KR20170115377A - Preparing method of lps-treated adipose-derived stem cells conditioned medium and pharmaceutical composition cantaining the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 LPS 조정 배지의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 줄기세포를 성장시키는 단계; 상기 줄기세포에 TLR4 효능제(agonist)를 첨가하여 자극시키는 단계; 및 줄기세포로부터 분비된 세크리톰 및 배지를 획득하는 단계를 포함하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공하며, TLR4 효능제로 줄기세포를 자극하여 분비된 세크리톰 및 배지를 포함하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 최적의 배지 조건으로 간세포 재생 용도에 대하여 유용하게 사용될 수 있다.The present invention provides a method for preparing an LPS-conditioned medium and a pharmaceutical composition comprising the same. More particularly, the present invention relates to a method for producing stem cells comprising the steps of growing stem cells; Stimulating the stem cells by adding a TLR4 agonist; The present invention also provides a method for producing a medium for hepatocyte regeneration comprising culturing stem cells and secretory cells secreted from stem cells and culturing the stem cells. To provide a pharmaceutical composition. And can be usefully used for hepatocyte regeneration under the optimal culture conditions of the present invention.

Description

LPS 처리한 지방조직-유래 줄기세포 조정 배지의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물{PREPARING METHOD OF LPS-TREATED ADIPOSE-DERIVED STEM CELLS CONDITIONED MEDIUM AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CANTAINING THE SAME}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a method for preparing an adipose tissue-derived stem cell regulatory medium and a pharmaceutical composition containing the same,

본 발명은 지질다당류(LPS)를 처리한 지방조직-유래 줄기세포 조정 배지의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 지방조직-유래 줄기세포를 저용량 LPS 처리하여 배양한 조정 배지의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a lipid-tissue-derived stem cell regulating medium and a pharmaceutical composition containing the same, more specifically, a human adipose tissue-derived stem cell is cultured by low-dose LPS treatment And a pharmaceutical composition containing the same.

재생의학에 대한 가능성으로 간엽줄기세포(MSC)가 광범위하게 연구되어 왔다. MSC는 높은 유효성, 기능적 가소성 및 낮은 면역원성과 같은 다양한 장점을 가지고 있다. 상기와 같은 MSC의 다양한 가능성 및 장점에도 불구하고, 적은 침습적 방법(invasive method)으로 다량의 지방조직-유래 줄기세포(ASC)를 얻을 수 있는 지방 조직세포에 대한 연구가 점점 활발해지고 있는 실정이다. 또한, 미래 재생의학에 대해 주요한 후보물질로서 ASC의 가능성이 대두되고 있다.As a possibility for regenerative medicine, mesenchymal stem cells (MSC) have been extensively studied. MSCs have various advantages such as high efficacy, functional plasticity and low immunogenicity. Despite the various possibilities and advantages of the MSCs described above, studies on adipose tissue cells which can obtain a large amount of adipose tissue-derived stem cells (ASCs) by an invasive method are becoming more active. The possibility of ASC as a major candidate for future regenerative medicine is also emerging.

그러나, ASC를 이용한 전임상연구에서의 좋은 결과에도 불구하고, 이의 임상응용에 대해서는 여전히 낮은 성장 역학, 조기 노화(early senescence), 생체 내 확장에 대한 유전적 불안정성 및 악성 변환 가능성과 같은 다양한 한계 요인에 의해 제한되고 있다. 상기와 같은 한계 요인에 대한 회피 방안으로, 줄기세포-기반 치료적 활동의 주요 메커니즘인 세크리톰(secretome)을 이용할 수 있다. 세포 그 자체의 사용보다 MSC-분비 분자의 사용은 상기 세포-기반 치료의 장점은 유지한 채 한계점을 피할 수 있는 방법이 될 수 있다. However, despite good results in preclinical studies using ASC, its clinical applications still suffer from a variety of marginal factors such as low growth dynamics, early senescence, genetic instability to in vivo expansion, and malignant transformation potential . As a countermeasure to these limiting factors, the secretome, the main mechanism of stem cell-based therapeutic activity, can be used. The use of MSC-secretory molecules rather than the use of the cells themselves can be a way to avoid limitations while maintaining the advantages of such cell-based therapies.

부분 간절제술(PH) 또는 생체 간이식 후 간 재생능력의 향상은 특히, 간경변(cirrhosis) 또는 다른 기능적 간 장애 환자에서 주요한 문제이다. 최근 연구에서 쥐류(murine) 모델에서의 MSC의 정맥 내 투여가 독성-유발 간부전(toxin-induced hepatic failure) 또는 PH에서의 재생능력을 향상시킨다는 보고가 있었다. 더욱이, MSC를 대신한 세크리톰의 분리된 투여가 간 재상능력에서 동등한 효과를 보이는 것으로 나타났다.Improvement in partial hepatic resection (PH) or hepatic regeneration after liver transplantation is a major problem, especially in patients with cirrhosis or other functional liver disorders. Recent studies have reported that intravenous administration of MSC in a murine model improves toxin-induced hepatic failure or regenerative capacity in PH. Furthermore, separate dosing of SeCliTom in place of the MSC showed an equivalent effect on liver function.

ASC 세크리톰의 조성은 배양 조건에 따라 의존된다. 그러므로 최적의 배양 방법은 높은 치료적 가능성이 있는 세크리톰을 얻을 수 있는 가장 쉬운 방법이 될 수 있다. LPS는 대표적인 TLR4 효능제(agosnist)이며, MSC가 인터류킨-1-베타(IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12, I형 인터페론(IFN) 및 종양괴사인자-알파(TNF-α)와 같은 향염즘성 사이토카인(Proinflammatory cytokines)을 방출하도록 야기한다. 또한, 이식 전 저용량, 비-독성 LPS의 MSC 전처리는 다양한 기관에서의 조직 손상에 대한 저항성을 증가시킨다(Ha T et al. Cardiovasc Res. 2008;78:546-53). 이에 따라, ASC의 LPS 처리가 높은 간 재생능력을 가지는 세크리톰을 생성하는데 영향이 있다고 판단되어 진다.The composition of ASC secretory depends on culture conditions. Therefore, the optimal culture method can be the easiest way to obtain high therapeutic potential seq. LPS is a representative TLR4 agonist and MSC is a major TLR4 agonist and has been shown to inhibit the expression of IL-6, IL-8, IL-12, type I interferon (IFN) and tumor necrosis factor- gt; proinflammatory < / RTI > cytokines such as < RTI ID = 0.0 > In addition, MSC pretreatment of low-dose, non-toxic LPS prior to transplantation increases resistance to tissue damage in various organs (Ha T et al. Cardiovasc Res. 2008; 78: 546-53). Accordingly, it is judged that the LPS treatment of ASC has an influence on the generation of the secretory having high liver regeneration ability.

상기 종래의 문제점을 해결하기 위한 본 발명자들은 LPS 처리 조건하에서 ASC 세크리톰을 획득하고, 간 재생, 향염즘 및 기관 회복 능력에 대한 효과를 평가하였다. 또한, 본 발명은 간 회복에 효과가 있는 높은 수득율의 세크리톰을 얻는데 최적의 배지 조건을 확립하고자 하였다. In order to solve the above conventional problems, the present inventors obtained an ASC secretory under LPS treatment conditions and evaluated the effects on liver regeneration, aromatism and organ recovery ability. In addition, the present invention aims to establish a culture condition optimal for obtaining a high yield of secretory cells effective for liver recovery.

