KR20170062696A - 미세유체칩 기반의 병원균 검출에서 계면동전기 흐름전위에 의한 비표지 센싱 방법 및 장치 - Google Patents

미세유체칩 기반의 병원균 검출에서 계면동전기 흐름전위에 의한 비표지 센싱 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

미세유체칩(microfluidic chip)을 기반으로 계면동전기 흐름전위(streaming potential)의 변화로부터 병원균을 검출하는 새로운 비표지(label-free) 센싱 방법 및 장치가 개시된다. 상기 센싱 방법 및 장치는, 항균펩타이드(antimicrobial peptide)가 고정된 하나 이상의 유리 구슬을 충전시킨 미세채널에 병원균 시료액을 흘려서, 병원균이 항균펩타이드와의 상호작용으로 시간 경과에 따라 유리 구슬에 결합되면 구슬의 하전성이 변하고, 이어서 흐름전위가 변하는 원리를 응용한 것으로서, 상기 센싱 방법 및 장치에 의하면 박테리아나 바이러스와 같은 병원균 검출에 있어 총 분석시간을 단축하고, 검출 안정성을 확보하며, 소형화에 의한 현장 진단 기능이 강화될 수 있다.

Description

미세유체칩 기반의 병원균 검출에서 계면동전기 흐름전위에 의한 비표지 센싱 방법 및 장치{APPARATUS AND METHOD FOR LABEL-FREE SENSING BY ELECTROKINETIC STREAMING POTENTIAL IN MICROFLUIDIC-CHIP BASED PATHOGEN DETECTION}
실시예들은 미세유체칩(microfluidic chip)을 기반으로 병원균(pathogen)을 검출하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미세채널에서 계면동전기 흐름전위(streaming potential)의 변화로부터 병원균을 검출하는 새로운 비표지(label-free) 센싱 방법 및 장치에 대한 것이다.
병원균의 검출은 임상진단, 질병통제, 식품안전, 수질 모니터닝 등의 공중보건에 있어 매우 중요하다. 병원균 검출에는 항체(antibody)가 널리 사용되어 왔으나, 항체를 얻기 위해서는 수많은 동물의 희생이 필요하고 안정성과 비용 측면에서 제한성이 있다. 항균펩타이드(antimicrobial peptide; AMP)는 이러한 항체를 대체할 수 있는 한 예로서, 항균펩타이드가 병원균과 결합하는 근원은 정전 상호작용(electrostatic interaction)과 친수성-소수성 상호작용에 있다. 즉, 항균펩타이드는 전체적으로 봐서 양(+) 전하로 하전되어 있고 병원균은 세포표면이 음(-) 전하로 하전되어 있어 양자 사이에 정전 유인력이 작용하고, 항균펩타이드의 친수성 머리(head) 그룹과 소수성 세포막 사이의 상호작용에 의해 결합하게 된다.
항균펩타이드는 그 말단기에 따라 여러 종류가 있는데, 쿨라지나 등(N.V. Kulagina, M.E. Lassman, F.S. Ligler, C.R. Taitt, "Antimicrobial peptides for detection of bacteria in biosensor assays", Anal. Chem., 77, 6504, 2005)과 만누 등(M.S. Mannoor, S. Zhang, A.J. Link, M.C. McAlpine, "Electrical detection of pathogenic bacteria via immobilized antimicrobial peptides", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107, 19207, 2010)은 항균펩타이드 마가이닌 I(magainin I)이 박테리아와 높은 결합 친화도(binding affinity)를 갖고 있음을 보고하였다.
한편, 미세유체칩을 기반으로 하는 병원균 검출에서 병원균의 센싱은 핵심적 기술로서, 하기 표 1 에서와 같이, 광학적, 전기화학적, 진동, 기계적 방법이 있다. 이들은, 효소결합면역흡착분석(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)나 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)과 같은 기존 방법에 비해 분석시간, 민감도, 및 비용 측면에서 장점이 있다. 이 중 종래의 전기화학적 방법으로는 임피던스 분광기에 의한 검출법이 있으며, 이는 포에나 등(D.P. Poenar, C. Iliescu, J. Boulaire, H. Yu, "Label-free virus identification and characterization using electrochemical impedance spectroscopy", Electrophoresis, 35, 433, 2014) 등에 의해 알려져 있다. 이 방법은 신속 검출과 높은 민감도를 얻을 수 있지만, 다소 복잡한 전극 설치와 회로를 구성해야 하는 번거로움이 있다.
