KR20170107860A - 정원줄기세포의 3차원 체외 배양 방법 및 그 용도 - Google Patents

정원줄기세포의 3차원 체외 배양 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정원줄기세포의 3차원 체외 배양 방법 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아가로스 기반 3차원 하이드로젤 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤 내부에 돼지 정원줄기세포를 배양하여 돼지 정원줄기세포의 자기 재생 및 미분화를 유지하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 아가로스 및 PEG-기반 3D 하이드로젤은 정원줄기세포의 유지에 강력한 시스템으로 사용될 수 있다.

Description

정원줄기세포의 3차원 체외 배양 방법 및 그 용도{A method of Effects of three dimensional culture of spermatogonial stem cell and use of the same}
본 발명은 정원줄기세포의 3차원 체외 배양 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
원시 생식 세포(primordial germ cell) 유래 정원 줄기 세포(Spermatogonial stem cells; 이하 'SSCs'라 함)은 기저부(basal compartment)에서 무한정적으로 재생되고 세정관의 관강 격실(adluminal compartment)에서 정자로 분화된다. 또 그들의 전능성(pluripotency)은 특화된 미세환경(microenvironments)에 의하여 유도될 수 있다(Kostereva N1, Hofmann MC. Reprod Domest Anim. 2008 Jul;43 Suppl 2:386-92. doi: 10.1111/j.1439-0531.2008.011894). 따라서 그들은 수컷 불임 치료(Kubota H1, Brinster RL.Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2006 Feb;2(2):99-108), 형질전환 정자 생성(Kanatsu-Shinohara M1, Toyokuni S, Shinohara T. Biol Reprod. 2005 Jan;72(1):236-40. Epub 2004 Sep 29) 및 수컷 환자-특이적 세포 기반 치료 기술의 개발(Rao M1, Condic ML. Stem Cells Dev. 2008 Feb;17(1):1-10. doi: 10.1089/scd.2008.0013)에 효과적으로 사용될 수 있다.
일반적으로 세포 배양 시스템은 이화학적(physico-chemical), 생리적(physiological) 및 ECM(extracellular matrix ) 니쉬(niche)으로 구성된다.
따라서, 현재까지, SSCs에서 자기 재생 유지를 지지하는 체외 배양 방법은 이화학적(Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Int J Mol Sci. 2015 Mar 11;16(3):5517-27. doi: 10.3390/ijms16035517. Review;Lee WY1, Park HJ, Lee R, Lee KH, Kim YH, Ryu BY, Kim NH, Kim JH, Kim JH, Moon SH, Park JK, Chung HJ, Kim DH, Song H. Stem Cell Res. 2013 Nov;11(3):1234-49. doi: 10.1016/j.scr.2013.08.008. Epub 2013 Aug 24) 및 생리적(Anjamrooz SH1, Movahedin M, Tiraihi T, Mowla SJ. Reprod Fertil Dev. 2006;18(6):709-20;Kubota H1, Avarbock MR, Brinster RL. Biol Reprod. 2004 Sep;71(3):722-31. Epub 2004 Apr 28) 니쉬 개발에 초점을 맞추었고, 이것은 줄기 세포 운명 조절에서 그들의 큰 한계에 직면하였다(Ebata KT1, Yeh JR, Zhang X, Nagano MC. Exp Cell Res. 2011 Jun 10;317(10):1319-29. doi: 10.1016/j.yexcr.2011.03.013. Epub 2011 Mar 21). 즉 장기간 배양에 효과적인 SSC 배양의 부재가 해결되지 않고 있어서, ECM 니쉬에 대한 많은 관심이 증폭되고 있다.
현재까지 SSCs의 자기 재생은 다양한 피더 세포 유래 세포성 니쉬(Nagano M1, Avarbock MR, Leonida EB, Brinster CJ, Brinster RL. Tissue Cell. 1998 Aug;30(4):389-97;Nagano M1, Ryu BY, Brinster CJ, Avarbock MR, Brinster RL. Biol Reprod. 2003 Jun;68(6):2207-14. Epub 2003 Jan 22;Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K, Ogonuki N, Toyokuni S, Ogura A, Shinohara T. Biol Reprod. 2005 Apr;72(4):985-91. Epub 2004 Dec 15) 및 정제된 ECM 단백질 유래 비세포(Akbarinejad V, Tajik P, Movahedin M, Youssefi R, Shafiei S, Mazaheri Z. Anim Reprod Sci. 2015 Jun;157:95-102. doi: 10.1016/j.anireprosci.2015.04.003. Epub 2015 Apr 15;Kim BG1, Cho CM, Lee YA, Kim BJ, Kim KJ, Kim YH, Min KS, Kim CG, Ryu BY. Biol Reprod. 2010 Jun;82(6):1162-9. doi: 10.1095/biolreprod.109.079558. Epub 2010 Feb 10) 니쉬에 기반한 통상적인 2차원 미세환경에서 유지된다.
