KR20170068694A - Novel natural disinfectant with probiotics properties - Google Patents

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KR20170068694A
KR20170068694A KR1020150175274A KR20150175274A KR20170068694A KR 20170068694 A KR20170068694 A KR 20170068694A KR 1020150175274 A KR1020150175274 A KR 1020150175274A KR 20150175274 A KR20150175274 A KR 20150175274A KR 20170068694 A KR20170068694 A KR 20170068694A
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KR1020150175274A
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이찬호
강정선
조원탁
조경진
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(주)진바이오텍
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    • C12R1/865—

Abstract

본 발명은 우수한 항균력을 가진 락토바실러스 루테리 균주(Lactobacillus reuteri KCCM 10651P) 또는 우수한 알코올 생성능을 가진 사카로미세스 세레비시아에 GB-SM7 균주(Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P)를 이용한 천연 소독제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 위 유산균과 효모균을 고체발효시킨 생균제를 포함하는 천연 소독제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 소독제는 동물에게 무해하고, 저장안정성이 우수하며, 항균력 특히 대장균에 대한 항균력이 뛰어나다.The present invention relates to a natural disinfectant using Lactobacillus reuteri KCCM 10651P with excellent antibacterial activity or Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P with Saccharomyces cerevisiae having excellent alcohol-producing ability . More particularly, the present invention relates to a natural disinfectant containing a probiotic agent in which the above lactic acid bacteria and yeast bacteria are solid-fermented. The disinfectant according to the present invention is harmless to animals, has excellent storage stability, and has excellent antibacterial activity, especially against E. coli.

Description

생균제 기능을 지니는 신규 천연 소독제 {NOVEL NATURAL DISINFECTANT WITH PROBIOTICS PROPERTIES}NOVEL NATURAL DISINFECTANT WITH PROBIOTICS PROPERTIES < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 항균 활성을 갖는 유산균주 및 효모균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유산균 및 효모균의 고체 발효물을 포함하는 천연 소독제에 관한 것이다.The present invention relates to a lactic acid bacteria strain and a yeast strain having an antibacterial activity. The present invention also relates to a natural disinfectant comprising solid fermented products of lactic acid bacteria and yeast.

세균, 바이러스 또는 곰팡이 중 일부는 병을 유발하거나 식품을 부패시키는 등 동물의 건강을 위협하는 큰 적이라 볼 수 있다. 특히, 과거에는 유해한 세균의 감염으로 인해 동물의 목숨까지 잃는 일도 많았기 때문에, 페니실린과 같은 항생제의 개발은 획기적인 의학적 성과로 인정되었었다.Some of the bacteria, viruses or fungi can be a major threat to the health of animals, such as causing disease or corrupting food. In particular, the development of antibiotics, such as penicillin, has been recognized as a breakthrough medical achievement, especially in the past, where harmful bacterial infections have led to the loss of animal lives.

그러나, 항생제에 대한 내성을 보이는 세균이 생성되면서 세균 등에 대한 공포가 다시 확산되고 있다. 특히, 2차 감염을 유발하는 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)과 같은 슈퍼박테리아가 큰 문제로 대두되면서, 대한민국 농림수산식품부는 2011년 7월부터 가축의 배합사료 내 항생제의 사용을 전면 금지하는 조치까지 발한 상태이다. However, as bacterium showing resistance to antibiotics is produced, fear of bacteria and the like is spreading again. In particular, since super bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which cause secondary infections, have become a big problem, the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of the Republic of Korea has prohibited the use of antibiotics in livestock feed since July 2011 Measures to swallow.

이로 인해, 최근에는 균 등의 감염을 치료하기 위해 항생제 등을 복용하는 것에 앞서, 균 등의 감염을 예방하기 위해 소독제를 활용하는 것이 중요시되고 있다.Therefore, in recent years, prior to taking antibiotics to treat infections such as germs, it is important to use disinfectants to prevent infection of germs and the like.

소독제라 함은 동물질병 방역의 목적으로 축사 또는 양어장 등의 소독대상에 적용하여 병원미생물을 사멸 또는 증식억제 작용하는 제제를 말한다. 여기서, 소독대상이라 함은 병원체에 오염되었거나 오염되었을 우려가 있는 축체(사체 포함), 축사바닥, 축사공간, 차량, 운반용구, 동물용 음수, 오물, 양어장, 어류 또는 기구 등을 말하는데, 일반적으로 유기물의 함량에 따라, 축사바닥, 오물, 사체, 농장차량 및 운반용구 등의 유기물이 많이 함유된 대상과 축사공간, 동물용 음수, 축체표면, 기구, 양어장, 어류 및 일반차량 등의 유기물이 적게 함유된 대상으로 분류할 수 있다. 또한, 유기물이라 함은 소독의 효력에 영향을 주는 것으로서, 탄수화물, 지방 또는 단백질 등과 이를 함유한 동물의 분비물, 배설물, 장내용물, 혈액, 동물의 조직 또는 사료찌꺼기 등을 말하며, 소독대상 병원체라 함은 동물의 건강한 사육을 위하여 사멸 또는 증식억제의 대상이 되는 병력을 갖고 있는 병원체들을 의미한다.Disinfectant refers to a preparation which is applied to a disinfection object such as a barn or a fish farm for the purpose of animal disease prevention and acts to kill or proliferate the microorganism of the hospital. Here, the disinfection object refers to a shaft body (including a carcass), a housing floor, a housing space, a vehicle, a conveying device, a drinking water for animals, dirt, fish farms, fishes or utensils that may be contaminated or contaminated by a pathogen, Depending on the content of organic matter, organic matter such as housing floor, dirt, carcass, farm vehicle, transportation equipment, etc., and organic matter such as housing space, animal water, animal body surface, instrument, fish farm, It can be classified as containing subject. Also, organic matter refers to carbohydrate, fat or protein and its secretions, excretion, intestinal contents, blood, animal tissues or feed residue, etc., which affect the efficacy of disinfection, Refers to pathogens that have a history of being killed or inhibited for growth of animals.

소독제로 많이 사용하고 있는 물질로는 알코올, 차염소산나트륨 및 과산화수소 등을 들 수 있다. 그러나, 알코올류는 공간에 분무했을 때 폭발 및 화재의 위험성이 있으며, 차염소산나트륨이나 과산화수소는 강력한 산화제로서 흡입하거나 피부에 접촉되었을 때 좋지 않은 영향을 끼칠 우려가 있고 빠르게 증발 또는 분해되어 소독 지속력이 낮다는 단점이 있다.Alcohol, sodium hypochlorite and hydrogen peroxide are examples of substances that are widely used as disinfectants. Alcohols, however, are explosive and fire hazardous when sprayed into the space. Sodium hypochlorite and hydrogen peroxide are strong oxidants which may have a bad influence when inhaled or in contact with skin, There is a drawback that it is low.