센싱 방법 관련 기술 총 분석시간 민감도 비용
기존 ELISA, PCR 느림 낮음 고비용
광학적 형광, 가시-자외선 분광광도계 중간 중간 저비용
전기화학적 임피던스 분광기 빠름 높음 중간 비용
진동 석영 결정 중간 높음 저비용
기계적 캔틸레버 중간 높음 중간 비용
N.V. Kulagina, M.E. Lassman, F.S. Ligler, C.R. Taitt, "Antimicrobial peptides for detection of bacteria in biosensor assays", Anal. Chem., 77, 6504, 2005 M.S. Mannoor, S. Zhang, A.J. Link, M.C. McAlpine, "Electrical detection of pathogenic bacteria via immobilized antimicrobial peptides", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107, 19207, 2010 D.P. Poenar, C. Iliescu, J. Boulaire, H. Yu, "Label-free virus identification and characterization using electrochemical impedance spectroscopy", Electrophoresis, 35, 433, 2014
본 발명의 일 측면에 따르면, 병원균을 형광염료로 염색하고 형광현미경으로 미세채널을 관측하여 병원균을 검출하는 종래의 방법을 대체할 수 있는 새로운 비표지(label-free) 방식의 센싱 방법 및 장치를 제공할 수 있다.
일 실시예에 따른 비표지(label-free) 센싱 방법은, 채널 내의 챔버에, 항균펩타이드가 고정된 하나 이상의 유리 구슬(bead)을 주입하는 단계; 병원균을 포함하는 시료액을 상기 채널 내로 도입함으로써, 상기 챔버 내의 상기 유리 구슬을 병원균과 결합시키는 단계; 및 상기 유리 구슬에 결합된 병원균을 센싱하기 위하여, 상기 채널 내의 흐름전위(streaming potential)의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 채널 내의 흐름전위의 변화를 측정하는 단계는, 시간 경과에 따른 단위 압력차 당 흐름전위의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 흐름전위는 상기 채널의 내벽 및 상기 챔버에 충전된 상기 유리 구슬이 시료액과 접촉한 표면에 형성된 전기이중층에 의해 발생되며, 상기 채널의 내벽은 음전하로 하전된다.
일 실시예에서, 상기 유리 구슬을 주입하는 단계는, 상기 채널 내에 위치한 복수 개의 둑을 이용하여 상기 유리 구슬이 상기 챔버로부터 이탈하는 것을 방지하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 유리 구슬을 병원균과 결합시키는 단계는, 펌프에 의한 압력차를 이용하여 상기 시료액을 상기 채널 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따른 비표지 센싱 장치는, 챔버를 포함하며, 병원균을 포함하는 시료액이 흐르기 위한 채널; 상기 챔버 내에 충전되며, 병원균과 결합하도록 항균펩타이드가 고정된 하나 이상의 유리 구슬; 및 상기 유리 구슬에 결합된 병원균을 센싱하기 위하여, 상기 채널 내의 흐름전위의 변화를 측정하도록 구성된 전극을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 전극은 상기 채널 내에서 상기 챔버에서 일정 거리 이격된 양 단에 위치한 한 쌍의 전극을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 한 쌍의 전극은, 시간 경과에 따른 단위 압력차 당 흐름전위의 변화를 측정하도록 구성된다.
일 실시예에서, 상기 흐름전위는 상기 채널의 내벽 및 상기 챔버에 충전된 상기 유리 구슬이 시료액과 접촉한 표면에 형성된 전기이중층에 의해 발생되며, 상기 채널의 내벽은 음전하로 하전된다.
일 실시예에 따른 비표지 센싱 장치는, 상기 챔버로부터 상기 유리 구슬이 이탈하는 것을 방지하도록 상기 채널 내에 배치된 복수 개의 둑을 더 포함한다.
일 실시예에 따른 비표지 센싱 장치는, 펌프에 의한 압력차를 이용하여 상기 시료액이 도입되기 위한 유입부; 및 병원균이 상기 유리 구슬에 결합된 후 병원균을 제외한 상기 시료액이 배출되기 위한 유출부를 더 포함한다.
일 실시예에서, 상기 채널의 폭은 상기 채널의 높이에 비해 크다.
일 실시예에서, 상기 압력차는 상기 채널의 단면적과 상기 시료액의 유량에 기초하여 결정된다.
일 실시예에서, 상기 흐름전위의 변화는, 시간 경과에 따라 상기 유리 구슬이 병원균과 결합됨으로 인한, 상기 유리 구슬이 충전된 상기 챔버의 하전성 변화에 대응된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 종래의 병원균을 형광염료로 염색하고 형광현미경으로 미세채널을 관측하여 병원균을 검출하는 방법 대신에, 미세채널에서 계면동전기 흐름전위(streaming potential)의 변화로부터 병원균을 검출하는 새로운 비표지(label-free) 센싱 방법 및 장치를 제공할 수 있다. 상기 비표지 방식의 센싱에 의하면, 병원균을 염색해야 하는 과정 및 형광이미지의 분석 과정이 필요 없게 되므로 총 분석 시간을 단축할 수 있고 분석 안정성을 확보할 수 있으며, 형광현미경 장비가 필요 없게 되어 소형화에 의한 현장 진단 기능이 강화될 수 있고, 궁극적으로는 병원균 검출에 있어 신속성, 선택성 및 정확성이 향상될 수 있다.
