KR20170103149A - 소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 마이셀 및 이의 제조방법 - Google Patents
소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 마이셀 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 양친매성 히알루론산으로 형성되고 소수성 인도시아닌 그린이 봉입되어 생체내 안정성이 우수하면서 인도시아닌 농도 조절이 용이한 나노 마이셀에 관한 것으로, 나노 마이셀을 이용하여 근적외선 및 광음향 이중 영상을 통해 암 조직의 영상화가 가능하다.
Description
본 발명은 소수성 인도시아닌 그린(indocyanine green)이 봉입된 마이셀 및 이의 제조방법과 마이셀을 이용한 근적외선 및 광음향 이중 영상 적용 기술에 관한 것이다.
최근 나노 기술을 이용한 질병의 치료와 질병의 진단 및 예방을 위한 영상화 관련 기술의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 예를 들어 조영제가 도입된 고분자 나노입자 시스템은 광학영상 및 자기공명영상 등의 방법을 통해 암 조직의 영상화 기술에 응용되고 있다.
영상화 기술 중 근적외선 형광 영상기술은 비침습성 질병 진단과 모니터링 기술로서 주목받고 있는데, 근적외선 영역인 700~900nm 영역이 백그라운드 자가 형광이 낮고 광산란이 적으며 깊은 조직까지 영상이 가능한 장점이 있어 이상적인 생체 영상을 수행할 수 있다. 형광 영상을 위한 형광 염료 중 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)는 임상을 통해 사용이 승인된 근적외선 형광 염료로서 주로 간 혈관 및 심장 염색에 사용되고 있으며 다양한 진단 및 영상기술에 응용되고 있다. 그러나, 근적외선 염료는 자기 소광(self-quenching)에 의해 양자 효율(quantum yield)이 낮아져 광학활성이 손상될 수 있고, 특히 인도시아닌 그린은 체내에서 혈장 단백질과 강한 결합을 형성하고 간을 통해 혈액 내에서 소변으로 빠르게 배출되는 단점이 있다. 또한, 인도시아닌 그린 자체가 극성을 띠고 있어 마이셀과 같은 입자에 담지가 어려워 인도시아닌 그린을 변형없이 생체내의 목적하는 위치에 전달하기가 어렵다.
이러한 인도시아닌 그린의 단점을 극복하기 위해 고분자 나노입자를 사용해 인도시아닌 그린을 전달하는 기술 개발이 요구되고 있다. 이러한 기술 중 하나로 한국 공개특허 제2015-0095108호에서는 히알루론산에 인도시아닌 그린을 결합시켜 생체내 안정성을 향상시키고 히알루로니다제 활성에 따라 특이적으로 형광을 나타낼 수 있는 기술을 개시하고 있다. 그러나, 인도시아닌 그린을 고분자 등에 결합시키는 경우 인도시아닌 그린의 양을 조절하기 어려울 수 있고, 결합 부분의 개질 등 화학적 변형이 수반되기 때문에 의약 제품으로 판매를 위한 승인의 어려움이 있을 수 있다.
본 발명은 생체내에서 안정하고 근적외선 및 광음향 이중 영상을 통해 암 조직의 영상화가 가능한 소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 나노 마이셀 및 이의 제조방법을 제공하자 한다.
본 발명은 양친매성 히알루론산으로 형성되고, 소수성 인도시아닌그린(indocyanine green)이 봉입된(encapsulated) 나노 마이셀을 제공한다.
본 발명은 양친매성 히알루론산으로 형성되고, 소수성 인도시아닌그린(indocyanine green)이 봉입된(encapsulated) 나노 마이셀을 포함한 근적외선 및 광음향 이중 영상이 가능한 조성물을 제공한다.
본 발명은 히알루론산의 카복시기를 아민으로 치환하고, 상기 치환된 아민에 알킬기를 결합시켜 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액을 제조하는 단계, 인도시아닌 그린에 소수성 염을 처리하여 소수성 인도시아닌그린을 제조하는 단계 및 상기 소수성 인도시아닌그린을 상기 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액에 적가하는 단계를 포함하는 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 나노 마이셀을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 양친매성 히알루론산 나노 마이셀은 암 세포에 특이적으로 세포 내재화(internalization)될 수 있고, 근적외선 형광 영상화 및 광음향 영상화가 가능하여 이중 영상을 통한 암 조직과 암 신생 혈관을 실시간으로 모니터링 할 수 있다.
