타난다. 그 연구에서는 대장샘암종과 그 주변의 정상 조직에서 마이크로RNA 표현의 양상을 비교하여 일부 마이크로RNA는 예후적 가치를 나타냄이 증명되었다(Schetter AJ, et al. 2008. MicroRNA expression profile associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 299:425-36).

따라서 마이크로RNA를 정확하고 신속하게 검출하는 기술이 필요하다. 과거에는 Nothern blotting, microarray, beadbased platform 등으로 분석이 시행되었다. 그러나 길이가 짧아 비슷한 nucleotide sequence가 존재하며 낮은 마이크로RNA 발현양 때문에 민감함과 선별도 면에서 만족스럽지 않다 (Waldman SA and Terzic A. 2008. MicroRNA signatures as diagnostic and therapeutic targets. Clin Chem 54:943-4).

최근에 마이크로RNA를 검출하기 위한 방법이 다양하게 제시되고 있다. nanoparticle-labeling 방식, modified invader assay, ribozyme-based methods, conjugated polymer-based methods, bioluminescence detection 그리고 electrochemical detection과 같은 기존의 방식은 마이크로RNA를 검출하는데 민감도가 향상되었으나 대부분의 방식이 프로브 개질, 고가의 표지와 같은 복잡한 과정을 필요로 한다. 최근에 효소 기반의 정량적 RT-PCR, RCA (branched rolling circle amplification), 및 LCR (ligase chain reaction) 방법이 보고되고 있으나 다수 효소가 필요한 방식으로 고가의 비용은 물론 단계가 복잡한 단점이 있다 (Li CP et al. 2011. One-step ultrasensitive detection of microRNAs with loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Chem Commun 47:2595-2597).

이에 새로운 기술에 기반한 신속하고 편리한 검출 방법의 개발이 필요하다.

WO2015103293 (2015년 7월9일 공개) Systems, compositions and methods for detecting and analyzing micro-rna profiles from a biological sample.

본원은 LAMP 기반의 신속하고 정확하게 miRNA 검출 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) 기반의 miRNA 검출 방법을 제공하며, 시료 중에 존재하는 miRNA가 가속 프라이머로서 기능하여, miRNA를 포함하지 않는 시료와 비교하여 증폭의 속도가 증가하여 소정의 시간 내에 miRNA를 포함하는 시료의 변별을 가능하게 하는 원리이다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 a) miRNA 검출이 필요한 대상 시료를 제공하는 단계; b) 상기 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드에 클로닝하는 단계: 또는 상기 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드를 제공하는 단계; c) 상기 플라스미드에 결합하는, 가속 프라이머 LB 및 LF를 제외한 4종류의 F3, B3, FIP 및 BIP의 LAMP 프라이머를 제공하는 단계로, 상기 4종류의 프라이머는 상기 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 기준으로 이의 업스트림 또는 다운스트림에 F3, FIP, 검출대상 microRNA, BIP 및 B3의 순서대로 결합하며, 상기 클로닝된 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않으며; d) 상기 대상 시료, 상기 플라스미드 및 상기 4종류의 프라이머의 존재 중에서 소정의 시간 동안 LAMP 반응을 수행하는 단계로, 상기 LAMP 반응은 선택적으로 양성 및/또는 음성대조군 시료에 대하여도 동일하게 수행되고, 그리고 e) 상기 LAMP 반응 결과를 분석하여 상기 대상 시료가 상기 miRNA를 포함하는지 여부를 판단하는 단계를 포함하며, 상기 소정의 시간 동안 상기 플라스미드가 증폭된 경우, 상기 대상 시료는 소정의 miRNA를 포함하는 것으로 판별하게 된다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 LAMP 반응 결과 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서 LAMP 반응은 miRNA를 포함하는 시료와 그렇지 않은 시료의 증폭의 속도의 차이를 변별할 수 있는 시간으로 수행되며, 일 구현예에서 상기 소정의 시간은 30분 내지 35분 동안 수행된다.

다른 양태에서 본원은 또한 검출대상 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드; 및 상기 플라스미드에 결합하나, 상기 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않는 F3, B3, FIP 및 BIP를 포함하는 LAMP 기반의 miRNA 검출용 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 검출대상 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드; 및 상기 플라스미드에 결합하나, 상기 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않는 F3, B3, FIP 및 BIP를 포함하는 LAMP 기반의 miRNA 검출용 조성물을 제공한다.