이에, 동물에게 무해한 소독제의 개발을 위해 천연 소독제에 관한 연구가 진행되고 있는데, 그 일예로 대한민국 공개특허공보 제 10-2014-0066904호에는 측백나무, 검양옻나무, 조록나무, 말오줌때, 붉나무, 개옻나무 또는 삼백초 등의 활용이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허공보 제 10-2005-0043444호에는 목초액과 프로폴리스의 활용이 개시되어 있다. 그러나, 천연 추출물 소독제는 시장에서 상업적으로 큰 성공을 거둔바 없는 것처럼 그 효과에 대해 의문이 있다.For example, Korean Patent Publication No. 10-2014-0066904 discloses a natural disinfectant for the development of a harmless disinfectant for animals. For example, Korean Patent Publication No. 10-2014-0066904 discloses a natural disinfectant, U.S. Patent Application No. 10-2005-0043444 discloses the use of wood vinegar and propolis. However, the effectiveness of disinfectants for natural extracts is questionable as they have not been commercially successful in the market.

대한민국 공개특허공보 제 10-2014-0066904호Korean Patent Publication No. 10-2014-0066904 대한민국 공개특허공보 제 10-2005-0043444호Korean Patent Publication No. 10-2005-0043444

저장 안정성이 우수하며, 항균력이 우수하고, 동물에게 무해한 천연 소독제를 제공하고자 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The present invention has been completed to provide a natural disinfectant excellent in storage stability, excellent in antibacterial activity and harmless to animals.

본 발명은 다음의 수단을 통해 전술한 과제를 해결한다.The present invention solves the above-described problems through the following means.

(1) 항균능을 가진 락토바실러스 루테리 균주(Lactobacillus reuteri KCCM 10651P).(1) Lactobacillus reuteri KCCM 10651P having antibacterial activity.

(2) 알코올 생성능이 우수한 사카로미세스 세레비시아에 GB-SM7 균주(Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P).(2) Saccharomyces cerevisiae strain GB-SM7 (Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P) with excellent alcohol-producing ability.

(3) 상기 (1) 및 (2) 중 하나 이상의 균주를 발효시킨 것을 포함하는 생균제.(3) A probiotic agent comprising fermenting at least one of the strains (1) and (2).

(4) 상기 (3) 에 있어서, 고체발효시킨 것을 특징으로 하는 생균제.(4) The probiotic agent according to (3), which is solid fermented.

(5) 상기 (4) 에 따른 생균제를 포함하는 천연 소독제.(5) A natural disinfectant comprising the probiotic agent according to (4) above.

본 발명에 따른 유산균은 항균력, 내산성 및 내담즙성이 우수하다. 본 발명에 따른 효모균은 알코올 생성능이 우수하다. 본 발명에 따른 생균제는 저장안정성이 우수하며, 천연 소독제로 활용할 수 있다.The lactic acid bacteria according to the present invention are excellent in antibacterial activity, acid resistance, and bile resistance. The yeast according to the present invention has an excellent alcohol producing ability. The probiotic agent according to the present invention has excellent storage stability and can be used as a natural disinfectant.

도 1 은 2 차 선발 군체 중 항균력을 나타내는 본 발명에 따른 유산균을 선발하기 위해 37 °C 에서 48 시간 배양한 후의 매질의 색깔을 나타낸 것이다. 우측 상단의 매질이 위 본 발명에 따른 유산균인 Lactobacillus reuteri KCCM 10651P 를 배양한 것이다.
도 2 는 본 발명에 따른 유산균인 L. reuteri KCCM 10651P 의 16S rDNA 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 3 은 본 발명에 따른 유산균인 L. reuteri KCCM 10651P 의 내산성을 평가한 것이다.
도 4 는 본 발명에 따른 유산균인 L. reuteri KCCM 10651P 의 내담즙성을 평가한 것이다.
도 5 는 알코올 생성능이 우수한 효모 균주 분리 과정을 나타낸 것이다.
도 6 은 본 발명에 따른 효모균인 S. cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P 의 배양 시간별 알코올, 균수 및 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 7 은 본 발명에 따른 효모균인 S. cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P 의 18S rDNA 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 8 은 본 발명에 따른 자가 발효액을 나타낸 것이다.
도 9 는 본 발명에 따른 고체 발효 종균으로 자가 발효를 하여 배양시간별 발효액내의 항균활성(E.coli O-157) 평가결과를 나타낸 것이다.
도 10 은 본 발명에 따른 고체 발효 종균의 저장성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 11 은 본 발명에 따른 소독제 살포에 따른 분만사내의 유해 낙하 세균수의 변화를 나타낸 것이다.
도 12 는 본 발명에 따른 소독제 살포에 따른 자돈사내의 유해 낙하 세균수의 변화를 나타낸 것이다.
도 13 은 본 발명에 따른 소독제의 사용 전, 후의 유해균의 감소 효과를 나타낸 것이다. 상단부분은 좌측부터 분만사(2월-소독 전), 분만사(2월-소독 후), 자돈사(2월-소독 전) 그리고 자돈사(2월-소독 후)에 관한 것이고, 중단부분은 좌측부터 분만사(7월-소독 전), 분만사(7월-소독 후), 자돈사(7월-소독 전) 그리고 자돈사(7월-소독 후)에 관한 것이며, 하단부분은 좌측부터 분만사(8월-소독 전), 분만사(8월-소독 후), 자돈사(8월-소독 전) 그리고 자돈사(8월-소독 후)에 관한 것이다.
도 14 는 본 발명에 따른 소독제 사용 5 개월 후 공기중의 오염균수의 변화(소독 전)를 나타낸 것이다. 좌측부터 분만사(2월), 분만사(8월), 자돈사(2월) 그리고 자돈사(8월)에 관한 것이다.FIG. 1 shows the color of the medium after incubation at 37 ° C for 48 hours in order to select the lactic acid bacteria according to the present invention showing the antibacterial activity among the secondary selection colonies. And the medium at the upper right is the culture of Lactobacillus reuteri KCCM 10651P, which is the lactic acid bacterium according to the present invention.
Figure 2 shows the 16S rDNA sequencing results of L. reuteri KCCM 10651P, a lactic acid bacterium according to the present invention.
Fig. 3 shows the acid resistance of L. reuteri KCCM 10651P, which is a lactic acid bacterium according to the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the bile resistance of L. reuteri KCCM 10651P, a lactic acid bacterium according to the present invention.
FIG. 5 shows a yeast strain isolation process having an excellent alcohol-producing ability.
FIG. 6 shows changes in alcohol, bacterial count and pH of the yeast S. cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P according to the present invention.
FIG. 7 shows the 18S rDNA sequencing results of S. cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P, a yeast strain according to the present invention.
8 shows a self-fermenting liquid according to the present invention.
FIG. 9 shows the results of the evaluation of the antimicrobial activity (E. coli O-157) in the fermentation broth of each fermentation broth according to the present invention after self-fermentation with the solid fermentation broth.
FIG. 10 shows the storage stability test results of the solid fermented seeds according to the present invention.
11 is a graph showing changes in the number of harmful bacteria in the delivery of a disinfectant according to the present invention.
FIG. 12 shows changes in the number of harmful drop bacteria in the piglets according to the disinfectant application according to the present invention.
Fig. 13 shows the effect of reducing harmful bacteria before and after using the disinfectant according to the present invention. The upper part is from left side (February - before disinfection), the postpartum period (February - after disinfection), Zodiac (February - before disinfection) and Zodiac (February - after disinfection) (From July to before disinfection), from birth to death (from July to after disinfection), from the left (from July to disinfection), from the left (from July to after disinfection) (August - before disinfection), child pens (August - after disinfection).
FIG. 14 shows the change in the number of contaminated bacteria in air after disinfecting agent (before disinfection) 5 months after using the disinfectant according to the present invention. From the left, it refers to the month of labor (February), the month of labor (August), the month of the month (February), and the month of August (August).

