KR20170040177A

KR20170040177A - Composition for preventing and treating dementia comprising Sagassum serratifolium extract

Info

Publication number: KR20170040177A
Application number: KR1020170044386A
Authority: KR
Inventors: 김형락; 오선지; 김재일; 최준형
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2017-04-12
Also published as: KR101806068B1

Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia containing a Sargassum serratifolium C. Agardh extract as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a composition containing a Sargassum serratifolium C. Agardh extract and a compound isolated from the extract as active ingredients. The composition of the present invention ensures stability without causing cytotoxicity, is capable of inhibiting expression of protein and gene inflammation-associated factors, and excellently suppresses production of beta-amyloid which is a causative factor for dementia, thereby being applicable as materials for functional foods and drugs for preventing, ameliorating, and treating dementia.

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for preventing and treating dementia,

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 항치매용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for anti-dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient.

치매는 우리나라 65세 이상의 노령인구 약 8.2~10.8%에서 나타날 정도로 빈번히 발생되고 있으며, 인구의 급속한 고령화와 함께 심각한 사회문제로 대두되고 있는 대표적인 노년기 질환으로 후천적으로 지적능력을 상실하고 인지장애, 행동 및 성격의 점진적 황폐화라는 임상증상을 나타내는 퇴행성질환이다. 특히, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 가장 많은 유형의 치매로 대뇌 피질(cortex)이나 해마(hippocampus)에 생기는 뇌위축과 노인반(senile plaque), 신경섬유다발(neurofibrillary tangles) 그리고 신경세포의 과립공포변성(granulovacuolar degeneration), 히라노체(Hirano body) 등의 조직학적 소견을 특징으로 하며, 베타 아밀로이드(β-amyloid, Aβ)는 노인반의 주요 구성성분으로 AD가 발생하는 중요한 원인으로 추정되고, 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 발생시켜 산화적 스트레스(oxidative stress)로 인한 신경세포사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다.Dementia occurs frequently in the elderly population aged 65 years or older in Korea, ranging from 8.2% to 10.8%. It is a representative geriatric disease that has become a serious social problem with rapid aging of the population, resulting in loss of intellectual ability, It is a degenerative disease that shows clinical signs of progressive devastation of personality. In particular, Alzheimer's disease (AD) is the most common type of dementia, which is caused by the cerebral cortex or hippocampus, the neurons in the brain, the senile plaque, the neurofibrillary tangles, It is characterized by granulovacuolar degeneration and Hirano body histologic features. Beta amyloid (Aβ) is a major constituent of the elderly, and it is presumed to be an important cause of AD. It is known that reactive oxygen species (ROS) are generated to cause nerve cell death due to oxidative stress.

주요 증상은 뇌세포파괴로 인한 인지기능, 기억력 감퇴로 서서히 진행되는 경우 사망에 이르게 된다. 40-65세 사이에 발병하는 경우 early-onset 또는 가족형 AD(familial AD), 65세 이상에서 발병되는 경우 late-onset 또는 산발성(sporadic AD)로 분류 된다. 가족형은 유전적 요인이 많이 작용한다. 일부 노화로 인한 신경퇴행성으로 발병하여 진행과정이 느린 경우를 노인성 치매(senile dementia)라고 하며 AD는 진행성으로 노인성 치매보다 증상의 진행속도가 빠르다.The main symptom is cognitive function due to brain cell destruction, and death is caused by gradual decline in memory. It is classified as early-onset or familial AD between the ages of 40 and 65 years, late-onset or sporadic AD when it is aged over 65 years. Genotype has a lot of genetic factors. Senile dementia is called senile dementia. It is progressive and has a faster rate of progression than senile dementia.

한편, 이와 같은 병인과 관련하여 지금까지 개발된 치매의 치료 또는 개선을 위한 약제로는 반응성 산소종에 의한 뇌 세포의 파괴를 억제하는 비타민 E와 셀레질린(Selegiline)과 같은 항산화제나 타크린(Tacrine), 아리셉트(Aricept) 및 엑셀론(Exelon)과 같은 아세틸콜린 분해효소 억제제가 개발되어 있다.Meanwhile, as a medicament for treating or improving dementia developed so far in relation to such a pathogen, antioxidants such as vitamin E and selegiline which inhibit the destruction of brain cells by reactive oxygen species, tacrine ), Aricept (Aricept) and exelon (acetylcholinesterase inhibitors) have been developed.

그러나, 이러한 약제들은 부작용이 유발될 수 있으며, 그 효능이 우수하지 못한 단점이 있다. 또한, 현재 치매와 관련된 연구가 국내·외적으로 많이 시행되고 있지만 아직까지 뚜렷한 효능을 나타내는 새로운 치료제를 개발한 사례는 없으며, 이러한 질병예방에는 섭취식품의 영향이 가장 큰 비중을 차지함에도 불구하고 식품학적 접근을 한 연구는 미흡한 실정이다.However, these medicines may cause side effects, and their efficacy is not excellent. In addition, although studies related to dementia are currently being carried out domestically and internationally, there have been no cases in which a new therapeutic agent has been developed which shows a remarkable efficacy. In spite of the fact that the influence of the foods consumed is the largest, There is a lack of research on approaches.

대한민국 공개특허 제2005-0023711호Korea Patent Publication No. 2005-0023711

이에 본 발명자들은 치매를 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 천연물 소재의 신규 의약품 및 기능성 식품을 연구하던 중, 톱니모자반 추출물이 치매를 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by studying new medicines and functional foods of natural materials capable of effectively preventing and treating dementia, and confirming that dentifrice extract can effectively prevent and treat dementia.

따라서 본 발명의 목적은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or ameliorating dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물일 수 있다. In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient. In one embodiment of the present invention, the sawtooth moth extract may be water or an extract obtained using an organic solvent.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the organic solvent may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane .

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the extract may contain saccharolinol, sagaquinoxanic acid or a saghydroquinoic acid compound.

또한, 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다. .The present invention also provides a health functional food for preventing or ameliorating dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient. .

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sawtooth moth extract may be water or an extract obtained using an organic solvent.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the extract may contain saccharumhenol, sagaquinoxanic acid or a saghydroquinoic acid compound.

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 톱니모자반 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서 이들 조성물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있으며, 염증 관련 인자들의 유전자 및 단백질 발현을 억제할 수 있고, 치매의 원인으로 알려진 베타 아밀로이드의 생성을 억제하는 효과가 우수하여, 치매를 예방, 개선 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성식품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient. Specifically, the present invention relates to a composition comprising an extract of Sawtooth mellifera and a compound isolated from the extract as an active ingredient, wherein the composition is stable without inducing toxicity to cells, can inhibit gene expression and protein expression of inflammation-related factors , The effect of inhibiting the production of beta amyloid, which is known to be the cause of dementia, is excellent, and thus it can be utilized as a material for pharmaceuticals and functional foods that can prevent, improve and treat dementia.