도 1 내지 도 3은 채널에서 양쪽 벽면의 다양한 하전 상태에 따른 전기이중층 형성 및 계면동전기 흐름전위(streaming potential)의 발생을 나타낸 측면도들이다.
도 4는 도 1 내지 도 3에 도시된 각각의 경우에 대해 압력차에 따른 흐름전위의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 일 실시예에 따른 비표지(label-free) 센싱 장치의 미세유체칩(microfluidic chip)의 개략도이다.
도 5b는 도 5a에 도시된 A 부분의 개략적인 평면도이다.
도 5c는 도 5a 에 도시된 A 부분의 개략적인 측면도이다.
도 6a 및 6b는 항균펩타이드(antimicrobial peptide)가 고정된 유리 구슬(bead)이 대장균에 결합되는 과정을 나타내는 개념도이다.
도 6c는 유리 구슬과 대장균이 결합된 형태를 나타내는 전자현미경 사진이다.
도 7a 및 7b는 도 6a 및 6b의 결합 과정으로 인한 채널에 형성된 챔버에서의 하전성 변화 및 이에 따른 흐름전위 변화를 설명하는 개념도이다.
도 8은 일 실시예에 따른 비표지 센싱 장치의 개략도이다.
도 9는 일 실시예에 따른 비표지 센싱 방법에 의하여 세종류 농도의 대장균에 대해 시간 경과에 따라 얻은 단위 압력차당 흐름전위의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10a 내지 10d는 종래의 형광현미경을 이용하여 대장균 농도 105 개/mL에 대해 시간 경과에 따라 관측하여 얻은 이미지들이다.
도 11은 도 10에 도시된 이미지로부터 종래의 방법에 의하여 얻은 시간 경과에 따른 구슬 1개 당 누적형광세기의 변화를 나타내는 그래프이다.
이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 상세히 살펴본다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 항균펩타이드(antimicrobial peptide)가 고정된 유리 구슬(bead)을 하나 이상 충전시킨 채널에 병원균이 포함된 시료액을 흘려서, 병원균과 항균펩타이드와의 상호작용으로 유리 구슬에 병원균이 결합되는 양상을 계면동전기 흐름전위(streaming potential)의 시간의 경과에 따른 변화로부터 병원균을 센싱할 수 있다. 상기 비표지 센싱 방법 및 장치에 의해 센싱 가능한 병원균은 항균펩타이드와의 상호작용으로 유리 구슬에 결합될 수 있는 박테리아나 바이러스와 같은 병원균이 모두 해당되며, 대표적으로는 병원성(pathogenic) 및 비병원성(non-pathogenic) 대장균(E. coli)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일반적으로, 표면이 하전된 채널 내에 압력차에 의해 유체가 흐르는 경우, 채널 벽면 근처에는 채널 벽면의 전하 부호와 반대인 상대이온(counter-ion)들이 많이 분포하여 전기이중층(electric double layer)이 형성된다. 상기 전기이중층 내의 상대이온들은 압력차 흐름에 의해 흐름전류(streaming current)를 생성시키고, 채널의 상류와 하류 간에는 공통이온(co-ion)과 상대이온들의 분포 차에 의한 전위차로 인하여 흐름전위(streaming potential)가 발생한다. 아울러, 상대이온들이 하류에 계속 축적되면, 유체 유동의 반대방향으로 상대이온들이 이동하게 되어 전도전류(conduction current)가 유도된다. 정상상태에서는 흐름전류와 전도전류의 총합은 0으로서, 채널 내부에서의 전류는 보존된다.
일정한 단면을 갖는 직선 채널 내에 일정한 이온농도(즉, 이온화세기)를 갖는 전해질 용액의 유동에 의한 계면동전기(electrokinetic) 효과로 발생하는 흐름전위 ΔE는 하기 수학식 1의 헬름홀츠-스몰루초우스키(Helmholtz-Smoluchowski, H-S) 식으로 주어진다.
Figure pat00001
상기 수학식 1에서, ΔP는 채널 양단에 가해진 압력차로서, 압력차는 채널의 단면적과 시료액의 유량으로부터 결정될 수 있는 값으로, 주어진 채널에서 유량을 변화시키면 압력차가 변화하게 된다. 또한, εo는 진공에서의 유전상수(dielectric constant 또는 vacuum permittivity)로서 8.854×10-12 Coul2/J·m 이고, εr은 전해질 용액의 상대유전율(relative permittivity)이며,
Figure pat00002
는 채널 벽면의 제타전위(zeta potential)이고, λ는 전해질 용액의 전기전도도(electric conductivity)이고, η는 전해질 용액의 점도이다.