[본 발명에 따른 유산균][Lactic acid bacteria according to the present invention]

본 발명에 따른 유산균(락토바실러스 루테리 KCCM 10651P)은 항균활성이 뛰어난 것을 특징으로 한다. 염기서열은 도 2 와 같으며, 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 제 KCCM10651P로 기탁되어 있다.The lactic acid bacterium according to the present invention (Lactobacillus lutea KCCM 10651P) is characterized by its excellent antimicrobial activity. The nucleotide sequence is shown in Fig. 2 and deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms as KCCM10651P.

본 발명에 따른 유산균은 항균 활성을 가지며, 특히 대장균에 대한 항균 활성을 가지고, 뿐만 아니라 내산성 및 내담즙성도 우수하여 위액과 담즙산을 통과해 장까지 안전하게 도달할 수 있어, 균에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적의 경구 또는 비경구 투여용 생균제로 이용할 수 있다. 여기서, 치료란 조성물의 투여로 질병의 증세가 호전되거나 질병의 억제 또는 경감 및 이롭게 변경되는 모든 것을 의미하며, 예방이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.The lactic acid bacterium according to the present invention has an antibacterial activity, in particular, has antimicrobial activity against E. coli, and is also excellent in acid resistance and bile resistance, and can pass safely through gastric juice and bile acid to the intestines. Or as a prophylactic agent for oral or parenteral administration for the purpose of prevention or treatment. Here, the term " treatment " means that the administration of the composition improves symptoms of the disease, inhibits or alleviates or alleviates the disease, and all means that the administration of the composition inhibits the disease or delays the onset of the disease.

또한, 본 발명에 따른 유산균은 생균 기능을 유지한 채 천연 소독제의 성분으로서도 활용할 수 있다.In addition, the lactic acid bacteria according to the present invention can be utilized as a component of a natural disinfectant while maintaining the function of a live bacteria.

[본 발명에 따른 효모균][Yeast according to the present invention]

본 발명에 따른 효모균(사카로미세스 세레비시아에 GB-SM7 KCCM 11130P)은 알코올 생성능이 우수하다. 알코올은 소독제로 많이 이용되는 물질인데, 본 발명에 따른 효모균은 특히 알코올 생성능이 우수하여, 유해균의 생장을 억제할 수 있다. 염기서열은 도 7 과 같으며, 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 제 KCCM11130P로 기탁되어 있다.The yeast (GB-SM7 KCCM 11130P in Saccharomyces cerevisiae) according to the present invention has excellent alcohol-producing ability. Alcohol is a substance widely used as a disinfectant, but the yeast according to the present invention has excellent alcohol-producing ability and can inhibit the growth of harmful bacteria. The nucleotide sequence is shown in Fig. 7 and deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms as Deposit No. KCCM11130P.

본 발명에 따른 효모균은 균에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적의 경구 투여용 생균제로 이용할 수 있으며, 또한 생균 기능을 유지한 채 천연 소독제의 성분으로서도 활용할 수 있다.The yeast according to the present invention can be used as a prophylactic agent for oral administration for the purpose of preventing or treating a disease caused by a bacterium, and can also be used as a component of a natural disinfectant while maintaining the function of a live bacterium.

[생균제][Probiotic agent]

본 발명에 따른 유산균 및 효모균의 생균제를 제조하는 일반적인 방법으로는 액상발효를 통해 생산, 회수된 미생물을 단순 고체 부형제에 혼합, 건조시켜 제조할 수 있다. 그러나, 위 방법으로 생산된 생균제는 고체 부형제에 대한 안정성 확보가 어려우며, 액상발효에 따른 배지의 비용뿐만 아니라 배양액의 회수 및 농축 등의 추가공정을 실시할 경우 생산비용이 증가할 수 있으며, 매 배치 일정한 품질의 균질을 확보하지 못하는 경우 고체부형제와의 혼합 단계에서 품질보다는 단순 혼합에 초점이 맞춰져 생균제의 품질적인 측면에서 문제가 발생할 수 있다.As a general method of producing probiotics of lactic acid bacteria and yeast according to the present invention, microorganisms produced and recovered through liquid fermentation can be mixed with simple solid excipients and dried. However, the probiotics produced by the above method have difficulty in securing stability against solid excipient. In addition to the cost of the medium due to the liquid fermentation, additional costs such as recovery and concentration of the culture medium may increase the production cost, If the homogeneity of a certain quality can not be secured, focusing on the simple mixing rather than the quality in the mixing step with the solid excipient may cause problems in terms of the quality of the probiotics.

따라서, 본 발명에 따른 유산균 및 효모균의 생균제는 고체발효를 통해 제조하는 것이 보다 바람직하다. 이 경우 액상발효를 통한 부형제와의 혼합과정이 아닌 고체원료를 직접 발효용 원료로 이용하여 제품을 생산하므로 별도의 추가공정을 가진 액상발효에 비해 생산비용이 저렴하며, 고체원료에 직접 미생물을 배양하여 미생물 자체의 발효 대사산물을 다량 함유하고 있어 사료곡물을 주 사료로 이용하는 가축의 사료 이용성을 개선할 수 있다. 또한, 자동화 고체발효 시스템을 이용한 제품의 대량생산공정에서 발효변수의 최적화를 통한 생산 공정의 표준화가 용이하며, 원료자체의 살균공정을 추가하여 생균제로서 특정 미생물만을 대량생산할 수 있어 우수한 품질을 확보할 수 있는 장점을 가지고 있다. 특히, 본 발명에 따른 유산균 및 효모균의 생균제를 고체발효를 통해 제조하면 액상발효를 통해 생산한 제품보다 미생물 안정성이 우수하여 장기간 보관에서도 동일한 품질을 유지할 수 있다.Therefore, the probiotics of lactic acid bacteria and yeast according to the present invention are more preferably produced through solid fermentation. In this case, since the product is produced by using the solid raw material directly as the raw material for fermentation, rather than mixing with the excipient through the liquid fermentation, the production cost is lower than that of the liquid fermentation with a separate additional process and the microorganism is cultured directly on the solid raw material And the fermentation metabolites of the microorganisms themselves are contained in a large amount, so that the feed availability of livestock using feed grains as the main feed can be improved. In addition, it is easy to standardize the production process by optimizing the fermentation parameters in the mass production process of the products using the automated solid fermentation system. By adding the sterilization process of the raw material itself, it is possible to mass produce specific microorganisms as the probiotic agent, Has the advantage of being able to. Particularly, when the probiotics of lactic acid bacteria and yeast according to the present invention are produced through solid fermentation, they have better microbial stability than the products produced through liquid fermentation, and the same quality can be maintained even after long-term storage.