본 발명자들은 ASC 세크리톰의 조성이 배양 조건에 따라 의존되므로, 최적의 배양 방법을 확립하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, ASC의 LPS 처리가 높은 간 재생능력을 가지는 세크리톰을 생성하는데 주요한 영향을 주며, 상기 세크리톰이 간 회복에 효과가 있다는 점을 발견하였다.Since the composition of the ASC secretory depends on the culture conditions, the present inventors conducted various studies to establish an optimal culture method. As a result, it was found that the LPS treatment of ASC has a major influence on the generation of secretory cells having high liver regeneration ability, and the secretory cells are effective for liver recovery.

이에 따라, 본 발명은 LPS 처리한 지방조직-유래 줄기세포 조정 배지의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for preparing an adipocyte-derived stem cell regulatory medium and a pharmaceutical composition containing the same, which have been subjected to LPS treatment.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.Hereinafter, various embodiments described herein will be described with reference to the drawings. In the following description, for purposes of complete understanding of the present invention, various specific details are set forth, such as specific forms, compositions and processes, and the like. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and techniques of manufacture are not described in any detail, in order not to unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to "one embodiment" or "embodiment" means that a particular feature, form, composition, or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the invention. Accordingly, the appearances of the phrase " in one embodiment "or" an embodiment "in various places throughout this specification are not necessarily indicative of the same embodiment of the present invention. In addition, a particular feature, form, composition, or characteristic may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless defined otherwise in the specification, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

본 발명은 LPS 처리한 지방조직-유래 줄기세포 조정 배지의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing an adipose tissue-derived stem cell regulating medium and a pharmaceutical composition containing the same,

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 줄기세포를 성장시키는 단계; 상기 줄기세포에 TLR4 효능제(agonist)를 첨가하여 자극시키는 단계; 및 줄기세포로부터 분비된 세크리톰 및 배지를 획득하는 단계를 포함하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the present invention provides a method for producing a stem cell comprising the steps of growing a stem cell; Stimulating the stem cells by adding a TLR4 agonist; And a step of obtaining secretory cells and a medium secreted from stem cells.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 자극은 상기 TLR4 효능제를 0.1 내지 1.0ng/mL로 처리하는, 간세포 재생용 LPS 조정 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the stimulus treats the TLR4 agonist at 0.1 to 1.0 ng / mL, to provide a method for preparing an LPS conditioned medium for hepatocyte regeneration.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 자극은 상기 TLR4 효능제를 12 내지 48시간 동안 처리하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the invention, the stimulus provides a method of producing a medium for hepatocyte regeneration wherein the TLR4 agonist is treated for 12 to 48 hours.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 TLR4 효능제가 LPS, 부프레노르핀(Buprenorphine), 카르바마제핀(Carbamazepine), 펜타닐(Fentanyl), 레보르파놀(Levorphanol), 메타돈(Methadone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the invention, the TLR4 agonist according to the present invention is administered in combination with LPS, buprenorphine, carbamazepine, fentanyl, levorphanol, methadone, Wherein the culture medium is at least one selected from the group consisting of:

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 TLR4 효능제가 LPS인, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a medium for hepatocyte regeneration wherein the TLR4 agonist according to the present invention is LPS.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 줄기세포가 지방조직-유래 줄기세포인, 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition is provided wherein the stem cells according to the present invention are adipose tissue-derived stem cells.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 세크리톰이 상향-조절(up-regulated)되는, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다. In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a medium for hepatocyte regeneration wherein the secretory cells according to the present invention are up-regulated.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세크리톰이 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a medium for hepatocyte regeneration wherein the secretory is at least one selected from the group consisting of IL-6, TNF-a, HGF and VEGF.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 배지를 20 내지 30배로 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a medium for hepatocyte regeneration further comprising the step of concentrating the medium according to the present invention 20 to 30 times.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 TLR4 효능제로 줄기세포를 자극하여 분비된 세크리톰 및 배지를 포함하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, which comprises a secretory cell and a medium secreted by stimulating stem cells with a TLR4 agonist.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 TLR4 효능제를 0.1 내지 1.0ng/mL의 농도로 포함하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration comprising a TLR4 agonist according to the present invention in a concentration of 0.1 to 1.0 ng / mL.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 TLR4 효능제가 LPS, 부프레노르핀(Buprenorphine), 카르바마제핀(Carbamazepine), 펜타닐(Fentanyl), 레보르파놀(Levorphanol), 메타돈(Methadone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the invention, the TLR4 agonist according to the present invention is administered in combination with LPS, buprenorphine, carbamazepine, fentanyl, levorphanol, methadone, Wherein the pharmaceutical composition is at least one selected from the group consisting of:

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 TLR4 효능제가 LPS인, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein the TLR4 agonist according to the present invention is LPS.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 줄기세포가 지방조직-유래 줄기세포인, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for regenerating hepatocytes, wherein the stem cells according to the present invention are adipose tissue-derived stem cells.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 세크리톰이 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다. In one embodiment of the present invention, the secretory according to the present invention is at least one selected from the group consisting of IL-6, TNF-a, HGF and VEGF.

본 발명의 일 구체예에서, 마우스 간세포 AML12 세포가 높은 생존력을 보이는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein mouse hepatocyte AML12 cells exhibit high viability.

본 발명의 일 구체예에서, 부분 간 절제된 마우스에서 IL-6 및 TNF-α의 혈청 농도가 감소하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein the serum concentration of IL-6 and TNF-? Is reduced in a partially resected mouse.

본 발명의 일 구체예에서, 부분 간 절제된 마우스에서 Ki67-양성 세포 수가 증가하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein Ki67-positive cells are increased in a partially resected mouse.

본 발명의 일 구체예에서, 부분 간 절제된 마우스에서 PCNA의 발현이 증가하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein expression of PCNA is increased in a partially resected mouse.

본 발명의 일 구체예에서, 부분 간 절제된 마우스에서 p-STAT3의 발현이 증가하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein the expression of p-STAT3 is increased in a partially resected mouse.

본 발명의 일 구체예에서, 부분 간 절제된 마우스에서 높은 간 재생률(LW/BW)을 보이는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다.In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, which shows a high liver regeneration rate (LW / BW) in a partially resected mouse.

본 발명의 일 구체예에서, 부분 간 절제된 마우스에서 알라닌 아미노전이효소(ALT) 및 아스파라진산염 아미노전이효소(AST)의 혈청 농도가 감소하는, 간세포 재생용 약학 조성물을 제공한다. In one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration wherein the serum concentration of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in the partially hepatectomized mouse is decreased.

본 발명의 일 구체예에서, TLR4 효능제로 자극된 줄기세포로부터 분비된 세크리톰 및 배지를 포함하는, 분비물을 제공한다.In one embodiment of the invention, secretions are provided, including secretory cells and media secreted from stem cells stimulated with TLR4 agonists.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 TLR4 효능제를 0.1 내지 1.0ng/mL의 농도로 포함하는, 분비물을 제공한다.In one embodiment of the invention, there is provided a secretion comprising the TLR4 agonist at a concentration of 0.1 to 1.0 ng / mL.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. As used herein, the term "stem cell" refers to a cell capable of self-replicating and capable of differentiating into two or more cells, including totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells.

본 발명에서 사용하는 용어 "지방조직-유래 줄기세포(ASC)"란, 지방조직에서 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포를 의미한다. 통상적으로 ASC는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통하여 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 ASC로는 휴림바이오셀사에서 공급받은 인간 ASC(3계대)를 사용하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.The term "adipose tissue-derived stem cell (ASC) " used in the present invention means undifferentiated adult stem cells isolated from adipose tissue. Typically, the ASC can be obtained through conventional methods known in the art. The ASC according to the present invention employs the human ASC (3rd passage) supplied by Hurim biosell, but is not limited thereto.