흐름전위는 계면동전기 현상의 하나로서 전기삼투(electroosmosis)와 반대되는 메커니즘으로, 하전된 물체의 표면전위인 미지의 제타전위를 결정하는 방법으로 이용되어 왔다. 일 예로서, 짐지크(Szymczyk) 등의 문헌(A. Szymczyk, B. Aoubiza, P. Fievet, J. Pagetti, "Electrokinetic phenomena in homogeneous cylindrical pores", J. Colloid Interface Sci. 216, 285, 1999)에 개시되어 있는 연구로부터, 다공성 물질의 기공(pore)이나 표면에 대한 하전 특성에 흐름전위의 측정이 유효하게 기여함을 알 수 있다. 아울러, 미국특허 제6,727,099호는 시간 경과에 따른 흐름전위 측정으로 다공성 멤브레인 표면에의 콜로이드 입자 침착에 대한 정보를 알 수 있음을 개시한다.
상기 수학식 1의 물리적 의미는, 하전된 채널에 전해질 용액을 압력차 ΔP로 흘리면 채널 양단 간에는 ΔE만큼의 전위차가 발생된다는 것이다. 그리고 임의의 외부 부하(external load)를 연결하면 이 외부 저항에 작용하는 전류와 전압을 얻을 수 있다.
실시예들에 따른 비표지(label-free) 센싱 방법 및 장치는 상기 원리를 이용하여 항균펩타이드에 결합된 병원균을 센싱하도록 구성된다. 상기 비표지 센싱 방법 및 장치는 미세기전시스템(micro-electromechanical system; MEMS) 및 미세가공(microfabrication) 기술과 접목되어 원하는 크기의 채널 폭을 갖는 미세유체칩(microfluidic chip) 형태의 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기술로 구현될 수 있으며, 미세종합분석 시스템(micro total analysis system; μTAS) 등에 적용될 수도 있다.
도 1 내지 도 3은 채널에서 양쪽 벽면의 다양한 하전 상태에 따른 전기이중층 형성 및 계면동전기 흐름전위의 발생을 나타낸 측면도들이다.
도 1은 채널을 정의하는 양 벽면(110, 120)이 모두 음전하로 하전된 상태를 나타낸다. 채널 내부는, 고체 벽면(110, 120)의 전하와 반대인 이온이 우세하게 존재하는 전기이중층 영역과, 양이온 및 음이온이 동일한 수로 존재하여 전기적으로 중성인 벌크(bulk) 영역(130)으로 나뉜다. 전기이중층 두께는 통상 κ-1로 표기된다. 도 1에서는 양 벽면(110, 120) 부근에 모두 양이온이 우세하게 많은 전기이중층이 형성된다. 채널 양단간에 압력차가 가해져 채널 내에 용액이 흐르면, 전기이중층을 구성하는 양이온들은 하류 쪽에 축적되어 채널 양단간에는 전하 구배에 의한 전기장이 형성된다. 도 1에서 전하 구배에 의한 전기장은 - 및 + 기호에 의해 표시되며, 이러한 전기장으로 인하여 흐름전위 E가 발생된다.
한편, 도 2는 한 쪽 벽면(110)은 음전하로 하전되는 반면 다른 쪽 벽면(120)은 하전되지 않는 상태를 도시한다. 이 경우 다른 쪽 벽면(120)에는 전기이중층이 형성되지 않으므로 채널에 가해진 압력차에 따라 하류에 축적되는 양이온의 양은 도 1에 비해 감소되며, 따라서 발생되는 흐름전위도 도 1의 경우보다 작아지게 된다.
도 3a는 한 쪽 벽면(110)은 음전하로 하전되는 반면 다른 쪽 벽면(120)은 그 일부 영역이 양전하로 하전된 상태를 도시한다. 이 경우 다른 쪽 벽면(120)의 양전하로 하전된 영역에서는 음이온이 우세한 전기이중층이 형성되므로, 채널에 가해진 압력차에 의해 이들 음이온들이 하류에 축적되는 양이온들을 상쇄하게 되며, 그 결과 발생되는 흐름전위는 도 2의 경우에 비해 더 낮아진다.
또한, 도 3b와 같이 한 쪽 벽면(110)은 음전하로 하전되는 반면 다른 쪽 벽면(120)은 전체가 양전하로 하전될 경우에는, 전기이중층에 존재하는 음이온이 반대쪽 전기이중층에 존재하는 양이온과 양적으로 동일하여 하류에서는 완전히 상쇄되므로 흐름전위 발생은 없게 된다.
도 4는 압력차 P에 따른 흐름전위 E의 변화를 나타내는 그래프로서, 도 4에 도시된 4 종류의 그래프(401-404)는 각각 도 1, 도 2, 도 3a 및 도 3b에 도시된 벽면의 하전 상태에 따른 흐름전위를 나타낸다. 도 4는 임의의 압력차에서의 흐름전위의 정성적인 변화도 나타낸다. 정전기장을 지배하는 푸아송-볼츠만(Poisson-Boltzmann, P-B) 식에서 하전된 벽면의 표면전위 ψs 가 25.7 mV 보다 낮으면 선형화된 P-B 식으로부터 벽면의 단위 면적당 전하(즉, 이온)의 갯수를 나타내는 표면전하밀도 σs 는 다음 관계로 표현된다.