본원은 LAMP 기반의 시료 중의 miRNA 존재를 신속하게 검출할 수 있는 방법, 키트 및 조성물을 개시한다. 본원에 따른 방법은 검출대상 miRNA 서열을 플라스미드에 클로닝하여 이를 시료와 함께 LAMP 반응에 사용하고, 시료 중에 존재하는 잠재적인 miRNA를 가속 프라이머 중의 하나로 대체 사용하여, miRNA가 존재하는 경우, 그렇지 않은 시료보다 반응이 신속히 진행되어 특정 miRNA의 존재를 신속하고 간편하게 검출할 수 있다.

도 1a는 LAMP 프라이머가 디자인되는 표적 핵산의 각 가닥의 영역의 위치를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 microRNA에 해당하는 DNA가 삽입된 플라스미드에서 각 프라이머의 위치 및 클로닝된 microRNA 염기서열이 LB 프라이머를 대체하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2a는 LAMP 반응에 사용되는 가속 프라이머 LB 및 LF의 존재여부에 따른 LAMP 반응속도의 차이를 분석하기 위하여, LAMP 반응실험에 사용된 프라이머의 조합을 표로 나타낸 것이다.
도 2b는 상이한 농도의 주형을 사용하여 도 2a의 프라이머 세트를 사용하여 LAMP 반응을 수행한 결과로, 위는 색분석 결과이고, 아래표는 색분석 결과를 정리한 것이다.
도 3a는 2 종류의 프라이머 세트 FIP 및 BIP를 기본으로 F3, B3 프라이머 첨가 여부에 따른 LB 프라이머의 가속 프라이머의 추가에 따른 LAMP 반응 속도 차이를 분석하기 위해, LAMP 반응실험에 사용된 프라이머의 조합을 표로 나타낸 것이다.
도 3b는 도 3a의 프라이머 세트를 사용하여 반응시간을 달리하여 LAMP 반응을 수행한 결과로, 위는 색분석 결과이고, 각 결과 아래에 증폭여부를 표기하였다.
도 4a는 본원의 일 실시예에 따라 검출 대상 표적 miRNA에 해당하는 DNA를 합성한 후 이를 플라스미드에 클로닝하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4b는 도 4a에 따른 플라스미드에서 표적 miRNA를 중심으로 디자인된 프라이머의 위치 및 서열을 나타내고, LB는 microRNA로 대체되었음을 나타낸다.
도 5는 도 4a의 플라스미드를 사용하여 시료 중의 microRNA를 LAMP 반응으로 검출한 결과를 나타낸다. miR-135 염기서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 1fg, 0.5fg, 0.1fg 첨가시 63℃에서 30분 반응 완료 후 miR-135 양성대조군에서는 microRNA가 가속 프라이머로 작용하여, 이의 영향으로 빠른 속도 증폭이 일어나 보라색에서 파란색으로 반응이 일어났으나 동일 농도의 음성대조군에서는 가속 프라이머로 작용할 수 있는 microRNA가 존재하지 않기 때문에, 증폭 속도가 느리므로 30분에서 발색 반응이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 LAMP 반응의 증폭 속도 차이로 마이크로RNA 존재 여부를 판단할 수 있음을 나타내는 것이다.

본원은 miRNA를 LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification, 루프 매개 등온 증폭방법)에서 일종의 가속 프라이머로 사용하여, 특정 miRNA를 신속하고 간단하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체 (strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트가 사용된다 (한국 특허 제612551호; Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고). 표준 LAMP 반응에는 4종류의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 가속프라이머로 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다.

도 1a에 기재된 바와 같이, 상술한 바와 같은 LAMP에 사용되는 프라이머 세트는 표적 핵산상의 6개의 구분되는 영역 (F3, F2, F1, B1c, B2c 및 B3)에 대하여 디자인되며, F3 및 B3는 두 개의 바깥쪽 프라이머로 증폭되는 산물의 크기를 결정하며, FIP 및 BIP는 두 개의 안쪽 프라이머로 FIP는 F1c 서열 및 F2 서열로 구성되고, BIP는 B1c 및 B2 서열로 구성되는 하이브리드 프라이머이다.

LAMP 반응은 크게 개시 구조 생산단계 및 사이클링 증폭단계를 포함하며, PCR과 달리 단일가닥으로 변성시키는 단계를 포함하지 않는다. 개시 구조 생산단계에서 FIP의 F2가 F2c 영역에 결합하여 신장을 개시한다. BIP도 이와 마찬가지로 진행된다. F3 프라이머는 F3c 영역에 결합하여 가닥교체 방식을 DNA 합성을 시작하여, FIP에서 신장된 DNA 가닥이 교체되면서 방출된다. 이렇게 방출된 단일가닥은 F1/F1c 결합을 통해 그 5‘ 말단에 고리를 형성하게 되고, BIP 및 B3 프라이머도 동일한 방식으로 합성 반응이 진행되어, 덤벨 모양의 양 말단에 고리가 형성된 단일가닥 핵산 분자가 형성된다. 이어 F1 영역의 3’ 말단으로부터 DNA 합성이 시작되며, 사이클링 단계가 진행된다.