고체 발효물을 종균으로 하여 생균제를 제조하는 경우 원료 배지는 파쇄 옥수수 또는 설탕 등을 이용할 수 있고, 특히 발효온도는 15~40 °C 가 바람직하며, 20~25 °C 가 보다 바람직하다. When a fermented product is prepared from a solid fermented product as a seed, crushed corn or sugar can be used as a raw material medium. The fermentation temperature is preferably 15 to 40 ° C, more preferably 20 to 25 ° C.

본 발명에 따른 생균제는 일정 기간 이상 균수가 동일하게 유지되며, pH 가 3.5 미만인 것을 특징으로 한다.The probiotics according to the present invention are characterized in that the number of bacteria is kept the same for a certain period of time and the pH is less than 3.5.

[소독제][disinfectant]

본 발명에 따른 유산균 및/또는 효모균을 고체발효하여 제조한 생균제를 이용하여 소독제를 제조할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 유산균과 효모균을 자가 발효하여 얻은 생균제를 함께 함유하는 소독제의 경우 항균 작용에 있어서 놀라운 시너지 효과가 나타난다.The disinfectant may be manufactured using the probiotics prepared by solid fermentation of the lactic acid bacteria and / or yeasts according to the present invention. Particularly, disinfectants containing the probiotics and the probiotics obtained by self-fermenting yeast cells according to the present invention exhibit remarkable synergistic effects in antibacterial action.

본 발명에 따른 소독제는 특히 대장균에 대한 항균력이 우수하다. 또한, 동물에게 무해한 천연 성분이기에, 다량 사용하더라도 특별히 문제되는 점은 없다.The disinfectant according to the present invention is particularly excellent in antibacterial activity against E. coli. In addition, since it is a natural ingredient harmless to animals, there is no particular problem even if it is used in a large amount.

본 발명에 따른 소독제는 저장성도 우수하여, 6 개월 이상 장기 보관하더라도 균수 및 품질에 이상이 없다.The disinfectant according to the present invention is excellent in storage stability, and even when stored for 6 months or longer, there is no abnormality in bacterial count and quality.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 한편, 하기 실시예는 본 발명의 일 구현예를 예시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. The following examples illustrate only one embodiment of the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

[실시예 1] 본 발명에 따른 유산균의 분리[Example 1] Separation of lactic acid bacteria according to the present invention

항균활성 및 내산성을 갖는 유산균 및 효모 균주를 선발하기 위해 자연계 샘플링을 통해 항균활성을 가지는 균주를 선발하였다. In order to select lactic acid bacteria and yeast strains having antibacterial activity and acid resistance, strains having antimicrobial activity through natural sampling were selected.

항균활성을 나타내는 유산균 균주를 선발하기 위해 토양, 각종 곡물류, 발효식품, 축분, 과일, 채소 등의 다양한 환경으로부터 시료를 채취한 후 MRS(de Man-Rogosa-Sharpe) 세균 배양액(Difco) 배지에 도말하여 35~40℃에서 24~48시간동안 배양하였다. 배양한 배지로부터 다양한 종류의 군체를 채취하여 BCP 세균 배양액 배지에 각각 도말 한 후, 군체의 모양 및 배지의 색상변화 등을 확인하여 유산균으로 판단되는 군체를 1차로 선발하였다. 선발된 군체를 MRS 부용이 첨가된 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 취한 후 pH를 7.0으로 보정 한 후 대장균(E. coli O-157)이 도말된 LB(Luria-Bertani) 세균 배양액 배지에 페이퍼 디스크(8mm)를 이용한 한천확산법으로 항균활성을 가진 군체를 2차로 선발하였다.Samples were collected from various environments such as soil, various cereals, fermented foods, fruits, vegetables and so on in order to select lactic acid bacterial strains exhibiting antibacterial activity. The samples were then transferred to a culture medium (Difco) of MRS (Difco) And cultured at 35 to 40 ° C for 24 to 48 hours. Various types of colonies were collected from the cultured medium and each was plated on the BCP culture medium. After checking the shape of the colonies and the color change of the medium, colonies judged to be lactic acid bacteria were firstly selected. The selected colonies were inoculated into 96-well plates supplemented with MRS trout and cultured at 37 DEG C for 48 hours. The culture broth was centrifuged to remove the supernatant, and the pH was adjusted to 7.0. Then, the broth was cultured in an LB (Luria-Bertani) culture medium containing E. coli O-157 Were selected for the second time.

2차 선발 군체 중 균주의 형태학적 성상 및 API 키트를 이용한 당 발효능 등을 비롯한 생화학적 특성 조사를 실시하였다. 분리 유산균의 생화학적 특성은 API 50 CHL 키트(bioMrieux Ltd., France)를 사용하였는데, 배양된 유산균을 API 50 CHL 매질에 현탁하여 유산균 배양액을 키트에 접종하고 37℃에서 48시간 배양한 후 매질의 색깔 변화를 확인함으로써 분석하였다(도 1). 도 1 에 나타난 바와 같이, 4 개의 매질 중 우측 상단의 매질에서 효과가 가장 우수하게 발현되었다.The biochemical characteristics including the morphological characteristics of the strains and the glycosyltransferase activity using the API kit were examined in the secondary selection colonies. The API 50 CHL kit (bioMrieux Ltd., France) was used to suspend the cultured lactic acid bacteria in the API 50 CHL medium, inoculate the culture broth of the lactic acid bacteria into the kit, incubate at 37 ° C for 48 hours, (Fig. 1). As shown in Fig. 1, the effect was most excellently expressed in the medium at the upper right of the four media.