도 1은 톱니모자반 추출물을 농도별로 처리한 후, 세포에 미치는 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 톱니모자반 추출물을 농도별로 처리한 후, 산화질소의 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 톱니모자반 추출물을 농도별로 처리한 후, 프로그라스탄딘 E₂ (PGE₂)의 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 톱니모자반 추출물의 종양괴사인자인 (TNF-α) 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 톱니모자반 추출물의 인터루킨 6 (IL-6) 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 톱니모자반 추출물의 iNOS 및 COX-2의 발현 저해 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 톱니모자반 추출물의 iNOS 및 COX-2의 발현 저해 정도를 mRNA 수준에서 확인하기 위해 PCR 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 톱니모자반 추출물의 TNF-a 및 IL-6의 발현 저해 정도를 mRNA 수준에서 확인하기 위해 PCR 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 톱니모자반 추출물이 처리된 세포의 세포질 및 핵 추출물을 대상으로 IkB-α의 인산화 및 NF-κB의 핵내로의 이동 억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 톱니모자반 추출물의 LPS에 의한 MAPKs 및 Akt활성화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 톱니모자만 추출물, Sargahydroquinoic acid(SHA), Sargaquinoic acid (SQA)및 Sargachromenol(SCM) 각각에 대한 Abeta 40 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 사가크로멘올(Sargachromenol) 화합물의 산화질소 생성, PGE₂ 생성 및 세포 독성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 사가크로멘올(Sargachromenol) 화합물의 iNOS 및 COX-2의 발현 저해 정도를 단백질 수준 및 mRNA 수준에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 사가크로멘올(Sargachromenol) 화합물의 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 발현 억제 정도를 단백질 수준 및 mRNA 수준에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 사가크로멘올(Sargachromenol) 화합물의 IkB-α 분해 억제효과와 NF-κB의 핵내로의 이동 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 17은 사가크로멘올(Sargachromenol) 화합물의 MAPKs와 Akt 단백질의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 사가퀴노익산(Sargaquinoic acid) 화합물의 산화질소 생성, PEG₂ 생성 및 세포독성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 사가퀴노익산(Sargaquinoic acid) 화합물의 iNOS 및 COX-2의 발현 저해 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 톱니모자반 분획물(1번 분획물)을 대상으로 1차 분획화한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 21은 톱니모자반 분획물(1번 분획물)을 대상으로 2차 분획화한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 22는 컬럼크로마토그래피로 정제한 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 23은 톱니모자반 분획물(2번 분획물)을 대상으로 1차 분획화한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 24는 톱니모자반 분획물(2번 분획물)을 대상으로 2차 분획화한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 25는 컬럼크로마토그래피로 정제한 사가크로멘올(Sargachromenol)의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 26은 톱니모자반 분획물(2번 분획물)을 대상으로 2차 분획화한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 27은 컬럼크로마토그래피로 정제한 사가퀴노익산(Sargaquinoic acid)의 크로마토그램을 나타낸 것이다.Fig. 1 shows the result of measuring the cytotoxicity on cells after treating the extracts of Tooth mothballs by concentration.
Fig. 2 shows the results of analysis of inhibition of nitric oxide production after treatment of the extracts of Sawtooth mildew by concentration.
FIG. 3 shows the results of analysis of inhibition of the production of progranthanide E ₂ (PGE ₂ ) after treatment of the extract of Tooth mothballs by concentration.
FIG. 4 shows the results of analysis of inhibition of tumor necrosis factor (TNF-α) production by the extract of Sawtooth mildew.
FIG. 5 shows the results of analysis of inhibition of interleukin 6 (IL-6) production by Saw Mab Bark extract.
FIG. 6 shows the results of western blot analysis of inhibition of expression of iNOS and COX-2 in Saw Mab Bark Extract.
FIG. 7 shows the results of PCR performed in order to confirm the degree of iNOS and COX-2 expression inhibition by the mRNA level of the Sawtooth mildew extract.
FIG. 8 shows the results of PCR performed to confirm the degree of inhibition of expression of TNF-a and IL-6 in mothballs extract at the mRNA level.
FIGS. 9 and 10 show the results of analysis of the degree of phosphorylation of IkB-.alpha. And the inhibition of migration of NF-.kappa.B into the nuclear cytoplasmic and nuclear extracts of cells treated with Sawtooth mildew extract.
11 shows the results of western blot analysis of the effects of LPS on MAPKs and Akt activation in Saw Moth extract.
FIG. 12 shows the results of analysis of inhibition of Abeta 40 production in each of the extracts of sawtooth bark, Sargahydroquinic acid (SHA), Sargaquinoic acid (SQA) and Sargachromenol (SCM) of the present invention.
Figure 13 shows the production of nitric oxide in the Sargachromenol compound, PGE ₂ And the degree of cytotoxicity was analyzed.
14 shows the results of confirming the degree of inhibition of iNOS and COX-2 expression of sargachromenol compound at protein level and mRNA level.
Fig. 15 shows the results of confirming the degree of suppression of TNF-a and IL-6 expression, which are inflammatory cytokines of sargachromenol compound, at the protein level and mRNA level.
Fig. 16 shows the results of inhibiting the IkB-alpha decomposition of sargachromenol compound and inhibiting the migration of NF-kB into the nucleus.
Fig. 17 shows the results of analysis of the effect of sagavirromolol compound on the phosphorylation of MAPKs and Akt protein.
18 shows the results of analysis of nitric oxide production, PEG ₂ production and cytotoxicity of sargaquinoic acid compound.
19 shows the results of Western blot analysis of the degree of inhibition of iNOS and COX-2 expression of sargaquinoic acid compound.
FIG. 20 shows a chromatogram obtained by first fractionating the fraction (fraction No. 1) of the sawtooth moth.
21 shows a chromatogram obtained by second fractionation of the fraction of Tooth Paecil (fraction No. 1).
22 shows chromatograms of sagas hydroquinonic acid purified by column chromatography.
FIG. 23 shows a chromatogram obtained by first fractionating a fraction of Tooth Mae (fraction No. 2).
Fig. 24 shows a chromatogram obtained by second fractionation of the fraction of Tobacco moth (fraction 2).
25 shows the chromatogram of Sargachromenol purified by column chromatography.
Fig. 26 shows chromatograms obtained by second fractionation of the saphenicum fraction (fraction No. 2).
27 shows the chromatogram of Sargaquinoic acid, which was purified by column chromatography.

본 발명은 톱니모자반 추출물이 항치매 효과가 있음을 규명한 톱니모자반 추출물의 신규 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a new use of a Sawtooth mildew extract which has been found to have anti-dementia effect.

일반적으로 치매란 앞서 종래기술에서도 기재한 바와 같이, 성장기에는 정상적인 지적 수준을 유지하다가 후천적으로 인지기능의 손상 및 인격의 변화가 발생하는 질환을 말한다. 치매는 다양한 원인에 의해 뇌신경이 파괴됨으로써 기억력장애, 언어능력 장애, 변뇨실금, 편집증적 사고, 실어증과 같은 정신기능의 전반적인 장애가 나타나며, 진행되는 과정에서 우울증이나 인격장애, 공격성 등의 정신의학적 증세가 동반되기도 한다. 의학계에서는 노화와 유전에 의한 원인성에 주목하고 있지만, 아직 정확한 발병원인과 치료법은 규명되지 않은 상태이다. 치매로 분류되는 질환은 이에 한정되지 아니하나 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 노인성 치매 및 두부손상에 의한 치매가 포함될 수 있고, 본 발명에서 제공하는 조성물이 치료, 예방 및 개선할 수 있는 질환으로 이러한 질환을 포함할 수 있다.Generally, dementia refers to a disease in which a normal cognitive level is maintained during the growth period, and damage or change in personality occurs as a result, as described in the prior art. Dementia is caused by a variety of causes, such as memory disorders, language impairment, mental retardation, paranoid thinking, and aphasia, and it can be seen that psychiatric symptoms such as depression, personality disorder, It is also accompanied. In the medical world, attention is paid to the cause of aging and genetics, but the precise cause of the disease and its treatment have not yet been identified. Diseases classified as dementia include, but are not limited to, Alzheimer's dementia, cerebrovascular dementia, senile dementia, and dementia caused by head injury, and diseases in which the composition provided by the present invention can treat, prevent and improve. &Lt; / RTI >

본 발명에서는 새로운 치매 치료제의 소재로서 톱니모자반 추출물에 주목하였는데, 톱니모자반은 조간대에서 점심대에 걸쳐 생육하는 식물로서 1∼4m인 다년생 대형 갈조류이다. 뿌리는 지름 4∼5cm로 원뿔상이고, 고무와도 같으며 나이테가 있고, 줄기는 원주상으로 짧고 다수의 중심가지로 나뉘며 편압되어 있다. 또한 줄기의 양 가장자리가 얇고, 세로로 중륵처럼 한쪽으로 융기하며, 가장자리에서 짧은 가지를 내고 있으며 줄기잎은 기부로 향하여 있고, 가장자리에 2중으로 된 톱니가 있으며, 기포는 둥근 모양에 가까우며 그 꼭대기에 관엽(冠葉) 또는 가시 모양의 돌기가 있다. 특히 우리나라의 남해안과 제주에 생육하는 것으로 알려져 있으며, 지질강하, 혈압강하, 방사성 동위원소 배출작용에 대한 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐, 아직까지 치매와 관련된 작용에 대해서는 알려진 바가 없다.In the present invention, attention has been paid to the extract of Sawtooth moth as a new dementia treatment agent. The sawtooth moth is a perennial broad-leaved brown algae having a length of 1 to 4 m, which grows in the tidal flat at the lunch stand. The roots are 4 ~ 5cm in diameter, conical, rubbery, and have rings. The stem is short in the circumference and divided into a number of central branches. In addition, the edges of the stem are thin, vertically rising like a midrible, with short branches at the edge, stem leaves are pointing toward the base, there are double teeth at the edge, the bubble is round and the top There are 冠葉 (冠葉) or spiny protuberances. Especially, it is known to grow in the southern coast of Korea and Jeju. It is known that it has functions for lipid lowering, hypotension, and radioactive isotope release. However, there is no known effect on dementia.

이러한 점에서 본 기술은 톱니모자반 추출물이 항염 활성이 우수하고 세포에 독성을 유발시키지 않으며 치매의 원인으로 알려진 베타 아밀로이드 생성을 억제하는 효과가 우수하여 치매 치료를 위한 의약품 소재 및 기능성 건강식품 소재로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.In this regard, the present technology is excellent in anti-inflammatory activity, does not cause toxicity to cells, and has an excellent effect of inhibiting the production of beta-amyloid, which is known to be a cause of dementia, so that it can be used as a medicine material and functional health food material for treating dementia I can see that it can.

