KR20170051346A - A composition for diagnosis of retinal disease - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 결절맥락막혈관병증 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 ANGPTL 4(Angiopoietin-like 4) 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 결절맥락막혈관병증 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 결절맥락막혈관병증 진단용 키트, 및 ANGPTL 4의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 결절맥락막혈관병증의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for diagnosing choroidal vasculopathy, and more specifically, the present invention relates to a composition for diagnosing choroidal vasculopathy which comprises an agent for measuring the level of mRNA of ANGPTL 4 (Angiopoietin-like 4) gene or a protein expressed therefrom A kit for the diagnosis of choroidal vascular disease comprising the composition, and a method for measuring the level of expression of ANGPTL 4, and a method for providing information for diagnosis of choroidal vasculopathy.
결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)은 맥락막 혈관에 방사상의 이상 혈관망이 존재하고 그 끝에 결절형의 확장된 혈관류를 가지는 임상 질환의 한 범주를 의미한다. Polypoidal choroidal vasculopathy (PCV) is a category of clinical disease with radial abnormal vascular network in the choroidal vessels and nodular extended vasculature at the end of the choroidal vasculopathy.
상기 질환의 주요 증상으로 맥락막의 혈관 끝이 전구 모양으로 변하면서 물이나 피가 새는 현상이 나타나는데, 출혈 자체에서 오는 이상보다 이때 일어난 출혈이 황반부에 영향을 미쳐 황반변성을 유발할 수 있고, 매우 빠른 시간 내 실명에 이를 수 있다. 따라서, 이를 조기 진단하는 것이 중요하나, 결절맥락막혈관병증 자체만으로는 특별한 이상 징후가 없기 때문에 상기 질환의 진단에 어려움이 있다.The chief complaints of this disease are that the blood vessels of the choroid become bulbous and water or blood leaks. The hemorrhage from the bleeding itself may cause hemorrhage in the macula, which may cause macular degeneration. I can achieve my real name. Therefore, it is important to perform early diagnosis, but there is no particular abnormal symptom with only choroidal vasculopathy itself, so it is difficult to diagnose the disease.
한편, 결절맥락막혈관병증을 진단하는 중요한 검사방법으로 인도시아닌그린형광안저혈관조영술(indocyanine green angiography, ICGA)이 있다. ICGA를 통해 진단하는 경우, 주로 후극부의 유두주변부와 황반부 망막색소상피 밑에 다양한 크기의 혈관이 방사상으로 분지를 하며 혈관망을 이루고, 그 끝에 결절성 확장이 있는 것을 확인할 수 있다. 다만, 병변 부위의 망막밑출혈이나 혈종 등으로 인해 형광이 차단되어 특징적인 맥락막 혈관 소견이 관찰되지 않을 수 있어, 결절맥락막혈관병증을 진단하는데 어려움이 있다(J Korean Ophthalmol Soc, 2010, 51(4), 616-622).Indocyanine green angiography (ICGA) is an important diagnostic tool for the diagnosis of choroidal vasculopathy. When diagnosed through ICGA, various sizes of blood vessels branching radially and forming a blood vessel network, and nodular expansion at the end are observed mainly in the periphery of the nipple of the posterior portion and under the macular retinal pigment epithelium. However, it is difficult to diagnose choroidal vasculopathy because of the lack of characteristic choroidal vascularity due to fluorescein block due to subretinal hemorrhage or hematoma of the lesion (J Korean Ophthalmol Soc, 2010, 51 (4) ), 616-622).
또한, 국내등록특허 제1334265호에서는 혈장과 같은 생물학적 시료 내에 존재하는 말론디알데히드의 수준을 이용하여 결절맥락막혈관병증을 진단하는 방법을 개발하였으나, 높은 성공율의 진단을 위해 효과적으로 결절맥락막혈관병증의 발병여부를 진단하는 방법을 개발하여야 할 필요성은 여전히 요구되는 실정이었다.In addition, Korean Patent No. 1334265 has developed a method of diagnosing choroidal vascular disease using the level of malondialdehyde present in a biological sample such as plasma. However, in order to diagnose a choroidal vascular disease with high success rate, There is still a need to develop a method of diagnosing whether or not the disease is diagnosed.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 결절맥락막혈관병증의 발병여부를 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, ANGPTL 4(angiopoietin-like 4)의 수준을 이용할 경우, 결절맥락막혈관병증의 발병여부를 보다 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors have made intensive efforts to develop a method for diagnosing the occurrence of choroidal vasculopathy more effectively. As a result, when the level of ANGPTL 4 (angiopoietin-like 4) is used, the occurrence of choroidal vasculopathy The present inventors have completed the present invention.
본 발명의 주된 목적은 ANGPTL 4(Angiopoietin-like 4) 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.The main object of the present invention is to provide a composition for diagnosing choroidal vascular disease of the choroid, which comprises an agent for measuring the level of mRNA of ANGPTL 4 (Angiopoietin-like 4) gene or a protein expressed therefrom.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for the diagnosis of choroidal vasculopathy in tuberculosis comprising the above composition.
본 발명의 또 다른 목적은 결절맥락막혈관병증이 의심되는 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for the diagnosis of choroidal vasculopathy by measuring the level of expression of ANGPTL4 protein in a biological sample separated from an individual suspected of having choroidal vasculopathy; And comparing the measured protein expression level with a protein expression level of a normal control sample. The present invention also provides a method for providing information for diagnosis of choroidal vascular disease.
본 발명의 또 다른 목적은 망막손상 질환 치료후보 물질을 상기 질환이 발병된 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에 처리하여 ANGPTL 4의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 상기 측정한 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 결절맥락막혈관병증 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening a candidate compound for treating retinopathy, comprising the steps of treating a biological sample separated from an individual suffering from the disease to measure the degree of expression of ANGPTL4; And comparing the measured degree of expression with the degree of expression of a control group not treated with the candidate substance.
본 발명의 또 다른 목적은 ANGPTL 4 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는, 결절맥락막혈관병증 치료제 스크리닝 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a screening composition for treating a choroidal vascular disease therapeutic agent comprising an ANGPTL 4 protein or an antibody or an aptamer that specifically binds to a fragment of the protein.
본 발명은 결절맥락막혈관병증 발병 환자에서 ANGPTL 4(Angiopoietin-like 4)가 높은 수준으로 존재하는 것에 기초한 것이다. 기존에는 ANGPTL 4 수준과 결절맥락막혈관병증 발병 환자간의 관계에 대해서는 알려진 바가 없었으나, 본 발명자는 환자의 연령, 성별, 고혈압 증상 여부에 관계 없이 결절맥락막혈관병증 발병 환자에서 상기 ANGPTL 4의 수준을 측정하여 상기 질환의 발병여부를 높은 정확성과 동시에 효과적으로 진단할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.The present invention is based on the high level of ANGPTL 4 (Angiopoietin-like 4) in patients with choroidal vasculopathy. Previously, the relationship between the level of ANGPTL 4 and patients with tuberculosis of the choroidal vasculopathy was not known. However, the present inventors measured the level of ANGPTL 4 in patients with choroidal vasculopathy, regardless of age, sex, and symptoms of hypertension And thus it is possible to diagnose whether or not the disease is caused with high accuracy and at the same time, thereby completing the present invention.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, ANGPTL 4(Angiopoietin-like 4) 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a diagnostic composition for the diagnosis of choroidal vascular disease comprising an agent for measuring the level of ANGPTL 4 (Angiopoietin-like 4) gene mRNA or protein expressed therefrom to provide.
본 발명의 용어, "ANGPTL 4(Angiopoietin-like 4)"는 지방조직에서 발현하는 아디포카인(adipokine)에서 처음으로 발견된 지방대사 관여 유전자를 의미한다. 본 발명은 상기 ANGPTL 4가 결절맥락막혈관병증 환자에서 높은 수준으로 존재하는 것을 확인하여, 결절맥락막혈관병증의 진단 마커로 사용하는 것이 특징이다.The term "ANGPTL 4 (Angiopoietin-like 4)" of the present invention means a lipid metabolism-related gene first found in adipokines expressed in adipose tissue. The present invention is characterized by the fact that ANGPTL 4 exists at a high level in patients with choroidal vasculopathy, and is used as a diagnostic marker for choroidal vasculopathy.