그러나 기존에 개발된 2D 배양 시스템은 SSC 증식의 촉진 및 SSC 분화의 억제에 있어 장시간 강력한 효과를 나타내지 못하고(Kanatsu-Shinohara M1, Toyokuni S, Shinohara T. Biol Reprod. 2004 Oct;71(4):1202-7. Epub 2004 Jun 9; Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K, Ogonuki N, Toyokuni S, Ogura A, Shinohara T. Biol Reprod. 2005 Apr;72(4):985-91. Epub 2004 Dec 15) 대동물(소, 돼지, 말 등) 유래 SSCs는 심지어 단 시간 동안 자기 재생 유지에도 많은 어려움을 나타내었다(Marret C1, Durand P. Reprod Nutr Dev. 2000 May-Jun;40(3):305-19;Aponte PM1, Soda T, van de Kant HJ, de Rooij DG. Theriogenology. 2006 Jun;65(9):1828-47). 따라서, 이러한 문제점을 해결하는 대안으로 체내 유사 3D 미세환경에 대하여 관심을 가지게 되었다.
[선행 특허 문헌]
대한민국특허공개번호 10-2005-0103270
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 자기 재생의 유지에서 SSCs에 의하여 선호되는 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아가로스 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 자기 재생을 유지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 아가로스 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 미분화를 유지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 자기 재생을 유지하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 미분화를 유지하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아가로스 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 자기 재생 유지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 아가로스 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 미분화 유지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 자기 재생 유지용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 미분화 유지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 정원 줄기세포는 돼지 정원 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 많은 경제적인 특성을 가지는 돼지 유래 SSCs를 피더 세포 존재 또는 부존재 하에서 2차원 배양 및 ECM 아나로그 없이 3차원 스카폴드 내에서 배양하고 생존률, 증식, 형태 및 SSC-특이적인 마커 유전자 및 단백질 발현을 분석하였다.
이하 본 발명을 도면과 하기 기재로부터 상세하게 설명한다.
돼지 SSCs의 자기 재생을 위한 3차원 아가로스 기반 하이드로젤 기전의 최적화
3차원 스카폴드로 아가로스 기반 하이드로젤 시스템을 이용하였고, 돼지 SSCs에 충분한 자기 재생을 지원하는 3차원 하이드로젤의 기전은 AP 활성 및 아가로스의 다양한 농도에 의하여 구축된 3차원 하이드로젤 내부에서 배양된 돼지 SSC의 콜로니 크기를 측정하여 결정하였다. 비록 농도 사이에 유의적인 차이는 없지만, AP 활성을 가지는 돼지 SSCs의 최고 퍼센트는 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel에서 관찰되었다(도 1A). 또, 0.6% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel 보다 더 큰 크기의 돼지 SSC 유래 콜로니의 크기가 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel에서 관찰되었다(도 1B). 이 결과들은 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel이 돼지 SSCs에서 증식의 촉진 및 미분화를 효과적으로 유지할 수 있다는 것을 나타내고, 돼지 SSC 자기 재생의 유지에 최적화된 기계적인 특성을 나타낸다.