특히 "β-아밀로이드(Amyloid β peptide, Aβ)"란 아밀로이드 전구 단백질로부터 AD특이적 단백질 분해효소 작용에 의해 생성된 단백질로, 이는 뇌 조직에 침착되면서 뇌세포의 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 기억 등의 기능을 담당하는 대뇌의 신경세포가 변성하여 대량으로 사멸하는 경우 Aβ가 침착한 '노인 반점', '신경 원섬유 변화'라고 하는 섬유 모양의 구조가 신경 세포 내에서 보이며, 알츠하이머의 경우 신경 세포는 세포사멸기작에 의해 사멸하는 것으로 보고되어 있다. In particular, "Amyloid β peptide (Aβ)" is a protein produced by the action of AD-specific protease from amyloid precursor protein, which is known to cause death of brain cells upon deposition in brain tissue. In the case of cerebral neurons degenerating and mass-destroying cerebral neurons that are responsible for memory functions, there is a fiber-like structure called 'senile spots' and 'neuron fiber changes' in which neurons are deposited, and in the case of Alzheimer's Neurons have been reported to be killed by apoptotic mechanisms.

한편, 본원발명의 톱니모자반 추출물은 이러한 Aβ 단백질이 뇌세포에서 생성 및 발현되는 것을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였고, 다른 종류의 모자반에 비해 톱니모자반 추출물이 그 효과가 더 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.On the other hand, it was confirmed that the Saw Mab Bark Extract of the present invention has an effect of reducing the production and expression of such A? Protein in brain cells, and it was confirmed that the Saw Mab Bark Extract is more effective than other kinds of Mab Moth .

그러므로 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.Therefore, the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia comprising an extract of Tooth mothballs as an active ingredient.

상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 이때 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용매를 사용할 수 있다.The extract of Tooth mackerel can be extracted with water or an organic solvent. The organic solvent that can be used in this case includes, but is not limited to, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, Ethyl acetate, methylene chloride, hexane, and cyclohexane can be used.

또한, 본 발명의 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물이 함유되어 있으며, 이들 화합물 역시 항염활성이 우수하며 항치매 효과를 가지고 있다는 것을 실험을 통해 확인할 수 있었다. In addition, it has been confirmed through experiments that the extract of the present invention contains saccharumolene, sagaquinoxanic acid or a saghydroquinoic acid compound, and these compounds also have excellent anti-inflammatory activity and anti-dementia effects.

그러므로 본 발명은 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.Therefore, the present invention can provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of dementia comprising, as an active ingredient, a compound of Saccharomerol, Sagaquinoxanic acid or Sasa Hydroquinoxic acid.

본 발명에 따른 상기 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다. The saccharide, sagaquinoxanic acid or saghydroquinoic acid compound according to the present invention may be used in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt. The salt is preferably an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and the free acid may be an organic acid or an inorganic acid. The organic acids include, but are not limited to, citric, acetic, lactic, tartaric, maleic, fumaric, formic, propionic, oxalic, trifluroacetic, benzoic, gluconic, methosulfonic, glycolic, succinic, Glutamic acid and aspartic acid. The inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid.

본 발명에 따른 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있는데, 바람직하게는 톱니모자반 추출물, 더욱 바람직하게는 톱니모자반의 주정추출물로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다. 상기 추출물로부터 이들 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다. The saccharide, sagaquinoxanic acid or saghydroquinoic acid compound according to the present invention can be isolated from nature or can be prepared by a chemical synthesis method known in the art, and preferably a sphagnum moth extract, more preferably, And may be those isolated and purified from the extract. Separation and purification of these compounds from the extract can be carried out by using column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) packed with various synthetic resins such as silica gel and activated alumina, Can be used. However, the method of extracting and separating and purifying the active ingredient is not necessarily limited to the above-mentioned method.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 톱니모자반 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 치매 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.In addition, the composition according to the present invention may comprise a pharmaceutically effective amount of a serrate extract alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. A pharmaceutically effective amount as used herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat the symptoms of dementia.

본 발명에 따른 톱니모자반 추출물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 치매 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.The pharmacologically effective amount of the extract according to the present invention is 0.5 to 100 mg / day / kg body weight, preferably 0.5 to 5 mg / day / kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately varied depending on the degree of dementia symptoms, the age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the patient.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. Also, the pharmaceutically acceptable hereinabove refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to a human. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다. In addition, the compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal. The formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatine capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.

본 발명에 따른 치매 증상의 예방 및 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 치매 증상의 예방 및 치료용 조성물은 치매 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 화합물들과 병행하여 투여할 수 있다.The composition for preventing and treating dementia according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or muscular, and the dose of the active ingredient may be appropriately determined depending on the administration route, age, sex, The severity of the patient, and the like. In addition, the composition for preventing and treating symptoms of dementia of the present invention may be administered in combination with compounds having an effect of preventing, ameliorating or treating dementia symptoms.

나아가 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 세포에 처리시, 세포 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있음을 확인하였고, 치매 증상을 효과적으로 예방, 치료 및 개선할 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.Further, it has been confirmed that the extract of Tooth mackerel according to the present invention does not induce cytotoxicity upon treatment with cells and is stable, and it is possible to effectively prevent, treat and ameliorate symptoms of dementia. Therefore, the composition of the present invention is very stable Feature.

따라서 본 발명의 치매 예방 및 치료용 조성물은 치매 증상의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물을 치매 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다. Therefore, the composition for the prevention and treatment of dementia of the present invention can be added to foods for the purpose of preventing or improving dementia symptoms. Therefore, the composition of the present invention can be used as a food composition for preventing and improving symptoms of dementia.

그러므로 본 발명의 치매 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물은 치매 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.Therefore, the composition for food for the prevention and improvement of dementia of the present invention can be easily utilized as a food which is effective for prevention and improvement of symptoms of dementia, for example, as a raw material, additives, food additives, functional foods or beverages of foods.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다. As used herein, the term " food " means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, preferably a state capable of being directly eaten through a certain degree of processing, , Food, food additives, functional foods and beverages.

본원발명에 따른 치매 증상의 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다. Examples of foods to which the composition for preventing or ameliorating symptoms of dementia according to the present invention can be added include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complexes, and functional foods. In addition, in the present invention, the food may include special nutritive foods (e.g., crude oil, spirits, baby food, etc.), meat products, fish meat products, tofu, mackerel, noodles (Such as soy sauce, soybean paste, kochujang, mixed potatoes), sauces, confectionery (eg, snacks), candies, chocolate, gums, ice cream, milk products (eg, fermented milk, cheese, But are not limited to, pickled foods (various kinds of kimchi, pickles, etc.), beverages (e.g., fruit drinks, vegetable beverages, beverages, fermented beverages and the like) and natural seasonings (e.g. The food, beverage or food additive may be prepared by a conventional production method.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. The above-mentioned " functional food " refers to a food group which is imparted with added value to function and express the function of the food by physical, biochemical or biotechnological techniques, or to control the bio-defense rhythm of the food composition, Refers to a food prepared by processing a body so as to sufficiently express the body's control function on the body, such as recovery, and the like. Specifically, it may be a health functional food. The functional food may include a food-acceptable food-aid additive, and may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the production of functional foods.

또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 치매 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. In the present invention, the term " beverage " means a general term for drinking or enjoying a taste, and includes a functional beverage. The beverage contains a composition for preventing and alleviating the symptoms of dementia as an essential ingredient at the indicated ratio, and there is no particular limitation to the other ingredients, and it may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient .

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 치매 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. Furthermore, the food containing the composition for prevention and improvement of symptoms of dementia of the present invention in addition to the above-mentioned invention may be used in various foods, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers , Chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, The components may be used independently or in combination.

본원발명의 치매 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.In the food containing the composition for preventing and alleviating dementia symptoms of the present invention, the amount of the composition according to the present invention may be 0.001% by weight to 90% by weight, preferably 0.1% And may be contained in an amount of 0.001 g to 2 g, preferably 0.01 g to 0.1 g, based on 100 ml of a beverage. However, for the purpose of health and hygiene or for the purpose of health control The active ingredient may be used in an amount in excess of the above range because there is no problem in terms of safety. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the above range.