또한, 본 발명의 소수성 인도시아닌그린은 히알루론산에 결합되어 있지 않고 양친매성 히알루론산으로 형성된 마이셀 내부에 봉입(encapsulated)되어 있어 인도시아닌 그린의 활성 및 이를 이용한 영상화 효과가 매우 우수하다.
도 1은 양친매성 히알루론산인 HA-C18 제조 과정을 나타낸다.
도 2는 양친매성 히알루론산인 HA-C18의 1H-NMR으로 피크(peak) 중 1은 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에서 아세트아미도 기(acetamido moiety)를 나타내고, 2는 C18의 말단 메틸 기(CH2CH3)를 나타내고, 3은 C18의 메틸렌 기(CH2CH2CH2)를 각각 나타낸다.
도 3은 인도시아닌 그린이 봉입된 정도에 따라 소수성 인도시아닌이 봉입된 나노 마이셀인 HA-ICG의 크기를 나타낸다.
도 4는 인도시아닌 그린이 봉입된 정도에 따라 소수성 인도시아닌이 봉입된 나노 마이셀인 HA-ICG의 제타 포텐셜을 나타낸다.
도 5는 HA-C18의 임계마이셀농도를 나타낸다.
도 6은 (A)에서 HA-C18 마이셀의 TEM 이미지와 (B)에서 인도시아닌 그린 10 중량%를 적가하여 제조한 HA-ICG10의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 7은 (A)에서 서로 다른 인도시아닌 그린을 적가하여 제조한 HA-ICG의 흡광도 스펙트라와 (B)에서 형광 이미션(emission) 스펙트라를 나타낸다.
도 8은 (A)에서 MTT 어세이에 따른 SCC-7의 세포 독성 결과와 (B)에서 MTT 어세이에 따른 NIH-3T3의 세포 독성 결과를 나타낸다.
도 9는 CD44가 과발현되고 CD44 수용체가 블록되지 않은 SCC-7에서 HA-ICG 나노 마이셀이 CD44 수용체 매개 특이적으로 SCC-7 세포에 세포 내재화 되는 것을 나타낸다.
도 10은 (A)에서 CD44가 과발현된 SCC-7, CD44 수용체가 블록된 SCC-7 및 CD44가 발현되지 않은 NIH-3T3에서 HA-ICG의 세포 흡수를 정량적으로 나타내고 (B)에서 HA-ICG가 처리된 CD44가 과발현된 SCC-7, CD44 수용체가 블록된 SCC-7 및 CD44가 발현되지 않은 NIH-3T3의 플로우 사이토메트릭 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 마우스에 HA-ICG를 주입한 후 NIRF를 통한 생체내분포를 나타낸다.
도 12는 (A)에서 HA-ICG를 주입한 마우스로부터 적출한 각 주요 기관의 NIRF 이미지를 나타내고, (B)에서 NIRF의 정량적 강도를 나타낸다.
도 13은 (A)에서 in-vitro 상의 처리한 HA-ICG 농도에 따른 광음향 신호 강도를 나타내고 (B)에서 HA-ICG 주입된 마우스에 750nm 파장을 이용하여 in- vivo 상의 광음향 이미지를 나타낸다.
도 14는 독소루비신으로 소수화된 인도시아닌그린이 봉입된 나노 마이셀의 UV 흡수 스펙트라를 나타낸다.
도 2는 양친매성 히알루론산인 HA-C18의 1H-NMR으로 피크(peak) 중 1은 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에서 아세트아미도 기(acetamido moiety)를 나타내고, 2는 C18의 말단 메틸 기(CH2CH3)를 나타내고, 3은 C18의 메틸렌 기(CH2CH2CH2)를 각각 나타낸다.
도 3은 인도시아닌 그린이 봉입된 정도에 따라 소수성 인도시아닌이 봉입된 나노 마이셀인 HA-ICG의 크기를 나타낸다.