돼지 SSC 미분화의 유지에 대한 3차원 배양 미세환경의 효과
다음으로, 돼지 SSC 미분화의 유지에 대한 3차원 배양 미세환경의 유용성을 돼지 SSC에서 특이적으로 발현되는 자가 재생의 전사 및 번역 조절 및 AP 활성 및 콜로니 형성 및 형태 수준에서 측정하였다. 구형 돼지 SSC 콜로니들은 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel 내에서 배양 6일 후 단일하게 형성되고 AP 염색에 의하여 강한 적색으로 양성적으로 염색되었다(도 2C). 반면,STO 세포를 피더로써 이용하거나(도 2A) 이용하지 않은(도 2B) 2차원 미세환경에서 6일간 배양된 돼지 SSCs는 dome-형태 모양을 가지는 콜로니를 형성하지 않았고 매우 약한 양성 AP 염색을 나타내었다. 또, 비록 2D 배양 환경에서, STO 세포 유래 세포성 미세환경이 배양 플레이트 유래 비세포성 미세환경에 비하여 돼지 SSCs에 대한 AP 활성에 더 강한 유지를 제공하였고, 2차원 미세환경에서의 것과 비교하여 AP 활성을 가지는 매우 높은 세포의 퍼센트가 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel에서 배양된 돼지 SSCs에서 검출되었다(도 3). 도 4 및 5에서 나타난 것과 같이, 자기 재생 관련 유전자들의 전사 및 번역 사이의 동일한 조절 패턴이 3D 배양 미세환경에서 야기되었다. 모든 자기 재생 관련 유전자들의 현저한 전사 및 번역에 대한 다운 조절이 2D 미세환경과 비교하여 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel에서 배양된 돼지 SSCs에서 검출되지 않았다. 다시 말해, 0.2% (w/v) Agarose-기반 3D hydrogel에서 배양된 돼지 SSCs는 NANOG, EPCAM 및 UCHL1의 전사 수준, 및 PLZF, OCT4, SOX2 및 TRA-1-81의 번역 수준에서 유의적으로 현저한 증가를 보여주었으며, 비록 유의적 차이는 없을지라도, OCT4 및 THY1의 전사 수준, 및 NANOG 및 TRA-1-60의 번역 수준에서 증가를 보여주었다. 이 결과들로부터, 본 발명자들은 미분화의 유지에서 돼지 SSCs는 2D 배양 미세환경보다는 3D 환경을 더 선호한다는 것을 알 수 있다.
돼지 SSCs의 증식 및 생존에 대한 3D 배양 미세환경의 효과
최종적으로, 돼지 SSC 생존률 및 증식 능력의 유지에서 3D 배양 미세환경의 효과를 체외 배양 후 콜로니 직경 및 생존 세포의 비율을 측정하여 평가하였다. STO 세포를 가지거나 가지지 않는 2D 미세환경과 비교하여, 0.2% (w/v) Agarose 기반 3D 미세환경에서 배양된 돼지 SSCs는 각각 가장 높은 세포 생존률 퍼센트(도 6) 및 가장 큰 콜로니 직경(도 7)을 나타내었다, 또한, 2D 미세환경에서, STO 세포 유래 세포성 니쉬(niche)는 세포성 니쉬가 없는 조건에 비하여 훨씬 강한 세포 생존률의 유지를 유도하였고(도 6) 작은 직경의 콜로니의 형성을 유도한 반면(도 7), STO 세포 유래 세포성 니쉬 없는 2D 미세환경에서 콜로니의 형성은 검출되지 않았고, 이것은 STO 세포 유래 세포성 니쉬가 돼지 SSCs의 증식 및 생존률을 유지하는데 필수적이라는 것을 시사한다. 또, 이들 결과는 돼지 SSCs의 배양에서 3D 배양 미세환경의 사용이 돼지 SSCs의 증식과 생존률을 유지하는데 있어서 2D STO 세포 유래 세포성 니쉬의 기능을 능가하는 충분하게 효과적이라는 것을 시사한다.
본 발명자들은 차원 차이에 따른 특성을 비교하기 위하여 2D 및 3D 배양 시스템에서 배양된 SSCs의 생존률(도 2) 및 AP 활성(도 4)을 조사하였다. Agarose 기반 3D hydrogel에서 배양된 SSCs는 가장 높은 생존률(100 %)을 나타내었고, 이것은 2D 환경에서 배양된 SSCs 보다 더 높았다. SSCs의 AP 활성은 2D 보다 3D 환경에서 증가하였고, 이 결과는 SSCs의 전분화능(pluripotency)에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 또한 본 발명자들은 SSC의 유지에 필요한 OCT4, NANOG, SOX2, THY1, PLZF, UCHL1, EPCAM, TRA-1-60, TRA-1-81과 같은 전분화능 마커인 분자 마커의 발현 레벨을 비교하였다. SSC-특이적인 마커의 전사(도 6) 및 번역 (도 7) 발현 레벨은 Agarose-기반 3D 환경에서 2D 환경에 비하여 증가하였다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 아가로스 및 PEG(polyethylene glycol)-hydrogel 등을 사용한 3D 배양 시스템은 SSCs의 확장 및 자기 재생을 유지하는데 사용될 수 있고, AP 활성 퍼센트가 이 3D 시스템에서 매우 높게 검출되었을 뿐 아니라 SSC-특이적인 유전자의 증가된 mRNA 및 단백질 발현이 아가로스 및 polyethylene glycol -기반 3D hydrogel 등에서도 관찰되었다. 따라서 아가로스 및 PEG-기반 3D hydrogel은 SSCs의 유지에 강력한 시스템이다.