나아가 본 발명의 조성물이 적용할 수 있는 질환인 치매는 퇴행성 뇌신경질환으로서, 사람의 정신(지적) 능력과 사회적 활동을 할 수 있는 능력의 소실을 말하며, 어떤 사람의 일상생활의 장애를 가져올 정도로 충분히 심할 때 이를 치매라고 한다. 즉 치매는 그 자체가 어떤 활동을 이야기하는 진단명이 아니라 단지 특정한 증상들이 나타나서 어떤 기준을 만족시키는 경우를 지칭하는 하나의 증후군이다. 치매는 여러가지 질환들에 의해 나타나는 병적 증상으로, 미만성 루이소체 치매, 두부 외상성 치매 등 매우 다양한 질환들에 의해서 치매가 나타날 수 있는데, 알쯔하이머병, 혈관성 치매, 미만성 루이소체 치매들은 치매의 증상으로만 나타날 수 있으며, 어떤 치매의 원인 질환들은 여러가지 나타나는 증상들 중 한 가지로 치매가 나타나기 때문에 이런 경우는 치매 이외의 다른 증상들을 살펴보면 쉽게 진단을 내릴 수 있는 경우도 많다. Furthermore, dementia, which is a disease to which the composition of the present invention can be applied, is a degenerative brain disease, which means loss of a person's mental (intellectual) ability and ability to perform social activities, and is sufficient In severe cases, it is called dementia. In other words, dementia is not a diagnosis that tells itself about an activity, but rather a syndrome that refers to cases in which certain symptoms appear and meet certain criteria. Alzheimer's disease, vascular dementia, and diffuse rheumatoid dementia are manifested by symptoms of dementia, such as dementia, dyslipidemia, dementia, traumatic dementia, and dementia. In some cases, dementia is one of the various manifestations of the cause of some dementia. In such cases, it is often easy to diagnose other symptoms other than dementia.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that the following examples are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

톱니모자반의 주정 추출물 제조Manufacture of alcohol extracts from teapot

본 발명에 사용한 톱니모자반은 부산시 기장군에서 채집하여 사용하였고, 톱니모자반은 음지 또는 양지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 2 kg과 주정(95% 에탄올)을 각각 8 L씩 넣고 70℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각기가 장착된 추출기로 추출한 후 여지 (와트만사, 미국) 또는 마이크로필터로 감압 여과하고, 여과된 추출물을 진공회전농축기로 40℃에서 용매를 제거한 다음 추출된 잔사로서 톱니모자반조추출물을 수득하였으며, 이 중 일부를 취하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.Tooth Sargassum used in the present invention was used to collect from the Busan Gijang County, tooth Sargassum is then air-dried in the shade or note grinding to powder 2 kg and ethanol (95% ethanol) into each by 8 L of obtained during the 70 ℃ 3 sigan The extract was filtered through a filter paper (Wattmann, USA) or a microfilter, and the filtered extract was subjected to solvent removal at 40 ° C in a vacuum rotary condenser. Then, An extract was obtained, and some of them were subjected to the following experiment.

<< 실험예Experimental Example 1> 1>

톱니모자반 주정 추출물의 세포독성 분석Cytotoxic Analysis of Extracts of Spirulina japonica

상기 실시 예 1에서 얻은 본 발명의 톱니모자반 주정추출물을 마우스 뇌세포인 BV-2 microglia 세포에 처리하여 본 발명의 추출물에 대한 세포독성을 측정하였다. 이를 위해 BV2 microglia 세포 (1 × 10⁴ cells/well)를 DMEM 배지에서 배양하고, 여기에 톱니모자반 주정추출물을 농도별(0, 0.4, 1.0, 2.0ug/ml)로 처리한 다음 2시간 배양하고 LPS (1 ug/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 100㎕와 MTS 용액 5㎕를 넣고 1시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포 독성 정도를 분석하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. The extract of Tohmae mushroom extract of the present invention obtained in Example 1 was treated with mouse brain cell BV-2 microglia to determine the cytotoxicity of the extract of the present invention. For this purpose, BV2 microglia cells (1 × 10 ⁴ cells / well) were cultured in DMEM medium, and then treated with 0, 0.4, 1.0 and 2.0 μg / LPS (1 ug / ml) and cultured for 24 hours. 100 μl of the culture medium and 5 μl of the MTS solution were added to a 96-well plate and incubated for 1 hour. The cytotoxicity was analyzed by measuring the absorbance at 490 nm using a microplate reader. The measurement value is an average value of three repeated experiments, and the results are shown in Fig.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, BV-2 microglia 세포에 대한 톱니모자반 주정 추출물의 세포 독성은 2.0 μg/ml의 농도까지는 나타나지 않는 것으로 나타났다(도 1 참조).As a result of the analysis, as shown in Fig. 1, the cytotoxicity of the extract of the teaspoonfulum mushroom extract on BV-2 microglia cells did not show up to a concentration of 2.0 μg / ml (see FIG. 1).

<< 실험예Experimental Example 2> 2>

LPSLPS 로 유발되는 Induced by NONO 생성에 대한 톱니모자반 주정 추출물의 영향분석 Analysis of the Effect of Sawtooth Mulberry Extract on the Production

BV-2 microglia 세포 (5.0 × 10⁴ cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 96 well plate에 접종하고, 상기 실시예 1에서 얻은 톱니모자반 주정추출물을 표시된 농도별로 처리하고 2시간 뒤 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO² ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphtyl-ethylenediamine in 5% phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO₂)를 serial dilution (연속 희석)하여 얻었고, 그 결과는 하기 도 2에 나타내었다. BV-2 microglia cells (5.0 × 10 ⁴ cells / well) were inoculated into 96-well plates using DMEM medium, treated with the indicated concentrations of the extracts of the sawtooth moths obtained in Example 1, and 2 hours later, LPS / ml) and cultured for 24 hours. The amount of NO produced was measured in the form of NO ² ^- present in cell culture medium using Griess reagent. 100 μl of the cell culture supernatant and 100 μl of Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphtyl-ethylenediamine in 5% phosphoric acid) were mixed and reacted on 96-well plates for 10 minutes. Absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader Respectively. Standard concentration curves were obtained by serial dilution of sodium nitrite (NaNO ₂ ), and the results are shown in FIG. 2 below.

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물을 처리하지 않고, LPS만을 처리한 군의 경우 대조군에 비해 산화질소의 생성이 급증한 것으로 나타난 반면, 톱니모자반 주정추출물을 처리한 군의 경우, LPS로 유도된 NO의 생성량이 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 2 참조).As a result, as shown in FIG. 2, in the group treated with LPS alone, the production of nitric oxide was increased compared with the control group without treating the extract of the toothed mackerel, whereas in the group treated with the extract of the toothed mushroom extract, The amount of NO induced by LPS decreased in a concentration-dependent manner (see FIG. 2).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 톱니모자반 주정추출물은 LPS로 유도된 NO의 생성을 효과적으로 억제할 수 있어 LPS에 의한 염증 반응을 제어할 수 있는 작용이 있음을 알 수 있었다. Therefore, it can be seen from the results that the extract of the teaspoon of the present invention can effectively inhibit the production of NO induced by LPS, thereby controlling the inflammatory reaction by LPS.

<< 실험예Experimental Example 3> 3>

LPSLPS 에 의한 On by PGEPGE ₂₂ 생성에 있어서 톱니모자반 주정추출물의 영향분석 Analysis of the effects of extracts of teaspoon moth extract

BV-2 microglia 세포 (3.0 × 10⁵ cells/ml)를 DMEM 배지를 이용하여 96 well plate에 접종하고, 톱니모자반 주정추출물을 농도별(0, 0.5, 1.0, 2.0ug/ml)로 처리하고 2시간 뒤 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 LPS에 의해 생성된 PGE₂의 양을 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.BV-2 microglia cells (3.0 × 10 ⁵ cells / ml) were inoculated into 96-well plates using DMEM medium, treated with 0, 0.5, 1.0 and 2.0 μg / After a period of time, fresh medium containing LPS (1 μg / ml) was treated and incubated for 24 hours. The amount of PGE ₂ produced by LPS was then measured using an ELISA kit.

분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물은 BV-2 microglia 세포에서 LPS로 유도된 PGE₂의 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났다.As a result, as shown in Fig. 3, it was found that the extract of Tephaphriticus spp. Reduced the production of LPS-induced PGE ₂ in BV-2 microglia cells in a concentration-dependent manner.

<< 실험예Experimental Example 4> 4>

LPSLPS 에 의한 전구염증성 사이토카인의 생성에 대한 톱니모자반 주정추출물의 영향분석Analysis of the Effect of Sawtooth Mung Bean Extract on the Production of Proinflammatory Cytokines by

앞서 실험예를 통해 확인한 바와 같이, 본 발명의 톱니모자반 주정추출물은 염증매개인자인 NO와 PGE₂의 생성을 농도 의존적으로 저해함을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 추출물이 전구염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 생성도 억제시킬 수 있는지 다음과 같은 실험을 통해 분석하였다. 상기 실험예 3에서 수행한 세포의 배양액을 수집하고 배양액 내의 TNF-α 및 IL-6 농도를 측정하였는데, 측정은 BD Biosciences (San Jose, USA)사의 ELISA kit를 사용하였다. 보다 구체적으로, BV-2 microglia 세포 (3.0 × 10⁵ cells/ml)에 톱니모자반 주정추출물을 농도별로 2시간 처리한 후, 1 μg/ml의 LPS가 함유된 배지를 처리한 다음 24시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 상층액에 분비된 전구염증성 사이토카인의 양을 ELISA kit로 분석하였다.As shown in the experimental examples, it was confirmed that the extracts of the teaspoon of the present invention inhibit the production of inflammatory mediators, NO and PGE ₂ , in a concentration-dependent manner. Therefore, the present inventors analyzed whether the extract of the present invention can inhibit the proinflammatory cytokines TNF-a and IL-6 production as follows. The concentration of TNF-α and IL-6 in the culture medium was measured by using the ELISA kit of BD Biosciences (San Jose, USA). More specifically, BVM-2 microglia cells (3.0 × 10 ⁵ cells / ml) were treated with the extract of Sawtooth mussel extract for 2 hours at a concentration, treated with medium containing 1 μg / ml of LPS, The culture was centrifuged and the amount of proinflammatory cytokine secreted into the supernatant was analyzed by ELISA kit.