본 발명의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 제제는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.The term "agent for measuring mRNA level of a gene " of the present invention means a preparation used for measuring the level of mRNA transcribed from the target gene in order to confirm the expression of the target gene contained in the sample . Specifically, the preparation can be used for RT-PCR, quantitative real time PCR, competitive RT-PCR, real time quantitative RT-PCR, RNase protection assay (RPA; a primer or a probe capable of specifically binding to a target gene used in a method such as protection assay, Northern blotting and DNA chip analysis, but is not particularly limited thereto.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. The "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying Quot; means a short nucleic acid sequence. Primers can be used to initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures.
한편, 상기 프로브는 ANGPTL 4 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.Meanwhile, the probe may be a probe capable of complementarily binding with the ANGPTL 4 gene, and the nucleotide sequence of the probe is not limited as long as it can complementarily bind to each gene.
본 발명에서, 상기 ANGPTL 4 유전자의 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the agent for measuring the level of the protein of the ANGPTL 4 gene may be an antibody specific to the protein, or an aptamer.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 제제는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "agent for measuring the level of protein" of the present invention means an agent used in a method for measuring the level of a target protein contained in a sample. Specifically, the preparation can be applied to various tissues such as western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Immunohistochemical staining, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Immunofluorescence, Immunochromatography, FACS (fluorescence activated cell sorter (FACS)), immunohistochemical staining, analysis, and protein chip technology assay. However, the present invention is not limited thereto.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.The "antibody" means a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule. Such an antibody can be produced by a conventional method from the obtained protein by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene. The form of the antibody is not particularly limited and any polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding antibody thereof may be included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies may be included. In addition, it may include a special antibody such as a humanized antibody. In addition, the antibody comprises a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and can be Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2, Fv and the like.
상기 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.The term "aptamer " refers to a single-stranded oligonucleotide, which refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a given target molecule. The aptamer may have various three-dimensional structures depending on its nucleotide sequence, and may have a high affinity for a specific substance such as an antigen-antibody reaction. An aptamer can inhibit the activity of a given target molecule by binding to a predetermined target molecule.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 ANGPTL 4에 대하여 사용될 수 있다. 상기 ANGPTL 4에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.The aptamer of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and the form thereof may be linear or cyclic, but is not limited thereto. The aptamers of the present invention can be used for ANGPTL 4. The aptamers having binding activity to ANGPTL 4 can be easily produced by a person skilled in the art with reference to the respective nucleotide sequences according to known methods.
본 발명의 용어 "결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)"이란, 맥락막에 발생하여 분지하는 혈관망과 말단의 결절형태 혈관변화를 나타내어 심각한 시력저하를 유발할 수 있는 안과질환이다. 본 발명의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 결절맥락막혈관병증의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.The term " polypoidal choroidal vasculopathy (PCV) "of the present invention refers to an ophthalmic disease that can cause severe visual loss due to a blood vessel network and a terminal nodule-shaped blood vessel change occurring in the choroid. The term "diagnosis" of the present invention means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to ascertain whether or not the choroidal vasculopathy is present or not.
한편, 본 발명에서 상기 조성물은 혈관표피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the composition may further include an agent for measuring the mRNA level of a vascular endothelial growth factor (VEGF) gene or the level of a protein expressed therefrom.
본 발명의 용어 "혈관표피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)"는 혈관형성(vasculogenesis)와 혈관신생(angiogenesis)을 자극하는 신호 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 암세포 또는 자체세포들에 의해 생성된 후 표피세포의 표면에 발현되어 있는 수용체인 혈관표피생성인자 수용체 1, 또는 2와 같은 수용체와 결합하여 작용하며, 생성 후 표피세포의 성장, 이동, 및 관형성(tube formation) 등, 혈관생성의 전 단계에 작용하는 역할을 한다.The term "vascular endothelial growth factor (VEGF)" of the present invention means a signal protein that stimulates vasculogenesis and angiogenesis. The protein binds to receptors such as vascular epidermal factor receptor 1 or 2, which is a receptor expressed on the surface of epidermal cells after being produced by cancer cells or its own cells, and acts on growth, migration, And tube formation, all of which play a role in the previous stages of angiogenesis.
다른 양태로서, 본 발명은 결절맥락막혈관병증의 진단용 조성물을 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것일 수 있다.In another aspect, the present invention provides a kit for the diagnosis of choroidal vasculopathy in tuberculosis comprising a composition for the diagnosis of choroidal vasculopathy. The kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit or a protein chip kit.
구체적인 일례로서, 본 발명의 ANGPTL 4 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. As a specific example, the kit for measuring the mRNA expression level of the ANGPTL 4 gene of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for conducting RT-PCR. The RT-PCR kit can be used in combination with a test tube or other appropriate container, a reaction buffer (pH and magnesium concentration varies), deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase , DNase, RNAse inhibitor, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, it may contain a primer pair specific to a gene used as a quantitative control.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.As another example, the kit of the present invention may contain the necessary elements necessary for performing DNA chip analysis. The kit for DNA chip analysis may include a substrate on which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and a reagent, a preparation, and an enzyme for producing a fluorescent-labeled probe. In addition, the substrate may contain a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 ANGPTL 4 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.As another example, the kit of the present invention may be a kit for analyzing a protein chip for measuring the level of a protein expressed from the ANGPTL 4 gene. The kit may include, but is not limited to, , A suitable buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like. The substrate is not particularly limited, but a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with a polystyrene resin, and a glass slide glass can be used, and the coloring enzyme is not particularly limited The fluorescent substance may be FITC, RITC or the like, and the coloring substrate liquid is not particularly limited, but ABTS (2, 3, 4, 5, 2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethylbenzidine).
다른 양태로서, 본 발명은 결절맥락막혈관병증이 의심되는 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계(제1단계); 및 상기 측정된 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method of measuring the level of expression of ANGPTL4 protein in a biological sample separated from an individual suspected of having choroidal vasculopathy (step 1); And comparing the measured protein expression level with a protein expression level of a normal control sample (second step).
제1단계는 결절맥락막혈관병증이 의심되는 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 의미한다.The first step is to measure the level of expression of ANGPTL4 protein in biological samples isolated from individuals suspected of having choroidal vasculopathy.
한편, 상기 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는 ANGPTL 4 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 상기 시료와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으며, 항체와 앱타머에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.Meanwhile, the step of measuring the expression level of the ANGPTL 4 protein may include contacting the ANGPTL 4 protein or an antibody or an aptamer that specifically binds to the fragment of the protein with the sample. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and the antibody and the aptamer are as described above.
본 발명의 용어 "개체"란, 결절맥락막혈관병증이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The term "individual" of the present invention may refer to any animal, including a human, who is or may be at risk of developing choroidal vasculopathy. The animal may be, but is not limited to, a mammal such as a cow, a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, a nutrient, a dog, a cat,
제2단계는 제1단계에서 측정된 ANGPTL 4 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 의미한다. The second step refers to comparing the ANGPTL4 protein expression level measured in the first step with the protein expression level of the normal control sample.
본 발명의 용어 "정상 대조군"이란, 결절맥락막혈관병증이 발병되지 않거나, 발병이 의심되지 않는 개체를 의미한다. The term "normal control group " of the present invention means an individual who does not develop or suspects the occurrence of choroidal vasculopathy.
본 발명의 용어 "시료"란, 결절맥락막혈관병증이 발병된 환자로부터 분리되어 ANGPTL 4 유전자의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하며, 구체적으로 상기 생물학적 시료는 혈액, 안구 세포, 안구 조직, 및 누액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The term "sample" of the present invention refers to a direct object for measuring the expression level of the ANGPTL 4 gene separated from a patient suffering from choroidal vasculopathy. Specifically, the biological sample includes blood, eye cells, And leakage may be selected.
상기 정보제공방법은 상기 생물학적 시료에서 측정한 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높은 경우, 결절맥락막혈관병증으로 판단하는 단계(제3단계)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. The information providing method may further include a step of determining that the ANGPTL 4 protein expression level measured by the biological sample is higher than the protein expression level of the normal control sample, have.
본 발명의 일실시예에서는, 결절맥락막혈관병증이 발병한 환자와 그렇지 않은 정상 대조군의 시료에서 ANGPTL 4 단백질의 발현량을 비교하였다. 그 결과, 정상 대조군에 비해, 결절맥락막혈관병증이 발병한 환자에서 ANGPTL 4 단백질의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 정상 대조군에 비해 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 결절맥락막혈관병증으로 판단하는 정보제공방법을 제공할 수 있는 것을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, the expression levels of ANGPTL 4 protein were compared between patients with tuberculosis vasculopathy and those without normal control. As a result, the expression level of ANGPTL 4 protein was increased in patients with tuberous choroidal vasculopathy, compared with the normal control group. Thus, it was confirmed that when the expression level of ANGPTL 4 protein is higher than that of the normal control group, it is possible to provide an information providing method judging as choroidal vasculopathy.