Figure pat00003
여기서, κ는 전기이중층 두께의 역수(즉, 전기이중층 두께는 κ- 1)이고, k는 볼쯔만 상수, T는 절대온도, e는 이온 1개가 갖는 단위 전하이다. 실제적으로, 표면전위 ψs 는 제타전위
Figure pat00004
와 동일하므로, 수학식 1과 수학식 2로부터 다음 수학식 3을 얻을 수 있다.
Figure pat00005
즉, 채널의 흐름전위는 채널 벽면의 전하밀도 함수이며, 구체적으로는 채널의 흐름전위 ΔE를 압력차 ΔP로 나눈 값은 채널 벽면의 표면전하밀도 σs 에 비례한다. 따라서, 실시예들에 따른 비표지 센싱 방법 및 장치에서는, 항균펩타이드가 고정된 유리 구슬을 채널에 충전시키고, 시간 경과에 따른 흐름전위의 변화를 이용하여 채널 벽면의 표면전하밀도를 측정함으로써 시간 경과에 따라 유리 구슬에 병원균이 결합된 정도를 센싱할 수 있다.
도 5a는 일 실시예에 따른 비표지 센싱 장치의 미세유체칩(1)의 개략도이며, 도 5b 및 5c는 각각 도 5a에 도시된 A 부분의 개략적인 평면도 및 측면도이다.
도 5a 내지 5c를 참조하면, 비표지 센싱 장치는 채널(10), 및 채널(10) 내에 충전되며 항균펩타이드가 결합된 하나 이상의 유리 구슬(100)을 포함할 수 있다. 각각의 유리 구슬(100)에는 하나 이상의 항균펩타이드가 고정될 수 있다. 채널(10) 내에는 유리 구슬(100)이 충전되기 위한 공간인 챔버(140)가 형성될 수 있다. 또한, 채널(10) 내에는 유리 구슬(100)이 챔버(140)로부터 이탈하지 못하도록 배치된 복수 개(예컨대, 2개)의 둑(150)(weir)이 형성될 수 있다. 예컨대, 둑(150)은 챔버(140)의 양단에 각각 위치할 수 있다.
또한, 비표지 센싱 장치는 병원균을 포함하는 시료액이 주입되기 위한 유입부(20), 및 시료액 내의 병원균이 유리 구슬(100)의 항균펩타이드에 결합된 후 병원균을 제외한 시료액이 배출되기 위한 유출부(30)를 더 포함할 수 있다. 유입부(20) 및 유출부(30)는 각각 유입튜빙(25) 및 유출튜빙(35)에 연결되어 시료액을 수용하거나 배출할 수 있다.
일 실시예에서, 비표지 센싱 장치는 서로 마주보는 하부기판(300) 및 상부기판(200)을 이용하여 구성될 수 있다. 하부기판(300) 및 상부기판(200)은 가공하기 쉽고 저렴한 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxame; PDMS)과 같은 플라스틱 소재, 가공하기는 상대적으로 어렵지만 표면 하전성이 높은 실리콘이나 유리계열 소재, 또는 다른 적절한 물질로 이루어질 수 있다.
본 발명에 의한 미세유체칩은, 유리 구슬이 충전되는 위치인 챔버의 앞뒤로 충전된 구슬이 흘러나가지 않게 하는 둑이 형성된 채널을 MEMS 공정을 이용하여 하나의 PDMS 채널기판에 형성시키고, 유입부와 유출부를 둥근 칼로 PDMS 채널기판을 관통시켜 형성시킨다. 유입부와 유출부의 직경은 1/16 인치로 하여 1/16 인치 튜빙의 설치가 가능하도록 한다.
일 실시예에서, 챔버(140)의 길이(L1)는 수백 개 정도의 유리 구슬(100)이 챔버(140) 내에 충전될 수 있도록 적절히 결정될 수 있으며, 예컨대 600 내지 1000 마이크로미터(μm) 정도일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 둑(150)의 길이(L2)는 약 300 마이크로미터(μm) 내외이다.
일 실시예에서, 둑(150)의 높이(H1)는 유리 구슬(100)이 챔버(140)로부터 이탈되지 않도록 유리 구슬(100) 직경의 1/4 내지 1/3 정도이다. 또한, 둑(150)이 형성된 영역에서 둑(150)을 제외한 채널(10)의 높이(H2)는 유리 구슬(100)이 채널이 충전될 수 있도록 유리 구슬(100)의 최대 직경보다는 약간 커야 한다. 한편, 둑(150)이 형성되지 않은 영역에서 채널의 높이(즉, H1 + H2)는 유리 구슬(100)과 상부기판(200) 사이의 거리가 15 마이크로미터(μm)를 넘지 않도록 설계되어, 통상 길이가 수 마이크로미터(μm) 정도인 병원균이 유리 구슬(100)에 쉽게 결합될 수 있도록 한다.