도 4는 인도시아닌 그린이 봉입된 정도에 따라 소수성 인도시아닌이 봉입된 나노 마이셀인 HA-ICG의 제타 포텐셜을 나타낸다.
도 5는 HA-C18의 임계마이셀농도를 나타낸다.
도 6은 (A)에서 HA-C18 마이셀의 TEM 이미지와 (B)에서 인도시아닌 그린 10 중량%를 적가하여 제조한 HA-ICG10의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 7은 (A)에서 서로 다른 인도시아닌 그린을 적가하여 제조한 HA-ICG의 흡광도 스펙트라와 (B)에서 형광 이미션(emission) 스펙트라를 나타낸다.
도 8은 (A)에서 MTT 어세이에 따른 SCC-7의 세포 독성 결과와 (B)에서 MTT 어세이에 따른 NIH-3T3의 세포 독성 결과를 나타낸다.
도 9는 CD44가 과발현되고 CD44 수용체가 블록되지 않은 SCC-7에서 HA-ICG 나노 마이셀이 CD44 수용체 매개 특이적으로 SCC-7 세포에 세포 내재화 되는 것을 나타낸다.
도 10은 (A)에서 CD44가 과발현된 SCC-7, CD44 수용체가 블록된 SCC-7 및 CD44가 발현되지 않은 NIH-3T3에서 HA-ICG의 세포 흡수를 정량적으로 나타내고 (B)에서 HA-ICG가 처리된 CD44가 과발현된 SCC-7, CD44 수용체가 블록된 SCC-7 및 CD44가 발현되지 않은 NIH-3T3의 플로우 사이토메트릭 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 마우스에 HA-ICG를 주입한 후 NIRF를 통한 생체내분포를 나타낸다.
도 12는 (A)에서 HA-ICG를 주입한 마우스로부터 적출한 각 주요 기관의 NIRF 이미지를 나타내고, (B)에서 NIRF의 정량적 강도를 나타낸다.
도 13은 (A)에서 in-vitro 상의 처리한 HA-ICG 농도에 따른 광음향 신호 강도를 나타내고 (B)에서 HA-ICG 주입된 마우스에 750nm 파장을 이용하여 in- vivo 상의 광음향 이미지를 나타낸다.
도 14는 독소루비신으로 소수화된 인도시아닌그린이 봉입된 나노 마이셀의 UV 흡수 스펙트라를 나타낸다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 양친매성 히알루론산(hyaluronic acid)으로 형성되고, 소수성 인도시아닌그린(indocyanine green)이 봉입된(encapsulated) 나노 마이셀(micelle) 을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 나노 마이셀을 포함한 근적외선 및 광음향 영상용 조성물을 제공할 수 있다. 히알루론산은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)이 교대로 반복되는 자연계에서 존재하는 선형 구조의 천연고분자로 생분해성 및 생체적합성이 우수하며 면역반응성이 극히 낮은 물질이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 히알루론산에 포함된 D-글루쿠론산의 카복실기에 아민기를 도입하고, 아민기를 통해 히알루론산에 알킬기를 결합시킨 양친매성 히알루론산이 형성하는 나노 마이셀에 소수성 인도시아닌 그린을 봉입시킬 수 있다.
본 발명에서 양친매성(amphiphathic) 히알루론산은 히알루론산에 소수성 성질을 가지는 화합물을 결합시켜 제조할 수 있으며 바람직하게는 히알루론산에 알킬기를 결합시켜 제조할 수 있다. 히알루론산에 알킬기(alkyl group)를 결합하여 양친매성 히알루론산을 제조하는 경우 히알루론산에 알킬기를 결합하여 히알루론산이 양친매성 성질을 가지게 되고, 양친매성 히알루론산은 자기 조립에 의해(self-assembly) 나노 마이셀을 형성할 수 있다. 히알루론산에 결합되는 알킬기는 C8 내지 C20, C12 내지 C 20, 바람직하게는 C16 내지 C20의 알킬기이나 이에 제한되지 않는다. 히알루론산에 결합된 알킬기의 사슬 길이가 길수록 소수성이 증가하여 적은 양의 양친매성 히알루론산으로 쉽게 나노 마이셀을 형성할 수 있으나 마이셀이 치밀하지 못할 수 있고, 히알루론산에 결합된 알킬기의 사슬 길이가 짧을수록 소수성이 감소하므로 양친매성 히알루론산의 양을 증가시켜야 나노 마이셀을 형성할 수 있어 히알루론산에 결합하는 알킬기의 탄소수를 조절할 필요가 있을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 히알루론산에 결합된 알킬기로 옥타데실기(octadecyl group)가 히알루론산 고분자에서 평균 100 잔기마다 카복시 그룹에 아민을 통해 결합하게 된다.