본 발명에서 사용하는 용어 "LPS(지질다당류)"란, 대표적인 TLR4 효능제로서, 염증유발 인자의 생성을 유도하는 물질을 의미한다. 보다 구체적으로, LPS는 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN, TNF-α와 같은 향염증성 사이토카인의 생성을 촉진한다.As used herein, the term "LPS (lipopolysaccharide)" means a representative TLR4 agonist that induces the production of inflammatory factors. More specifically, LPS promotes the production of an inflammatory cytokine such as IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN and TNF-α.

본 발명에서 사용하는 용어 "조정 배지(conditioned medium, CM)"란, 세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말하는 것으로, 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 성장 인자, 사이토카인을 이용하는 것을 말한다. 본 발명의 일 구체예에서 "LPS-조정 배지(LPS-CM)"란, LPS 0.1ng/mL 내지 1.0ng/mL, 바람직하게는 0.5ng/mL로 12 내지 48시간, 바람직하게는 24시간 동안 자극시킨 후, ASC로부터 얻어진 20 내지 30배, 바람직하게는 25배로 농축된 조정 배지를 의미한다.The term "conditioned medium (CM) " used in the present invention refers to a medium in which cells are exchanged with a serum-free medium after reaching the logarithmic growth phase, which is the highest cell division period, and only the culture medium is collected. Refers to the use of growth factors and cytokines extracted from the medium. In one embodiment of the present invention, "LPS-conditioned medium (LPS-CM)" refers to a medium containing LPS at a concentration of 0.1 ng / mL to 1.0 ng / mL, preferably 0.5 ng / mL for 12 to 48 hours, Means conditioned medium enriched to 20-30 times, preferably 25 times, as obtained from ASC after being stimulated.

본 명세서에서 사용하는 용어 "세크리톰(secretome)"이란, 일반적으로 줄기세포에서 분비되거나 표면에 존재하는 분자의 집합으로써, 분비물을 의미한다. 세크리톰에는 사이토카인, 케모카인 및 성장인자와 같은 생물활성 펩티드(bioactive peptide)를 포함한다. 본 발명에 따른 세크리톰으로는 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF가 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. As used herein, the term "secretome" refers to a secretion, generally a collection of molecules secreted or present on a surface of a stem cell. Seqrimont includes bioactive peptides such as cytokines, chemokines, and growth factors. The secretory according to the present invention includes, but is not limited to, IL-6, TNF-a, HGF and VEGF.

본 명세서에서 사용하는 용어 "부분 간 절제된 마우스(hepatectomized mice)"란, 간의 약 70%를 PH 실시한 마우스를 의미한다. As used herein, the term " hepatectomized mice "refers to mice that have been subjected to PH by about 70% liver.

본 발명에서 사용하는 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 물질 또는 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비 경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 피내 또는 뇌혈관내 경로를 통하여 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 투여는 정맥 내 투여를 하는 것이 바람직하다.The term "administration " as used herein refers to the introduction of a substance or composition into a subject by any suitable method, and the administration route of the composition may be administered through various routes, oral or non-oral, And can be administered in a conventional manner via oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intranasal, inhalation, intradermal or intracerebral routes. The administration according to the present invention is preferably intravenous administration.

본 명세서에서 사용하는 용어 "발현의 증가"란 정상 또는 대조군에 비하여 유전자 또는 단백질의 발현이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가하는 것을 의미하며，보다 구체적으로는 통계학적 비교에서 P 값의 확률치가 0.05 미만인 경우를 말한다.As used herein, the term "increased expression" means that the expression of a gene or protein is significantly increased as compared to a normal or control group. More specifically, in a statistical comparison, when the probability value of the P value is less than 0.05 .

본 명세서에서 사용하는 용어 "mRNA 발현"이란, 생물학적 시료에서　특정 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 의미하는 것으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term " mRNA expression "means the presence and expression level of mRNA of a specific marker gene in a biological sample and can be determined by measuring the amount of mRNA. RT-PCR, Competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, and RNase protection assay (RPA). RNase protection assay, northern blotting or DNA chip, but are not limited thereto.

본 발명에 따른 간 기능을 평가할 수 있는 마커로서, 상기 세크리톰인 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF 이외에, p-STAT3, 간 재생의 안정된 마커인 PCNA, 리보솜 RNA의 전사와 관련된 핵단백질인 항원 Ki67에 대한 Ki-양성 세포, 간 손상 및 간기능장애의 생화학적 표지인 ALT 및 AST가 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.In addition to the secretory proteins IL-6, TNF-α, HGF and VEGF, p-STAT3, a stable marker for liver regeneration, PCNA, nuclear proteins associated with transcription of ribosomal RNA But are not limited to, Ki-positive cells against phosphorus antigen Ki67, ALT and AST, biochemical markers of liver damage and liver dysfunction.

본 발명에 따른 LPS를 처리한 지방조직-유래 줄기세포 조정 배지의 제조 방법을 적용할 경우, 다양한 세크리톰 및 마커들의 수 또는 발현이 증가하고, 세포의 생존력 또한 증가하여, 이에 따라 간 재생, 향염즘 및 기관 회복 능력에 대한 우수한 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 최적의 배지 조건으로 간세포 재생 용도에 대하여 유용하게 사용될 수 있다.When the method for preparing an adipose tissue-derived stem cell regulating medium treated with LPS according to the present invention is applied, the number or expression of various secretory and markers is increased and the viability of the cells is also increased, It has excellent effects on the ability of the dental arch and the organ recovery. Therefore, it can be usefully used for hepatocyte regeneration under the optimal culture conditions of the present invention.

도 1은 본 발명에 따른 향염즘성 사이토카인의 mRNA 발현 및 분비에 대한 LPS 처리 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 정상 및 간독성 작용제-처리 마우스 간세포의 생존에 대한 CM 및 LPS-CM의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 부분 간 절제된 마우스에서의 IL-6 및 TNF-α의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 부분 간 절제된 마우스에서의 간 재생에 대한 CM 및 LPS-CM의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 부분 간 절제 마우스에서 AST 및 ALT의 혈청 수준에 대한 CM 및 LPS-CM의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 LPS 농도 차이에 따른 AML12에서의 증식 변화를 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the effect of LPS treatment on the expression and secretion of mRNA of a flavonoid cytokine according to the present invention.
Figure 2 shows the effect of CM and LPS-CM on the survival of normal and hepatotoxic agonist-treated mouse hepatocytes according to the present invention.
Figure 3 shows the serum concentrations of IL-6 and TNF- [alpha] in fractionally resected mice according to the present invention.
Figure 4 shows the effect of CM and LPS-CM on liver regeneration in partially resected mice according to the present invention.
Figure 5 shows the effect of CM and LPS-CM on serum levels of AST and ALT in a partial liver resection mouse according to the invention.
Fig. 6 shows the proliferation change in AML12 according to the LPS concentration difference.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example 1: 지방조직-유래 줄기세포의 배양 1: Culture of adipose tissue-derived stem cells

인간 ASC(3계대)를 휴림바이오셀(서울, 한국)로부터 제공받았다. 휴림바이오셀(한국 질병관리본부 등록번호: 1-700069-B-N-01)의 기관감사위원회로부터 인간 ASC의 성과를 승인받았고, 모든 환자로부터 사전동의를 얻었다. 배양된 ASC는 MSC 표현형을 보인다: MSC 마커 CD90이 발현되고, 조혈 마커(hematopoietic marker) CD31 및 CD34는 발현되지 않는다. ASC를 배양하였고, 기존의 방법으로 ASC 세크리톰을 준비하였다. Human ASC (3 passages) were received from Hurim Biocell (Seoul, Korea). Human ASC was approved by the Institutional Audit Committee of Hurim Biocell (Korea Institute of Disease Control and Registration, Korea: 1-700069-B-N-01) and obtained prior consent from all patients. Cultured ASC shows the MSC phenotype: MSC marker CD90 is expressed, hematopoietic markers CD31 and CD34 are not expressed. ASC was cultured, and ASC secretory cells were prepared by conventional methods.