가속 프라이머인 LB 또는 LF 프라이머는 상술한 덤벨 구조의 단일 가닥 부위에 결합하며 B1 및 B2 사이의 고리 또는 F1 및 F2 사이의 고리에 결합한다. LB 또는 LF 프라이머를 사용하며 DNA 합성이 시작되는 origin이 증가하여 결국 반응 속도가 빨라지는 효과를 가져온다. LAMP 반응에서는 그 과정에서 통상 6개의 고리가 형성되며, 두 개의 고리만이 합성 기원으로 사용되나, LB 및 LF 프라이머를 사용하는 경우에는 6개의 모든 고리가 합성 기원으로 사용되어, 소정의 시간 동안 합성되는 DNA 양이 증가하게 된다.

추가의 원리 및 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB)프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.

본원에 따른 마이크로 RNA 검출 방식은 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 검출하고자 하는 마이크로 RNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 검사대상 시료와 함께, 가속 프라이머를 제외한 4종류의 기본 프라이머 LAMP 반응에서 사용하고, 검사대상 시료 중에 마이크로 RNA가 존재하는 경우, 이것이 일종의 가속 프라이머 (LB 또는 LF)로 작용하여, 합성 반응이 그렇지 않은 경우보다 신속하게 진행되고, 이러한 차이를 이용하여 목적하는 마이크로 RNA를 검출할 수 있다는 원리이다.

따라서 한 양태에서 본원은 LAMP 기반의 miRNA 검출 방법으로, a) miRNA 검출이 필요한 대상 시료를 제공하는 단계; b) 상기 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드에 클로닝하는 단계: 또는 상기 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드를 제공하는 단계; c) 상기 플라스미드에 결합하는, 가속 프라이머 LB 및 LF를 제외한, 4종류의 F3, B3, FIP 및 BIP의 LAMP 프라이머를 제공하는 단계로, 상기 4종류의 프라이머는 상기 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 기준으로 이의 업스트림 또는 다운스트림에 F3, FIP, 검출대상 microRNA, BIP 및 B3의 순서대로 결합하며, 상기 클로닝된 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않으며; 그리고 d) 상기 대상 시료, 상기 플라스미드 및 상기 4종류의 프라이머의 존재 중에서 소정의 시간 동안 LAMP 반응을 수행하는 단계로, 상기 LAMP 반응은 선택적으로 양성 및/또는 음성대조군 시료에 대하여도 동일하게 수행되고, e) 상기 LAMP 반응 결과를 분석하여 상기 대상 시료가 상기 miRNA를 포함하는지 여부를 판단하는 단계로, 상기 소정의 시간 동안 상기 플라스미드가 증폭된 경우, 상기 대상 시료는 소정의 miRNA를 포함하는 것으로 판단한다.

본원에 따른 방법에서 검출 대상 “miRNA”또는 "miR" 또는 "마이크로 RNA" 또는 “마이크로알엔에이”는 세포에 존재하는 noncoding RNA로 길이 20-25개의 뉴클레오타이드로 이루어진 짧은 단일 가닥염기(single-strand nucleotide)이며 인간의 경우 약 1500개의 마이크로RNA 유전자가 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 마이크로RNA는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성을 낮추거나 번역율을 낮추어 표적 유전자의 발현을 억제한다. 마이크로RNA는 전체 유전자의 30% 이상을 조절함으로써, 발달, 분화, 세포증식 세포사멸과 같은 기본적인 생명현상에서 중요한 역할을 하고 있다. 따라서 miRNA 검출은 다양한 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

본원에 따른 방법이 사용되는 miRNA는 특별히 제한되는 것은 아니며, 길이 약 20 내지 25nt로 가속 프라이머로서의 기능을 하는 한 제한되지 않는다. 따라서 특정한 목적을 위해 검출이 필요한 다양한 miRNA가 본원의 방법에 따라 검출이 될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "프라이머"는 LAMP 반응에 사용되는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3' 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다.

본원에 따른 방법에 사용되는 LAMP 프라이머는 기본 4종류의 F3, FIP, B3 및 BIP 프라이머가 사용되며, 상술한 원리에 따라서, 검출 대상 miRNA에 상응하는 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 부위를 기준으로 본원에 따른 방법에 채용되는 플라스미드에 결합할 수 있도록 디자인된다.