양친매성 히알루론산으로 형성된 나노 마이셀의 내부는 알킬기에 의해 소수성 환경이 형성되고, 여기에 소수성 인도시아닌 그린이 봉입(encapsulated)될 수 있다. 그리고, 본 발명의 양친매성 히알루론산으로 형성된 나노 마이셀은 종양 조직 세포에서 과발현되는 CD44 수용체에 특이적으로 결합할 수 있어, CD44 수용체를 매개로 한 암 세포의 특이적 세포 내재화가 가능하다. 이러한 특이적 세포 내재화를 통해 본 발명의 나노 마이셀에 봉입된 인도시아닌 그린은 암 세포에 선택적으로 전달될 수 있으며, 이를 통해 종양 조직 및 종양 혈관의 근적외선 영상화뿐만 아니라 광음향 영상화를 통한 이중 영상화가 가능하다.
본 발명에서 양친매성 히알루론산으로 형성된 나노 마이셀에 봉입된 소수성 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)은 인도시아닌 그린의 소수화를 통해 제조된다. 소수성 인도시아닌 그린는 소수성 염과 인도시아닌 그린을 혼합하여 제조할 수 있고 바람직한 소수성 염은 테트라부틸암모니움 요오드화물(tetrabutylammonium iodide, TBAI)이나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 인도시아닌 그린은 소수성 항암제에 의해 소수성 염 형태의 인도시아닌 그린을 형성하여 나노 마이셀에 봉입될 수 있다. 소수성 인도시아닌 그린을 형성하기 위한 소수성 항암제로는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 멜판란(melphalan)이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 소수성 인도시아닌 그린은 양친매성 히알루론산으로 형성된 나노 마이셀에 봉입되게 되는데, 이 때 양친매성 히알루론산과 공유결합 등과 같이 특이적인 화학적 결합을 이루지 않고, 나노 마이셀 내부의 소수성 환경에 의해 내부 중심에 위치하게 된다. 이러한 특징은 인도시아닌 그린이 마이셀을 이루는 고분자 등과 특정 결합을 이룰 필요가 없어 인도시아닌 그린의 개질 등 화학적 변형이 불필요하여 인도시아닌 및 인도시아닌을 소수화하기 위해 사용하는 항암제 등과 같은 약물의 고유 특성이 그대로 유지될 수 있다. 구체적으로, 인도시아닌 그린이 고분자 등과 특이적 결합을 이루지 않고 봉입되기 때문에 인도시아닌 그린의 광학적 특성이 그대로 유지되게 된다. 항암제 등에 의해 소수화된 인도시아닌 그린이 나노 마이셀에 봉입되는 경우, 인도시아닌 그린 자체의 특징적인 광학적 특성이 유지될뿐만 아니라 항암제의 고유 형광 특성 및 항암제의 효과 또한 그대로 유지되어 종양 조직이나 혈관에 특이적으로 전달될 수 있다. 또한, 인도시아닌 그린을 고분자 물질 등에 결합할 필요 없이 자가 형성되는 나노 마이셀에 봉입 시킬 수 있어 인도시아닌 그린의 농도를 효과적으로 용이하게 조절하여 나노 마이셀에 봉입시킬 수 있다. 이러한 특징은 목적하는 종양 조직에 인도시아닌 그린이 적은 농도로 축적되는 경우 광음향 및 형광 영상 이미징이 뚜렷하게 나타나지 않을 수 있고, 지나치게 많은 농도로 축적되는 경우 자기 소광(self-quencing)에 의한 영향의 증가로 인해 광학활성이 손상되어 명확한 광음향 및 형광 영상 이미징이 나타나지 않을 수 있는 현상을 용이하게 해결할 수 있다.