다른 양태로서, 본 발명은 결절맥락막혈관병증 치료후보 물질을 상기 질환이 발병된 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에 처리하여 ANGPTL 4의 발현 정도를 측정하는 단계(제1단계); 및 상기 측정한 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 결절맥락막혈관병증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention relates to a method of treating a subject suffering from choroidal vasculopathy by administering a biological sample separated from an individual suffering from the disease (step 1) to measure the degree of expression of ANGPTL4; And comparing the measured degree of expression with the degree of expression of a control group not treated with the candidate substance (second step).
제1단계는 결절맥락막혈관병증 치료후보 물질을 상기 질환이 발병된 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에 처리하여 ANGPTL 4의 발현 정도를 측정하는 단계를 의미한다. The first step is to measure the degree of expression of ANGPTL4 by treating a candidate substance for treating choroidal vasculopathy of the choroidal artery with a biological sample separated from the subject suffering from the disease.
상기 생물학적 시료는 혈액, 안구 세포, 안구 조직, 및 누액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The biological sample may be selected from the group consisting of blood, eye cells, eye tissue, and leakage, but is not limited thereto.
본 발명의 용어 "치료후보 물질"이란, ANGPTL 4의 발현 또는 활성을 감소시켜 결절맥락막혈관병증의 치료 가능성이 있는 물질로, 올리고 뉴클레오티드, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.The term "therapeutic candidate substance" of the present invention refers to a substance capable of reducing the expression or activity of ANGPTL4 to treat choroidal vasculopathy, including, without limitation, oligonucleotides, proteins, compounds and the like.
상기 "올리고 뉴클레오티드”는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 ANGPTL 4 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 구체적으로 ANGPTL 4의 핵산에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 또는 siRNA(small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다.The term "oligonucleotide " means a polymer formed by polymerizing several to several tens of nucleotides with a phosphodiester bond. Examples of oligonucleotides that inhibit the expression of ANGPTL 4 mRNA include, specifically, ANGPTL 4 Antisense oligonucleotides specific for nucleic acids, or siRNA (small interfering RNA), and the like.
상기 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 ANGPTL 4 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 상기 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 mRNA에 결합하여 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 등을 방해하거나 또는 mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다.The term "antisense oligonucleotide" refers to a DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to a complementary sequence in mRNA and inhibits translation of mRNA into a protein . In the present invention, the oligonucleotide which inhibits the expression of ANGPTL 4 mRNA is DNA or RNA having a sequence complementary to the mRNA, or a derivative thereof, which binds to the mRNA and translates the mRNA, translocates into the cytoplasm, maturation, and the like, or may interfere with all other biological functions or activities of the mRNA.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 구체적으로는 6 내지 100 염기일 수 있고, 더욱 구체적으로는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 가장 구체적으로는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내(in vivo)에서 합성되거나, 시험관 내(in vitro)에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위(Multi-cloning site; MCS)의 기원(origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I를 이용하는 방법을 들 수 있다.The length of the antisense oligonucleotide is not particularly limited, but may be specifically 6 to 100 bases, more specifically 8 to 60 bases, and most specifically 10 to 40 bases. The antisense oligonucleotides may be synthesized in vivo according to a conventional method used in the art, or may be synthesized in vitro and administered in vivo. As a non-limiting example of a method for synthesizing antisense RNA in vivo, there is a method in which antisense RNA is transcribed using a vector whose origin is a multi-cloning site (MCS) in the opposite direction . As a non-limiting example of a method for synthesizing antisense RNA in vitro, there is a method using RNA polymerase I.
본 발명의 ANGPTL 4의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 ANGPTL 4의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.The antisense oligonucleotides that inhibit the expression of ANGPTL 4 of the present invention can be easily prepared by a known method having a knowledge in the art with reference to the nucleotide sequence of ANGPTL 4.
제2단계는 제1단계에서 측정한 ANGPTL 4의 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계를 의미한다.The second step is a step of comparing the expression level of ANGPTL 4 measured in the first step with the expression level of the control group not treated with the candidate substance.
상기 제2단계의 비교를 통해, 결절맥락막혈관병증의 치료후보 물질을 처리한 군에서 ANGPTL 4의 발현 정도가 대조군에 비해 유의미하게 감소하는 경우, 상기 후보물질은 결절맥락막혈관병증의 치료제로서 가능성이 있음을 나타낸다.Through comparison of the second step, when the degree of ANGPTL 4 expression is significantly decreased in the group treated with the candidate substance for tuberculosis vasculopathy, the candidate substance is likely to be a therapeutic agent for choroidal vasculopathy .
다른 양태로서, ANGPTL 4 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는, 결절맥락막혈관병증 치료제 스크리닝 조성물을 제공한다. In another embodiment, there is provided a screening composition for treating a choroidal vascular disease therapeutic, comprising an ANGPTL 4 protein or an antibody or an aptamer that specifically binds to a fragment of said protein.
상기 항체 또는 앱타머에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.The above-mentioned antibodies or aptamers are as described above.
다른 양태로서, ANGPTL 4 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 망막손상 질환의 진단용 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing retinal damage diseases comprising an agent that measures the level of the mRNA of the ANGPTL 4 gene or the protein expressed therefrom.
또한, 망막손상 질환이 의심되는 개체로부터 분리되는 생물학적 시료에서 ANGPTL 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계(제1단계), 및 상기 측정된 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는 망막손상 질환의 진단용 조성물을 제공한다.Also, there is provided a method for detecting a retinal damage disease comprising the steps of: (1) measuring the expression level of ANGPTL 4 protein in a biological sample separated from a subject suspected of having a retinal damage disease; and comparing the measured protein expression level with a protein expression level of a normal control sample (Second step) for the diagnosis of retinal damage diseases.
상기 "유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제", 및 "단백질의 수준을 측정하는 제제"에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.The above-mentioned "preparation for measuring mRNA expression level of gene" and "preparation for measuring protein level" are as described above.
상기 "망막손상 질환"은 충격, 및 질병 등의 이유로 망막에 손상이 발생하는 질환을 의미한다. 상기 망막손상 질환으로는 망막혈관폐쇄, 망막정맥분지폐쇄, 급성 허혈성 시각 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.The term " retinal damage disease "means a disease in which damage to the retina occurs due to impact, disease, and the like. The retinal damage disease may be any one selected from the group consisting of retinal vascular occlusion, retinal vein branch occlusion, and acute ischemic optic neuropathy, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에서는 망막정맥분지폐쇄 질환이 발병한 환자와 그렇지 않은 정상 대조군의 시료에서 ANGPTL 4 단백질의 발현량을 비교하였다. 그 결과, 정상 대조군에 비해, 망막정맥분지폐쇄 질환이 발병한 환자에서 ANGPTL 4의 단백질 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 1a). 또한, ANGPTL 4와 함께 VEGF의 단백질의 발현량 역시 증가하는 것을 확인하였다(도 1b).In one embodiment of the present invention, the expression levels of ANGPTL 4 protein were compared between patients with a retinal vein occlusive disease and normal controls. As a result, it was confirmed that the protein expression level of ANGPTL 4 was increased in patients who developed branch retinal vein occlusion disease (Fig. 1A) as compared with the normal control group. In addition, it was confirmed that the expression amount of VEGF protein was also increased with ANGPTL 4 (Fig. 1B).
또한, 결절맥락막혈관병증 질환이 발병한 환자와 그렇지 않은 정상 대조군의 시료에서 ANGPTL 4의 단백질의 발현량을 비교하였다. 그 결과, 정상 대조군에 비해, 결절맥락막혈관병증 질환이 발병한 환자에서 ANGPTL 4의 단백질의 발현 정도가 증가하는 것을 확인하였다(도 5a).In addition, the expression level of ANGPTL 4 protein was compared between patients with tuberculosis and those without normal control. As a result, it was confirmed that the expression level of ANGPTL 4 protein was increased in patients suffering from choroidal vasculopathy disease (Fig. 5A) as compared with the normal control group.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 망막정맥분지폐쇄 질환이 발병한 환자에서 ANGPTL 4의 단백질의 발현 정도가 높을수록 중앙 부분 황반 두께(CSMT)가 커지고, 황반의 전체 용량(TMV)이 커지며, 모세혈관의 비관류 지역이 커짐을 확인하였다(도 2a 내지 4b).In an embodiment of the present invention, the central macular thickness (CSMT) is increased and the total macular volume (TMV) is increased as the degree of protein expression of ANGPTL 4 is higher in a patient with a retinal vein branch occlusion disease, It was confirmed that the non-perfusion region of the blood vessel was enlarged (Figs. 2A to 4B).