효과가 가장 좋은 위 분리 유산균을 동정하기 위하여 16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 위자드 게놈 DNA 정화 키트[Wizard genomic DNA purification kit(Promega co., USA)]를 사용하여 분리 유산균으로부터 게놈 DNA를 추출한 후 16S rRNA 유전자 염기서열 결정을 위한 다용도 프라이머(universal primer)인 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분 30초간 익스텐션 조건으로 PCR 기계(pTC-150 minicycler, MJ Research Co., USA)를 사용하여 35 회 실시하였다. PCR 산물을 1% 아가로스겔에 전기영동 한 다음 위자드 SV 겔 및 PCR 글린-업 시스템[Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega Co.)]을 사용하여 정제한 후 염기서열결정법을 통해 염기서열을 결정하였다. 염기서열은 BLASTN 프로그램으로 젠뱅크(Genbank)에 등록되어 있는 유전자 염기서열과 비교를 통해 선발균주를 동정하고 사료첨가제로 적용 가능한 GRAS급(Generally Recognized As Safe) 균주를 최종 선발하였다. 선발한 균주의 16S rDNA 시퀀싱 결과는 도 2 와 같다.The nucleotide sequences of the 16S rDNA gene were analyzed to identify the most effective gastric isolate. Genomic DNA was extracted from isolated lactic acid bacteria using Wizard genomic DNA purification kit (Promega co., USA), and then a universal primer 27F (5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ') and 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primers. PCR was performed 35 times using a PCR machine (pTC-150 minicycler, MJ Research Co., USA) under denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 60 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds. The PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel and purified using a Wizard SV gel and a PCR gel-up system (Wizard SV Gel and PCR clean-up system (Promega Co.)). The sequence was determined. The nucleotide sequence was selected by comparing BLASTN program with the genome sequence registered in Genbank, and the selected strain, GRAS (Generally Recognized As Safe), which can be applied as a feed additive, was finally selected. The 16S rDNA sequencing results of the selected strains are shown in FIG.

[실시예 2] 본 발명에 따른 유산균의 특징[Example 2] Characteristics of lactic acid bacteria according to the present invention

[실시예 2-1] 생화학적 특징[Example 2-1] Biochemical characteristics

위 선발한 본 발명에 따른 균의 생화학적 특성을 조사하였으며, 그 결과는 아래의 표 1 과 같았다.The biochemical characteristics of the bacterium according to the present invention were examined, and the results were as shown in Table 1 below.

선발균주의 생화학적 특성(API 50 CHL)Biochemical properties of selected strains (API 50 CHL) 화학물질chemical substance 분리된 스트레인Isolated strain 화학물질chemical substance L. reuteri
KCCM10651P L. reuteri
KCCM10651P 대조군Control group -- 에스큘린Esculin ++ 글리세롤Glycerol -- 살리신Salincin ++ 에리스리톨Erythritol -- 셀리비오스Celibius ++ D-아라비노스D-arabinose -- 말토스Maltose ++ L-아라비노스L-arabinose ++ 락토스Lactose ++ 리보스Ribos ++ 멜리비오스Melibiose ++ D-자일로스D-xylose -- 사카로스Sakaros ++ L-자일로스L-xylose -- 트레할로스Trehalose -- 아도니톨Adonitol -- 이뉼린Inulin -- B-메틸-자일로사이드B-methyl-xyloside -- 멜레키토스Melekitose -- 갈락토스Galactose ++ D-라피노스D-raffinose ++ D-글루코스D-glucose ++ 아미돈Amidon -- D-프럭토스D-fructose ++ 글리코진Glycogen -- D-만노스D-Mannos ++ 자일리톨Xylitol -- L-소르보스L-sorbose -- B-젠티오바이오스B-Zentio Bios ++ 람노스Rams North ++ D-타가토스D-tagatose ++ 둘리시톨Dulysite -- D-라시소스D-lassicose -- 이노시톨Inositol -- D-트라가토스D-tragatose -- 만니톨Mannitol ++ D-푸코스D-Fucos -- 소르비톨Sorbitol ++ L-푸코스L-Fucos -- a-메틸-D-만노사이드a-methyl-D-mannose -- D-아라비톨D-arabitol -- a-메틸-D-글루코사이드a-methyl-D-glucoside -- L-아라비톨L-arabitol -- N-아세틸글루코사민N-acetylglucosamine ++ 글루코네이트Gluconate ++ 아미그달린Amigalline ++ 2-케토-글루코네이트2-keto-gluconate -- 알부틴Arbutin ++ 5-케토-글루코네이트5-keto-gluconate --

* +: 양성반응, -: 음성반응* +: Positive, -: negative response

[실시예 2-2] 내산성[Example 2-2] Acid resistance

분리균주의 내산성 평가를 위해서는 선발된 균주가 생균제로서 기능을 발휘하기 위해서는 pH 3 이하의 조건인 동물의 위를 통과하여야 하기 때문에 1N HCl로 pH 2, 3, 4의 조건으로 조정한 MRS broth 배지에 선발균주를 접종하여 37℃로 배양하면서 발효시간 별 균수변화를 확인하였다.In order to evaluate the acid resistance of the isolates, the selected strains must pass on animals that are under pH 3 conditions in order to function as probiotics. Therefore, MRS broth medium adjusted to pH 2, 3 and 4 with 1N HCl The bacterial strain was inoculated and cultured at 37 ℃.

도 3 에서 보는 바와 같이, L. reuteri KCCM10651P균주를 pH 2, 3에서 각 1시간씩 두었을 때 생존율이 90% 이상으로 균수감소가 거의 없으며, 1시간이후 pH 2에서 균수가 감소하는 경향을 나타내었으나, 배양 12시간 이후부터 균수는 증가하였으며 pH 3에서도 3시간 이후부터 균수가 증가하는 것으로 확인되었다. pH 4에서는 균수의 감소가 없이 완만히 증가하는 것으로 확인되어 기존 여러 논문 등 유산균 선발을 통한 내산성 분석에서 pH 2의 조건에서 1시간 배양 시 균수가 급격하게 감소하여 생존율이 1~48% 수준을 나타내는 여러 보고 보다 상당히 높은 수준인 것으로 판단된다. 또한 pH 4에서 1시간 배양 시 생존율이 최대 51% 수준인 여러 논문보다 상당히 높은 수준의 내산성을 가지고 있는 균주로 판단할 수 있다. 음식물의 섭취량이나 종류에 따라 차이가 있겠지만 음식물이 위를 통과하는데 2~3시간이 소요되며 위산의 pH가 2~3으로 희석된다는 점을 고려할 때, 내산성을 가진 L. reuteri KCCM10651P이 실제로 위를 통과한 시점에서 최소 50% 이상의 높은 생존율을 가질 것으로 판단된다.As shown in FIG. 3, when the strain of L. reuteri KCCM10651P was incubated at pH 2 and 3 for 1 hour, the viability of the strain was not more than 90%, and the bacterial number tended to decrease at pH 2 after 1 hour However, the number of bacteria increased from 12 hours after culture and the number of bacteria increased from 3 hours after pH 3. At pH 4, it was found to increase slowly without decreasing the number of bacteria. Therefore, in the analysis of acidity by selection of lactic acid bacteria such as the existing papers, the number of bacteria decreased rapidly during 1 hour culture at pH 2 and the survival rate was 1 ~ 48% It is judged to be considerably higher than the report. In addition, it can be judged as a strain having a significantly higher level of acid resistance than other papers having a maximum survival rate of 51% when cultured at pH 4 for 1 hour. Considering that the food takes 2-3 hours to pass through the stomach and the pH of the stomach acid is diluted to 2 ~ 3, the acid-resistant L. reuteri KCCM10651P actually passes over the stomach And at least 50% survival rate at one time point.