본 발명의 나노 마이셀에 봉입된 소수성 인도시아닌 그린 또는 항암제등 약물은 생체내부로 주입된 나노 마이셀이 종양 조직이나 종양 혈관에 특이적으로 생체내에서 분포되고 암 세포에 내재화된 후, 나노 마이셀의 분해에 따라 방출되게 된다.
본 발명에 따르면, 소수성 인도시아닌 그린이 나노 마이셀을 이루는 히알루론산과 결합되지 않고 나노 마이셀의 내부 중심에 위치하게 되기 때문에 기존에 알려진 형광 염료를 고분자에 결합하여 전달하는 방법과는 구분되는 효과가 있다. 특히, 히알루론산이 히알루로니다아제(hyaluronidase)와 같은 효소에 의한 분해되는 것을 방지할 수 있어 인도시아닌이 종양 조직에 특이적으로 전달되어 암 세포 내부에 축적되기 전에 방출되거나 분해되는 것을 최소화 하여 다량 축적될 수 있다.
본 발명은 양친매성 히알루론산으로 형성되고, 소수성 인도시아닌 그린을 포함한 나노 마이셀을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 나노 마이셀의 제조방법은 히알루론산의 카복시기를 아민으로 치환하고, 상기 치환된 아민에 알킬기를 결합시켜 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 인도시아닌 그린에 소수성 염을 처리하여 소수성 인도시아닌그린을 제조하는 단계; 및 상기 소수성 인도시아닌그린을 상기 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액에 적가하는 단계를 포함하는 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 나노 마이셀을 제조하는 방법이다.
본 발명의 나노 마이셀 제조방법 중 소수성 인도시아닌그린을 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액에 적가하는 단계에 있어서, 적가하는 소수성 인도시아닌그린은 30 중량%이하, 10 내지 30 중량%, 바람직하게는 5 내지 15중량%이나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 30 중량%을 초과하는 경우 응집현상에 의해 나노 입자가 형성되지않아 본 발명에서 목적하는 나노 마이셀의 제조가 어려울 수 있다. 또한, 적가하는 소수성 인도시아닌그린의 양의 증가에 따라 나노 마이셀에 봉입되는 소수성 인도시아닌그린이 증가하여 광음향 및 형광 영상의 신호의 세기도 증가하나 나노 마이셀의 크기도 증가하여 세포내 전달 효과가 감소할 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위해 보다 구체적인 실시예에 대하여 설명하며, 하기 실시예에 따라 본 발명이 제한되어 해석되는 것은 아니다.
소수성 인도시아닌 그린이
봉입된
마이셀(micelle)의
제조
1-1.
양친매성
히알루론산의 준비
6.8kDa 히알루론산(hyaluronic acid) 3mM을 무수 포름아미드(anhydrous formamide) 5mL에 열을 가하면서 완전히 녹인 용액을 준비한 후 실온에서 냉각시켰다. 용액을 냉각한 후, EDC(1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide) 96mg 및 NHS(N-hydroxysuccinimide) 58mg를 첨가하여 히알루론산의 카복시 그룹과 반응시켰다. 2시간 후 DMF(N-N dimethyl formamide)에 용해된 C18 3mM을 첨가하고 질소분위기에서 5시간 동안 반응시켰으며 반응 동안 온도는 60℃를 유지시켰다(도 1). 이 후, 24시간 동안 실온에서 더 저어주어 얻은 혼합 용액을 에탄올에서 24시간, 에탄올-물 혼합용액에서 48시간, 물에서 24시간 동안 각각 순차적으로 투석하였다. 투석을 마친 후 얻어진 최종 용액을 필터 및 동결건조를 통해 정제하여 양친매성 히알루론산인 HA-C18를 수득하고 NMR 분광광도계(300 Hz; Bruker, Billerica, MA)를 사용하여 1H-NMR을 통해 확인하였다(도 2).