구체적으로 본원에 따른 프라이머는 검출 대상 miRNA에 상응하는 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 부위를 기준으로 도 1b에 나타난 바와 같이 이의 업스트림 또는 다운스트림 영역의 F3, F2, LF, F1c, B1c, B2, B3의 순서로 위치하는 영역에 대하여 디자인되며, F3, FIP, BIP 및 B3의 순서대로 결합을 하며, 검출 대상 miRNA에 상응하는 폴리뉴클레오타이드가 LB 결합부위로 작용하며, 여기에는 대상 시료 중의 miRNA가 결합을 하여 LB 프라이머의 기능을 하게 된다.

본원에 따른 방법에서 가속 프라이머는 LB 및 LF 모두가 제외되는 것이 바람직하다. 하나만 제외되는 경우, 마이크로 RNA가 첨가된 샘플과 첨가되어 있지 않은 샘플의 반응속도 차이가 두 개를 모두 제외한 것과 비교하여, 5분 내외로 짧아지게되어 구별이 어려울 수 있다. 본원 도 2a에서 lane 1과 2를 보면 LF가 첨가되어 있는 상태에서 LB 의 +/- 차이는 마이크로 RNA 샘플의 여부에 따른 차이로 볼 수 있으므로 LF만 있는 경우도 35분에서 검출된다. 그러므로 LF, LB 둘 다 제외를 시킨 후 마이크로 RNA의 유무에 따른 반응 속도 차로 결과를 보는 것이 보다 정확하다.

하지만 가속 프라이머 중 하나를 사용하는 것은 제외하는 것은 아니며, 조건의 조절 예를 들면 사용되는 플라스미드의 농도를 가속프라이머 두 개를 모두 제외하는 것과 비교하여 낮은 농도 예를 들면 95% 이하, 예를 들면 90% 이하, 예를 들면 80% 이하, 예를 들면 70% 이하, 예를 들면 60% 이하, 예를 들면 50% 이하의 농도로 플라스미드를 사용하여, miRNA의 존재 유무를 증폭속도로 변별할 수 있는 한 가속 프라이머 두 개 중 하나만 제외하고 사용하는 것도 가능하다.

따라서 상술한 바와 같은 조건을 만족하는 한 프라이머 디자인은 일반적 LAMP 방법에 채용되는 사항을 고려하여 디자인될 수 있다. 일반적으로 프라이머 디자인에 Tm 값, 이중구조, 각 프라이머 말단의 안정성 및 GC 함량을 고려하여 디자인 될 수 있다. Tm 값은 F1c 및 B1c 영역에 대하여는 60℃ 내지 68℃, 또는 64℃ 내지 66℃, F2, B2, F3 및 B3 영역에 대하여는 55℃ 내지 63℃, 또는 59℃ 내지 61℃, 루프 프라이머 영역에 대하여는 일반적인 miRNA의 크기가 20-24nt이고, 등온증폭의 특징상 프라이머 디자인시 40-60% 범위가 적당하며, 이를 초과하는 비정상적으로 높은 GC의 비율이 아닌 한 64℃ 내지 66℃ 일 수 있다.

본원에 따른 방법에서 사용되는 프라이머 간의 간격은 증폭 산물의 크기가 약 200 내지 300 뉴클레오타이드가 되도록, 검출대상 miRNA에 상응하는 DNA 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 사이에 두고, 바깥쪽 두 개의 프라이머 F3 및 B3를 위치시키며, 길이를 증가시키는 경우, 다른 프라이머 디자인을 고려하여 증가시킬 수 있다. F2 영역의 5’말단부터 B2 영역의 5’말단까지의 거리는 약 120 내지 180 뉴클레오타이드가 되도록 디자인하고, 루프를 형성하는 부위인 F2 영역의 5’말단부터 F1 영역의 5’말단까지의 거리는 약 40 내지 60 뉴클레오타이드가 되도록 디자인하고, 반대쪽 B2 및 B1 간격도 동일하게 되도록 디자인 된다. F3 및 F2, F2 및 F1 사이의 간격은 0 내지 60 뉴클레오타이드 반대쪽 B3 및 B2 간격도 동일하게 되도록 디자인 된다.

본원의 방법에 채용되는 프라이머는 본원에 개시된 반응의 특징 및 프라이머의 특징을 고려하여, 시중의 프라이머 디자인 소프트웨어 예를 들면 Primer Explorer 4 (Fujitsu, Japan), LAVA (LAMP Assay Versatile Analysis) 및 LAMP Designer (PREMIER Biosoft)와 같은 것을 사용할 수 있다.