일 실시예에에서, 채널(10)은 마이크로미터 수준의 크기를 가진 미세채널이다. 또한 일 실시예에서, 채널(10)의 폭(W)은 채널(10) 높이(즉, H1 + H2) 보다 크다. 예컨대, 채널(10)의 폭(W)은 채널(10) 높이의 4배 이상이고 500 마이크로미터(μm) 이하일 수 있다.
일 실시예에서, 채널(10)이 형성된 하부기판(300)은 PDMS로 이루어지며, 1.5 내지 2.5 밀리미터(mm)의 두께를 갖는다. 또한 일 실시예에서, 하부기판(300)을 덮는 상부기판(200)은 유리로 이루어지며 1.0 내지 1.5 밀리미터(mm)의 두께를 갖는다.
미세유체칩 제조를 위하여, 채널(10) 및 이에 포함된 챔버(140)와 둑(150)을 MEMS 공정을 이용하여 하부기판(300)상에 형성할 수 있으며, 또한 상부기판(200)을 관통하여 유입부(20)와 유출부(30)를 형성할 수 있다. 유입부(20) 및 유출부(30)는 둥근 칼로 상부기판(200)을 파내어 형성할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다음으로, 상부기판(200)이 하부기판(300)의 채널(10)이 형성된 면에 접합될 수 있다. 일 실시예에서, 상부기판(200)과 하부기판(300)은 산소 플라즈마 접합법으로 접합되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 6a 및 6b는 항균펩타이드가 고정된 유리 구슬이 대장균에 결합되는 과정을 나타내는 개념도이며, 도 6c는 유리 구슬과 대장균이 실제로 결합된 형태를 나타내는 전자현미경 사진이다.
도 6a를 참조하면, 항균펩타이드는 양전하를 가지므로 항균펩타이드가 결합된 유리 구슬(100)도 양전하를 띈다. 그러나, 대장균과 같이 음전하를 가진 병원균(400)이 유리 구슬(100)의 항균펩타이드에 결합되면, 도 6b에 도시된 것과 같이 병원균(400)의 결합으로 인해 유리 구슬(100)의 양전하가 감소된다. 도 6c에 도시된 것과 같이 하나의 유리 구슬(100)에는 다수의 병원균(400)이 결합될 수 있으며, 시간이 경과하면서 결합되는 대장균(400)의 개수가 늘어나면, 점차 유리 구슬(100)의 많은 부분이 비하전성으로 변화되고, 유리 구슬이 갖는 양전하 개수만큼 병원균이 결합하면 완전히 비하전으로 된다.
도 7a 및 7b는 도 6a 및 6b의 결합 과정으로 인한 채널에 형성된 챔버에서의 하전성 변화 및 이에 따른 흐름전위 변화를 설명하는 개념도이다.
도 7a 및 7b를 참조하면, 본 실시예에서 채널 벽면은 음전하를 띄는 한편, 항균펩타이드가 고정된 유리 구슬(100)이 챔버(140) 내부에 충전된다. 챔버(140)는 초기에는 도 7a에 도시된 것과 같이 유리 구슬(100)로 인하여 양전하로 하전되어 있으나, 도 7b에 도시된 것과 같이 음전하를 가지는 병원균이 점차 유리 구슬(100)에 결합됨에 따라 챔버(140) 부분은 점차 비하전성으로 변하게 된다. 이는, 챔버 부분만 살펴보면 도 3a를 참조하여 전술한 벽면(120)의 일부 영역이 양전하로 하전된 상태로부터, 도 2를 참조하여 전술한 상기 일부 영역이 비하전 상태로 변화하는 것에 대응된다.
따라서, 챔버(140) 부분이 양전하에서 비하전성으로 변화함에 따라 채널의 흐름전위는 증가하게 되므로, 역으로 채널의 흐름전위를 측정할 경우, 시간 경과에 따라 챔버(140)의 유리 구슬(100)이 병원균과 결합된 정도를 센싱할 수 있다.
도 8은 일 실시예에 따른 비표지 센싱 장치의 개략도이다.
도 8을 참조하면, 비표지 센싱 장치는 도 5를 참조하여 전술한 실시예와 같이 구성된 채널(10), 및 채널(10) 내의 챔버를 충전하는 유리 구슬을 포함한다. 유입부(20)는 유입튜빙(25)에 연결되며, 실린지 펌프(syringe pump)(27)에 의하여 유입튜빙(25) 내로 병원균을 포함하는 시료액이 주입된다. 시료액의 병원균이 챔버의 유리 구슬에 결합되며, 병원균을 제외한 나머지 시료액은 유출부(30) 및 이에 연결된 유출튜빙(25)을 통하여 배출될 수 있다.