분석결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톱니모자반 주정추출물은 BV-2 microglia 세포에서 LPS로 유도된 TNF-α 및 IL-6의 생성을 농도 의존적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.As a result of the analysis, as shown in FIG. 4 and FIG. 5, it was confirmed that the extract of the teaspoon of the present invention can reduce the production of TNF-α and IL-6 induced by LPS in a concentration-dependent manner in BV-2 microglia cells Respectively.

<< 실험예Experimental Example 5> 5>

LPSLPS 에 의한 On by iNOSiNOS 와 Wow COXCOX -2의 단백질 발현에 대한 톱니모자반 주정추출물의 효과분석Analysis of the Effect of Sawtooth Mung Bean Extract on Protein Expression

NO와 PGs는 NOS와 COX에 의해 _L-arginine 및 인지질로부터 합성된다. 병리적인 조건 하에서 NO와 PGE₂의 상당한 증가는 염증 과정을 자극하고 다른 염증 매개체와 함께 상승효과를 나타내는 iNOS와 COX-2에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다.또한, iNOS와 COX-2는 염증성 사이토카인과 박테리아성 endotoxin에 노출되었을 때 강하게 발현되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 LPS로 유도된 BV-2 microglia 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 있어서 톱니모자반 주정추출물의 효과를 iNOS와 COX-2에 대한 각각의 항체를 이용한 웨스턴블럿을 통해 확인하였다. NO and PGs are synthesized from _L- arginine and phospholipids by NOS and COX. Significant increases in NO and PGE ₂ under pathological conditions are known to be induced by iNOS and COX-2, which stimulate inflammatory processes and exhibit synergistic effects with other inflammatory mediators. In addition, iNOS and COX-2 inhibit inflammatory cytokines And bacterial endotoxin, which are known to be strongly expressed. Therefore, the present inventors confirmed the effect of the extract of Sawtooth mildew extract on the protein expression of iNOS and COX-2 in BV-2 microglia cells induced by LPS by Western blot using each antibody against iNOS and COX-2.

분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, BV-2 microglia 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현은 톱니모자반 주정추출물의 처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다.As shown in FIG. 6, protein expression of iNOS and COX-2 in BV-2 microglia cells was inhibited by the treatment of extracts of Sawtooth mung bean sprouts.

<< 실험예Experimental Example 6> 6>

LPSLPS 에 의한 On by iNOSiNOS 와 Wow COXCOX -2의 -2 of mRNAmRNA 발현에 대한 톱니모자반 주정추출물의 효과분석 Analysis of Effect of Sawtooth Mung Bean Extract on Expression

상기 실험예 5에서 톱니모자반 주정추출물이 LPS에 의한 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하였고, 나아가 본 발명자들은 본 발명의 추출물이 이들 유전자의 mRNA 발현 수준에서도 억제하는지 확인하기 아래와 같이 기재된 위해 iNOS와 COX-2 유전자에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 통해 분석하였다. In Experimental Example 5, it was confirmed that the extract of Tooth Moth extract inhibited the expression of iNOS and COX-2 protein by LPS. Furthermore, the inventors of the present invention confirmed that the extract of the present invention also inhibited the mRNA expression level of these genes. (Reverse-transcriptase PCR) using specific primers for iNOS and COX-2 genes.

<프라이머 서열><Primer sequence>

5’-CCATGATGGTCACATTCTGC-3’(iNOS에 대한 센스 프라이머)5'-CCATGATGGTCACATTCTGC-3 '(sense primer for iNOS)

5’-TCTTCGAAATCCCACCTGAC-3’(iNOS에 대한 안티센스 프라이머)5'-TCTTCGAAATCCCACCTGAC-3 '(antisense primer for iNOS)

5’-TGGGCAAAGAATGCAAACAT-3’(COX-2에 대한 센스 프라이머)5'-TGGGCAAAGAATGCAAACAT-3 '(sense primer for COX-2)

5’-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3’(COX-2에 대한 안티센스 프라이머)5'-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3 '(Antisense primer for COX-2)

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톱니모자반 주정 추출물은 iNOS와 COX-2을 단백질 수준뿐만 아니라 mRNA 발현 수준에서도 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that the extract of the teaspoon of the present invention inhibits iNOS and COX-2 at not only protein level but also mRNA expression level.

<< 실험예Experimental Example 7> 7>

LPSLPS 에 의한 전구염증성 사이토카인의 Of proinflammatory cytokines by mRNAmRNA 발현에 대한 For expression 톱니모자반주정추출물의Sawtooth extract of alcohol 효과분석 Effect analysis

상기 실험예 4에서 톱니모자반 주정추출물이 LPS에 의한 TNF-α 및 IL-6 생성억제 효과를 단백질 수준에서 확인하였기에 mRNA 발현 수준에서도 억제하는지 확인하기 위해 아래에 기재된 프라이머 서열을 이용하여 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)로 분석하였다. In Experimental Example 4, in order to confirm that TNF-α and IL-6 production inhibition by LPS was inhibited at the protein level and also suppressed at the mRNA expression level, reverse-transcriptase PCR).

<프라이머 서열><Primer sequence>

5’-TAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3’ (TNF-α에 대한 센스 프라이머)5'-TAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3 '(sense primer for TNF-a)

5’-ACAAGGTACAACCCATCGGC-3’ (TNF-α에 대한 안티센스 프라이머)5'-ACAAGGTACAACCCATCGGC-3 '(antisense primer for TNF-a)

5’-CCTCTCTGCAAGAGACTTCCAT-3’ (IL-6에 대한 센스 프라이머)5'-CCTCTCTGCAAGAGACTTCCAT-3 '(sense primer for IL-6)

5’-ACAGGTCTGTTGGGAGTGGT-3’ (IL-6에 대한 안티센스 프라이머)5'-ACAGGTCTGTTGGGAGTGGT-3 '(Antisense primer against IL-6)

분석결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톱니모자반 주정추출물은 LPS에 의한 TNF-α 및 IL-6 생성 억제를 mRNA 발현 수준에서도 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.As a result of the analysis, it was found that the extract of the teaspoon of the present invention effectively inhibited TNF-α and IL-6 production inhibition by LPS at the mRNA expression level as shown in FIG.

<< 실험예Experimental Example 8> 8>

톱니모자반 주정추출물의 Sawtooth extract of alcohol NFNF -κB 전사인자 -KB transcription factor 핵이동Nuclear migration 억제 효과 Inhibitory effect

NF-κB는 일반적인 상태에서는 IκB-α(inhibitory of κB-α)와 함께 결합하여 세포질에 불활성화 상태로 존재한다. 하지만 LPS와 같은 외부자극에 의해 자극을 받으면 IκB-α가 인산화되어 유비퀴틴에 의해 분해되며 유리형의 NF-κB (p65)는 핵으로 이동함으로써 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 이들 유전자의 전사를 유도한다. NF-κB binds normally with IκB-α (inhibitory of κB-α) and is inactivated in the cytoplasm. However, when stimulated by external stimuli such as LPS, IκB-α is phosphorylated and degraded by ubiquitin, and free NF-κB (p65) is transferred to the nucleus, resulting in the expression of cytokines, cytokine receptors, To the κB site of the promoter or enhancer of the gene involved in the transcription of these genes.

이에 본 발명자들은 톱니모자반 주정추출물이 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 대한 영향을 줄 수 있는지 확인하기 위해, LPS로 유도된 BV-2 microglia 세포에서 톱니모자반 주정추출물에 의한 IκB-α의 인산화와 NF-κB의 핵이동을 Western blot으로 관찰하였다. Therefore, in order to confirm whether or not the extract of the teaspoon mushroom can affect the migration of NF-κB to the nucleus, the present inventors have found that the phosphorylation of IκB-α by LPS-induced BVM- Nuclear transfer of NF-κB was observed by Western blot.