본원에 따른 프라이머의 길이는 최종 증폭 산물의 길이 등을 고려하여 적절하게 정할 수 있으며, 예를 들면 최소 10 뉴클레오타이드이며, F3와 B3의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이며, FIP와 BIP의 경우 최소 30 뉴클레오타이드이며, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머 제작방법은 높은 엄격도 조건에서 표적인 단일염기다형성이 포함된 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.

상술한 바와 같이 검사 대상 시료 중의 마이크로 RNA는 통상 19-25개의 뉴클레오타이드로 이루어진 짧은 단일 가닥으로 기존의 가속 프라이머인 LB 또는 LF와 동일한 역할을 수행하게 되므로 검사 대상 시료가 마이크로 RNA를 포함한 경우 LAMP 반응이 신속하게 진행되어, 마이크로RNA가 포함되지 않은 경우와 비교하여 소정의 시간 동안 합성되는 핵산의 양에 차이가 나게 되는 원리로 마이크로 RNA를 검출할 수 있게 된다. 따라서 가속프라이머로 작용하는 마이크로 RNA를 포함하는 시료와 포함하지 않는 시료에서 증폭된 핵산의 양을 구분할 수 있을 정도로 증폭이 가능한 시간 동안 반응을 수행하는 것이 중요하다.

일 구현예에서는 검출대상 마이크로RNA를 포함하는 플라스미드 DNA 농도를 조절하여 63℃에서 30분내지 35분에 증폭여부의 검출이 가능하도록 반응조건을 설정한다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법에 사용되는 프라이머 세트를 포함하는 마이크로 RNA 검출용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본원에 따른 방법, 조성물 또는 키트는 다양한 시료에서 miRNA 검출을 위해 사용될 수 있다. 시료는 예를 들면, 혈액, 소변, 분변 또는 체액과 같은 가검물, 또는 분리된 조직, 세포 또는 이로부터 유래된 추출물과 같은 생물학적 시료를 포함한다. 시료를 처리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 시료를 채취한 후, 이를 프로테나제 K(Proteinase K)를 처리하여 열수추출하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다. 또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 통상의 시료 수득방법에 의해 직접 수득한 것이거나 또는 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 시료는 상술한 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.

본원에 따른 프라이머 세트를 사용한 LAMP 반응을 위한 조성물 또는 키트는 dNTPs, 완충액, 마그네슘 및 DNA 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있다. 또한 반응을 향상시키기 위한 베타인 또는 DMSO와 같은 물질을 추가로 포함할 수 있다.

마그네슘은 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드 또는 마그네슘 설페이트와 같은 염의 형태로 사용된다.

완충액은 예를 들면 소디움포스페이트 완충액, 포타슘포스페이트 완충액, Tris-HCl 완충액 또는 Tricine 완충액 같은 것이 사용될 수 있다.

본원에 따른 LAMP반응에 사용될 수 있는 DNA 폴리머라제는 호열성 미생물 유래의 폴리머라제로서, 특히 5'->3' 엑소뉴클리아제 기능이 결여된 폴리머라제를 포함한다. 비제한적 예로는 Bacillus stearothermophilus, Bst, DNA 폴리머라제; Thermus, thermophilus, Tth, DNA 폴리머라제; Thermus aquaticus, Taq, DNA 폴리머라제; Thermococcus litoralis DNA 폴리머라제; Pyrococcus furiosus, Pfu, DNA 폴리머라제; 및 Bacillus caldotenax DNA 폴리머라제를 포함한다.

또한 반응물에는 dNTP 대신에 뉴클레오타이드 유사체 (analog)도 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형되거나 또는 자연에서 발견되지 않는 것으로 주형 유도된 DNA 합성 과정에서 천연의 뉴클레오타이드와 함께 또는 단독으로 중합될 수 있는 것이다. 이러한 와슨 크릭 베이스 페어링을 통해 중합될 수 있는 유사체로 뉴클레오타이드 베이스의 유사를 포함하는 것은 예를 들면 치환된 퓨린 또는 피리미딘, 데아자퓨린, 메틸퓨린, 메틸피리미딘, 아미노퓨린, 아미노피리미딘, 티오퓨린, 티오피리미딘, 인돌, 피롤, 7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 하이포잔틴, 쉐도사이토신, 쉐도아이소사이토신, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 2-티오피리미딘, 4-티오티민, 6-티오구아닌, 니트로피롤, 니트로인돌 및 4-메틸인돌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 치환된 데옥시리보스 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 치환 또는 비치환된 아라비노스, 치환 또는 비치환된 자일로스 및 치환 또는 비치환된 피라노스를 포함한다. 포스페이트 에스테르 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트, 포스포로셀로노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포로아미데이트, 보론포스페이트, 포스포트리에스테르 및 메틸포스포네이트와 같은 알킬포스포네이트를 포함한다.