실시예Example 2:  2: LPSLPS -CM의 제조Manufacturing of -CM

ASC를 100mm 세포 디쉬(코닝글라스워크스, 코닝, 뉴욕, 미국)에서 성장시켰다. 70% 내지 80%의 융합(confluence)에 도달한 후, 5.0x105개의 ASC를 낮은 농도의 LPS(0.5ng/mL; 시그마-알드리치, 세인트 루이스, 미주리, 미국)를 포함하거나 포함하지 않는 무-혈청 저-글루코스 둘베코 변형 이글 배지(serum-free low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)(써모 사이언티픽, 헤멜 헴프스테드, 영국) 5mL에서 24시간 동안 배양하였다. MSC의 정맥 내 투여를 포함한 다양한 실험에서, 1x105 내지 1.0x106개의 MSC 0.1mL를 마우스 내 주입하는데 사용하였다. 본 발명의 프로토콜에서는, 5.0x105 ASC에서의 세크리톰을 DMEM 5mL에서 배양하였다. 이에 따라, 세크리톰 동액(equivalent amount)(0.1mL)을 얻기 위해서, 조정 배지를 LPS를 포함하거나 포함하지 않은 자극 후, 한외여과 단위(ultrafiltration unit) 3kDa 분자량 컷오프(아미콘 울트라-PL3; 밀리포어, 베드퍼드, 메사추세츠, 미국)를 이용하여 상기 조정 배지를 25배 농축하였다. 여기서, LPS-CM 및 CM은 24시간 동안 LPS를 포함하거나 포함하지 않은 자극 후 ASC로부터 얻어진 25배 농축된 조정 배지를 의미한다. ASCs were grown in 100 mm cell dishes (Corning Glass Works, Corning, NY, USA). After reaching a confluence of 70% to 80%, 5.0 x 10 < 5 > ASC was diluted in serum-free low-glucose Dulbecco's modified Eagle's (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) with or without low concentrations of LPS medium, DMEM) (Thermo Scientific, Hemel Hempstead, UK) for 24 hours. In a variety of experiments, including intravenous administration of MSCs, 1 x 10 5 to 1.0 x 10 6 0.1 mL of MSC was used to inject into the mice. In the protocol of the present invention, the secretin in 5.0 x 105 ASC was cultured in 5 mL DMEM. Thus, in order to obtain an equivalent amount (0.1 mL) of Seqrimom, the conditioned media was subjected to stimulation with or without LPS in the ultrafiltration unit 3 kDa molecular weight cutoff (Amicon Ultra-PL3, Millipore , Bedford, Mass., USA) was used to concentrate the conditioned medium 25-fold. Here, LPS-CM and CM mean conditioned media 25 times concentrated from ASC after stimulation with or without LPS for 24 hours.

실시예Example 3: 부분 간 절제된 마우스 내 3: Partially resected mouse CM 및 CM and LPSLPS -CM의-CM's 정맥 내 투여Intravenous administration

사례조절연구(case-control study)를 통하여 8주 된 수컷 BALB/c 마우스(Damool Science, Daejeon, Korea)를 이용한 CM 및 LPS-CM의 정맥 내 투여 효과를 평가하였다. 본 연구는 한국의 가톨릭 대학교에 있는 대전 세인트 메리스 병원의 임상의학연구소의 동물실험윤리위원회(기관감사위원회 #CMCDJ-AP-2014-007)에서 승인받았다. 동물을 병원균 부재(pathogen-free) 환경에서 사육하였고, 미국국립과학아카데미(National Institutes of Health publication 86-23, 1985 revision)에 의한 실험동물의 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 인도적 관리를 하였다. 약 70%의 부분 간절제술(PH)을 틸레타민-졸라제팜(tiletamine-zolazepam) 진정제(30mg/kg 복강 내 조레틸; 버박, 니스, 프랑스) 조건하에서 수행하였다. 간 재생을 간 중량에 대한 체중(LW/BW)의 비율(퍼센트)로 발현시켰다. PH 후 1시간 이내, 마우스를 4개의 실험군으로 나누고, 0.1mL의 저-글루코스 DMEM(대조군), 저-글루코스 DMEM 내 0.5ng/mL의 LPS(LPS군), CM(CM군) 및 LPS-CM(LPS-CM군)을 정맥 내 투여하였다. 각 군은 25마리 마우스를 포함하고(전체 100마리) 두 개의 하위군(subgroup)으로 분류하였다: 하나의 하위군은 아스파라진산염 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 혈청 수준과 같은 혈청 테스트(serology) 내 연속된 변화를 평가하는데 사용하였으며(n=5), 다른 하위군은 물질 투여 후 효소면역측정법(ELISA) 및 특정 시점(1, 2, 3 및 7일)에 대한 조직 표본에 대한 혈청을 얻는데 이용하였다(n=20).A case-control study was conducted to evaluate the effects of intravenous administration of CM and LPS-CM on 8-week-old male BALB / c mice (Damool Science, Daejeon, Korea). This study was approved by the Animal Experimental Ethics Committee (Institutional Audit Committee # CMCDJ-AP-2014-007) of the Institute of Clinical Medicine, Daejeon St. Mary's Hospital, Catholic University, Korea. Animals were raised in a pathogen-free environment and humanitarian management was conducted according to guidelines for the management and use of experimental animals by the National Institutes of Health publication 86-23, 1985 revision. Approximately 70% partial hepatectomy (PH) was performed under the condition of a tiletamine-zolazepam sedative (30 mg / kg intraperitoneally administered retort; Liver regeneration was expressed as a ratio (percent) of body weight (LW / BW) to liver weight. (LPS group), CM (group CM), and LPS-CM (control group) in 0.1 mL of low-glucose DMEM (control), 0.5 ng / (LPS-CM group) were intravenously administered. Each group was divided into two subgroups, each containing 25 mice (100 total). One subgroup was the serum level of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) (N = 5), and the other subgroups were used for enzyme immunoassay (ELISA) and at the time point (1, 2, 3 and 7 days) (N = 20) were used to obtain serum for tissue samples.

실시예Example 4: 분석평가 4: Analysis evaluation

실시예Example 4-1: 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 4-1: Real-time quantitative polymerase chain reaction