도 1은 아가로스 기반 3D 하이드로젤 내부에 돼지 SSC를 배양함으로써 증식의 촉진 및 AP 활성 유지를 자극하는 3D hydrogel 조건의 최적화를 나타낸 그림. 회수된 돼지 SSCs를 다양한 농도(w/v)의 Agarose에 의하여 구축된 3D 하이드로젤 내부에서 6일간 배양한 후 배양된 돼지 SSCs의 AP 활성을 AP 염색에 의하여 양성으로 염색된 세포의 퍼센트를 계산하여 분석하고 돼지 SSCs 유래 콜로니 직경을 측정하여 증식을 분석하였다. 결론적으로, 비록 처리 사이에 현저한 차이가 있지만, 0.2% (w/v) Agarose-based 3D hydrogel 내부에서 배양된 돼지 SSCs가 0.6% (w/v) Agaorose-based 3D hydrogel에 비하여 더 높은 AP 활성을 나타내었다. 동시에, 0.2% (w/v) Agarose-based 3D hydrogel에서 0.6% (w/v) Agarose-based 3D hydrogel과 비교하여 현저하게 증가된 직경의 돼지 SSC 유래 콜로니가 검출되었다. 모든 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다. * p<0.05.
도 2는 2D 및 3D 미세환경에서 배양된 돼지 SSC의 AP 활성을 나타낸 그림. 2D 미세환경에서 돼지 SSCs의 미분화가 STO 세포로 코팅(A)되거나 코팅되지 않은(B) 배양 플레이트 상에서 유지된 반면에, 3D 미세환경에서 미분화된 돼지 SSCs의 배양은 0.2% (w/v) Agarose-based 3D hydrogel (C)에서 수행되었다. 배양 6일 후, 배양된 돼지 SSCs를 AP 염색을 수행하고 콜로니 사이즈를 관찰하였다. 2D 환경보다 더 강한 AP 염색(적색)과 더 큰 콜로니 크기가 3D 미세환경에서 검출되었다. 스케일 바는 50 μm.
도 3은 돼지 SSCs에서 alkaline phosphatase (AP) 활성의 유지에 대한 3D 배양 미세환경의 효과를 나타낸 그림. 6 일 동안, 2D 미세환경에서 돼지 SSCs의 배양을 STO 세포가 코팅 또는 코팅되지 않은 2D 배양 플레이트 및 0.2% (w/v) Agarose에 의하여 구축된 3D 하이드로젤 내의 3D 미세환경에서 각각 수행되었다. 그 후, 배양 후 AP 활성의 유지를 AP 염색에 의하여 양성으로 염색된 세포의 퍼센트를 계산하여 분석하였다. 3D 미세환경에서 배양된 돼지 SSCs에서 AP 양성 세포의 퍼센트는 2D 환경과 비교하여 현저하게 높았다. 모든 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다, *-** p<0.05.
도 4는 돼지 SSC에서 특이적으로 발현된 유전자의 전사 조절에 대한 3D 미세환경의 효과를 나타낸 그림. 2D 미세환경에서 돼지 SSCs의 미분화를 STO 세포로 코팅되거나 코팅되지 않은 배양 플레이트 상에서 유지하고 3D 미세환경에서 미분화된 돼지 SSCs의 배양을 0.2% (w/v) Agarose에 의하여 구축된 3D 하이드로젤 내의 3D 미세환경에서 각각 수행되었다. 그 후, 돼지 SSC-특이적인 유전자의 전사 레벨을 6일째 배양에서 실시간 PCR로 정량적으로 모니터하였다. 2D 미세환경과 비교하여, 3D 미세환경은 OCT4 및 THY1 를 제외하고는 NANOG, EPCAM 및 UCHL1의 현저한 업-레귤레이션을 유도하였다. 동시에, OCT4 및 THY1 의 전사적 조절은 2D 환경보다 3D 환경에서 배양된 돼지 SSCs에서 상대적으로 높았다. 모든 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다. *-** p<0.05.