LAMP 반응은 DNA 폴리머라제 활성에 적합한 온도에서 반응된다. 반응온도는 반응에 사용되는 효소, 표적의 핵산 서열을 고려하여 어려움 없이 결정될 수 있다. 이어 반응물은 상술한 바와 같은 miRNA의 검출에 적합한 소정의 시간으로 반응된다. 당업자라면 반응조건을 고려하여 반응시간을 결정할 수 있을 것이며, 예를 들면 20분-50분의 시간에서 결정할 수 있으나, 시료에 포함된 표적 핵산의 양에 따라 달라질 수 있으며, 결정될 수 있다. 예를 들면 민감도를 높이기 위해 반응시간을 증가시킬 수 있다.

본원에 따른 LAMP 분석은 다양한 분석 포맷으로 분석될 수 있으며, 예를 들면 액상반응 또는 일부 성분이 고상기질에 흡착된 상태로 수행될 수도 있다.

본원에 따른 방법, 프라이머 세트를 포함하는 조성물 또는 키트는 단일염기다형성을 판별하고자 하는 임의의 생물학적 시료를 사용한 LAMP 방식으로 분석에 사용되며, 증폭된 산물은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다.

증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 정량 또는 정성분석에 사용된다.

일 구현예에서 본원에 따른 증폭산물은 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화로 검출될 수 있다. 이 경우, 반응액은 적절한 지시 시약 (indicator)를 포함할 수 있으며, 반응액 중 마그네슘 이온 농도에 반응하여 색이 변하는 염료로서 HNB (hydroxy naphthol blue)를 사용하여 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 클로스트리디움 퍼프린젠스를 정량 또는 정성분석 할 수 있으며, 특히 나안으로 검출이 가능하여 그 편리성이 증대된다.

다른 구현예에서 증폭 산물은 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서는 검출가능하게 표지된 프라이머가 사용될 수 있으며, 핵산에 특이적 결합 후 표지된 프라이머를 통해 방출되는 신호를 통해 핵산의 증폭여부가 검출되며, 실시간 검출이 가능하다. 간접적 검출방법에서는 증폭된 핵산에 결합할 수 있는 표지된 프로브가 사용될 수 있다. 본원에서 검출가능하게 표지된 것의 의미는 분광학적, 광학적, 광화학적, 생화학적, 효소적, 전기적 및/또는 면역화학적 방법과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 물질로 표지된 물질을 의미한다. 이러한 물질은 예를 들면 형광모이어티, 화학발광 모이어티, 생발광모이어티, 자성입자, 효소, 기질, 방사능 및 발색단 물질을 포함한다.

일 구현예에서 검출을 위한 표지자 (label)는 이로 제한하는 것은 아니나, 광방출, 광산란, 광흡수 물질과 같은 검출가능한 형광, 화학발광 또는 생발광 신호를 생성 또는 소거할 수 있는 화합물을 포함하며, 예를 들면 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997을 참조할 수 있다. 형광 물질은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니다 플루오레신 (예를 들면 미국특허 6,020,481), 로다민 (예를 들면 미국 특허 6,191,278), 벤조페녹사진 (예를 들면 미국특허 6,140,500), 공여체와 수용체를 포함하는 에너지 전이 형광 염료 (예를 들면 미국특허 5,945,526) 및 사이아나인 (예를 들면 WO1997-45539), 리사민, 파이코에리쓰린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, 및/또는 Texas Red는 물론 기타 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 형광 모이어티를 포함한다. 형광염료는 6-carboxyfluorescein; 2′,4′,1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2′,4′,5′,7′,1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein ("FAM"), TET, ROX, VIC 또는 JOE가 사용된다. 일 구현예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다. 또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al., eds. " DNA and RNA Structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.

또한 프라이머의 비 특이적 프라이밍 발생에 의한 비특이적 증폭여부의 검출이 필요한 경우, 비특이적 핵산 결합제인 에씨디움 브로마이드 또는 피코그린과 같은 물질을 주형을 포함하지 않는 대조군 반응에 사용하여 비특이적으로 합성된 총 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.

본원에 따른 키트는 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 반응에 사용되는 성분 및 상술한 4개의 프라이머 세트를 별도로 또는 하나의 튜브에 제공할 수 있다. 본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군으로는 검출대상 miRNA를 포함하지 않는 시료, 양성대조군은 검출대상 miRNA를 포함하는 시료일 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.