전체 ASC RNA를 TRIzol 시약(인비트로겐, 써모피셔사이언티픽 부, 월섬, 메사추세츠, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였다. 역전사를 1㎍ RNA, 랜덤 프라이머 및 M-MLV 역전사효소(프로메가, 매디슨, 위스콘신, 미국)로 수행하였다. SYBR 그린 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)에 사용된 프라이머는 다음과 같다: IL-6 정방향 5'-CACACAGACAGCCACTCACC-3' 및 역방향 5'-TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT-3'; TNF-α 정방향 5'-AACCTCCTCTCTGCCATCAA-3' 및 역방향 5'- GGAAGACCCCTCCCAGATAG-3'; 혈관표피성장인자(VEGF) 정방향 5'-TCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3' 및 역방향 5'-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-3'; 간세포성장인자(HGF) 정방향 5'- TGCTGTCCTGGATGATTTTG-3' 및 역방향 5'-AGTGTAGCCCCAGCCATAAA-3'; 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 정방향 5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' 및 역방향 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'. 상기 반응을 96-웰 광반응(optical reaction) 플레이트 리더를 갖춘 어플라이드 바이오시스템즈 7500 패스트 실시간 PCR 시스템(라이프 테크놀로지스, 칼즈배드, 캘리포니아, 미국)을 이용하여 수행하였다. 표적 유전자의 발현 수준을 비교 역치 사이클 방법(comparative threshold cycle method)를 이용하여 계산하였고, GAPDH 하우스키핑 유전자로서 GAPDH로 정규화하였다. 세 개의 독립된 실험의 데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. Total ASC RNA was extracted using TRIzol reagent (Invitrogen, Thermofisher Scientific, Waltham, Mass., USA) according to the manufacturer's instructions. Reverse transcription was performed with 1 ug of RNA, random primers and M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA). The primers used for the SYBR green real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) were: IL-6 forward 5'-CACACAGACAGCCACTCACC-3 'and reverse 5'-TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT-3'; TNF-α forward 5'-AACCTCCTCTCTGCCATCAA-3 'and reverse 5'-GGAAGACCCCTCCCAGATAG-3'; Vascular endothelial growth factor (VEGF) forward 5'-TCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3 'and reverse 5'-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-3'; Hepatocyte growth factor (HGF) forward 5'-TGCTGTCCTGGATGATTTG-3 'and reverse 5'-AGTGTAGCCCCAGCCATAAA-3'; And glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) forward 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 'and reverse 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'. The reactions were performed using an Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA) equipped with a 96-well optical reaction plate reader. The expression level of the target gene was calculated using the comparative threshold cycle method and normalized to GAPDH as the GAPDH housekeeping gene. Data from three independent experiments are presented as means ± SD.

실시예Example 4-2: 효소면역측정법 4-2: Enzyme immunoassay

생체 외 실험에서, CM 및 LPS-CM를 각 디쉬에 수집하여 1,500rpm으로 5분 동안 원심분리 하였고, 인간 IL-6 방출을 제조사의 지침에 따른 ELISA 키트(이바이오사이언스, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국)를 이용하여 측정하였다. 생체 내 실험에서, 마우스 IL-6 및 TNF-α의 농도를 부분 간 절제된 마우스의 혈청 내에서 대조 배지, LPS, CM 및 LPSCM을 주입한 후 1, 2 및 3일에 ELISA 키트(이바이오사이언스 및 바이오레전드, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국)를 이용하여 결정하였다.In vitro experiments, CM and LPS-CM were collected in each dish and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes and human IL-6 release was measured by ELISA kit (BioScience, San Diego, Calif., USA) . In vivo experiments, the concentrations of mouse IL-6 and TNF-a were measured by ELISA kit (Bioscience and Biotechnology) at 1, 2 and 3 days after injection of control media, LPS, CM and LPSCM in serum of partially hepatectomized mice Bio Legend, San Diego, CA, USA).

실시예Example 4-3: 세포 생존력 분석법 4-3: Cell viability assay

비종양 마우스 세포주 AML12(CRL-2254)를 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀(매나사스, 버지니아, 미국)에서 구입하였고 10% 소태아혈청(인비트로겐), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄-G 보충(insuline transferrin-selenium-G supplement)(인비트로겐), 40ng/mL 덱사메사손(시그마-알드리치) 및 100ng/mL 암포테리신 B(인비트로겐)로 충진된 DMEM/Ham F12(인비트로겐)에서 유지시켰다. AML12 세포를 웰 당 1×104개의 세포로 96-웰 플레이트 내에 도포하였고, 하룻밤 동안 부착(adhere)시켰다. 그 후, CM 또는 LPS-CM를 첨가하였고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. TLR4 배양 시험에서, CM 또는 LPS-CM으로의 배양 이전에, 세포를 비히클 대조(vehicle control)로서 TLR4 억제제 TAK-242(1μM; 칼바이오캠, 라호이아, 캘리포니아, 미국) 또는 디메틸 설폭사이드(시그마-알드리치)로 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 간세포 독성을 50mM 티오아세트아미드(TAA)(시그마-알드리치)의 존재하에서 AML12 세포를 유지시킴으로써 유도하였다. 정상 및 TAA-처리 AML12 세포를 대조 배지, LPS(0.5ng/mL), CM 및 LPS-CM에서 배양하였고, 세포 생존력을 Ez-Cytox 세포 생존 분석 키트(대일랩서비스, 서울, 한국)를 이용하여 조사하였다.Non-tumor mouse cell line AML12 (CRL-2254) was purchased from American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) and incubated with 10% fetal bovine serum (Invitrogen), 1x insulin transferrin- were maintained in DMEM / Ham F12 (Invitrogen) filled with 40 ng / mL dexamethasone (Sigma-Aldrich) and 100 ng / mL amphotericin B (Invitrogen). AML12 cells were seeded at 1 x 10 < RTI ID = 0.0 > Cells were plated in 96-well plates and adhered overnight. CM or LPS-CM was then added and incubated at 37 [deg.] C for 24 hours. Prior to incubation with CM or LPS-CM, cells were cultured in the TLR4 culture test using the TLR4 inhibitor TAK-242 (1 [mu] M (Calbiochem, Lahia, Calif., USA) or dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich) for 1 hour. Hepatocellular toxicity was then induced by maintaining AML12 cells in the presence of 50 mM thioacetamide (TAA) (Sigma-Aldrich). Normal and TAA-treated AML12 cells were cultured in control medium, LPS (0.5 ng / mL), CM and LPS-CM, and cell viability was measured using an Ez-Cytox cell survival assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea) Respectively.

실시예Example 4-4:  4-4: Ki67Ki67 발현의 면역조직화학( Immunohistochemistry of expression ( ImmunohistochemicalImmunohistochemical ) 분석) analysis

파라핀-임배디드 조직 절편을 크실렌(xylene) 내에서 탈파라핀화(deparaffinized)하였고 알코올의 급에 따라 재수화(rehydrated)하였다. 시료를 0.01M 시트레이트 버퍼(pH 6.0)로 오토클레이브(CHS-ACCE-860; JW 제약, 서울, 한국)에서 121℃로 5분 동안 가열하여 항원을 회수(retrieved)하였다. 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase)를 비활성시키기 위하여 상기 절편을 3% 과산화수소에 5분 동안 두었고, 10분 동안 단백질 블록 무혈청 용액(다코, 글로스트럽, 덴마크)으로 블록시키고, Ki67 핵항원에 대한 일차 래빗 다클론성 항체(1:300; 압캠, 케임브리지, 메사추세츠, 미국)로 증식세포를 검출하기 위하여 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였다. 슬라이드를 비오틴닐화(biotinylated) 이차 항체로 30분 동안 실온에서 처리하였고, 스트렙타아비딘-호스라디시 페록시다아제(HRP) 및 3,3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 용액(다코)으로 추가의 10분 동안 실온에서 처리하였고, 헤마토자일린(hematoxylin)으로 대조염색을 실시하였다.The paraffin-embedded tissue sections were deparaffinized in xylene and rehydrated according to the alcohol level. The sample was heated at 121 ° C for 5 minutes in an autoclave (CHS-ACCE-860; JW Pharma, Seoul, Korea) with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) to retrieve the antigen. To inactivate endogenous peroxidase, the sections were placed in 3% hydrogen peroxide for 5 minutes, blocked with protein block serum-free solutions (Dako, Glostrup, Denmark) for 10 minutes, and incubated with Ki67 nuclear antigen Were incubated at 4 [deg.] C overnight to detect proliferating cells with a primary rabbit polyclonal antibody (1: 300; Volcam, Cambridge, Mass., USA). The slides were treated with a biotinylated secondary antibody for 30 minutes at room temperature and added with streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) and 3,3'-diaminobenzidine solution (Dako) For 10 min at room temperature, and subjected to contrast dyeing with hematoxylin.