도 5는 돼지 SSCs에서 특이적으로 발현된 유전자의 번역 조절에 대한 3D 미세환경의 효과를 나타낸 그림. 2D 미세환경에서 분리된 돼지 SSCs의 미분화를 STO 세포로 코팅되거나 코팅되지 않은 배양 플레이트 상에서 유지하거나 또는 3D 미세환경에서 미분화된 돼지 SSCs의 배양을 0.2% (w/v) Agarose에 의하여 구축된 3D 하이드로젤 내의 3D 미세환경에서 유지하였다. 6일째 배양 후 돼지 SSC-특이적인 유전자의 번역 레벨을 형광 면역정량법에 의하여 분석하였다. 2D 미세환경과 비교하여, 3D 미세환경은 NANOG 및 TRA -1-60을 제외하고는 PLZF, OCT4, SOX2 및 TRA -1-81의 현저한 번역적 업-레귤레이션을 유도하였다. 동시에, NANOG 및 TRA -1-60의 번역적 조절은 2D 환경보다 3D 환경에서 배양된 돼지 SSCs에서 상대적으로 높았다. 모든 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다. *-** p<0.05.
도 6은 돼지 SSCs의 생존률에 대한 3D 배양 미세환경의 효과를 나타낸 그림. 2D 배양을 위해, 돼지 SSCs를 STO 세포의 존재 또는 부존재 하에서 배양하였다. 또한, 돼지 SSCs의 3D 미세환경에서 배양을 위해, 그들을 0.2% (wt/v) Agarose-based 3D hydrogel로 캡슐화하였다. 그 후, 배양된 pSSCs의 세포 생존률을 6일째 배양에서 trypan blue 배제 어세이에 의해 결정하였다. 3D 미세환경은 STO 세포를 가지거나 가지지 않은 2D 미세환경과 비교하여 세포 생존률에서 현저하게 높은 퍼센트를 나타내었다. 모든 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다. *,** p<0.05.
도 7은 돼지 SSCs의 증식에 대한 3D 배양 미세환경의 효과를 나타낸 그림. 2D 미세환경에서 돼지 SSCs의 미분화를 STO 세포가 코팅 또는 코팅되지 않은 2D 배양 플레이트 상에서 유지하고, 0.2% (w/v) Agarose에 의하여 구축된 3D 하이드로젤 내의 3D 미세환경에서 각각 수행되었다. 미분화된 돼지 SSCs의 3D 미세환경에서 배양을 0.2% (wt/v) Agarose-based 3D hydrogel에서 수행하였다. 2D 및 3D 미세환경에서 6일 동안 배양된 돼지 SSCs의 콜로니 직경을 현미경으로 측정하였다. 2D 미세환경과 비교하여, 3D 미세환경은 콜리니의 직경에서 현저한 증가를 나타내었다. 모든 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM를 나타낸다. N/D = not detected. * p<0.05.
도 8은 2차원 (2D) 및 3차원 (3D) 미세환경에서 배양된 돼지 SSCs의 형태 및 AP(alkaline phosphatase) 활성을 나타낸 그림. 분리된 돼지 SSCs를 돼지 정소 기질 세포(porcine testicular stromal cells;PTSCs) feeder (A)로 코팅된 배양 플레이트 상에서 7일간 배양하였고, 반면에 3D 4-arm (B) 및 8-arm (C) polyethylene glycol (PEG)-hydrogel 내부에 미분화된 돼지 SSCs를 각각 배양하였다. 그 후, AP 활성의 분석을 AP 염색으로 수행하였다. 결론적으로, 3D 4-arm (E) 및 8-arm (F) PEG-hydrogel 내에서 배양된 돼지 콜로니는 PTSCs feeder (D) 상에서 배양된 콜로니에 비하여 더 두꺼운 적색 및 더 큰 콜로니 사이즈를 나타내었고, 이것은 3D 4-arm 및 8-arm PEG-hydrogel이 2D 미세환경보다 돼지 SSCs의 미분화된 유지를 더 효과적으로 지지할 수 있다는 것을 시사한다. 스케일 바는 50 μm.