1-2. 소수성
인도시아닌그린의
준비 및
마이셀내
봉입
TBAI(tetrabutylammonium iodide) 염 6mM을 클로로포름 속 인도시아닌그린 1mM 수용액에 첨가한 후 약 30분간 초음파처리하여 소수성 인도시아닌 그린인 인도시아닌-TBAI를 제조하였다. 제조한 소수성 인도시아닌그린을 10, 20, 30 중량%로 각각 제조해 놓은 양친매성 히알루론산인 HA-C18 마이셀 수용액에 적가(add drop-wise)하고 10 중량%의 경우 HA-ICG 10, 20 중량%의 경우 HA-ICG 20, 30 중량%의 경우 HA-ICG 30으로 각각 구분되도록 라벨링하였다. 클로로포름을 증발시켜 제거하여 HA-C18 마이셀 내부 중심에 소수성 인도시아닌그린-TBAI이 봉입시키고 남은 용액을 물에서 48시간 동안 투석 후 동결 건조하였다. 소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 마이셀과, 봉입되지 않는 마이셀의 크기는 DLS(dynamic light scattering) 방법으로 분석하였고 HA-C18의 크기는 평균 400 내지 500nm로 나타났으며, 인도시아닌 그린이 로딩된 양에 따라 마이셀의 평균 크기는 달리진 것을 확인하였다(도 3). 마이셀의 평균 제타 포텐셜(zeta potential)은 Zetasizer Nano Z analyzer (Malven Instruments, Malvern, UK)으로 분석하였다(도 4). HA-C18 마이셀 수용액의 임계마이셀농도(critical micelle concentration)은 피렌(pyrene)을 형광탐침(fluorescent probe)으로 하여 측정하였다(도 5). HA-C18 마이셀과 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 HA-C18 마이셀의 형태는 투과전자현미경(JEOL JEM-2000 FX, Tokyo, Japan)으로 확인하였다(도 6). 소수성 인도시아닌그린이 HA-C18 마이셀에 로딩되는 효율은 동결 건조된 HA-C18 마이셀을 계량하여 1mM DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 확인하였다. 소수성 인도시아닌그린이 봉입되지 않은 HA-C18 마이셀을 기준으로하고, 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 HA-C18 마이셀이 DMSO에 용해되어 방출되는 인도시아닌그린의 790nm 흡광도를 비교하였으며, 로딩 효율은 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 HA-C18 마이셀 대비 로딩된 소수성 인도시아닌 그린의 중량비로 표현하였다. 봉입된 소수성 인도시아닌 그린의 양은 적가한 소수성 인도시아닌 그린의 양의 증가에 따라 증가하였고, HA-ICG 10의 경우 40 중량%, HA-ICG 20의 경우 72 중량%, HA-ICG 30의 경우 78.5 중량%에 해당하였다(도 7). 이를 통해, 인도시아닌 그린의 로딩 효율이 매우 높고 나노 마이셀에 봉입되는 인도시아닌 그린의 농도 조절이 용이하고 효과적임을 알 수 있다.
1-3. 세포 독성 확인
In vitro에서 소수성 인도시아닌그린(ICG)이 봉입된 HA-C18 마이셀(HA-ICG)의 세포 독성을 편평상피암(squamous cell carcinoma, SCC) 세포주 SCC-7 및 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 세포주 NIH-3T3에 소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 마이셀인 HA-ICG를 농도를 0.2, 0.4, 0.8, 1.5, 3, 6.25, 12.5㎍/ml달리하여 처리하고 MTT 어세이를 수행하였다. 세포 독성은 각각 HA-ICG가 처리되지 않은 세포를 양성 대조군으로 하고, 트리톤-X-100(triton-X-100)을 처리한 세포를 음성 대조군으로하여 퍼센트로 계산하였으며, 서로 다른 샘플 5개를 통해 평균±표준편차로 나타내었다. 그 결과 NIH-3T3 및 SCC-7 모두 높은 세포 생존율(> 90%)이 나타났다(도 8).