분석결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포질에서 LPS에 의한 IκB-a의 인산화와 NF-κB의 감소는 톱니모자반 주정추출물의 처리 농도에 의존적으로 억제되는 것으로 나타났고, 도 10에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 증가하는 NF-κB의 핵 내로의 이동은 톱니모자반 주정추출물 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 9, phosphorylation of IκB-a by LPS and decrease of NF-κB in the cytoplasm were inhibited in a manner dependent on the treatment concentration of the extracts of Sawtooth mussel, The translocation of NF-κB into the nucleus, which is increased by LPS, was reduced by treatment with Sawtooth mugwort extract.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 주정추출물이 LPS에 의한 IκB-α의 인산화 및 분해를 억제할 수 있고 NF-κB의 유리화를 감소시킴으로써 NF-κB가 핵으로 이동하여 염증성 사이토카인과 같은 염증 인자들의 전사인자로써 작용하는 것을 차단할 수 있음을 알 수 있었다. From these results, the inventors of the present invention found that the extract of the present invention of the present invention can inhibit the phosphorylation and degradation of IκB-α by LPS and reduce vitrification of NF-κB, thereby allowing NF-κB to migrate to the nucleus, It is possible to block the action of the same inflammatory factor as a transcription factor.

<< 실험예Experimental Example 9> 9>

LPSLPS 에 의한 On by MAPKsMAPKs 와 Wow AktAkt 활성화에 대한 톱니모자반 주정추출물의 효과 Effect of Sawtooth mung bean extract on activation

다양한 외부자극에 의한 NF-κB 전사인자의 활성화를 통해 iNOS나 COX-2 또는 전구염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 과정에 있어서, 이들 분자를 조절하는 신호전달기전은 주요 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소들, 즉 extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK), p38 MAPK와 PI3K/Akt을 들 수 있다. 이에 본 발명자들은 이들 3가지 세포내 단백질의 인산화에 관한 톱니모자반 주정추출물의 효과를 알아보기 위하여 Western blot을 수행하였다.In the process of inducing the expression of iNOS or COX-2 or proinflammatory cytokines through the activation of NF-κB transcription factors by a variety of external stimuli, the signaling mechanisms that regulate these molecules include three enzymes belonging to the major MAPK superfamily , Extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK), p38 MAPK and PI3K / Akt. Therefore, the present inventors performed Western blotting to examine the effect of the extract of the teat mushroom extract on the phosphorylation of these three intracellular proteins.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 유도된 ERK, JNK, p38 MAPK의 인산화는 물론 PI3K의 하위 신호전달 effector인 Akt의 인산화도 저해하는 것으로 나타났다. 따라서 LPS에 의해 유도된 BV-2 microglia 세포의 염증 반응에서 톱니모자반 주정추출물은 다양한 세포내 신호 단백질 경로를 차단함으로써 염증 반응을 효과적으로 저해할 수 있음을 알 수 있었다.As a result, it was shown that phosphorylation of ERK, JNK, p38 MAPK induced by LPS as well as phosphorylation of Akt, which is a lower signaling effector of PI3K, was inhibited as shown in Fig. Therefore, it has been shown that the extract of Sawtooth mildew in the inflammation reaction of BV-2 microglia cells induced by LPS can effectively inhibit the inflammatory reaction by blocking various intracellular signal protein pathways.

<< 실험예Experimental Example 10> 10>

β-β- amyloidamyloid 과발현 세포에서 톱니모자반 주정추출물 및 유효성분들에 대한 β- In the overexpressed cells, the extracts of Sawtooth mussel and the β- amyloidamyloid 생성억제효과 분석 Analysis of production inhibition effect

알츠하이머 질병의 특징 중 하나는 뇌 안에 있어서 신경세포(nerve cell, neuron)들 사이에 amyloid plaques의 축적을 들 수 있다. 여기서 amyloid는 신체에서 일반적으로 만들어내는 단백질 조각에 대한 일반적인 용어이며, Beta(β)-amyloid는 amyloid precursor protein (APP)라고 불리는 단백질로부터 잘려진 단백질 단편이다. 정상 뇌에서는 이러한 단편 단백질들이 계속 분해되어 제거되지만, 알츠하이머 병, 치매를 앓고 있는 뇌에서는 그 단백질들이 딱딱한 불용성 plaques (hard, insoluble plaques)을 형성하면서 축적되게 된다. One of the hallmarks of Alzheimer's disease is the accumulation of amyloid plaques between nerve cells (neurons) in the brain. Here amyloid is a general term for protein fragments that are normally produced in the body, and Beta (β) -amyloid is a protein fragment cut from a protein called amyloid precursor protein (APP). In the normal brain, these fragment proteins are continually degraded and eliminated, but in the brains suffering from Alzheimer's disease and dementia, the proteins accumulate while forming hard insoluble plaques (hard, insoluble plaques).

알츠하이머 질병의 진단에 사용되는 바이오마커로 Amyloid beta 1-40(Abeta 40)이 많이 이용되고 있으므로, 본 실험에서는 Abeta 40을 과발현하는 CHO-APP751 세포를 이용하여 톱니모자반 주정추출물 및 이의 유효성분인 sargahrdroquinoic acid, sargachromenol 및 sargaquinoic acid에 의한 Abeta 40 축적저해 효과를 분석하였다. 이를 위해, CHO-APP751 세포를 100 mm dish에 2 x 10⁶농도로 깔고 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 동안 세포를 배양한 후 새로운 배양액 10 ml에 각각의 화합물 및 추출물을 농도별로 30시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 PBS로 두번 세척 후 세포를 용해시킨 다음 원심분리(14,000g, 10min)하여 상층액을 취하였다. 상층액을 대상으로 단백질 농도를 측정한 후 동일한 양의 단백질을 Abeta 40 ELISA kit를 이용하여 Abeta 40의 양을 분석하였다. Since Amyloid beta 1-40 (Abeta 40) is widely used as a biomarker used for diagnosis of Alzheimer's disease, in this experiment, CHO-APP751 cells overexpressing Abeta 40 were used and the extract of Sawtooth mildew and its active ingredient sargahrdroquinoic acid, sargachromenol and sargaquinoic acid. To this end, CHO-APP751 cells were plated at a density of 2 × 10 ⁶ in a 100-mm dish, and cells were cultured in DMEM containing 10% FBS for 24 hours. Lt; / RTI > After the cells were washed twice with PBS, the cells were lysed and centrifuged (14,000 g, 10 min) to obtain supernatant. Protein concentration was measured in the supernatant and the amount of Abeta 40 was analyzed using the Abeta 40 ELISA kit.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톱니모자반의 주정추출물, sargahrdroquinoic acid, sargachromenol 및 sargaquinoic acid은 농도 의존적으로 Abeta 40 단백질의 축적을 억제하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 추출물이 amyloid plaque의 축적을 효과적으로 저해하여 알츠하이머 질병을 예방 및 치료할 수 있다고 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 12, the extract of the present invention, sargahrdroquinoic acid, sargachromenol and sargaquinonic acid inhibited the accumulation of Abeta 40 protein in a concentration-dependent manner. From these results, The extract of the present invention effectively inhibited the accumulation of amyloid plaques and could prevent and treat Alzheimer's disease.

<< 실시예Example 2> 2>

톱니모자반 주정추출물로부터 유효성분인 Sawtooth mugwort extract from the active ingredient 사가하이드로퀴노익산Saga Hydroquinoxaline , , 사가크로멘올Saga cromoenol 및 And 사가퀴노익산의Saga cuneo 분리 detach

<2-1> <2-1> SargahydroquinoicSargahydroquinoic acidacid 의 분리 Separation of

톱니모자반 주정추출물을 100 g을 물:에탄올 (9:1, v/v)의 혼합용매 1 리터에 녹인 후 분액깔때기에 넣고 동량의 n-hexane을 넣어 평형화시킨 후 위층의 n-hexane 가용부를 모아 무수황산나트륨으로 탈수한 다음 농축하여 n-hexane 분획물을 분리하였다. 분리된 n-hexane 분획물 12.2g을 120 mL methanol에 녹여 membrane filter로 여과 후 200 uL을 주입하여 Phenomenex C18(2) (15μm, 21.2 mm × 250 mm) 칼럼이 장착된 HPLC로 4개의 획분으로 분리하였다(도 20 참조). 크로마토그래피의 이동상으로는 메탄올 (A)과 물 (B)의 혼합용매를 사용하였으며 유속은 7 mL로 설정하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(90/10) ∼ A/B(94/6) 농도로 33분간, A/B(94/6) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 10 분간 씻어준 후에 A/B(90:10) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50-100회 실시하여 대량의 1번 분획물의 1차 획분을 얻었다. 대량으로 얻은 1차 획분의 순도를 높이기 위하여 동일한 기기와 칼럼을 사용하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(85/15) ∼ A/B(87/13) 농도로 26분간, A/B(87/13) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(87:13) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 실시하여 보다 순도가 높은 1번 분획물의 2차 획분을 얻었다(도 21 참조). After dissolving 100 g of the extract of the teaspoon of the mother liquor in 1 liter of a mixed solvent of water and ethanol (9: 1, v / v), the same amount of n-hexane was added to the separating funnel and the n-hexane soluble portion After dehydration with anhydrous sodium sulfate, the n-hexane fraction was isolated by concentration. The separated n-hexane fraction (12.2 g) was dissolved in 120 mL of methanol, filtered through a membrane filter, and then 200 μL was injected and separated into four fractions by HPLC equipped with Phenomenex C18 (2) (15 μm, 21.2 mm × 250 mm) column (See Fig. 20). As a mobile phase of the chromatography, a mixed solvent of methanol (A) and water (B) was used and the flow rate was set to 7 mL. The chromatographic conditions were A / B (90/10) to A / B (94/6) for 33 minutes, A / B (94/6) to A / B / B (100/0) for 10 minutes and the column was equilibrated for 10 minutes at A / B (90:10) concentration. Chromatography was performed 50-100 times by automatic sample injection with Autosampler to obtain a large fraction of the first fraction of fraction No. 1. The same instrument and column were used to increase the purity of the first fraction obtained in large quantities. The chromatographic conditions were A / B (85/15) to A / B (87/13) for 26 min, A / B (87/13) to A / B / B (100/0) for 6 minutes and the column was equilibrated for 10 minutes at A / B (87:13) concentration. Chromatography was performed by automatically injecting the sample into an autosampler to obtain a second fraction of fraction 1 having a higher purity (see FIG. 21).