한편, 본 발명의 일실시예에서는 결절맥락막혈관병증 질환이 발병한 환자에서 ANGPTL 4의 단백질의 발현 정도와 병변 지역(lesion area)의 크기가 상당한 상관관계를 가짐을 확인하였다(도 5b).Meanwhile, in one embodiment of the present invention, it was confirmed that the degree of protein expression of ANGPTL 4 and the size of the lesion area were significantly correlated with the occurrence of the choroidal vascular disease disease (Fig. 5B).
본 발명은 ANGPTL 4 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 제공하여, 결절맥락막혈관병증을 진단할 수 있고, 이를 통해 상기 질환을 조기에 치료할 수 있다.The present invention provides a composition comprising an agent for measuring the mRNA level of the ANGPTL 4 gene or the level of the protein expressed therefrom to diagnose the choroidal vascular disease of the tuberculosis and thereby to treat the disease early.
도 1a는, 대조군과 BRVO 실험군의 평균적인 ANGPTL 4 수준을 나타낸 그래프이다.
도 1b는, 대조군과 BRVO 실험군의 평균적인 VEGF 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2a는, BRVO 실험군의 ANGPTL 4 수준과 중앙 부분 황반 두께(CSMT) 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 2b는, BRVO 실험군의 VEGF 수준과 중앙 부분 황반 두께(CSMT) 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 3a는, BRVO 실험군 중 주요한 BRVO군의 모세혈관 비관류가 발생한 부위를 나타낸 사진이다.
도 3b는, BRVO 실험군 중 황반 BRVO군의 모세혈관 비관류가 발생한 부위를 나타낸 사진이다.
도 4a는, BRVO 실험군의 ANGPTL 4 수준과 모세혈관 비관류 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 4b는, 실험군의 VEGF 수준과 모세혈관 비관류 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5a는, 대조군과 PCV 실험군의 평균적인 ANGPTL 4 수준을 나타낸 그래프이다.
도 5b는, PCV 실험군의 ANGPTL 4 수준과 병변 지역(lesion area) 크기 사이의 상관관계를 나타낸 그래프이다.FIG. 1A is a graph showing the average ANGPTL 4 level of the control group and the BRVO experimental group.
FIG. 1B is a graph showing the average VEGF levels in the control and BRVO experimental groups.
2A is a graph showing the correlation between the ANGPTL 4 level and the central partial macular thickness (CSMT) of the BRVO experimental group.
FIG. 2B is a graph showing the correlation between the VEGF level in the BRVO test group and the central partial macular thickness (CSMT).
FIG. 3A is a photograph showing a site of capillary non-perfusion in the main BRVO group among the BRVO test groups.
FIG. 3B is a photograph showing the area of capillary non-perfusion in the BRVO group of the BRVO experimental group.
FIG. 4A is a graph showing the correlation between ANGPTL 4 level and capillary vascular perfusion in the BRVO experimental group.
Figure 4b is a graph showing the correlation between VEGF levels in the experimental group and capillary vasculature.
FIG. 5A is a graph showing the average ANGPTL 4 level of the control and PCV experimental groups.
FIG. 5B is a graph showing the correlation between the ANGPTL 4 level and the lesion area size in the PCV test group.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예Example 1: 실험1: Experiment 참여자의 선정 Selection of Participants
실시예Example 1-1: 실험 참여자의 선정방법 1-1: Selection method of experiment participants
실시예 1-1-1: 망막분지정맥폐쇄(branch retinal vein occlusion, BRVO)환자 실험군과 대조군Example 1-1-1: Branch retinal vein occlusion (BRVO) patient test group and control group
실험군과 대조군은 2014년 12월부터 2015년 7월 사이의 경북대학교 안과에서 각각 망막분지정맥폐쇄(branch retinal vein occlusion, BRVO)로 인한 황반부종(macular edema, ME)의 치료를 위한 베바시주맵주입술(intravitreal bevacizumab injection)과 노인성 백내장 수술이 예정된 환자들로 이루어졌다. 상기 환자를 대상으로 수행한 모든 실험방법은 헬싱키 선언에 의거하여 수행되었고, 경북대학병원의 임상시험심사위원회로부터 승인받았으며, 모든 환자로부터 동의를 얻었다.The experimental group and the control group were treated with bevacizumab injection for the treatment of macular edema (ME) due to branch retinal vein occlusion (BRVO) in the ophthalmology department of Kyungpook National University between December 2014 and July 2015. (intravitreal bevacizumab injection) and patients scheduled for geriatric cataract surgery. All of the experimental methods performed on the patients were performed according to the Helsinki Declaration, approved by the Clinical Examination Committee of Kyungpook National University Hospital, and obtained from all patients.
BRVO로 인한 황반부종 환자들 중 다음의 기준을 충족하는 경우, 본 실시예의 실험군에 포함되었다:Among the patients with macular edema due to BRVO, those that met the following criteria were included in the experimental group of this example:
1달 이상의 기간 동안 의학적으로 감지 가능한 확산 황반부종(diffuse macular edema) 또는 포낭 황반부종(cystoid macular edema)에 해당하는 경우, 최대 교정 시력이 20/400과 20/40의 사이에 해당하는 경우, 및 광학 간섭 단층 촬영(spectral-domain optical coherence tomography, OCT) (Spectralis OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)상에서 중앙 부분 황반 두께(central subfield macular thickness, CSMT)가 300 μm 또는 그 이상인 경우.A medically detectable diffuse macular edema or cystoid macular edema for a period of one month or more, where the best corrected visual acuity is between 20/400 and 20/40, and If the central subfield macular thickness (CSMT) is 300 μm or more on spectral-domain optical coherence tomography (OCT) (Spectralis OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)
다음의 항목에 해당하는 경우, 본 실시예의 실험군, 및 대조군에서 제외되었다;The experimental group and the control group of this example were excluded when the following items were met:
항 혈관생성 약물인 베바시주맵(bevacizumab), 라니비주맵(ranibizumab), 및 페갑타닙(pegaptanib) 등을 투여한 적이 있는 경우, 레이저 광 응고술(laser photocoagulation), 또는 유리체 절제술(vitrectomy)등을 받은 적이 있는 경우, 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 및 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)을 앓고 있는 경우, 홍채 조홍(iris rubeosis)을 앓고 있는 경우, 안구 염증(ocular inflammation), 및 유리체망막 질병(vitreoretinal diseases)의 병력이 있는 경우, 및 최근 심근경색(myocardial infarction) 또는 뇌혈관 사고(cerebral vascular accidents)가 있는 경우.In the case of administration of anti-angiogenic drugs bevacizumab, ranibizumab, and pegaptanib, they have received laser photocoagulation or vitrectomy. Or ocular inflammation, and vitreoretinal diseases, such as those suffering from diabetes mellitus, diabetic retinopathy, iris rubeosis, ocular inflammation, And if there is recent myocardial infarction or cerebral vascular accidents.
만일, 두 가지 질병이 모두 발생된 환자에서는 최초 진단된 질병으로 분류하였다.If both diseases were present, they were classified as first diagnosed.
실험군은 주요한 BRVO군과 황반 BRVO군 (macular BRVO)으로 나누었다. 구체적으로, 주요한 BRVO들은 보통 광학 디스크 근처에서 망막의 1/4 또는 그 이상에 영향을 주는 망막 정맥의 주요한 가지 중의 하나에 관여하는 것을 의미하고, 황반 BRVO들은 황반 정맥 중의 하나와 오직 황반 망막의 조각에 관여하는 것을 의미한다.The experimental group was divided into the main BRVO group and macular BRVO group (macular BRVO). Specifically, major BRVOs usually involve one of the major branches of the retinal vein affecting 1/4 or more of the retina near the optical disk, and macular BRVOs may be associated with one of the macular veins and only the macular retina . ≪ / RTI >
포괄적인 안과 조사에 의해 백내장 수술을 받기로 예정되어 있는 환자 중 당뇨병의 병력이 없고, 망막 혈관 질환이 없는 경우, 대조군에 포함되었다.Patients scheduled to undergo cataract surgery by comprehensive ophthalmologic examination were included in the control group when there was no history of diabetes and no retinal vascular disease.