도 9는 돼지 SSCs에서 자기 재생 관련 및 SSC-특이적인 유전자들의 전사 조절에 대한 PEG-hydrogel를 사용한 3D 니쉬의 효과를 나타낸 그림. 신생(neonatal) 수컷 돼지 유래 SSC를 2D PTSCs feeder 상, 및 3D 8-arm PEG-hydrogel 내에서 7일간 배양한 후, 자기 재생 관련 및 SSC-특이적인 유전자들의 전사 레벨을 실시간 PCR로 분석하였다. 결론적으로,3D 8-arm PEG hydrogel 내에서 배양된 돼지 SSCs는 2D PTSCs feeder 보다 SSC-특이적인 유전자인 THY1 (D) 및 UCHL1 (E)를 현저하게 더 높이 발현하고 자기 재생 관련 유전자인 OCT4 (A), NANOG (B) 및 EPCAM (C)의 발현에서 현저한 차이는 2D 및 3D 미세환경에서 검출되지 않았다. 에러 바는 표준 에러(SE)를 나타낸다. n=5. * p < 0.05.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1; 동물
1-에서 4-일령 잡종(Landrace X Yorkshire) 또는 순혈(Yorkshire X Yorkshire) 수컷 piglets을 금보(Gumbo, 원주, 한국)에서 기증받았으며 신생(neonatal) piglets으로부터 고환의 분리는 금보 농장에서 통상적인 거세 수술을 통하여 수행하였다. 모든 동물 수술은 강원대 동물실험 윤리위원회의 승인(IACUC approval No. KW-131106-1)과 가이드라인에 따라서 수행하였다 .
실시예 2: 신생 돼지 고환으로부터 정원 줄기세포의 회수
신생 돼지 고환으로부터 정원 줄기세포의 회수는 기존의 DP(Petri dish plating post-differential plating) 방법을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 고환으로부터 얻은 세정관(seminiferous tubule)을 기계적으로 분산시키고, 타입 IV collagenase (Worthington Biochemical, Lakewood, CA)를 사용하여 효소적으로 처리하였다. 또, hyaluronidase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 트립신(Welgene Inc., Daegu, Korea)을 절단된 세정관을 분산시키기 위하여 연속적이고 개별적으로으로 사용하였다. 그 다음, DP를 위해서, 적혈구 파쇄 버퍼(Sigma-Aldrich) 처리를 통하여 적혈구 없는 분산된 세포를 10% (v/v) 우태아 혈청(FBS; Welgene) 및 1% (v/v) antibiotic-antimycotic 용액(Welgene)으로 보충된 고 포도당 Dulbecco modified Eagle 배지(DMEM; Welgene)에서 젤라틴-코팅된 페트리 디쉬에서 배양하고, 부유 세포를 16시간 동안 배양 후 수집하였다. Petri dish plating post-DP를 위해서, 수집된 세포들을 15% (v/v) FBS, 1% (v/v) 비필수 아미노산(NEAA; Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% (v/v) antibiotic-antimycotic 용액, 2 mM L-glutamine (Invitrogen), 0.1 mM 베타-mercaptoethanol (Invitrogen), 103 units/ml 마우스 LIF(leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc., Temecula, CA), 및 10 ng/ml GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)가 보충된 DMEM에 페트리 디쉬 위에서 배양하였다.
오버나잇 후, 페트리 디쉬 바닥에 부착되지 않은 세포들을 조심스럽게 회수하여 그 회수된 세포들을 다음 실험에 사용하였다
실시예 3: 아가로스 기반 3차원 하이드로젤의 구축 및 하이드로젤로 돼지 SSCs의 캡슐화
기질의 스톡 용액은 열 조건에서 1% (w/v) Agarose 분말을 DMEM에서 녹여서 준비하였다. 다음으로, 다양한 기계적 특성을 가지는 Agarose-기반 3D hydrogel을 구축하기 위하여 스톡을 37℃로 가열된 DMEM에 다양한 농도(0.2 및 0.6% (w/v))로 희석되었고, 돼지 SSCs의 하이드젤로 캡슐화는 37℃에서 희석된 기질 용액을 세포와 혼합하고 31℃에서 습도 95% 공기 및 5% CO2 조건에서 고형화하였다.