실시예Example 4-5:  4-5: 웨스턴Western 블롯Blot 분석 analysis

간세포 독성에 대한 CM 및 LPS-CM의 효과를 생체 외(TAA-처리 AML12 세포) 및 생체 내(부분 간 절제된 마우스) 실험에서 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 평가하였다. TAA-처리 AML12 세포를 DMEM, LPS, CM으로 배양하였고, LPS-CM를 EzRIPA 용해 키트(아토 코퍼레이션, 도쿄, 일본)를 이용하여 용해하고, 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 수집하였다. 간조직을 용해 버퍼(로슈진단 생명과학, 인디애나폴리스, 인디애나, 미국) 내 용해시켰다. 용해물(lysate) 내 단백질 농도를 브래드포드 시약(Bradford reagent)(바이오-라드 래버러토리스, 허큘레스, 캘리포니아, 미국). 웰 당 동일한 양의 단백질(30㎍)을 SDS-PAGE로 분리하였고, 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 우유로 블록 된 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)으로 전자-이동(electro-transferred)시키고, 증식세포핵항원(PCNA), p-STAT3(Tyr705), STAT3 및 β-액틴에 대한 일차 항체(1:1,000 희석)로 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, HRP-접합 이차 항-래빗 및 항-마우스 IgG(1:2,000 희석)로 1시간 동안 실온에서 배양하였다(셀 시그널링, 비벌리, 메사추세츠, 미국). 특정 면역복합체를 웨스턴 블롯 플러스 화학발광 시약(Western Blotting Plus Chemiluminescence Reagent)(Millipore)을 이용하여 검출하였다.The effects of CM and LPS-CM on hepatocellular toxicity were evaluated using western blot analysis in vitro (TAA-treated AML12 cells) and in vivo (partially hepatectomized) experiments. TAA-treated AML12 cells were cultured in DMEM, LPS, and CM. LPS-CM was dissolved in an EzRIPA dissolution kit (Ato Corporation, Tokyo, Japan), centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes, Respectively. Liver tissue was lysed in lysis buffer (Roche Diagnostics Life Sciences, Indianapolis, Ind., USA). Bradford reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif., USA) was used as the protein concentration in the lysate. The same amount of protein (30 μg) per well was separated by SDS-PAGE and electro-transferred to a nitrocellulose membrane blocked with 5% non-fat milk for 1 hour at room temperature, The cells were incubated overnight at 4 ° C with primary antibody (1: 1,000 dilution) against the nucleus antigens (PCNA), p-STAT3 (Tyr 705 ), STAT3 and β-actin, HRP- conjugated secondary anti- rabbit and anti- mouse IgG (1: 2, 000 dilution) for 1 hour at room temperature (Cell Signaling, Beverly, Mass., USA). Specific immune complexes were detected using Western Blotting Plus Chemiluminescence Reagent (Millipore).

실시예Example 4-6: 간 기능 평가 4-6: Evaluation of liver function

혈액 샘플을 각 마우스로부터 채취하였고, 10분 동안 10,000rpm에서 원심분리한 후, 혈청을 수집하였다. 간 손상의 지표인 아미노전이효소 AST 및 ALT의 농도를 Idexx VetTest 화학분석기(아이덱스 래보러토리즈, 웨스트브룩, 메인, 미국)를 이용하여 측정하였다.Blood samples were taken from each mouse, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and serum was collected. The levels of aminotransferase AST and ALT, indicators of liver damage, were measured using an Idexx VetTest chemistry analyzer (Idex Laboratories, Westbrook, Maine, USA).

실시예Example 4-7: 통계학적 분석 4-7: Statistical analysis

모든 데이터를 SPSS 11.0 소프트웨어(SPSS Inc., 시카고, 일리노이, 미국)를 이용하여 분석하였고, 평균±표준편차로 나타내었다. 군 간의 통계학적 비교를 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 및 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검증을 이용하여 수행하였다; 만-휘트니 U 검정을 두 개의 군 간의 평균값을 비교하기 위하여 사용하였고, 크러스칼-왈리스 검정을 세 개 이상의 군 간의 평균값을 비교하기 위하여 사용하였다. P 값의 확률치가 0.05 미만이면 통계학적으로 유의하다고 판단하였다.All data were analyzed using SPSS 11.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) and expressed as mean ± SD. Statistical comparisons between groups were performed using Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U tests; The Whitney U test was used to compare the mean values between the two groups and the Kruskal-Wallis test was used to compare the mean values between three or more groups. P value less than 0.05 was considered statistically significant.

분석결과Analysis

향염즘성Flavoriness 사이토카인의  Cytokine mRNAmRNA 발현 및 분비에 대한  For expression and secretion LPSLPS 처리 효과 Treatment effect

실시간 정량 중합효소 연쇄반응을 통하여 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF의 mRNA 발현을 결정하였다. 0.5ng/mL의 LPS에서 상기 마커들의 mRNA 발현이 증가하였고 그 후 발현이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 1A). 이는 저용량 LPS가 상기 매개체의 mRNA의 발현을 상향조절(up-regulate) 한다는 것을 알 수 있다. 0.5ng/mL의 LPS로 유지된 LPS-CM 및 0.5ng/mL의 LPS가 없는 CM에서의 인간 ASC 내에 인간 IL-6 농도를 측정하였다. IL-6 발현 수준이 LPS-CM에서 6.19ng/mL로 CM에서 1.65ng/mL 보다 유의하게 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다(P<0.05)(도 1B).The mRNA expression of IL-6, TNF-α, HGF and VEGF was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction. MRNA expression of the markers was increased in 0.5ng / mL of LPS and thereafter the expression was decreased (Fig. 1A). It can be seen that low-dose LPS up-regulates the expression of mRNA of the mediator. Human IL-6 levels were measured in human ASCs in CM without LPS-CM maintained at 0.5 ng / mL of LPS and 0.5 ng / mL of LPS. IL-6 expression level was 6.19 ng / mL in LPS-CM and significantly higher than 1.65 ng / mL in CM (P <0.05) (Fig. 1B).

정상 및 Normal and 티오아세트아미드Thioacetamide -처리 -process AML12AML12 세포에서의 CM 및  CM &lt; / RTI &gt; LPSLPS -CM의 효과Effect of -CM