실시예 1-1-2: 결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy) 환자 실험군과 대조군Example 1-1-2: Experimental group and control group of polypoidal choroidal vasculopathy
실험군은 2014년 1월부터 2014년 10월 사이의 경북대학교 안과에서 결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)의 치료를 위한 라니비주맵주입술(intravitreal ranibizumab injection) 수술이 예정된 모든 일련의 환자들로 이루어졌다. 대조군은 동일 기간 동일한 과에서 노인성 백내장 수술이 예정된 모든 일련의 환자들로 이루어졌다.The experimental group consisted of all patients scheduled to undergo intravitreal ranibizumab injection for the treatment of polypoidal choroidal vasculopathy (PCV) in Kyungpook National University Hospital from January 2014 to October 2014 . The control group consisted of all the patients who underwent cataract surgery for the same period in the same period.
PCV의 환자들 중 처음 상기 과에 방문할 당시 다음의 기준을 충족하는 경우, 본 실시예의 실험군에 포함되었다:The first of the patients of PCV, when meeting the following criteria at the time of the visit to the above section, was included in the experimental group of this example:
나이가 50세 이상; 중심와(central fovea)를 포함한 PCV 다음의 활성 황반 CNV; 최대교정시력(BCVA)이 20/40과 20/400 사이(스넬렌 등가); 광학 간섭 단층 촬영(spectral-domain optical coherence tomography, OCT) (Spectralis OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)상에서 중앙 부분 황반 두께(central subfield macular thickness, CSMT)가 300μm 또는 그 이상인 경우.Age 50 or older; Active macular CNV following PCV, including central fovea; Maximum BCVA between 20/40 and 20/400 (Snellen equivalent); If the central subfield macular thickness (CSMT) is 300 μm or more on spectral-domain optical coherence tomography (OCT) (Spectralis OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)
다음의 경우는 제외되었다: 항 혈관생성 약물인 베바시주맵(bevacizumab), 라니비주맵(ranibizumab), 및 페갑타닙(pegaptanib) 등을 투여한 적이 있는 경우; 레이저 광 응고술(laser photocoagulation), 또는 유리체 절제술(vitrectomy)등을 받은 적이 있는 경우; 병적 근시, 혈관 양선조, 추정된 눈 히스토플라스마증, 또는 다른 이차 CVN와 같은 망막 또는 맥락막 질환; 망막 색소 상피 파열 또는 지리적 위축; 당뇨병 또는 당뇨병성 망막병증; 특발성 또는 자가면역 포도막염의 병력; 및/또는 심근경색 또는 뇌혈관 사고.The following cases were excluded: when the anti-angiogenic drugs bevacizumab, ranibizumab, and pegaptanib were administered; Laser photocoagulation, or vitrectomy, or the like; Retinal or choroidal diseases such as pathologic myopia, angioplasty, presumed ocular histoplasmosis, or other secondary CVN; Rupture of the retinal pigment epithelium or geographical atrophy; Diabetic or diabetic retinopathy; History of idiopathic or autoimmune uveitis; And / or myocardial infarction or cerebrovascular accident.
포괄적인 안과 조사에 의해 백내장 수술을 받기로 예정되어 있는 환자 중 고혈압 또는 당뇨병의 병력이 없고, 망막 혈관 질환이 없거나 종합 안구 검사에 의해 측정된 초자소구안병(drusen)이나 색소상피 탈착과 같은 어떠한 PCV의 증상이 없는 경우, 대조군에 포함되었다.Patients who are scheduled to undergo cataract surgery by a comprehensive ophthalmologic examination have no history of hypertension or diabetes, no retinal vascular disease, or any PCV, such as drusen or pigment epithelium desensitization, Were not included in the control group.
나아가, 녹내장, 포도막염, 또는 각막염과 같은 다른 안구 질환이 있는 환자는 양 그룹으로부터 배제되었다.Furthermore, patients with other eye diseases such as glaucoma, uveitis, or keratitis were excluded from both groups.
실시예Example 1-2: 실험 참여자의 특성 1-2: Characteristics of participants
실시예 1-2-1: 망막분지정맥폐쇄(branch retinal vein occlusion, BRVO)Example 1-2-1: Branch retinal vein occlusion (BRVO)
2014년 12월부터 2015년 7월 사이의 연구기간 동안 노인성 백내장 수술과 BRVO의 치료를 위해 베바시주맙주입술이 예정된 환자는 각각 63명(대조군), 및 61명(실험군)이었다. 대조군 중 당뇨병 증상이 있는 2명의 환자, 및 실험군 중 실험 이전에 항-VEGF 또는 레이저 광 응고화 등의 처리를 받은 경험이 있는 11명의 환자는 실험에서 제외되어, 총 실험대상은 대조군 61명, 실험군 50명이었다.During the study period from December 2014 to July 2015, 63 patients (control group) and 61 patients (experimental group) were scheduled for the treatment of geriatric cataract surgery and BRVO, respectively. Two patients with diabetes mellitus in the control group and 11 patients who had undergone anti-VEGF or laser photocoagulation prior to the experiment among the experimental groups were excluded from the experiment and the total subjects were 61 control subjects, 50 people.
대조군과 실험군의 의학적 특징들은 표 1과 같이 나타났다. 구체적으로, 대조군과 실험군의 평균 나이는 각각 61.0 ± 5.9(범위, 49-76)세와 60.5 ± 12.4(범위, 22-84)세로 나타났다. 대조군의 경우, 18%만이 고혈압 증상을 나타낸 반면. 실험군에서는 42%의 높은 비율로 고혈압 증상을 나타냈으며, 실험군의 평균적인 망막분지정맥폐쇄의 증상 지속기간은 3.7 ± 2.5 개월로 확인되었다.The medical characteristics of the control and experimental groups were as shown in Table 1. Specifically, the mean age of the control and experimental groups was 61.0 ± 5.9 (range, 49-76) years and 60.5 ± 12.4 years (range, 22-84). In the control group, only 18% had symptoms of hypertension. In the experimental group, hypertensive symptoms occurred at a high rate of 42%, and the mean duration of symptoms of branch retinal vein occlusion in the experimental group was 3.7 ± 2.5 months.
(개월)Duration of symptoms
(month)
(상기 값들은 특별한 언급이 없으면 평균 ± 표준편차; * 독립적인 t 검정 (t-test); † 카이 제곱 검정(Chi-square test).)(These values are mean ± SD unless otherwise noted.) * Independent t test ( t- test) † Chi-square test.
실시예 1-2-2: 결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy)Example 1-2-2: Polypoidal choroidal vasculopathy
2014년 5월부터 2015년 2월 사이의 연구기간 동안, 노인성 백내장 수술과 PCV의 치료를 위해 베바시주맙주입술이 예정된 환자 중 대조군 10명, 실험군 10명을 선정하였다. 상기 대조군은 당뇨병 증상이 있는 환자를 제외한 것이며, 상기 실험군은 실험 이전에 항-VEGF치료를 받은 경험이 있는 환자를 제외한 것이다.During the study period from May 2014 to February 2015, 10 patients in the control group and 10 patients in the experimental group were selected for the treatment of geriatric cataract surgery and PCV. The control group excluded patients with diabetic symptoms, and the experimental group excluded patients who had received anti-VEGF treatment prior to the experiment.
대조군과 실험군의 의학적 특징들은 표 2와 같이 나타났다. 구체적으로, 대조군과 실험군의 평균 나이는 각각 70.4세와 72.8세로 나타났다. The medical characteristics of the control and experimental groups are shown in Table 2. Specifically, the mean age of the control and experimental groups was 70.4 years and 72.8 years, respectively.
(상기 값들은 특별한 언급이 없으면 평균 ± 표준편차; PCV= 결절맥락막혈관병증 (polypoidal choroidal vasculopathy); BCVA = 최대 교정 시력 활성; CST = 중앙 부분 두께; * 독립적인 t 검정 (t-test); † 카이 제곱 검정(Chi-square test).)PCV = polypoidal choroidal vasculopathy; BCVA = maximal corrected visual acuity; CST = central part thickness; * independent t- test ( t- test); Chi-square test.)
실시예Example 2: 각 환자에서 2: In each patient ANGPTLANGPTL 4와 4 and VEGF의Of VEGF 수준 level
실시예Example 2-1: 방수(Aqueous Humor)의 수집 2-1: Collection of Aqueous Humor
베바시주맵주입술을 수행하기 전 또는 백내장수술을 실시하기 전, 30-게이지 주사바늘의 투베르쿨린 미량 주사기(tuberculin microsyringe)를 사용하여 희석되지 않은 방수 샘플(0.1-0.2 ml)을 천자(limbal paracentesis)에서 채취하였다. 상기 채취된 샘플들을 즉시 멸균 튜브에 옮겼고, 검정에 사용되기 전까지 80°C의 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관하였다.Prior to performing bevacizumab injection or prior to cataract surgery, an undiluted water sample (0.1-0.2 ml) was injected into the limbal paracentesis using a tuberculin microsyringe of 30-gauge needles Respectively. The harvested samples were immediately transferred to a sterile tube and stored in a deep freezer at 80 ° C until used for assay.