한편, 비표지 센싱 장치에는 채널(10)의 흐름전위를 측정하기 위한 전극이 구비된다. 전극은 채널(10)에 형성된 챔버 전후로 각각 배치된 한 쌍의 전극으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 채널(10)의 챔버 전후로 각각 5 밀리미터(mm) 정도 떨어진 채널(10) 내의 지점에 전극선(40, 50)의 직경 크기의 빈 공간을 형성하고, 상부기판과 하부기판을 접합하고 난 후 해당 공간에 전극선(40, 50)을 삽입하고 나서 에폭시(epoxy) 수지 등으로 밀봉할 수 있다. 전극선(40, 50)은 은(Ag)/염화은(AgCl) 또는 다른 적당한 도전 물질로 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 비표지 센싱 장치는 전극선(40, 50)을 통한 흐름전위를 검출 및 분석하기 위한 검출부를 더 포함한다. 예를 들어, 검출부는 전극선(40, 50)과 전기적으로 연결되어 흐름전위값을 측정하기 위한 디지털 멀티미터(60) 및 디지털 멀티미터(60)의 측정값을 분석, 가공 및/또는 저장하기 위한 퍼스널 컴퓨터(Personal Computer; PC)(70)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 정밀한 측정을 위하여, 디지털 멀티미터(60)는 정밀도가 10-7 내지 10-8 V 수준인 것이 사용될 수 있다.
또한 일 실시예에서, 비표지 센싱 장치는 형광현미경(80)을 더 포함한다. 형광현미경(80)은 흐름전위 측정에 의한 병원균 검출과 병행하여 종래와 같은 형광이미지 관측을 수행할 수 있도록 하는 것으로서, 형광현미경(80)은 대물렌즈가 채널 위쪽에서 채널(10)을 향하도록 배치될 수 있다.
본 발명자들은, 이상에서 설명한 것과 같이 구성된 미세유체칩 기반 비표지 센싱 방법 및 장치로 대장균에 대한 검출실험을 수행하여 검출속도와 검출효율을 측정하고, 종래의 방법에 따라 형광현미경으로 얻은 형광이미지에 의한 검출 결과와 비교 확인하였다.
병원균이 결합될 유리 구슬로는 1차 아민기를 가지며 직경이 약 30 내지 38 마이크로미터(μm)인 것을 구입하여 사용하였으며, 종래에 알려진 화학적 방법을 이용하여 항균펩타이드를 유리 구슬에 고정시키고, 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 고정된 상태를 확인하였다. 도 5의 실시예와 같이 제작된 미세유체칩에 유입튜빙 및 유출튜빙을 설치하고, 실린지 펌프에 의해 항균펩타이드가 고정된 유리 구슬 수백개를 채널의 챔버에 충전시켰다.
센싱할 병원균으로는 대장균(E. coli DH5α)을 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 확보하여 배양하고 희석하여 사용하였으며, 가시-자외선 분광광도계(uv-visible spectrophotometer; UV-VIS)　에 의하여 배양액의 광학밀도(Optical Density; OD)를 측정함으로써 대장균의 개수를 산출하였다. 대장균을 포함하는 시료액으로는 인산완충식염수(Posphate Buffered Saline;　PBS) 용액을 사용하였으며, 상업적인 조건보다 해리되는 전해질 이온농도를 낮게 하여 총 이온농도가 수 mM 수준이 되도록 조제하였다.
도 8의 실시예와 같이 비표지 센싱 장치를 구성하고, 전술한 과정에 의해 준비된 시료액을 실린지 펌프에 의해 약 1.2×10-3 mL/min의 유량으로 채널에 주입하면서 시간 경과에 따른 흐름전위값을 측정하였다. 시료액의 유량과 전극선이 위치한 지점에서의 채널 단면적으로부터, 선속도 및 압력차를 산출할 수 있고, 103, 104, 105 개/mL 농도의 대장균에 대해 시간 경과에 따른 단위 압력차당 흐름전위(ΔE/ΔP)의 변화를 도 9에 나타내었다.
도 9에 도시되는 바와 같이, 대장균 농도가 103 개/mL인 경우 흐름전위에 약간의 편차가 있으나, 세 종류의 농도에 대한 검출 차이는 분명히 존재한다. 또한, 시간이 경과할수록 흐름전위가 점차 증가하여 약 30분이 경과하면 흐름전위의 증가속도가 포화되었다.
한편 본 발명자들은, 본 발명에 따른 실시예에 대한 비교예로서, 대장균이 유리 구슬에 결합하는 것을 종래와 같이 형광현미경에 의한 형광이미지를 통해서도 관찰하였다.
도 10a 내지 10d는 형광염료인 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 이용하여 종래에 알려진 방법으로 염색한 대장균 농도 105 개/mL에 대해 종래의 형광현미경을 이용하여 시간 경과에 따라 관측하여 얻은 이미지들로서, 각각 병원균 주입 직후, 주입 5분 후, 주입 20분 후, 및 주입 50분 후의 형광이미지를 나타낸다.