마우스 간세포 AML12 세포의 증식에 대한 CM 및 LPS-CM의 효과를 조사하였다. 정상 및 TAA-처리 마우스 AML12 세포를 대조 배지, LPS, CM 및 LPS-CM에서 배양하였고, 세포 생존력을 결정하였다. 정상 및 TAA-처리 AML12 세포에서 모두 LPS-CM군이 가장 높은 생존력(각각 106.5% 및 69.6%)을 보이는 것을 확인할 수 있었다(P<0.05)(도 2A). 또한, TLR4 억제제인 TAK-242를 이용하여 LPS-CM이 LPS가 아닌 LPS-CM에 의하여 효과가 있다는 것을 입증하기 위하여 실험을 수행하였다. LPS 신호는 다수의 향염즘성 매개체의 생성물과 함께 TLR4에 의하여 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 그러므로, LPS 신호를 블록시키기 위해서, TAK-242를 대조 배지, LPS, CM 및 LPS- CM에서 배양된 TAA-처리 AML12 세포로 충진하였다. TAK-242 처리는 LPS 또는 LPS-CM군에서 유의한 변화를 보이지 않았고, LPS-CM 효과 및 LPS/TLR4 신호간의 관련이 없다고 판단된다. p-STAT3의 발현 수준은 비처리 AML12 세포에 대하여 TAA-처리 AML12 세포에서 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다. 그러나, LPS-CM이 p-STAT3의 발현을 증가시키는 것과 달리 CM에서는 반대의 결과를 보였다. 또한, TAK-242 처리는 LPS-CM군에서의 p-STAT3 발현의 유의한 변화를 보이지 않았다(도 2B). 또한, AML12에서 LPS 농도 차이에 따른 증식률(proliferation rate)을 확인한 결과, 본 발명의 조건인 LPS 0.5ng/ml에서 세포의 증식이 가장 많은 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 6).The effects of CM and LPS-CM on proliferation of mouse hepatocyte AML12 cells were investigated. Normal and TAA-treated mouse AML12 cells were cultured in control media, LPS, CM and LPS-CM and cell viability was determined. The highest viability (106.5% and 69.6%, respectively) of the LPS-CM group was observed in both normal and TAA-treated AML12 cells (P <0.05) (FIG. 2A). In addition, an experiment was conducted to demonstrate that LPS-CM is effective by LPS-CM rather than LPS using the TLR4 inhibitor TAK-242. The LPS signal was confirmed to be influenced by TLR4 along with the product of a number of aromatic mediators. Therefore, to block the LPS signal, TAK-242 was filled with TAA-treated AML12 cells cultured in control media, LPS, CM, and LPS-CM. TAK-242 treatment did not show any significant change in LPS or LPS-CM group, and it was judged that there was no correlation between LPS-CM effect and LPS / TLR4 signal. The level of expression of p-STAT3 was significantly reduced in TAA-treated AML12 cells versus untreated AML12 cells. However, LPS-CM increased the expression of p-STAT3, whereas CM showed the opposite result. In addition, TAK-242 treatment did not show significant changes in p-STAT3 expression in the LPS-CM group (Fig. 2B). Further, as a result of confirming the proliferation rate according to the difference in LPS concentration in AML12, it was confirmed that the cell proliferation was most increased at 0.5 ng / ml of LPS which is the condition of the present invention (Fig. 6).

부분 간 절제된 마우스에서의 In partial hepatectomized mice 향염즘성Flavoriness 사이토카인의 분비에서의  In the secretion of cytokines LPSLPS -CM의 효과Effect of -CM

CM 또는 LPS-CM의 주입이 부분 간 절제된 마우스의 IL-6 및 TNF-α의 혈청 농도에 변화가 있는지 확인하였다. 도 3은 혈청 IL-6 및 TNF-α 수준이 PH 후 2일에 최대를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 LPS-CM의 투여는 대조 배지, LPS 및 CM에 대하여 IL-6 및 TNF-α의 수준을 효과적으로 낮추는 것을 확인할 수 있었다(P<0.05). PH 3일 후, 상기 변화는 사라지는 것을 확인할 수 있다. 그러나 CM군에 대하여 LPS-CM군에서의 IL-6 농도는 PH 3일 후에도 여전히 유의하게 낮은 수준을 보이는 것을 확인할 수 있다(P<0.05).CM or LPS-CM infusion was found to alter serum concentrations of IL-6 and TNF-alpha in partially resected mice. FIG. 3 shows that serum IL-6 and TNF-alpha levels peaked at 2 days after PH. However, administration of LPS-CM was found to effectively lower IL-6 and TNF-α levels in control media, LPS and CM (P <0.05). After 3 days of PH, the change disappears. However, IL-6 levels in the LPS-CM group were still significantly lower in the CM group after PH 3 (P <0.05).

PHPH 후 간 재생에 대한 CM 및  CM for late regeneration and LPSLPS -CM의 효과Effect of -CM

부분 간 절제된 마우스에서의 간 재생에 대한 CM 및 LPS-CM 처리의 효과를 다음과 같이 조사하고 도 4에 나타내었다: (1) PH 후 1, 2, 3 및 7일에 간 내 Ki67-양성 세포 수의 면역조직화학 평가; (2) PH 후 2일에 PCNA 발현에 대한 웨스턴 블롯; 및 (3) PH 후 7일에 간 중량 측정.The effects of CM and LPS-CM treatment on hepatic regeneration in partially hepatectomized mice were investigated as follows and shown in Figure 4: (1) intrahepatic Ki67-positive cells at 1, 2, 3 and 7 days post- Immunohistochemical evaluation of vesicles; (2) Western blot for expression of PCNA on day 2 post-PH; And (3) liver weight measurement at 7 days after PH.

항원 Ki67은 리보솜 RNA의 전사와 관련된 핵단백질이며, 이에 따라, 증식세포에서 독점적으로 발현된다. 도 4A는 PH 후 1일에 Ki67-표지된 간세포의 절편을 나타낸 것이다. 도 4B에서 Ki67-양성 세포수는 대조군, LPS군, CM군 및 LPS-CM군에서 모두 2일에 가장 높게 나타나며, 그 후 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한, PH 후 1, 2 및 3일에 대조, LPS 및 CM 마우스에 대하여 LPS-MC 마우스는 Ki67-양성 세포수가 유의하게 높은 것으로 입증되었다(P<0.05). 그러나 7일에, CM군 및 LPS-CM군 간의 Ki67-양성 세포수는 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다. The antigen Ki67 is a nuclear protein involved in the transcription of ribosomal RNA and is therefore exclusively expressed in proliferating cells. FIG. 4A shows a section of Ki67-labeled hepatocytes at day 1 after PH. In Fig. 4B, the number of Ki67-positive cells was highest at 2 days in the control, LPS, CM, and LPS-CM groups, and then decreased. In addition, LPS-MC mice showed a significantly higher number of Ki67-positive cells (P < 0.05) than LPS and CM mice at 1, 2 and 3 days post-PH. However, at day 7, there was no significant difference in the number of Ki67-positive cells between the CM group and the LPS-CM group.

PCNA의 간세포 발현은 간 재생의 안정된 마커이다. PH 후 2일에, 웨스턴 블롯의 결과로 LPS-CM 마우스가 가장 높은 PCNA 단백질 수준을 보이며, 그 다음으로 CM군에서 높은 수준을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 경향이 p-STAT3 발현에서도 보여, LPS-CM-주입 마우스에서 가장 높은 발현을 보이며 CM-주입 마우스가 그 다음으로 높은 발현을 나타내었다(도 4C).Hepatocyte expression of PCNA is a stable marker of liver regeneration. As a result of Western blot on day 2 after PH, LPS-CM mice showed the highest PCNA protein level, followed by CM group. These trends were also observed in p-STAT3 expression, showing the highest expression in LPS-CM-injected mice and the next highest expression in CM-injected mice (Fig. 4C).

간 재생을 PH 7일 후 LW/BW 비율을 기반으로 평가하였다. 간 재생률이 대조군, LPS군, CM군 및 LPS-CM군에서 각각 2.55±0.25, 2.51±0.47, 3.23±0.08 및 3.73±0.33으로 계산되었으며, 여기서 LPS-CM군에서 가장 높은 간 재생을 보이는 것을 확인할 수 있었다(P<0.05)(도 4D).Liver regeneration was evaluated based on the LW / BW ratio after 7 days of PH. The liver regeneration rate was calculated to be 2.55 ± 0.25, 2.51 ± 0.47, 3.23 ± 0.08 and 3.73 ± 0.33 in the control, LPS, CM and LPS-CM groups, respectively. (P < 0.05) (Fig. 4D).