[실시예 2-3] 내담즙성[Example 2-3]

생균제로서 갖추어야 할 조건 중의 또 다른 특성으로 장까지 안전하게 도달하기 위해서는 담즙산에 대한 내성이 있어야 한다. 선발균주의 담즙산 내성을 측정하기 위하여 담즙산염(bile salt) 0.3, 1.0%가 각각 함유된 MRS 부용 배지에 선발균주 배양액을 접종한 후에 37℃로 배양하면서 배양시간별 균수변화 확인을 통해 담즙에 대한 내성을 평가하였다.Another characteristic of the conditions that must be provided as probiotics is that they must be resistant to bile acids to reach the intestines safely. In order to measure the tolerance of bile acids to the selected strains, 0.3 ml of bile salt and 1.0% of bile salt were inoculated into the MRS supplement medium and incubated at 37 ° C. .

도 4 에서 보는 바와 같이 Oxgall 0.3%(pH 7.8) 및 1.0%(pH 8.5) 첨가구와 control구 (무첨가구) 전체에서 균수의 감소 없이 증가하는 경향을 나타내어 기존에 알려진 바와 같이 Lactobacillus 속은 담즙산에 대한 내성이 약해 담즙산 0.3%를 배지에 첨가할 경우 균수가 급격히 감소하는 경향을 나타내었다는 기존 보고와 상반되는 결과로 기존에 선발, 보고되었던 균주보다 담즙산에 대한 내성이 우수하여 생균제로서의 가치가 높을 것으로 판단된다.As shown in FIG. 4, there was a tendency that the total number of control (no added) and 0.3% (pH 7.8) and 1.0% (pH 8.5) additions of Oxgall increased without decreasing the number of bacteria. As is known, Lactobacillus sp. The results showed that the addition of 0.3% biliary acid to the medium resulted in a rapid decrease in the number of bacteria. This result is inferior to that of the previous report, .

[실시예 3] 본 발명에 따른 효모균의 분리[Example 3] Separation of yeasts according to the present invention

생균제 기능을 가지는 천연 소독제를 개발하기 위해 다음과 같은 특징의 효모를 분리하였다. 일반적인 효모들은 항균력이 없는 것으로 보고되어 있기 때문에 대사산물인 알코올 생성과 휘발성 지방산을 다량 유도하여 유해균의 생장을 억제해야 한다. 따라서, 본 발명에서는 과일, 발효 식품, 채소 및 곡물 등을 대상으로 효모 균주를 분리하였다. 1차 분리는 감자한천배지(Potato dextrose agar)에서 형태학적으로 효모균과 유사한 군체들을 분리하였으며, 분리 된 균들을 대상으로 알코올 생성능을 비교 평가하여 알코올 생성능이 우수한 균주를 최종 분리하고자 하였다. In order to develop a natural disinfectant having a probiotic function, yeast having the following characteristics was isolated. Generally, yeasts are reported to have no antimicrobial activity. Therefore, it is necessary to inhibit the growth of harmful microorganisms by inducing alcohol production and volatile fatty acids, which are metabolites. Therefore, in the present invention, yeast strains were isolated from fruits, fermented foods, vegetables and grains. The primary isolates were isolated from potato dextrose agar and morphologically similar to yeast strains. To isolate strains with excellent alcohol - producing ability, we tried to isolate the strains with comparable alcohol production.

1차 선발균주를 대상으로 액상발효의 곡물발효를 통해 대장균군의 감소 및 알코올 생성량을 기준으로 최종균주를 선발하고 발효조건 설정을 통해 액상발효공정을 위한 기초자료로 활용하였다. 균주 선정을 위해 도 5 와 같이 배양기 내 1L 보틀을 이용하여 발효를 진행하였으며, 원료조성으로는 물에 10% 옥수수곡물을 분쇄하여 첨가한 후 121℃로 15분간 멸균한 후 외부의 환경과 유사하게 각 보틀을 얇은 천으로만 막아 완전 밀폐하지 않은 상태로 7일간 배양하면서 발효성상 및 오염균 발생상황 등을 점검하였다.The primary strains were selected from the fermentation process of liquid fermentation and the final strains were selected based on the amount of alcohol production and the amount of alcohol production. The fermentation conditions were used as basic data for the liquid fermentation process. For the selection of strains, fermentation was carried out using a 1 L bottle in an incubator as shown in FIG. 5. As a raw material composition, 10% corn grain was added to water and pulverized, and sterilized at 121 ° C for 15 minutes. Each bottle was covered with a thin cloth and incubated for 7 days without being completely closed, and the fermentation characteristics and the occurrence of contaminants were checked.

배양 7일 후 배양액 내의 알코올을 3% 이상 생성하면서 pH 3.8~3.9이 되도록 하는 본 발명에 따른 효모균인 S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P를 최종 분리 하였다(도 6). 위 최종선발균주를 YPD broth로 30℃에서 24시간 배양 후 원심분리하여 세포를 모아 게놈 DNA 추출 키트[genomic DNA extraction kit(General Biosystem, Korea)]를 사용하여 분리하였으며 분리된 게놈 DNA는 18S rDNA 시퀀싱을 위한 견본으로 사용하였다. 18S rDNA의 PCR 증폭은 포워드 프라이머(forword primer); NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')와 리버스 프라이머(reverse primer); ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')을 사용하였으며, 95℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45초간 어닐링, 72℃에서 5분간 익스텐션 조건으로 PCR 기계(pTC-150 minicycler, MJ Research Co., USA)을 사용하여 30 회 실시하였다. 최종 PCR 프로덕트를 1% 아그로스겔에 전기영동한 후 DNA 단편을 회수하여 시퀀싱 분석을 의뢰를 통해 염기서열을 결정하였다. 염기서열은 BLASTN 프로그램으로 젠뱅크에 등록되어 있는 유전자 염기서열과 비교를 통해 선발균주를 동정하였다(도 7).After 7 days of culture, S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P according to the present invention, which produces a pH of 3.8 to 3.9 while producing more than 3% of alcohol in the culture medium, was finally isolated (Fig. The final selection strain was cultured in YPD broth at 30 ° C for 24 hours, centrifuged, and the cells were collected using a genomic DNA extraction kit (General Biosystem, Korea). The separated genomic DNA was subjected to 18S rDNA sequencing Were used as samples. PCR amplification of 18S rDNA was performed using a forward primer; NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ') and a reverse primer; PCR machine (pTC-150 minicycler, MJ Research Co., USA) was used for PCR amplification at 95 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 45 seconds, and extension at 72 ° C for 5 minutes using ITS2 (5'- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 ' ) For 30 times. The final PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, and the DNA fragments were recovered and subjected to sequencing analysis to determine the base sequence. The nucleotide sequence was identified by comparing with the gene sequence registered in GenBank with the BLASTN program (FIG. 7).