실시예 1: 마이크로RNA 시료 준비

본원에 따른 방법을 검증하기 위한 일 예로서 miR-135를 사용하였다.

폐암 세포주로부터 수득한 조직으로부터 Trizol® (Life Technology, USA) 및 Qiagen RNA extraction Kit를 제조자의 방법대로 사용하여 총 RNA를 분리하였다.

실시예 2: 목적하는 마이크로 RNA 시퀀스의 플라스미드 클로닝

플라스미드로는 TOP blunt vector (Enzynomics, Korea)를 사용하였으며 miR-135 시퀀스 정보를 miRBase(http://www.mirbase.org)에서 수득하였다. 도 4에 기재된 바와 같이 miR-135 염기서열 포함 및 앞쪽과 뒤쪽에 vector와 동일 제한효소 처리 부위 염기서열을 첨가하여 폴리뉴클레오타이드를 외부에 의뢰하여 합성하였다 ((주)제노텍). 구체적으로 BamH1(New England Biolabs)과 XhoI(New England Biolabs) 제한효소를 플라스미드와 삽입되는 폴리뉴클레오타이드에 동일하게 처리하였다. 이어 제한효소를 처리하여 양쪽 말단을 동일하게 절단한 벡터에, 말단에 역시 동일한 제한효소 부위를 갖는 miR-135 유전자를 삽입하고 서열분석을 통해 확인하였다.

실시예 3: LAMP 프라이머 디자인

상기 벡터에 대하여 총 6개 세트 ( FIP, BIP, LF, LB, F3, B3 )를 디자인하였으며, 그 서열은 표 1 및 위치는 도 4b에 기재되어 있다.

구체적으로 ClustalX multiple sequence alignment program을 이용하여 벡터서열과 miR-135 유전자를 삽입하고 Solgent에 의뢰한 서열 분석 결과를 정렬(align) 하였다. mir-135 유전자가 삽입된 부위를 먼저 LB 프라이머 위치로 선정을 하여 LB 프라이머를 중심으로 나머지 프라이머를 디자인 하였다.

[표 1]

실시예 4 가속 프라이머의 존재 여부에 따른 반응속도 차이 분석

본원은 가속 프라이머( LF, LB )와 동일 역할을 하게 되는 마이크로RNA 존재 여부에 따른 차이를 확인하기 위하여 4개 기본 Primer 세트( F3, B3, FIP, BIP )외에 가속 프라이머( LF, LB )의 첨가에 따른 증폭 속도 차이를 확인하는 실험을 수행하였다.

LAMP 반응 total volume은 25μl이며, LF 프라이머 및 LB 프라이머의 첨가 여부에 따른 4개 프라이머( F3, B3, FIP, BIP ), 5개 프라이머( F3, B3, FIP, BIP, LF/ F3, B3, FIP, BIP, LB ) 또는 6개 프라이머( F3, B3, FIP, BIP, LF, LB )를 사용하여 수행하였다. 반응에 사용된 조성 및 성분은 프라이머의 갯수를 제외하고는 동일하였으며, 다음과 같다. 총 25μl에 0.2μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 120μM HNB (Sigma) 및 mir-135 서열을 삽입한 Plasmid DNA를 농도별로 첨가 하였다. 도 2, 도 3은 mir-135 RNA 샘플 대신 제노텍에서 합성한 LB 프라이머를 첨가하여 수행하였다.

LAMP 반응은 63℃에서 45분간 진행하였으며 Bst DNA polymerse는 80℃ 이상의 온도에서 불활성을 나타내므로 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 기본 4개 프라이머만을 사용한 경우(Lane 4)와 가속 프라이머를 첨가한 경우 LF, LB 모두 첨가(Lane 1), LF만 첨가(Lane 2), LB만 첨가(Lane 3)를 비교하였을 때 최소 10분~15분 이상의 증폭 속도 차이를 나타내는 것을 확인하였다.

이어 5개 프라이머세트 (F3, B3, FIP, BIP, LF or LB)의 LAMP 반응 결과와 6개 프라이머 세트(F3, B3, FIP, BIP, LF, LB)의 결과는 증폭 속도 차이가 5분 내외로 짧다. 그러나 4개 프라이머 세트 (F3, B3, FIP, BIP)의 LAMP 반응 결과와 5개 프라이머 세트 (F3, B3, FIP, BIP, LF or LB)의 결과는 증폭 속도 차이가 10분~15분으로 커지기 때문에 마이크로RNA검출에 적합한 것으로 나타났다.