PHPH 후 간 기능에 대한 CM 및  CM for late function and LPSLPS -CM의 효과 Effect of -CM

간 손상 및 간기능장애(hepatic dysfunction)의 생화학적 표지인 ALT 및 AST의 혈청 수준을 평가하였고 도 5에 이의 결과를 나타내었다. 먼저, PH를 하지 않은 대조 마우스에 LPS, CM 및 LPS-CM를 투여하고, 상기 물질의 단독 투여로 간 효소 수준이 증가되지 않은 것을 확인하였다. 그 후, 부분 간 절제된 마우스에 상기 물질을 꼬리 정맥을 통하여 투여하였다. 간 효소 AST 및 ALT의 혈청 농도가 PH 후 1일에 가장 높은 증가를 보였으며 그 후 감소되어 7일에 정상 수준과 비슷하게 도달되는 것을 확인할 수 있었다. 1일에, 대조군 및 LPS군에 대하여 LPS-CM군에서 AST 및 ALT 수준이 유의하게 낮게 나타났고(P<0.05), 이는 PH 후에 간 기능의 회복이 가속화된 것으로 판단할 수 있다.Serum levels of ALT and AST, which are biochemical markers of liver damage and hepatic dysfunction, were evaluated and the results are shown in FIG. First, LPS, CM and LPS-CM were administered to a control mouse without PH, and it was confirmed that the administration of the substance alone did not increase the liver enzyme level. The material was then administered via the tail vein to the partially resected mice. Serum concentrations of liver enzymes AST and ALT showed the highest increase on day 1 after PH, and then decreased, reaching normal level on day 7. On day 1, AST and ALT levels were significantly lower in the LPS-CM group than in the control and LPS groups (P <0.05), suggesting that the recovery of liver function was accelerated after PH.

Claims (24)

줄기세포를 성장시키는 단계;
상기 줄기세포에 TLR4 효능제(agonist)를 첨가하여 자극시키는 단계; 및
줄기세포로부터 분비된 세크리톰 및 배지를 획득하는 단계를 포함하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법.Growing stem cells;
Stimulating the stem cells by adding a TLR4 agonist; And
A method for producing a medium for hepatocyte regeneration comprising the step of obtaining a secretory cell and a medium secreted from stem cells. 제 1항에 있어서,
상기 자극은 상기 TLR4 효능제를 0.1 내지 1.0ng/mL로 처리하는, 간세포 재생용 LPS 조정 배지의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein said stimulus is treated with said TLR4 agonist at 0.1 to 1.0 ng / mL. 제 1항에 있어서,
상기 자극은 상기 TLR4 효능제를 12 내지 48시간 동안 처리하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the stimulus treats the TLR4 agonist for 12 to 48 hours. 제 1항에 있어서,
상기 TLR4 효능제가 LPS, 부프레노르핀(Buprenorphine), 카르바마제핀(Carbamazepine), 펜타닐(Fentanyl), 레보르파놀(Levorphanol), 메타돈(Methadone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 배지의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the TLR4 agonist is at least one selected from the group consisting of LPS, Buprenorphine, Carbamazepine, Fentanyl, Levorphanol, Methadone, A method for producing a medium. 제 4항에 있어서,
상기 TLR4 효능제가 LPS인, 간세포 재생용 배지의 제조방법. 5. The method of claim 4,
Wherein said TLR4 agonist is LPS. 제 1항에 있어서,
상기 줄기세포가 지방조직-유래 줄기세포인, 간세포 재생용 배지의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein said stem cells are adipose tissue-derived stem cells. 제 1항에 있어서,
상기 세크리톰이 상향-조절(up-regulated)되는, 간세포 재생용 배지의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the secretory is up-regulated. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 21. &lt; / RTI &gt; 제 6항에 있어서,
상기 세크리톰이 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 배지의 제조방법. The method according to claim 6,
Wherein the saccharide is at least one selected from the group consisting of IL-6, TNF-a, HGF and VEGF. 제 1항에 있어서,
상기 배지를 20 내지 30배로 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 간세포 재생용 배지의 제조방법. The method according to claim 1,
And further concentrating the medium to 20 to 30 times. TLR4 효능제로 줄기세포를 자극하여 분비된 세크리톰 및 배지를 포함하는, 간세포 재생용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, comprising secretory cells secreted by stimulating stem cells with a TLR4 agonist and a medium. 제 10항에 있어서,
상기 TLR4 효능제를 0.1 내지 1.0ng/mL의 농도로 포함하는, 간세포 재생용 약학 조성물.11. The method of claim 10,
And the TLR4 agonist at a concentration of 0.1 to 1.0 ng / mL. 제 10항에 있어서,
상기 TLR4 효능제가 LPS, 부프레노르핀, 카르바마제핀, 펜타닐, 레보르파놀, 메타돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 약학 조성물.11. The method of claim 10,
Wherein the TLR4 agonist is at least one selected from the group consisting of LPS, buprenorphine, carbamazepine, fentanyl, levorphanol, methadone. 제 12항에 있어서,
상기 TLR4 효능제가 LPS인, 간세포 재생용 약학 조성물.13. The method of claim 12,
Wherein said TLR4 agonist is LPS. 제 10항에 있어서,
상기 줄기세포가 지방조직-유래 줄기세포인, 간세포 재생용 약학 조성물.11. The method of claim 10,
Wherein said stem cells are adipose tissue-derived stem cells. 제 10항에 있어서,
상기 세크리톰이 IL-6, TNF-α, HGF 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 간세포 재생용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
Wherein the secretory is at least one selected from the group consisting of IL-6, TNF-a, HGF and VEGF. 제 10항에 있어서,
마우스 간세포 AML12 세포가 높은 생존력을 보이는, 간세포 재생용 약학 조성물.11. The method of claim 10,
A pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein mouse hepatocyte AML12 cells show high viability. 제 10항에 있어서,
부분 간 절제된 마우스에서 IL-6 및 TNF-α의 혈청 농도가 감소하는, 간세포 재생용 약학 조성물.11. The method of claim 10,
Wherein the serum concentration of IL-6 and TNF-a is decreased in the partially hepatectomized mouse. 제 10항에 있어서,
부분 간 절제된 마우스에서 Ki67-양성 세포 수가 증가하는, 간세포 재생용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
Wherein the number of Ki67-positive cells in the partially hepatectomized mouse is increased. 제 10항에 있어서,
부분 간 절제된 마우스에서 PCNA의 발현이 증가하는, 간세포 재생용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
A pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, wherein expression of PCNA is increased in a partially hepatectomized mouse. 제 10항에 있어서,
부분 간 절제된 마우스에서 p-STAT3의 발현이 증가하는, 간세포 재생용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
Wherein expression of p-STAT3 is increased in a partially hepatectomized mouse. 제 10항에 있어서,
부분 간 절제된 마우스에서 높은 간 재생률(LW/BW)을 보이는, 간세포 재생용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
A pharmaceutical composition for hepatocyte regeneration, which shows a high liver regeneration rate (LW / BW) in partial liver resected mice. 제 10항에 있어서,
부분 간 절제된 마우스에서 알라닌 아미노전이효소(ALT) 및 아스파라진산염 아미노전이효소(AST)의 혈청 농도가 감소하는, 간세포 재생용 약학 조성물. 11. The method of claim 10,
Wherein the serum concentration of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) is decreased in partially liver-resected mice. TLR4 효능제로 자극된 줄기세포로부터 분비된 세크리톰 및 배지를 포함하는, 분비물.Secretions, including secretory cells and media secreted from stem cells stimulated by TLR4 agonists. 제 23항에 있어서,
상기 TLR4 효능제를 0.1 내지 1.0ng/mL의 농도로 포함하는, 분비물.24. The method of claim 23,
Said TLR4 agonist at a concentration of 0.1 to 1.0 ng / mL.
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