소수성
인도시아닌그린이
봉입된
마이셀(HA-ICG)의
in vitro
세포내
내재화 확인
SCC-7 세포를 37℃, 5% CO2조건 및 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 항생제-분열억제제 용액(GibcoVR/ Invitrogen/Thermo Fisher Scientific)을 포함한 RMPI 1640 (GibcoVR Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 배양하였다. HA-ICG 마이셀의 세포 흡수를 확인하기 위해 SCC-7 세포를 Lab-Tek 챔버 슬라이드에 1×105 cells/well로 씨딩하고 24시간 후 HA-ICG 마이셀을 SCC-7 세포에 가한 후 37℃ 암실에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지의 세포를 PBS(Phosphate buffer saline)로 3회 세척하고 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 세포 고정 후, 20분간 골드 안티페드 시약(gold antifade reagent) 및 DAPI(4′, 6-diamidino-2-phenylindo)로 핵을 염색하였고, 세포 형광은 공초점 레이저 현미경으로 확인하였다. CD44 매개에 의한 HA-ICG 마이셀의 세포 흡수 확인을 위해 SCC-7 세포 배양 배지에 8mg/mL 히알루론산 폴리머를 처리하여 CD44 수용체를 블록시킨 SCC-7 세포 및 CD44가 발현되지 않은 NIH-3T3 세포에서도 세포내 내재화 확인을 수행하였다. 그 결과 CD44가 과발현된 SCC-7 세포에서 HA-ICG의 세포내 내재화에 의한 형광이 확인되었다(도 9). 또한, 세포 배양 후 배지 세포를 PBS로 3회 세척 후 수확하여 플로우 사이토미터(flow cytometer, FACScan)으로 플로우 사이토메트릭 분석(flow cytometeric analysis)을 수행하였다. 그 결과, 공초점 레이저 현미경으로 확인한 결과와 유사하게 나타났다(도 10). 이상의 결과를 통해 HA-ICG 마이셀은 암세포에서 CD44 수용체 매개에 의한 엔도사이도시스를 통해 암세포 내로 내재화 되는 것을 확인할 수 있었다.
소수성
인도시아닌그린이
봉입된
마이셀(HA-ICG)의
in-
vivo
및
ex-
vivo
세포내
내재화 확인
근교배 Balb/c 누드 마우스(5 weeks, male; Orient Bio Inc., Seongnam-si, South Korea)에 세포를 피하 주사하여 CD44-발현 SCC-7가 이식된 마우스를 준비하였다. 종양 크기가 약 100mm3로 자랐을 때 HA-ICG를 정맥주사로 마우스에 투여하였다. 정맥주사 투여 후 HA-ICG의 종양 특이성 및 생체내분포(bio-distribution) 분석을 Fluorescencelabeled Organism Bio-imaging Instrument(FOBI, NEO science, Gyeonggi, Korea)을 사용하여 서로 다른 특정 시간 때에 수행하였다(도 11). 그리고, HA-ICG 투여 후 24시간 후 주요 기관인 간, 폐, 비장, 심장 및 신장과 종양 조직을 마우스로부터 적출하고, HA-ICG의 종양 축적은 근적외선 형광(near-infrared fluorescence, NIRF)으로 측정하여 확인하였다(도 12). NIRF 결과 종양 조직 및 간에서 NIRF 강도가 높게 나타났고, 간에서 NIRF 강도가 높게 나타난 것은 HARE 수용체 및 세망세피계(reticuloendothelial system)에 의한 것이므로 간에서 NIRF 강도가 높게 나타나더라도, in- vivo 에서 형광 측정을 모니터링 하여 종양 조직을 확인할 수 있는 것으로 확인되었다.
소수성
인도시아닌그린이
봉입된
마이셀(HA-ICG)에
의한
광음향
이미징
측정
HA-ICG 투여를 통해 종양 조직 및 종양 혈관을 확인하기 위한 광음향 이미징(photoacoustic imaging, PAI)은 680, 750 및 900nm 파장에서 광음향 CT 스캐너 (Nexus 128; Endra Inc., Ann Arbor, MI)를 사용하여 수행하였다. 광음향 강도는 HA-ICG의 농도에 의존적으로 나타났으며, 종양 조직 및 종양 혈관을 광음향 이미징에 의해 확인하였다(도 13).