실시예Example 2-2: 2-2: ANGPTLANGPTL 4와 4 and VEGF의Of VEGF 분석방법 Analysis method
상업적으로 이용 가능한 ANGPTL 4 ELISA kit (R&D Systems, MN, 미국) 및 인간 VEGF 면역학적 검정(Biosource, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)을 사용한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays)를 통해 상기 실시예 2-1에서 수집된 방수 샘플에서의 ANGPTL 4(angiopoietin-like 4) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 양을 측정하였다. 상기 측정은 생산자가 제공한 설명서에 따라 수행하였다.(Enzyme-linked immunosorbent assays) using a commercially available ANGPTL 4 ELISA kit (R & D Systems, MN, USA) and a human VEGF immunoassay (Biosource, Invitrogen, Carlsbad, ANGPTL 4 (angiopoietin-like 4) and vascular endothelial growth factor (VEGF) levels were measured in the water samples collected at 1. The measurements were performed according to the manufacturer's instructions.
구체적으로, ANGPTL 4 측정을 위해, 항-인간 ANGPTL 4 다클론성의 염소 IgG 항체(DY3485, R&D Systems)로 코팅된 플레이트의 웰에 2배로 희석된 상기 실시예 2-1에서 수집된 방수 샘플을 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후, 세척 버퍼를 사용하여 세척과정을 거친 다음, 100 μl의 검출가능한 항체와 함께 상기 샘플을 추가적으로 2시간 동안 배양하였다. 작업 희석배율의 Streptavidin-Horseradish Peroxidase와 기질 용액을 각 웰에 첨가하였고, 플레이트들을 20분간 상온에서 배양하였다. 반응물에서 색의 세기는 다중 검출기(multi-late reader)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.Specifically, for the ANGPTL 4 measurement, the waterproof sample collected in Example 2-1, which was diluted 2-fold in the well of a plate coated with an anti-human ANGPTL 4 polyclonal goat IgG antibody (DY3485, R & D Systems) Respectively. After incubation for 2 hours, washing was carried out using wash buffer, and then the sample was incubated with 100 [mu] l of the detectable antibody for an additional 2 hours. Working dilution magnification of Streptavidin-Horseradish Peroxidase and substrate solution was added to each well and plates were incubated at room temperature for 20 minutes. The intensity of the color in the reaction was measured at 450 nm using a multi-detector reader.
또한, VEGF 검정을 위해, 항-마우스 VEGF 다클론성의 IgG 항체로 코팅된 플레이트의 웰에 2배로 희석된 상기 실시예 2-1에서 수집된 방수 샘플을 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후, 세척 버퍼를 사용하여 세척과정을 거친 다음, 100 μl의 효소가 결합된 다클론성 항체와 함께 상기 샘플을 추가적으로 2시간 동안 배양하였다. 기질 용액을 첨가하였고, 플레이트들을 30분간 상온에서 배양하였다. 반응물에서 색의 세기는 다중 검출기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.Also for the VEGF assay, the waterproof sample collected in Example 2-1 above, which was diluted 2-fold in the well of a plate coated with anti-mouse VEGF polyclonal IgG antibody, was added. After incubation for 2 hours, washing was carried out using washing buffer, and the sample was incubated with an additional 100 μl of enzyme-conjugated polyclonal antibody for an additional 2 hours. Substrate solution was added and plates were incubated at room temperature for 30 minutes. The intensity of color in the reactants was measured at 450 nm using multiple detectors.
실시예Example 2-3: 각 환자에서 2-3: In each patient ANGPTLANGPTL 4와 4 and VEGFVEGF 수준 사이의 관계 Relationship Between Levels
실시예 2-3-1: 망막분지정맥폐쇄(branch retinal vein occlusion, BRVO)Example 2-3-1: Branch retinal vein occlusion (BRVO)
상기 실시예 2-2에 따라, BRVO 환자에서 ANGPTL 4의 수준을 측정한 결과, 대조군과 실험군의 수용액에서의 평균적인 ANGPTL 4 수준은 각각 1727.0 ± 818.7 pg/ml, 및 16767.5 ± 11995.0 pg/ml으로 나타났다(도 1a). 또한, 주요한 BRVO군의 수용액에서의 평균적인 ANGPTL 4 수준은 23270.8 ± 9449.1 pg/ml로 높게 나타난 반면, 황반 BRVO군에서의 ANGPTL 4의 수준은 3854.6 ± 1552.4 pg/ml으로 낮게 나타났다.According to the above Example 2-2, the ANGPTL 4 levels in the BRVO patients were 1727.0 ± 818.7 pg / ml and 16767.5 ± 11995.0 pg / ml, respectively, in the aqueous solutions of the control and experimental groups (Fig. 1A). In addition, the average level of ANGPTL 4 in the aqueous solution of the major BRVO group was as high as 23270.8 ± 9449.1 pg / ml, while the level of ANGPTL 4 in the macular BRVO group was as low as 3854.6 ± 1552.4 pg / ml.
또한, 상기 실시예 2-2에 따른 VEGF의 수준을 측정한 결과, 대조군과 실험군의 수용액에서의 평균적인 VEGF 수준은 각각 36.9 ± 17.6 pg/ml, 및 105.1 ± 70.7 pg/ml으로 나타났다(도 1b). 또한, 주요한 BRVO군의 수용액에서의 평균적인 VEGF 수준은 132.2 ± 74.2 pg/ml로 높게 나타난 반면, 황반 BRVO군에서의 VEGF 수준은 54.3 ± 11.4 pg/ml으로 낮게 나타났다.As a result of measuring the level of VEGF according to Example 2-2, the average VEGF levels in the aqueous solutions of the control and experimental groups were 36.9 ± 17.6 pg / ml and 105.1 ± 70.7 pg / ml, respectively ). The average VEGF level in the main BRVO group was 132.2 ± 74.2 pg / ml, while the VEGF level in the macular BRVO group was 54.3 ± 11.4 pg / ml.
실시예 2-3-2: 결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy)Example 2-3-2: Polypoidal choroidal vasculopathy
상기 실시예 2-2에 따라, PCV 환자에서 ANGPTL 4 단백질의 수준을 측정한 결과, 대조군과 실험군의 수용액에서의 평균적인 ANGPTL 4 단백질 수준은 각각 1659 ± 858 pg/ml, 및 5219 ± 3490 pg/ml으로 나타났다(도 5a).According to the above Example 2-2, the level of ANGPTL 4 protein was measured in PCV patients. As a result, the average ANGPTL 4 protein levels in the aqueous solutions of the control and experimental groups were 1659 ± 858 pg / ml and 5219 ± 3490 pg / ml (Fig. 5A).
또한, 상기 실시예 2-2에 따른 VEGF의 수준을 측정한 결과, 대조군과 실험군의 수용액에서의 평균적인 VEGF 수준은 각각 42.9 ±7.5 pg/ml 및 75.5 ± 31.4 pg/ml로 나타났다. 이에 대한 Mann-Whitney p=0.001로 나타났다.As a result of measuring the level of VEGF according to Example 2-2, the average VEGF levels in the aqueous solutions of the control and experimental groups were 42.9 ± 7.5 pg / ml and 75.5 ± 31.4 pg / ml, respectively. Mann-Whitney p = 0.001 for this.
실시예Example 3: 안과적 조사 (Ophthalmic Examinations) 3: Ophthalmic Examinations
실시예Example 3-1: 중앙 부분 황반 두께(central subfield macular thickness, CSMT), 황반의 전체 용량(total macula volume, 3-1: central subfield macular thickness (CSMT), total macula volume, TMVTMV ) 및 병변 지역(lesion area)의 측정방법) And lesion area
실험군, 및 대조군의 환자들을 대상으로 시력 검사용 차트(Snellen chart)를 이용한 최대 교정시력검사와 슬릿-램프 생체현미경(slit-lamp biomicroscopy)을 이용한 안저 검사(dilated fundus examination)를 포함한 안과적 조사를 실시하였다. 실험군의 환자들은 유리체 내 주입술(intravitreal injection) 전에 광학 간섭 단층 촬영 (optical coherence tomography)을 실시하여, 자동화된 중앙 부분 황반 두께(central subfield macular thickness, CSMT)와 황반의 전체 용량(total macular volume, TMV)을 측정하였다. Patients in the experimental group and the control group underwent ophthalmologic examination including a maximum corrected visual acuity test using a Snellen chart and a dilated fundus examination using a slit-lamp biomicroscopy Respectively. Patients in the experimental group underwent optical coherence tomography prior to intravitreal injection to assess the ability of automated central macular thickness (CSMT) and total macular volume (TMV) ) Were measured.