선발균주의 동정결과 Saccharomyces cerevisiae MYCO10831 균주와 98% homology가 있는 것으로 분석되어 최종 효모 선발균주를 S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P로 명명하고 본 과제에 사용하였다.As a result of the identification of the selected strain, Saccharomyces cerevisiae MYCO10831 strain and 98% homology were identified, and the final yeast selection strain was named S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P and used in this task.

[실시예 4] 본 발명에 따른 효모균의 특징[Example 4] Characteristics of yeast according to the present invention

선발균주인 S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P균주의 생화학적 특성 분석은 API 키트(API 20C AUX, bioMrieux Ltd., France)를 이용하였으며, 그 결과는 아래의 표2 에 나타내었다.Biochemical characterization of the strain S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P was performed using an API kit (API 20C AUX, bioMrieux Ltd., France), and the results are shown in Table 2 below.

화학물질chemical substance 특성characteristic 글루코스Glucose ++ 클리세롤Cleese Roll -- 2-케토-D-글루코네이트2-keto-D-gluconate -- L-아라비노스L-arabinose -- D-자일로스D-xylose -- 아도니톨Adonitol -- 자일리톨Xylitol -- D-갈락토스D-galactose ++ 이노시톨Inositol -- D-소르비톨D-sorbitol -- α-메틸-D-글루코사이드alpha -methyl-D-glucoside -- N-아세틸-D-글루코사민N-acetyl-D-glucosamine -- D-셀로비오스D-cellobiose -- D-락토스D-lactose -- D-말토스D-Maltose ++ D-사카로스D-Sakaros ++ D-트레할로스D-trehalose -- D-멜레지토스D-Melitose -- D-라피노스D-raffinose --

* +: 양성반응, -: 음성반응* +: Positive, -: negative response

선발균주인 S. cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P균주의 배양 시간별 알코올, 균수 및 pH 의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 6 과 같았다.The change in alcohol, bacterial count and pH of the S. cerevisiae GB-SM7 strain KCCM11130P, which is the starting strain, was measured by the incubation time, and the results were as shown in FIG.

[실시예 5] 발효[Example 5] Fermentation

본 발명에서 선별한 Lactobacillus reuteri KCCM10651P 와 Saccharomycess cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P의 고체 발효물을 종균으로 농가에서 생산 가능한 최적의 생균제 제조 조건은 아래의 표 3 에 표기하였다.Table 3 below shows the conditions for producing the fermented product of Lactobacillus reuteri KCCM10651P and Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM11130P selected in the present invention as the optimum probiotics to be produced in the farm as a seed bacterium.

항 목Item 조 건Condition 원료 배지 및 사용량Raw material and usage 파쇄 옥수수, 10%
설탕, 3%Crushed corn, 10%
Sugar, 3% 원료 증자Increase in raw materials >100℃, 15분> 100 ° C, 15 minutes 물 첨가량Water addition amount 87%87% 고체 발효 유산균 종균Solid fermented lactic acid bacteria 0.1~0.2%0.1 to 0.2% 고체 발효 효모 종균Solid fermented yeast strain 0.5~1%0.5 to 1% 발효온도Fermentation temperature 20~25℃20 ~ 25 ℃ 발효시간Fermentation time 5~7일5 to 7 days

위 표 3 의 조건에 따라 도 8 과 같이 500L 용량으로 자가 발효를 하여 본 발명에 따른 유산균과 효모균의 생균제를 제조하였으며, 2차례의 시험 생산 결과는 아래의 표 4 에서 처럼 발효 종료시점에 유산균 균수는 109 CFU/mL 이상, 효모균수는 108 CFU/mL 이상의 동일한 균수를 유지하였다. 또한, 발효 초기 대장균군이 검출되었으나, 발효 3일 차부터는 전혀 검출이 되지 않았으며, pH 역시 3.5 미만으로 나타내어 다양한 유기산 및 기능성 항균물질 등 다양한 대사산물이 함께 포함되어 있을 것으로 판단된다.8, the fermentation broth of lactic acid bacteria and yeast according to the present invention was prepared by self-fermentation with a capacity of 500 L. The results of the two test production were as shown in Table 4 below, is 10 9 CFU / mL or more can, yeast was maintained the same number of bacteria more than 10 8 CFU / mL. In addition, the E. coli group was detected at the early stage of fermentation. However, no detection was found from the third day of fermentation, and the pH was also less than 3.5, indicating that various metabolites such as various organic acids and functional antimicrobial substances may be contained together.

자가 발효 조건에서의 발효 후 결과Results after fermentation under self-fermentation conditions 분석항목Analysis item 발효 일자Effective Date 1차Primary 2차Secondary pHpH 00 5.54 5.54 5.42 5.42 33 4.09 4.09 3.98 3.98 55 3.65 3.65 3.61 3.61 77 3.38 3.38 3.47 3.47 알코올, %Alcohol, % 00 0.00 0.00 0.00 0.00 33 1.3 1.3 1.7 1.7 55 2.2 2.2 2.4 2.4 77 2.4 2.4 2.7 2.7 Saccharomyces cerevisiae, cfu/ml Saccharomyces cerevisiae , cfu / ml 00 1.0×107 1.0 x 10 7 1.0×107 1.0 x 10 7 33 4.0×107 4.0 × 10 7 8.0×107 8.0 × 10 7 55 1.9×108 1.9 × 10 8 3.5×108 3.5 × 10 8 77 3.7×108 3.7 × 10 8 2.0×108 2.0 x 10 8 Lactobacillus reuteri, cfu/ml Lactobacillus reuteri , cfu / ml 00 6.0×106 6.0 × 10 6 5.6×106 5.6 × 10 6 33 1.2×108 1.2 × 10 8 1.6×108 1.6 x 10 8 55 5.6×108 5.6 x 10 8 4.4×108 4.4 × 10 8 77 5.4×109 5.4 × 10 9 3.7×109 3.7 × 10 9 대장균(Coliforms)Coliforms 00 -- -- 33 -- -- 55 -- -- 77 -- --

[실시예 6] 자가 배양물의 항균활성 평가[Example 6] Evaluation of antibacterial activity of self-cultured product

본 발명에서 개발한 위 고체 발효 종균으로 자가 발효를 하여 배양시간별 항균활성 평가결과를 도 9 에 나타내었다. 자가 발효공정의 경우 배양 3일 이후부터 대장균(E. coli O-157)에 대한 항균활성을 나타내며, 발효시간이 경과 할수록 활성이 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 농가에서 직접 배양한 생균제가 기능성 사료첨가제 혹은 천연 소독제로서 충분한 가치가 있을 것으로 확인되었다.FIG. 9 shows the evaluation results of the antimicrobial activity of the above-mentioned solid fermentation broth developed by the present invention after self-fermentation by the culture time. In the case of the self-fermentation process, the antimicrobial activity against E. coli O-157 was shown from 3 days after the incubation, and the activity increased gradually with the lapse of fermentation time. It has been found to be of sufficient value as an additive or a natural disinfectant.