독소루비신에
의해 소수화된
인도시아닌그린이
봉입된
마이셀(HA-ICG/DOX)의
제조
독소루비신(Doxorubicin, DOX)과 인도시아닌그린(Indocyanin green, ICG)을 암조건에서 각각 DMSO에 1시간 동안 용해시킨 후 무게비 1:1로 혼합하였다. 이 후 pH5.5의 MES 버퍼에 독소루비신과 인도시아닌그린이 포함된 혼합물을 한방울씩 떨어뜨리면서 교반하여 염상태로 결합된 독소루비신과 인도시아닌을 침전시켰다. 염상태로 결합된 독소루비신과 인도시아닌을 침전시킨 후 15,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득한 침전물을 PBS로 잘 씻어준 후 동결건조 하여 독소루비신에 의해 소수화된 인도시아닌그린(DOX-ICG)을 제조하였다. DOX-ICG 을 실시예 1에서 제조한 HA-C18와 함께 DMSO에 용해시킨 후 교반하면서 증류수에 한방울씩 떨어뜨려서 DOX-ICG가 봉입된 HA-C18 나노 마이셀인 HA-ICG/DOX이 포함된 수용액 얻었다. HA-ICG/DOX이 포함된 수용액을 MWCO 3,500Da 투석막으로 투석하여 DMSO와 염형태가 아닌 독소루비신과 인도시아닌그린을 제거하고 동결건조 하여 파우더형태의 HA-ICG/DOX를 제조하였다. 제조한 나노 마이셀인 HA-ICG/DOX를 UV 흡수 스펙트럼을 통해 독소루비신에 의해 소수화된 인도시아닌그린이 봉입된 나노 마이셀인 것을 확인하였다(도 14).
Claims (8)
- 양친매성 히알루론산으로 형성되고, 소수성 인도시아닌그린(indocyanine green)이 봉입된(encapsulated) 나노 마이셀.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 히알루론산은 히알루론산에 알킬기(alkyl group)가 결합된 나노 마이셀.
- 제2항에 있어서,
상기 알킬기는 C16 내지 C20인 나노 마이셀.
- 제1항에 있어서,
상기 소수성 인도시아닌그린은 테트라부틸암모니움 요오드화물(tetrabutylammonium iodide) 또는 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물에 의해 소수화된 인도시아닌그린인 나노 마이셀.
- 제4항에 있어서,
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin) 또는 멜판란(melphalan)인 나노 마이셀.
- 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 마이셀을 포함한 근적외선 및 광음향 영상용 조성물.
- 히알루론산의 카복시기를 아민으로 치환하고, 상기 치환된 아민에 알킬기를 결합시켜 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 인도시아닌 그린에 소수성 염을 처리하여 소수성 인도시아닌그린을 제조하는 단계; 및 상기 소수성 인도시아닌그린을 상기 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액에 적가하는 단계를 포함하는 소수성 인도시아닌그린이 봉입된 나노 마이셀의 제조 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 소수성 인도시아닌 그린을 10 내지 30 중량%으로 양친매성 히알루론산을 포함하는 수용액에 적가하는 단계를 포함하는 나노 마이셀의 제조 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160025534A KR101789563B1 (ko) | 2016-03-03 | 2016-03-03 | 소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 마이셀 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (2)
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| KR20170103149A true KR20170103149A (ko) | 2017-09-13 |
| KR101789563B1 KR101789563B1 (ko) | 2017-11-20 |
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ID=59968052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160025534A KR101789563B1 (ko) | 2016-03-03 | 2016-03-03 | 소수성 인도시아닌 그린이 봉입된 마이셀 및 이의 제조방법 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101789563B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11617804B2 (en) * | 2014-07-18 | 2023-04-04 | Wake Forest University | Hyaluronic acid-based nanoparticles as biosensors for imaging-guided surgery and drug delivery vehicles and methods associated therewith |
-
2016
- 2016-03-03 KR KR1020160025534A patent/KR101789563B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101789563B1 (ko) | 2017-11-20 |
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