구체적으로, 중심와에 위치한 황반 부위의 6 × 6 mm 구역을 조사하였다. 각각의 스캔은 회선당 1024 A (1024 A-scans per line)로 구성하였다. 중심부위의 황반의 윤곽은 중심와의 20 × 20°를 포함하는 25 회선 수평 래스터 스캔(25-line horizontal raster scan)으로 구성된 빠른 황반 용량 조정(fast macular volume preset)을 사용하여 관찰하였다. 자동화되어 실시간으로 측정이 가능하고 9개의 프레임으로 설정된 고속 모드에서 스캔을 관찰하였다. 중심와의 1000 μm 지름의 원안의 망막 평균 두께에 의해 CSMT를 자동적으로 계산하였다(the center circle of the Early Treatment Diabetic Retinopathy Study grid; 소프트웨어 버전 version 5.4.6.0). 스캔이 정확한 위치에서 수행되는 것을 확인하기 위해서 장비의 눈 추적 시스템을 사용하였다. 상기 측정들은 환자 정보를 알지 못한 숙련된 기술자들에 의해 기록되었고, 16 dB 스코어 이상의 높은 양질의 이미지를 선택하였다.Specifically, a 6 × 6 mm area of the macular area located in the central lobe was examined. Each scan consisted of 1024 A (1024 A-scans per line) per line. The contours of the central macula were observed using a fast macular volume preset consisting of a 25-line horizontal raster scan with 20 × 20 ° to the center. The scan was observed in a high-speed mode that was automated and capable of real-time measurement and set to nine frames. CSMT was automatically calculated by the average retinal thickness of the original 1000 μm diameter circle (the center circle of the Early Treatment Diabetic Retinopathy Study grid; software version version 5.4.6.0). We used an equipment eye tracking system to verify that the scan was performed at the correct location. The measurements were recorded by skilled technicians who did not know the patient information and selected high quality images with a 16 dB score or better.
PCV의 환자에게 기준치(baseline)에서 형광 혈관 촬영법(FA) 및 인도시아닌 그린 혈관 촬영법(ICGA)(HRA; Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany)을 수행하였다. FA는 1차 투여 이후 12개월간 반복되었다. 병변 지역(lesion area)은 FA를 기초로 측정되었으며, CNV 사이즈는 ICGA를 기초로 하여 HRA프로그램 (software version 1.7, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)을 통해 측정되었다. 병변 지역(lesion area)은 CNV 누출과 CNV 위치 내에 또는 인접한, 장액성 색소 상피 박리, 출혈, 차단된 형광 중 하나 이상을 포함한다. Fluorescence angiography (FA) and indocyanine green angiography (ICGA) (HRA; Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany) were performed on the baseline of PCV patients. FA was repeated for 12 months after the first administration. The lesion area was measured based on FA and the CNV size was measured using the HRA program (software version 1.7, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) based on ICGA. Lesion areas include one or more of CNV leak and serous pigment epithelial detachment, hemorrhage, blocked fluorescence in or adjacent to the CNV location.
실시예Example 3-2: 3-2: BRVOBRVO 환자에서 In patients ANGPTLANGPTL 4, 및 4, and VEGF의Of VEGF 수준과 중앙 부분 황반 두께(CSMT) 사이의 상관관계 Correlation Between Levels and Central Partial Macular Thickness (CSMT)
상기 실시예 2에서 측정된 ANGPTL 4, 및 VEGF의 수준과 상기 실시예 3-1에 따라 측정된 중앙 부분 황반 두께(CSMT) 사이의 상관관계를 비교하였다. 그 결과, 실험군의 평균 CSMT는 579.1 ± 139.7 μm를 나타냈다. 특히, 주요한 BRVO군의 경우, 625.2 ± 134.4 μm를 나타내, 황반 BRVO군에서 측정된 477.7 ± 90.7 μm보다 더 두꺼운 중앙 부분 황반을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 실험군에서 수용액의 ANGPTL 4 (r = 0.574, P < 0.001), 및 VEGF (r = 0.401, P = 0.006)의 수준이 높을수록 CSMT가 커지는 상관관계가 있음을 확인하였다(도 2a, 및 2b). 특히, VEGF 수준을 위한 조정 후에도, CSMT는 ANGPTL 4의 수준과 유의성 있는 상관도가 있음을 확인하였다(β = 0.606, R2 = 0.304, P = 0.005).The correlation between the level of ANGPTL 4 measured in Example 2 above and the level of VEGF and the central partial macular thickness (CSMT) measured according to Example 3-1 were compared. As a result, the average CSMT of the experimental group was 579.1 ± 139.7 μm. In particular, the major BRVO group showed 625.2 ± 134.4 μm and had a thicker central macular area than the 477.7 ± 90.7 μm measured in the macular BRVO group. It was also confirmed that the higher the level of ANGPTL 4 ( r = 0.574, P <0.001) and VEGF ( r = 0.401, P = 0.006) in the experimental group, the greater the CSMT ). In particular, after adjustment for VEGF levels, CSMT was found to have a significant correlation with the level of ANGPTL 4 (β = 0.606, R 2 = 0.304, P = 0.005).
실시예Example 3-3: 3-3: BRVOBRVO 환자에서 In patients ANGPTLANGPTL 4, 및 4, and VEGF의Of VEGF 수준과 황반의 전체 용량(TMV) 사이의 상관관계 Correlation Between Levels and Total Macular Volume (TMV)
상기 실시예 2에서 측정된 ANGPTL 4, 및 VEGF의 수준과 상기 실시예 3-1에 따라 측정된 황반의 전체 용량(TMV) 사이의 상관관계를 비교하였다. 그 결과, 실험군의 평균 TMV는 12.4 ± 1.9 mm3를 나타냈다. 특히, 주요한 BRVO 군의 경우, 13.0 ± 1.9 mm3를 나타내, 황반 BRVO군에서 측정된 11.3 ± 1.3 mm3보다 더 큰 황반의 전체 용량을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 실험군에서 수용액의 ANGPTL 4 (r = 0.453, P = 0.001), 및 VEGF (r = 0.336, P = 0.022)의 수준이 높을수록 TMV가 커지는 상관관계가 있음을 확인하였다. 특히, VEGF 수준을 위한 조정 후에도, TMV는 ANGPTL 4의 수준과 유의성 있는 상관도가 있음을 확인하였다(β = 0.453, R2 = 0.193, P = 0.035).The correlation between the level of ANGPTL 4 measured in Example 2 above and the level of VEGF was compared with the total macular volume (TMV) measured according to Example 3-1. As a result, the mean TMV of the experimental group was 12.4 ± 1.9 mm 3 . In particular, the main BRVO group showed 13.0 ± 1.9 mm 3 , and it was confirmed that it had a total macular volume greater than 11.3 ± 1.3 mm 3 measured in the macular BRVO group. In addition, it was confirmed that TMV increased as the levels of ANGPTL 4 ( r = 0.453, P = 0.001) and VEGF ( r = 0.336, P = 0.022) In particular, after adjustment for VEGF levels, TMV was found to have a significant correlation with the level of ANGPTL 4 (β = 0.453, R 2 = 0.193, P = 0.035).
실시예Example 3-4: 3-4: PCVPCV 환자에서 In patients ANGPTLANGPTL 4 의4 of 수준과 병변 지역(lesion area) 사이의 상관관계 Correlation between level and lesion area
PCV환자에 대하여, 상기 실시예 2에서 측정된 ANGPTL 4의 수준과 실시예 3-1에 따라 측정된 병변 지역(lesion area) 사이의 상관관계를 비교하였다. 그 결과, 실험군의 ANGPTL4와 lesion area간 상관관계는 rs= 0.600, P=0.016*의 상당한 양적 상관관계를 나타내었다(도 5b).For PCV patients, the correlation between the level of ANGPTL 4 measured in Example 2 above and the lesion area measured according to Example 3-1 was compared. As a result, the correlation between ANGPTL4 and lesion area in the experimental group showed a significant positive correlation of r s = 0.600, P = 0.016 * (Fig. 5B).