[실시예 7] 고체 발효 종균의 저장성 실험 결과[Example 7] Test results of storage stability of solid fermented seeds

최종 개발제품인 고체발효 종균의 보관테스트를 통해 제품특성(균수, 수분) 변화를 6개월 동안 조사 하였다(도 10). 개발제품을 밀봉한 후 매 15일 마다 분석을 진행하여 미생물 균수 변화 및 수분함량 변화를 조사하였다. 총 6개월간 저장성 평가에서 유산균 균주는 108 CFU/g이상을 유지하고 있었으며 효모 균주 역시 107 CFU/g의 균수를 6개월까지 유지하는 것으로 분석되었다. 아울러 수분함량 역시 1% 내외의 증가 현상은 확인되었으나, 제품 보관품질에는 영향을 줄 수 있는 수준이 아닌 것으로 판단된다. 또한, 6개월 장기 보관 시 균수 및 다른 품질특성 등의 급격한 변화는 확인할 수 없었으며, 제품판매를 위한 최소한의 유통기간으로 설정할 수 있을 것으로 판단된다.Changes in product characteristics (bacteria, moisture) were investigated for 6 months through the storage test of the final product, a solid fermentation strain (Fig. 10). After the developed product was sealed, the analysis was carried out every 15 days to investigate changes in microbial count and moisture content. The lactic acid bacteria maintained more than 10 8 CFU / g for 6 months and the yeast strains were also maintained at 10 7 CFU / g for up to 6 months. In addition, the water content was also increased by around 1%, but it is not considered to affect the product storage quality. In addition, no rapid change such as the number of bacteria and other quality characteristics could be confirmed during the 6 months long storage period, and it could be set as the minimum distribution period for product sales.

[실시예 8] 소독력 평가[Example 8] Evaluation of disinfecting power

본 발명에서 개발한 제품을 이용하여 농가에서 자가 배양한 액을 제조한 후 소독력 평가를 진행하였다. 자가 배양한 액을 원액으로 하여 소독제로 사용하였다. 경북 상주의 축산 농가를 대상으로 분만사와 자돈사에 소독제의 살포 전, 후의 낙하 유해세균의 농도를 측정하였다(도 11, 12). 낙하세균 측정은 공중 낙하균 측정법으로 진행하였으며 준비된 Chromcult agar 배지를 측정 장소에 3장씩 놓고 동시에 뚜껑을 열고 정치시켰다. 5분간 노출시킨 후 다시 조용히 뚜껑을 닫고 37℃에서 24시간 배양하여 대장균과 대장균군의 평균 개수를 구하였다.The product developed in the present invention was used to evaluate the disinfection ability after the self-cultured liquid was prepared at the farm. The autologous culture was used as a disinfectant. The concentrations of harmful bacteria were measured before and after the spraying of disinfectants in the powdery moths of the farmers in Sangju, Gyeongbuk Province (Figs. 11 and 12). Falling bacteria were measured by aerial drop assay. Three Chromcult agar mediums were placed in the measurement area, and the lid was opened and left at the same time. After 5 minutes of exposure, the lid was closed again and incubated at 37 ° C for 24 hours to determine the average number of E. coli and E. coli.

분만사의 경우 소독제 살포 전, 후를 비교하였을 때 대장균은 최대 72.34 %(도 11, 2월), 대장균군은 최대 27.73 %(도 11, 2월) 감소시켰으며 5개월 이상 꾸준히 사용 시에는 분만사의 낙하 유해균이 대부분 감소하는 경향을 나타내었다. 도 12에서와 같이 자돈사의 경우에도 유사한 결과를 나타내었으며 5개월 이상 소독제를 사용 시 자돈사 내부의 유해균들을 효과적으로 감소시켰다.When the disinfectant was sprayed before and after spraying, E. coli was decreased to 72.34% (Fig.11, Feb.) and E. coli was decreased to 27.73% (Fig.11, Feb.) And most of the fallen harmful bacteria showed a tendency to decrease. As shown in FIG. 12, similar results were obtained in the case of piglets, and when the disinfectant was used for 5 months or longer, the harmful bacteria in the piglets were effectively reduced.

본 발명에서 개발한 고체 발효 종균 제품은 농가에서 손쉽게 배양할 수 있다. 생균제로서 필요한 항균력, 내담즙성 그리고 내산성 특징을 지니는 종균으로 농가에서 쉽게 배양할 수 있는 형태로 개발 되었다. 농가에서 특별한 고가의 설비가 없어도 오염없이 배양 가능하며, 배양된 액은 소독력을 가지고 있어 천연 소독제로 활용이 가능하다. The solid fermented seed product developed in the present invention can be easily cultivated in a farm. It has the characteristics of antimicrobial activity, biliary properties and acid resistance required as a probiotic agent, and it has been developed into a form that can be easily cultured in a farmhouse. It is possible to cultivate without pollution without special expensive facilities in the farmhouse, and the cultivated liquid can be used as a natural disinfectant because it has the disinfecting power.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)Name of depository: Korea Microorganism Conservation Center (overseas)

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기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)Name of depository: Korea Microorganism Conservation Center (overseas)

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수탁일자 : 20101110Payment date: 20101110

Claims (5)

항균능을 가진 락토바실러스 루테리 균주(Lactobacillus reuteri KCCM 10651P).Lactobacillus reuteri KCCM 10651P with antimicrobial activity. 알코올 생성능이 우수한 사카로미세스 세레비시아에 GB-SM7 균주(Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P).GB-SM7 strain (Saccharomyces cerevisiae GB-SM7 KCCM 11130P) in Saccharomyces cerevisiae, which has excellent alcohol-producing ability. 제 1 항에 따른 균주 및 제 2 항에 따른 균주 중 하나 이상의 균주를 발효시킨 것을 포함하는 생균제.A prophylactic agent comprising fermenting at least one strain of the strain according to claim 1 and a strain according to claim 2. 제 3 항에 있어서, 고체발효시킨 것을 특징으로 하는 생균제.The probiotic agent according to claim 3, which is solid fermented. 제 4 항에 따른 생균제를 포함하는 천연 소독제.A natural disinfectant comprising the probiotic agent according to claim 4.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20190069905A (en) * 2017-12-12 2019-06-20 주식회사 국순당 Saccharomyces cerevisiae ksd-yc which is a novel yeast
KR102531063B1 (en) * 2022-06-23 2023-05-10 주식회사 케이시에프엔시 Complex microbial fermentation broth for livestock gas removal and livestock health promotion

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190069905A (en) * 2017-12-12 2019-06-20 주식회사 국순당 Saccharomyces cerevisiae ksd-yc which is a novel yeast
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