실시예 4: 돼지 SSCs의 배양
2D 배양을 위해, 4 x 105 돼지 SSCs를 mitomycin C에 의하여 유사분열적으로 불활성화된 STO 세포로 코팅 또는 코팅되지 않은 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. 동시에, 3D 배양을 위해, 1 x 105 돼지 SSCs를 Agarose 기반된 3차원 하이드로젤에 삽입하였다. 그 후, 2차원 및 3차원 미세환경에 노출된 돼지 SSCs를 ITS(insulin-transferrin-selenium; Invitrogen), 60 μM putrescine dihydrochloride (Sigma-Aldrich), 6 mg/ml D-(+)-glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), 0.11 mg/ml sodium pyruvate, 1 μg/ml DL-젖산(Sigma-Aldrich), 5 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA, Sigma-Aldrich), 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 베타-mercaptoethanol, 1% (v/v) FBS, 1% (v/v) NEAA, MEM vitamin solution (Sigma-Aldrich), 1% (v/v) antibiotic-antimycotic solution, 0.1 mM ascorbic acid (Sigma-Aldrich), 103 units/ml 마우스 LIF, 10 ng/ml GDNF, 30 ng/ml 베타-estradiol (Sigma-Aldrich), 60 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 20 ng/ml 인간 EGF(epidermal growth factor; Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ), 및 10 ng/ml 인간 bFGF(basic fibroblast growth factor; Peprotech, Inc.)로 보충된 Stempro-34 배지(Invitrogen)로 구성된 SSC 배양 배지에서 6일간 배양하였다. 배지는 2일마다 신선한 것으로 교체하였다.
실시예 5: 트립판 블루 배제 어세이
0.4% (wt/v) trypan blue 용액(Sigma-Aldrich) 10 마이크로리터를 배양 배지에서 10 μL 세포 현탁액으로 혼합하고 양성적으로 염색된 세포의 수를 hemocytometer를 사용하여 계수하였다. 죽은 세포들은 염료를 배제하는데 실패하여 양성적으로 염색되고 생존 세포는 염료를 배제하여 음성적으로 염색된다. 세포 생존률을 분석하기 위하여, 생존 세포의 퍼센트를 세포의 총수(생존+사멸)에 기초하여 계산하였다.
실시예 6: AP(Alkaline Phosphatase) 염색
4% (v/v) paraformaldehyde (Junsei Chemical Co., Ltd., Chuo-ku, Japan)으로 고정화된 세포를 DPBS로 세척하고 0.2 mg/ml Naphthol AS-MX phosphate (Sigma-Aldrich), 2 % (v/v) N,N-dimethyl formamide (Sigma-Aldrich), 및 1 mg/ml Fast Red TR 염으로 보충된 0.1 M pH 8.2 Tris 버퍼(Sigma-Aldrich)로 구성된 AP 염색 용액으로 90분간 상온에서 염색하였다. 염색된 세포를 DPBS로 2회 헹구고, AP-양성 세포의 비율을 hemocytometer를 사용하여 현미경(CKX-41; Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 측정하였다.
실시예 7: 콜로니 직경의 측정
콜로니 직경을 i-Solution Lite 버젼 10.0 소프트웨어 (IMT i-Solution Inc., Vancouver, Canada)를 사용하여 측정된 콜로니의 수평 및 수직 직경을 평균하여 계산하였다.
실시예 8: 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction;qRT-PCR)
각 제조업자의 지시에 따라, 전체 mRNA를 Dynabeads　mRNA Direct™ Kit (Ambion, Austin, TX)를 사용하여 추출하고, 그 다음 cDNA 합성을 ReverTra Ace　 qPCR RT Master Mix를 사용하여 gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japan)를 가지고 수행하였다. 다음, qRT-PCR를 THUNDERBIRD SYBR　qPCR Mix (Toyobo)로 7500 Real time PCR system (Applied Biosystem, Foster City, CA) 하에서 수행하였다. PCR 특이성을 melting 곡선 데이터를 분석하여 동정하고 특정 유전자 발현의 노말화(normalization)는 GAPDH의 mRNA 레벨과 비교하여 수행하였다. 상대적 mRNA 레벨을 2-△△Ct로 계산하였고, 여기서 Ct =타겟 증폭에 대한 역치 사이클(threshold cycle), △Ct = Cttarget gene (각 샘플에 대한 특정 유전자들) - Ctinternal reference(각 샘플에 대한 GAPDH), 및 △△Ct = △Ctsample (각 실험에서 처리 샘플) - △Ctcalibrator (각 실험에서 대조군 샘플). 표 1은 돼지에 대한 GenBank로부터 유래한 cDNA 서열을 가지고 Primer3 software (Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research)에 의하여 고안된 프라이머들의 일반적인 정보 및 서열을 나타낸다.