이후 1번 분획물의 2차 획분 중 1번을 동일한 조건으로 재크로마토그래피하여 정제하였으며 (523 mg), 분석용칼럼 (Phenomenex C18(2), 3 μm, 3 mm × 150 mm)으로 분석한 결과 단일물질로 판명되었으며, 이를 NMR로 분석한 결과 sargahydroquinoic acid로 판명되었다(도 22 참조). Then, 1 part of the second fraction of the fraction No. 1 was purified by re-chromatography (523 mg) and analyzed with an analytical column (Phenomenex C18 (2), 3 μm, 3 mm × 150 mm) Which was determined to be sargahydroquinoic acid by NMR analysis (see FIG. 22).

<2-2> <2-2> SargachromenolSargachromenol 의 분리Separation of

상기 도면 20의 2번 분획물을 1번 분획물과 동일한 HPLC 장치와 칼럼을 사용하여 재크로마토그래피하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(91.5/8.5) ∼ A/B(92.2/7.8) 농도로 26분간, A/B(92.2/7.8) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(91.5:8.5) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 2번 분획물의 2차 획분을 얻었다. 도 23에 나타난바와 같이 2번 분획물은 3개의 피크를 나타내었으며, 이중 2번 피크 (Frc2-2)를 다시 정제하여 도 24와 같은 크로마토그램을 얻었으며(126 mg), 분리물을 NMR로 분석한 결과 sargachromenol로 판명되었다. The fraction No. 2 in FIG. 20 was re-chromatographed using the same HPLC apparatus and column as the fraction No. 1. The chromatographic conditions were A / B (92.5 / 8.5) to A / B (92.2 / 7.8) for 26 min and A / B (92.2 / / B (100/0) for 6 minutes and the column was equilibrated for 10 minutes at A / B (91.5: 8.5) concentration. Chromatography was performed 50 times by autosampler injecting sample automatically to obtain a second fraction of large fraction 2. As shown in FIG. 23, the fraction No. 2 showed three peaks. The peak No. 2 (Frc2-2) was further purified to obtain a chromatogram as shown in FIG. 24 (126 mg) One result turned out to be sargachromenol.

<2-3> <2-3> SargaquinoicSargaquinoic acidacid 의 분리Separation of

도면 20의 3번 분획물을 1번 분획물과 동일한 HPLC 장치와 칼럼을 사용하여 재크로마토그래피하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(93.4/6.6) ∼ A/B(93.8/6.2) 농도로 20분간, A/B(93.8/6.2) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(93.8/6.2) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50-100회 실시하여 대량의 3번 분획물의 2차 획분을 얻었다. 도 25에 나타난 바와 같이 3번 분획물은 4개의 피크를 나타내었으며, 이중 4번 피크 (Frc3-4)를 다시 정제하여 도 26과 같은 크로마토그램을 얻었고(171 mg), 분리물을 NMR로 분석한 결과 sargaquinoic acid로 판명되었다. The fraction No. 3 in FIG. 20 was re-chromatographed using the same HPLC apparatus and column as the fraction No. 1. The chromatographic conditions were A / B (93.4 / 6.6) to A / B (93.8 / 6.2) for 20 min, A / B (93.8 / / B (100/0) for 6 minutes and the column was equilibrated for 10 minutes at A / B (93.8 / 6.2) concentration. Chromatography was performed 50-100 times by autosampler injecting samples to obtain a second fraction of large fraction 3. As shown in FIG. 25, the fraction No. 3 showed four peaks. The peak No. 4 (Frc 3-4) was further purified to obtain a chromatogram as shown in FIG. 26 (171 mg). The separated fractions were analyzed by NMR The result proved to be sargaquinoic acid.

<< 실험예Experimental Example 11> 11>

사가크로멘올에On Sagar cromenol 대한 About NONO 와 Wow PGEPGE ₂₂ 생성량 및 세포 독성 시험분석Production and cytotoxicity test analysis

본 발명자들은 상기 화합물들을 BV-2 세포에 2시간 전처리 후, LPS (0.1 mg/mL)를 24시간 처리하였다. NO의 농도는 배지 (100 mL)와 Griess 시약 (0.1% naphtylethylene diamine dihydrochloride + 1% sulfanilamide + 5% phosphoric acid)을 동일한 비율로 반응시켜 microplate reader로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포 독성 확인을 위해, BV-2 세포들을 96-well plate 에 5x10⁴cells/well로 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 농도별로 희석된 DMEM 배지로 교체하여 2시간 배양하였고, LPS가 함유한 DMEM 배지에 다시 24시간 배양한 다음, MTS 시험 키트를 사용하여 세포 생존율을 확인하였다. MTS 용액은 FBS-free DMEM에 5%(v/v)농도로 섞어 100 ml씩 처리하였다. 1시간 후에 microplate reader를 사용하여 490 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.The inventors treated the compounds with BV-2 cells for 2 hours and then treated with LPS (0.1 mg / mL) for 24 hours. NO concentration was measured by incubating the medium (100 mL) with Griess reagent (0.1% naphtylethylene diamine dihydrochloride + 1% sulfanilamide + 5% phosphoric acid) at the same rate and measuring absorbance at 540 nm with a microplate reader. To confirm cytotoxicity, BV-2 cells were plated at 5 × 10 ⁴ cells / well in a 96-well plate and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Subsequently, the cells were cultured for 2 hours in DMEM supplemented with DMEM medium. Cell viability was confirmed using the MTS test kit after culturing for 24 hours in DMEM medium containing LPS. The MTS solution was mixed with FBS-free DMEM at a concentration of 5% (v / v) and treated with 100 ml each. After 1 hour, the absorbance was measured at a wavelength of 490 nm using a microplate reader.

분석 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물을 처리한 군에서는 NO와 PGE₂ 생성량이 sargachromenol 화합물에 의하여 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났고(도 13a 및 13b 참조), 화합물의 처리에 의해 세포 독성은 유발되지 않는 것으로 나타나 본 발명의 화합물은 세포에 대해 안정성을 나타냄을 알 수 있었다(도 13c 참조). As a result of the analysis, as shown in FIG. 13, in the group treated with the compound of the present invention, NO and PGE ₂ (See FIGS. 13A and 13B), and the cytotoxicity was not induced by the treatment of the compound, indicating that the compound of the present invention exhibited stability to cells (See Fig. 13C).

<< 실험예Experimental Example 12> 12>

사가크로멘올의 iNOS 및 COX - 2 의 mRNA 와 단백질 발현에 미치는 영향분석 BV-2 cell (1*10⁶cells/well)을 sargachromenol로 농도별로 처리한 후, LPS (0.1 mg/mL)를 4시간 또는 16시간 동안 자극하였다. iNOS와 COX-2의 mRNA 발현은 real-time PCR로 측정하였고, 단백질 발현은 western blot으로 확인하였다. Saga of cromenol iNOS And COX - 2 of mRNA And its effect on protein expression BV-2 cell (1 * 10⁶cells / well) were treated with sargachromenol at different concentrations and stimulated with LPS (0.1 mg / mL) for 4 hours or 16 hours. The mRNA expression of iNOS and COX-2 was measured by real-time PCR and protein expression was confirmed by western blot.

분석결과, Sargachromenol의 처리 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현과 단백질 발현이 모두 감소되는 것으로 나타났다(도 14a ~ 14c 참조).As a result, both mRNA expression and protein expression of iNOS and COX-2 were decreased in a dose-dependent manner of Sargachromenol (see FIGS. 14A to 14C).