도 11은, 도 10에 도시된 이미지로부터 산출된, 시간 경과에 따른 구슬 1개당 누적형광세기의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11에 도시된 결과를 본 발명의 일 실시예에 의한 도 9의 결과와 비교하면, 시간의 경과에 따른 검출 속도의 변화 특성, 및 대장균 농도에 따른 검출 특성이 유사한 것을 확인할 수 있다. 이는, 본 발명의 실시예에 따라 흐름전위에 의하여 검출한 결과가 종래의 형광이미지를 통한 검출 결과와 부합하는 것을 의미하는 것으로서, 흐름전위에 의한 센싱 방식이 유효한 비표지 센싱 방식임을 알 수 있다.
이상에서 살펴본 본 발명은 도면에 도시된 실시예들을 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다. 그러나, 이와 같은 변형은 본 발명의 기술적 보호범위 내에 있다고 보아야 한다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해서 정해져야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 채널 내의 챔버에, 항균펩타이드가 고정된 하나 이상의 유리 구슬을 주입하는 단계;
    병원균을 포함하는 시료액을 상기 채널 내로 도입함으로써, 상기 챔버 내의 상기 유리 구슬을 병원균과 결합시키는 단계; 및
    상기 유리 구슬에 결합된 병원균을 센싱하기 위하여, 상기 채널 내의 흐름전위의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 비표지 센싱 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유리 구슬을 주입하는 단계는, 상기 채널 내에 위치한 복수 개의 둑을 이용하여 상기 유리 구슬이 상기 챔버로부터 이탈하는 것을 방지하는 단계를 포함하는 비표지 센싱 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 유리 구슬을 병원균과 결합시키는 단계는, 펌프에 의한 압력차를 이용하여 상기 시료액을 상기 채널 내로 도입하는 단계를 포함하는 비표지 센싱 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 채널 내의 흐름전위의 변화를 측정하는 단계는, 시간 경과에 따른 단위 압력차 당 흐름전위의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 비표지 센싱 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 압력차는 상기 채널의 단면적과 상기 시료액의 유량에 기초하여 결정되는 비표지 센싱 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 흐름전위는 상기 채널의 내벽 및 상기 챔버에 충전된 상기 유리 구슬이 시료액과 접촉한 표면에 형성된 전기이중층에 의해 발생되며, 상기 채널의 내벽은 음전하로 하전된 비표지 센싱 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 흐름전위의 변화는, 시간 경과에 따라 상기 유리 구슬이 병원균과 결합됨으로 인한, 상기 유리 구슬이 충전된 상기 챔버의 하전성 변화에 대응되는 비표지 센싱 방법.
  8. 챔버를 포함하며, 병원균을 포함하는 시료액이 흐르기 위한 채널;
    상기 챔버 내에 충전되며, 병원균과 결합하도록 항균펩타이드가 고정된 하나 이상의 유리 구슬; 및
    상기 유리 구슬에 결합된 병원균을 센싱하기 위하여, 상기 채널 내의 흐름전위의 변화를 측정하도록 구성된 전극을 포함하는 비표지 센싱 장치.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 챔버로부터 상기 유리 구슬이 이탈하는 것을 방지하도록 상기 채널 내에 배치된 복수 개의 둑을 더 포함하는 비표지 센싱 장치.
  10. 제 8항에 있어서,
    펌프에 의한 압력차를 이용하여 상기 시료액이 도입되기 위한 유입부; 및
    병원균이 상기 유리 구슬에 결합된 후 병원균을 제외한 상기 시료액이 배출되기 위한 유출부를 더 포함하는 비표지 센싱 장치.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 전극은 상기 채널 내에서 상기 챔버에서 일정 거리 이격된 양 단에 위치한 한 쌍의 전극을 포함하는 비표지 센싱 장치.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 한 쌍의 전극은, 시간 경과에 따른 단위 압력차 당 흐름전위의 변화를 측정하도록 구성된 비표지 센싱 장치.
  13. 제 10항 또는 제 12항에 있어서,
    상기 압력차는 상기 채널의 단면적과 상기 시료액의 유량에 기초하여 결정되는 비표지 센싱 장치.
  14. 제 8항에 있어서,
    상기 흐름전위는 상기 채널의 내벽 및 상기 챔버에 충전된 상기 유리 구슬이 시료액과 접촉한 표면에 형성된 전기이중층에 의해 발생되며, 상기 채널의 내벽은 음전하로 하전된 비표지 센싱 장치.
  15. 제 8항에 있어서,
    상기 채널의 폭은 상기 채널의 높이에 비해 큰 비표지 센싱 장치.
  16. 제 8항에 있어서,
    상기 흐름전위의 변화는, 시간 경과에 따라 상기 유리 구슬이 병원균과 결합됨으로 인한, 상기 유리 구슬이 충전된 상기 챔버의 하전성 변화에 대응되는 비표지 센싱 장치.
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