Figure pat00001
표 1은 본 발명에 사용된 프라이머 서열 및 PCR 조건 등이다. 표 1에서 레퍼런스 1은 Park MH1, Park JE, Kim MS, Lee KY, Park HJ, Yun JI, Choi JH, Lee Es, Lee ST. Development of a high-yield technique to isolate spermatogonial stem cells from porcine testes. J Assist Reprod Genet. 2014 Aug;31(8):983-91. doi: 10.1007/s10815-014-0271-7. Epub 2014 Jun 18.
실시예 9: 형광 면역어세이
고정화 과정은 4% (v/v) paraformaldehyde 용액에서 15분 동안 세포를 배양하여 수행하였다. DPBS로 2회 헹군 후, 그 고정화된 세포들을 0.01% (v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich)이 보충된 DPBS에서 투과하고 4℃에서 1시간 동안 DPBS로 희석된 anti-rabbit OCT3/4, NANOG, SOX2, PLZF, TRA-1-60 및 TRA-1-81 일차 항체로 염색하였다. 그 후, 1차 항체들을 DPBS로 희석된 Alexa Flour 488-conjugated 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 1차 또는 2차 항체의 상세 정보 및 희석률은 표2에 리스트하였다. 1시간 후, 염색된 세포들을 DPBS로 2회 세척하고, 그들로부터 유래한 형광 강도를 SoftMax®Pro 6.2.2. (Molecular Devices Cooperation, Sunnyvale, CA)를 사용하여 측정하였다.
Figure pat00002
표 2는 본 발명에서 사용된 1차 및 2차 항체와 그 관련정보이다. 표 2에서 레퍼런스 1은 Park MH1, Park JE, Kim MS, Lee KY, Park HJ, Yun JI, Choi JH, Lee Es, Lee ST. Development of a high-yield technique to isolate spermatogonial stem cells from porcine testes. J Assist Reprod Genet. 2014 Aug;31(8):983-91. doi: 10.1007/s10815-014-0271-7. Epub 2014 Jun 18.
실시예 10:통계 분석
SAS(Statistical Analysis System) 소프트웨어를 각 실험에서 나타낸 수치 데이터 모두를 통계적으로 분석하는데 사용하였다. SAS 패키지에서 변량 (ANOVA) 분석을 통한 주요 효과의 유의성을 검출할 때, 각 처리의 비교는 최소 자승법 또는 DUNCAN 방법으로 수행하였고, 처리들 중의 유의성 차이는 p 값이 0.05 보다 적을 때 결정하였다.

Claims (12)

  1. 아가로스 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 자기 재생을 유지하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 자기 재생을 유지하는 방법.
  3. 아가로스 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 미분화를 유지하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것을 특징으로 하는 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 미분화를 유지하는 방법.
  5. 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 자기 재생을 유지하는 방법.
  6. 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤 내부에 정원줄기세포를 배양하여 정원줄기세포의 미분화를 유지하는 방법.
  7. 아가로스 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 자기 재생 유지용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 자기 재생 유지용 조성물.
  9. 아가로스 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 미분화 유지용 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서 상기 아가로스의 양은 0.2% (w/v) 농도인 것을 특징으로 하는 정원줄기세포의 미분화 유지용 조성물.
  11. 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 자기 재생 유지용 조성물.
  12. 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol;PEG) 기반 3차원 하이드로젤을 유효성분으로 포함하는 정원줄기세포의 미분화 유지용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102137911B1 (ko) * 2019-09-16 2020-07-27 강원대학교산학협력단 형질전환 정원줄기세포의 생산방법

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