또한 2개 세트 FIP, BIP를 기본으로 F3, B3 프라이머 첨가 여부에 따른 LB 프라이머의 가속 프라이머 LAMP 반응 속도 차이를 분석하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있으며, F3, B3의 첨가 여부는 반응속도에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 판단되며 LB 프라이머를 첨가한 경우(Lane 2, Lane 4)와 포함하지 않은 경우(Lane 1, Lane 3)는 15분의 LAMP 반응 속도 차이를 보인다. 따라서 LAMP 반응 시간 30분~40분 사이에 결과 확인시 LB 프라이머와 동일 역할을 하는 마이크로RNA가 포함된 시료의 경우 검출이 되며 목적하는 마이크로RNA가 아닌 다른 마이크로RNA 혹은 마이크로RNA가 포함되지 않은 시료의 경우는 검출이 되지 않는다.

실시예 5: LAMP 반응을 통한 miRNA 검출

LAMP 반응은 총 25㎕로 반응하였으며, LF 및 LB를 제외한 4개의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 반응에 사용된 조성 및 성분 다음과 같다. 총 25㎕에 0.2μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 120μM HNB (Sigma) 및 실시예 2에서 준비한 miR-135 유전자가 삽입된 plasmid DNA를 1fg, 0.5fg, 0.1fg 첨가하였다. 그리고 실시예 1에서 준비한 miR-135 positive sample과 miR-135 negative sample을 각 50ng으로 동일한 양을 첨가하여 실험을 수행하였다. LAMP 반응은 63℃에서 30분 Bst DNA polymerse는 80℃ 이상의 온도에서 불활성을 나타내므로 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.

증폭여부는 색분석으로 다음과 같이 수행하였다. 색분석은 HNB (hydroxy naphthol blue) 염료를 반응액에 넣어 수행하였다. HNB는 Mg² ⁺ 이온 농도의 지시자(indicator)로서 작용한다. Mg² ⁺ 이온이 없을 경우, 하늘색으로 보이며, Mg² ⁺ 이온이 있을 경우, 보라색을 띤다. 따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg² ⁺ 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응으로, 나안 또는 약 650nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정성 및 정량 분석이 가능하다. 본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.

결과는 도 5에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 miR-135 plasmid DNA를 1fg, 0.5fg, 0.1fg 첨가시 58℃에서 30분 반응 완료 후 miR-135 positive sample을 첨가한 경우 가속 프라이머의 영향으로 빠른 속도 증폭이 일어나 보라색에서 파란색으로 반응이 일어났으나 동일 농도의 negative sample 첨가시 증폭 속도가 느리므로 30분에서 발색 반응이 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이는 LAMP 반응의 증폭 속도 차이로 마이크로RNA 존재 여부를 판단할 수 있음을 나타내는 것이다.

Claims

LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) 기반의 miRNA 검출 방법으로, 상기 방법은
a) miRNA 검출이 필요한 대상 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드에 클로닝하는 단계: 또는 상기 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드를 제공하는 단계;
c) 상기 플라스미드에 결합하는, 가속 프라이머 LB 및 LF를 제외한 4종류의 F3, B3, FIP 및 BIP의 LAMP 프라이머를 제공하는 단계로, 상기 4종류의 프라이머는 상기 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 기준으로 이의 업스트림 또는 다운스트림에 F3, FIP, 검출대상 microRNA, BIP 및 B3의 순서대로 결합하며, 상기 클로닝된 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않으며; 그리고
d) 상기 대상 시료, 상기 플라스미드 및 상기 4종류의 프라이머의 존재 중에서 소정의 시간 동안 LAMP 반응을 수행하는 단계로, 상기 LAMP 반응은 선택적으로 양성 및/또는 음성대조군 시료에 대하여도 동일하게 수행되고,
e) 상기 LAMP 반응 결과를 분석하여 상기 대상 시료가 상기 miRNA를 포함하는지 여부를 판단하는 단계로, 상기 소정의 시간 동안 상기 플라스미드가 증폭된 경우, 상기 대상 시료는 소정의 miRNA를 포함하는 것으로 판단하는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 LAMP 반응 결과 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 소정의 시간은 30분 내지 35분인, 방법.
검출대상 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드; 및 상기 플라스미드에 결합하나, 상기 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않는 F3, B3, FIP 및 BIP를 포함하는 LAMP 기반의 miRNA 검출용 키트.
검출대상 miRNA에 상응하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드; 및 상기 플라스미드에 결합하나, 상기 폴리뉴클레오타이드에는 결합하지 않는 F3, B3, FIP 및 BIP를 포함하는 LAMP 기반의 miRNA 검출용 조성물.