실시예Example 4: 모세혈관 4: capillary vessel 비관류Non-ductile (( nonperfusionnonperfusion ) 지역의 측정) Area measurement
실시예Example 4-1: 플루오레세인 혈관 조영법( 4-1: Fluorescein angiography ( FluoresceinFluorescein AngiogrpahyAngiogrpahy )을 사용한 모세혈관 ) 비관류Non-ductile (( NonperfusionNonperfusion ) 지역의 측정) Area measurement
정맥기(45초와 2분 사이)에서, 플루오레세인 혈관 조영법(HRA-2; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)에 의한 이미지를 관찰하였다. 구체적으로, 디지털 데이터 수집 후에, 이미지들을 어도비 소프트웨어(Adobe Systems, Inc, San Jose, CA)로 변환하였다. 모세혈관 비관류 지역을 망막 모세혈관상의 소실부(dropout)로 정의하였다. 비관류 지역의 경계는 면적 측정 기능을 사용하여 원으로 에워 쌌다. 망막의 충혈에 의한 플루오레세인은 망막 사진의 플루오레세인 혈관 조영법 이미지와 비교하여 비관류와 구별하였다. 전체의 이미지 지역을 픽셀로서 계산하였고, 의학적 해석을 위한 목적으로 디스크 지역(disc area, DA)으로 변환하였다. 이를 위해, DA가 2.7 mm2라는 가정에 기초한 범위 인자를 사용하였다. 혈관 조영법의 비관류 지역은 두명의 독립된 망막 전문가에 의해 측정되었다.At the venous phase (between 45 seconds and 2 minutes), images were observed by fluorescein angiography (HRA-2; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany). Specifically, after digital data collection, images were converted to Adobe software (Adobe Systems, Inc., San Jose, Calif.). The capillary nonpenal area was defined as the dropout on the retinal capillary. The boundaries of the nonpermanent region were surrounded by a circle using the area measurement function. Fluorescein by retinal congestion was distinguished from non - perfusion by comparison with fluorescein angiographic image of the retina. The entire image area was calculated as pixels and converted to a disc area (DA) for medical interpretation purposes. For this, a range factor based on the assumption that DA is 2.7 mm 2 was used. The nonvascular region of the angiography was measured by two independent retinal experts.
실시예Example 4-2: 4-2: BRVOBRVO 환자에서 In patients ANGPTLANGPTL 4, 및 4, and VEGF의Of VEGF 수준과 모세혈관 Levels and Capillaries 비관류Non-ductile 사이의 상관관계 Correlation between
상기 실시예 2에서 측정된 ANGPTL 4, 및 VEGF의 수준과 상기 실시예 4-1에 따라 측정된 모세혈관 비관류 지역의 상관관계를 비교하였다. 그 결과, 실험군의 평균 비관류 지역의 크기는 30.1 ± 26.6 DA를 나타냈다. 특히, 주요한 BRVO군의 경우, 42.0 ± 23.4 DA를 나타내, 황반 BRVO군에서 측정된 2.7 ± 2.3 DA보다 더 큰 비관류 지역을 가지고 있음을 확인하였다(도 3a, 내지 3b). 또한, 실험군에서 ANGPTL 4(r = 0.897, P < 0.001), 및 VEGF(r = 0.721, P < 0.001)의 수준이 높을수록 비관류 지역 크기의 크기가 커지는 상관관계가 있음을 확인하였다(도 4a, 및 4b). 특히, VEGF 수준을 위한 조정 후에도, 비관류 지역 크기는 ANGPTL 4의 수준과 유의성 있는 상관도가 있음을 확인하였다(β = 0.818, R2 = 784, P < 0.001).The correlation between the levels of ANGPTL 4 and VEGF measured in Example 2 above and the capillary non-perfusion regions measured according to Example 4-1 were compared. As a result, the mean non - perfusion area of the experimental group was 30.1 ± 26.6 DA. Particularly, the major BRVO group showed 42.0 ± 23.4 DA, and it was confirmed that it has a larger non-perfusion area than the 2.7 ± 2.3 DA measured in the macular BRVO group (FIGS. 3 a to 3 b). In addition, it was confirmed that there was a correlation that the size of the non-vascular region increased as the level of ANGPTL 4 ( r = 0.897, P <0.001) and VEGF ( r = 0.721, P <0.001) , And 4b). Particularly, after adjustment for VEGF levels, the non-perfusion region size was found to be significantly correlated with the level of ANGPTL 4 (β = 0.818, R 2 = 784, P <0.001).
실시예Example 5: 통계적 분석 5: Statistical analysis
통계적 분석은 윈도우 버전의 SPSS V.18.0 (SPSS, Inc, Chicago, Illinois, USA)에 의해서 수행하였다. 결과값은 평균 ± 표준 편차 (standard deviation (SD))로 표시하였다. 독립적인 t 검정 (t-test)과 카이 제곱 검정 (Chi-squared tests)을 사용하여 BRVO 그룹 및 PCV 그룹과 대조 그룹을 비교하였다. 수용액의 생물지표(biomarker) 농도와 NPA와 TMV를 포함한 표현형 사이의 관계를 평가하기 위해, 피어슨 상관계수와 95% 신뢰도 간격으로 계산하였다. 수용액의 VEGF 농도의 조정을 위해 다중 선형 회귀분석 (Multiple linear regression analysis)을 사용하였다. 0.05 미만의 P값은 통계적 유의도를 나타내기 위해 고려하였다.Statistical analysis was performed with a Windows version of SPSS V.18.0 (SPSS, Inc, Chicago, Illinois, USA). Results were expressed as mean ± standard deviation (SD). Using the independent t-test (t -test) and chi-square test (Chi-squared tests) were compared to the control group and the group and BRVO PCV group. To evaluate the relationship between biomarker concentrations of aqueous solutions and phenotypes including NPA and TMV, Pearson correlation coefficients and 95% confidence intervals were calculated. Multiple linear regression analysis was used to adjust the VEGF concentration in aqueous solution. P values less than 0.05 were considered to indicate statistical significance.
상기 결과들은, 결절맥락막혈관병증과 ANGPTL 4의 수준간의 관계를 보여주며, ANGPTL 4의 수준을 측정하여 결절맥락막혈관병증을 진단할 수 있음을 시사한다.These results show the relationship between the levels of ANGPTL 4 and tuberculous choroidal vasculopathy, suggesting that the levels of ANGPTL 4 can be measured to diagnose choroidal vasculopathy.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.
Claims (13)
A composition for the diagnosis of choroidal vascular disease of the choroid, which comprises an agent for measuring the level of the mRNA of the ANGPTL 4 (Angiopoietin-like 4) gene or the protein expressed therefrom.
The composition according to claim 1, wherein the agent for measuring the level of the protein of the ANGPTL 4 gene comprises an antibody specific for the protein, or an aptamer.
2. The composition of claim 1, wherein the composition further comprises an agent that measures the mRNA level of a vascular endothelial growth factor (VEGF) gene or the level of a protein expressed therefrom.
A kit for the diagnosis of choroidal vascular disease of the choroid, comprising the composition according to any one of claims 1 to 3.
5. The kit according to claim 4, wherein the kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit or a protein chip kit.
상기 측정된 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 결절맥락막혈관병증의 진단을 위한 정보제공방법.
Measuring the level of expression of the ANGPTL 4 protein in a biological sample separated from an individual suspected of having choroidal vasculopathy (step 1); And
And comparing the measured protein expression level with a protein expression level of a normal control sample (second step).
7. The method of claim 6, wherein the measuring step comprises contacting the sample with an ANGPTL4 protein or an antibody or aptamer that specifically binds to a fragment of the protein.
7. The method according to claim 6, wherein the biological sample is selected from the group consisting of blood, eye cells, eye tissue, and leakage.
8. The method of claim 7, wherein the antibody is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
10. The method according to any one of claims 6 to 9, wherein the method further comprises the step of determining that the expression level of the ANGPTL4 protein measured in the biological sample is higher than that of the normal control sample, Step 3). ≪ / RTI >
상기 측정한 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계(제2단계)를 포함하는, 결절맥락막혈관병증 치료제 스크리닝 방법.
Treating the candidate substance for treating retinal damage disease with a biological sample separated from an individual suffering from the disease (step 1); and measuring the degree of expression of ANGPTL 4 (step 1); And
And comparing the measured degree of expression with the degree of expression of a control group not treated with the candidate substance (second step).
12. The screening method according to claim 11, wherein the biological sample is selected from the group consisting of blood, eye cells, eye tissue, and leakage.
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