<< 실험예Experimental Example 13> 13>

사가크로멘올의Saga of cromenol 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향분석 Influence on the production of inflammatory cytokines

상기 실험예 4의 방법에서 톱니모자반 주정추출물 대신 사가크로멘올을 처리한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 세포의 배지 중에서 IL-6, TNF-a의 양은 enzyme-linked immunosorbent assay kit (ELISA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였고, 이들 cytokine들의 mRNA 발현은 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. The amount of IL-6 and TNF-a in the cell culture medium was measured by enzyme-linked immunosorbent assay kit (ELISA) in the same manner as in Experimental Example 4, except that sago clromor The mRNA expression of these cytokines was confirmed by real-time PCR.

분석결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 사가크로메놀 화합물은 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-a의 단백질 및 mRNA의 발현을 모두 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.As a result of the analysis, as shown in Fig. 15, it was shown that the sagarchromenol compound inhibited the expression of both IL-6 and TNF-a protein and mRNA, which are inflammatory cytokines, in a concentration-dependent manner.

<< 실험예Experimental Example 14> 14>

사가크로멘올의Saga of cromenol IkBIkB 분해 억제효과와 And NFNF -- kBkB 의 of 핵내로의Into the nucleus 이동 억제효과 분석 Analysis of movement inhibition effect

NF-kB의 활성화에 미치는 사가크로멘올 화합물의 활성을 분석하기 위해, 사가크로멘올 화합물을 처리한 BV-2 세포들로부터 세포질 및 핵 단백질을 각각 추출한 후, NF-kB 및 IkB의 인산화 정도를 western blot 방법으로 분석하였다. 또한 NF-kB의 nuclear translocation은 immunofluorescence를 이용하여 confocal 현미경으로 관찰하였다. In order to analyze the activity of sag- cromenol compounds on the activation of NF-kB, the cytoplasmic and nuclear proteins were extracted from BV-2 cells treated with sagachronic compounds, and the degree of phosphorylation of NF-kB and IkB was determined by western blot method. Nuclear translocation of NF-kB was also observed by confocal microscopy using immunofluorescence.

분석결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 사가크로멘올 화합물을 처리한 군은 처리 농도에 의존적으로 IkB-a의 인산화를 억제하는 것으로 나타났고, NF-kB의 핵내로의 이동을 억제하는 것으로 나타났다.As a result of the analysis, as shown in Fig. 16, the group treated with the sagachronic compound showed inhibition of the phosphorylation of IkB-a depending on the treatment concentration, and inhibited the migration of NF-kB into the nucleus.

<< 실험예Experimental Example 15> 15>

사가크로멘올의Saga of cromenol MAPKsMAPKs 와 Wow AktAkt 단백질 인산화에 미치는 영향분석 Analysis of effect on protein phosphorylation

BV-2 세포에 사카크로멘올 화합물과 LPS를 처리한 후 세포 용해물 전체를 수득하였고, 이를 이용한 western blot 분석을 통해 MAPKs와 Akt의 인산화 정도를 확인하였다. 또한, Wortmannin (Akt 억제제) 또는 sargachromenol을 각각 2 시간 전처리 후, LPS를 24시간 자극한 다음 NO 생성량을 griess 시약으로 반응시켜 측정하였다.BV-2 cells were treated with saccharomer compound and LPS, and the whole cell lysate was obtained. Western blot analysis was used to confirm the degree of phosphorylation of MAPKs and Akt. After pretreatment with Wortmannin (Akt inhibitor) or sargachromenol for 2 hours each, LPS was stimulated for 24 hours, and NO production was measured by reaction with griess reagent.

분석결과, 본 발명의 Sargachromenol은 Akt의 인산화를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났고(도 17a 참조), 나아가 Wortmannin (Akt 억제제) 또는 sargachromenol을 각각 2 시간 전처리 후, LPS를 24시간 결과, NO 생성량도 억제되는 것으로 나타났다(도 17b 참조). As a result of the analysis, Sargachromenol of the present invention effectively inhibited the phosphorylation of Akt (see Fig. 17A). Furthermore, after pretreatment with Wortmannin (Akt inhibitor) or sargachromenol for 2 hours each, (See FIG. 17B).

<< 실험예Experimental Example 16> 16>

사가퀴노익산의Saga cuneo NONO 와 Wow PGEPGE ₂₂ 생성량 억제 및 세포 독성 시험Production inhibition and cytotoxicity test

사가퀴노익산 화합물을 BV-2 세포에 2시간 전처리 후, LPS (0.1 mg/mL)를 24시간 처리하였다. NO의 농도는 배지 (100 mL)와 Griess 시약 (0.1% naphtylethylene diamine dihydrochloride + 1% sulfanilamide + 5% phosphoric acid)을 동일한 비율로 반응시켜 microplate reader로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포독성 여부의 확인을 위해 BV-2 cell을 96-well plate 에 5*10⁴cells/well로 분주하고 37도에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 농도별로 희석된 DMEM 배지로 교체하여 2시간 배양하였고, LPS가 든 DMEM 배지에 다시 24시간 배양하였다. MTS 시험 키트를 사용하여 세포 생존율을 확인하였다. MTS 용액은 FBS-free DMEM에 5%(v/v)농도로 섞어 100 ml씩 처리하였다. 1시간 후에 microplate reader를 사용하여 490 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.Sagarooquinoxaline compound was pretreated with BV-2 cells for 2 hours and treated with LPS (0.1 mg / mL) for 24 hours. NO concentration was measured by incubating the medium (100 mL) with Griess reagent (0.1% naphtylethylene diamine dihydrochloride + 1% sulfanilamide + 5% phosphoric acid) at the same rate and measuring absorbance at 540 nm with a microplate reader. To confirm cytotoxicity, BV-2 cells were plated in 96-well plates at 5 × 10 ⁴ cells / well and cultured at 37 ° C for 24 hours. Subsequently, the cells were cultured for 2 hours in a DMEM medium supplemented with the diluted concentration, and cultured for 24 hours in DMEM supplemented with LPS. MTS test kit was used to confirm cell viability. The MTS solution was mixed with FBS-free DMEM at a concentration of 5% (v / v) and treated with 100 ml each. After 1 hour, the absorbance was measured at a wavelength of 490 nm using a microplate reader.

분석결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 사가퀴노익산 화합물은 농도 의존적으로 NO와 PGE₂ 생성량을 억제하는 것으로 나타났고, 반면 세포에는 독성을 유발시키지 않는 것으로 나타났다.As a result of the analysis, as shown in Fig. 18, the sagaquinoxane compound was found to have NO and PGE ₂ , While it did not induce toxicity in the cells.

<< 실험예Experimental Example 17> 17>

사가퀴노익산의Saga cuneo iNOSiNOS 및 COX-2의 And COX-2 mRNA와mRNA and 단백질 발현에 미치는 영향분석 Analysis of effect on protein expression

BV-2 (1*10⁶cells/well) 세포에 사가퀴노익산을 농도별로 처리한 후, LPS (0.1 mg/mL)를 4시간 또는 16시간 동안 처리하여 세포를 자극하였다. 이후 iNOS와 COX-2의 단백질 발현은 western blot으로 확인하였다.Cells were treated with LPS (0.1 mg / mL) for 4 hours or 16 hours after BV-2 (1 * 10 ⁶ cells / well) Protein expression of iNOS and COX-2 was confirmed by western blot.

분석결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 사가퀴노익산 처리 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 단백질 양이 감소되는 것으로 나타났다.As a result of the analysis, as shown in Fig. 19, the amount of iNOS and COX-2 protein was decreased in dependence on the concentration of sagaquinoxanic acid treatment.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 궁극적으로 톱니모자반의 주정추출물과 상기 추출물로부터 분리된 화합물인 사카크로멘올, 사가퀴노익산 및 사가하이드로퀴노익산이 모두 항염활성이 우수하고 치매치료를 위한 의약 및 기능성 식품 소재로 활용할 수 있음을 알 수 있었다. From these results, the inventors of the present invention have found that, ultimately, the alcohol extract of Sawtooth mildew and the compounds separated from the above extract, saccharomerol, sagaquinoxanic acid and saghydroquinoxanic acid are excellent in anti-inflammatory activity, It can be used as

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims

A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of dementia comprising as an active ingredient an extract of Sawtooth mildew.

The method according to claim 1,
Wherein the toothed moth extract is an extract obtained by using water or an organic solvent.

3. The method of claim 2,
Wherein the organic solvent is selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane.

The method according to claim 1,
Wherein the extract comprises saccharometer, sagaquinoxanic acid or a saghydroquinoic acid compound.

The method according to claim 1,
Wherein said dementia is a disease induced by intracellular beta amyloid protein.

A health functional food for preventing or improving dementia comprising an extract of Sawtooth mildew as an active ingredient.

The method according to claim 6,
Wherein said toothed moth extract is an extract obtained by using water or an organic solvent.

8. The method of claim 7,
Wherein the organic solvent is selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane.

The method according to claim 6,
Wherein said extract contains saccharumolene, sagaquinoxanic acid or a saghydroquinoic acid compound.