KR20170034599A

KR20170034599A - 동종이식용 비세포성 신경도관의 제조방법

Info

Publication number: KR20170034599A
Application number: KR1020150133079A
Authority: KR
Inventors: 김재광
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2017-03-29

Abstract

본 발명은 삼투압과 계면활성제를 이용하여 비세포성 신경도관을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면 세포를 거의 포함하지 않고 세포외 기질이 잘 보존된 신경도관을 제조할 수 있다. 따라서 동종이식에 적합한 신경도관의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

동종이식용 비세포성 신경도관의 제조방법{A method to make acellular nerve conduit for allograft}

본 발명은 동종이식용 비세포성 신경도관의 제조방법에 관한 것이다.

손상된 말초신경을 복구하기 위한 외과적 수술은 미국에서 연 50,000건 이상 시행되고 있으며, 우리나라에서도 2006년 18,279건, 2007년 23,517건, 2008년 25,120건, 2009년 25,590건, 그리고 2010년 28,722건으로 매년 시행 건수가 증가하였다(2010년 건강보험 심사평가원의 자료).

말초신경 복구 수술은 비복신경, 전완 표재 신경 등의 신경을 부분적으로 분리하여 손상부위에 자가 이식하는 방법이 널리 이용되고 있다. 그러나 이 경우 수술 시간이 연장되고 공여부의 운동능력 소실, 감각 소실 및 동통 발생 등의 단점이 있다. 이러한 단점을 감소시키고자 운동신경 손상 부위에 감각신경을 이식하기도 하나, 이 경우 공여부와 수여부 사이에 구조적인 차이가 있어 결과 예측이 어렵다.

근래에는 자가 신경을 대체할 수 있는 인조 신경 개발이 시도되고 있으나, 가격이 높고 효과가 확실히 검증되지 않아 아직 국내에서 상품화된 바 없다.

이에 대안으로 동종 신경을 이식하는 방법이 연구되고 있다. 이 경우 수여자의 손상 부위에 이식되었을 때 면역반응을 유발하는 것을 방지하기 위해 비세포(acellular) 상태로 만든 후 이식을 하고 있다. 동종 신경은 슈반 세포가 없지만 세포외 기질은 그대로 보존되기 때문에 자가 신경 이식보다는 효율이 떨어지지만인조 신경도관보다는 효율이 우수한 것으로 보고된 바 있다(Journal of Bone and Joint Surgery Am. 2012:94(5);410- 417).

현재까지 보고된 동종이식용 비세포성 신경도관을 제조하는 방법에 관한 종래기술은 모두 SDS와 같은 음이온성 계면활성제를 이용한다. 미국 특허 공개번호 제2001/0049138호는 신경도관을 음이온성 계면활성제인 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)와 SDS에 차례로 담근 후 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-100에서 배양하여 세포를 제거하는 방법을 개시하고 있다([0026] 단락). 미국 특허 등록번호 제7,402,319호는 신경도관을 양쪽성 계면활성제인 설포베타인-10(sulfobetaine-10)을 함유한 용액 내에서 배양한 후 양쪽성 계면활성제인 설포베타인-16과 음이온성 계면활성제인 트리톤 X-200을 함유한 용액 내에서 배양하기를 2회 반복함으로써 세포를 제거하는 방법(칼럼 14, 첫 번째 단락)을 개시하고 있다. 미국 특허 등록번호 제7,402,319호의 방법이 현재 널리 이용되고 있는 방법이며 미국 특허 공개번호 제2001/0049138호의 방법보다 효과가 우수하다고 보고된 바 있다(Experimental and clinical evidence for use of decellularized nerve allografts inperipheral nervegapreconstruction, Szynkaruk M, Kemp SW, Wood MD, Gordon T, Borschel GH. Tissue EngPartBRev. 2013 Feb;19(1):83-96). 그러나 음이온성 계면활성제는 세포를 파괴시키는 능력이 강하기는 하지만 세포외 기질 역시 파괴할 수 있고 생체내에서 세포독성이 강하다는 단점이 있어 보다 개선된 방법의 개발이 요구된다.

미국 특허 공개번호 제2001/0049138호 미국 특허 등록번호 제7,402,319호

본 발명은 저장성 및 고장성 완충 용액, 그리고 비이온성과 양쪽성 2종의 계면활성제를 사용하여 신경 조직을 손상시키지 않고 비세포성 신경도관을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 비이온성 계면활성제를 포함하는 저장성 완충액 내에서 신경도관을 배양하는 단계;및

2) 양쪽성 계면활성제를 포함하는 고장성 완충액 내에서 신경도관을 배양하는 단계를 포함하는, 동종이식용 비세포성 신경도관의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 1) 단계를 수행한 후 상기 2) 단계를 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100)(C₁₄H₂₂O(C₂H_4O)_n), 트윈 20(Tween 20), 또는 트윈 80(Tween 80)일 수 있으며, 바람직하게는 트리톤 X-100일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 양쪽성 계면활성제는 CHAPS 계면활성제(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 설포베타인 10(sulfobetaine-10) 또는 설포베타인-16(sulfobetaine-16)일 수 있고, 예를 들어 CHAPS 계면활성제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 음이온성 계면활성제를 이용하지 않는다는 점에서 기존의 방법들과 차이가 있다. 또한 기존의 방법들이 3종 이상의 계면활성제를 이용하는 것과 달리, 본 발명에서는 총 2종의 계면활성제만을 이용한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 완충액은 트리스(Tris) 완충액일 수 있다. 트리스(Tris)는 Tris(hydroxymethyl)aminomethane의 약어로서, IUPAC 명칭은 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol이다.

본 발명의 방법을 이용하면 세포를 거의 포함하지 않고 세포외 기질은 잘 보존된 신경도관을 제조할 수 있다. 따라서 동종이식에 적합한 신경도관의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 지방조직을 제거하고 10 mm 정도 길이로 절단한 좌골신경의 사진이다.
도 2는 절단된 좌골신경을 3차 증류수를 채운 코니컬 튜브에 넣은 사진이다.
도 3은 비이온성 계면활성제 등을 포함하는 저장성 트리스 완충액 내의 좌골신경 사진이다.
도 4는 양쪽성 계면활성제 등을 포함하는 고장성 트리스 완충액 내의 좌골신경 사진이다.
도 5는 제조된 비세포성 신경도관 사진이다.
도 6은 비세포성 신경도관을 동종이식하는 사진이다.

이하에서 언급된 트리톤 X-100, EDTA, 아프로티닌, CHAPS, 트리스 완충액, NaCl은 모두 Sigma^® (USA)로부터 구입한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비세포성 신경도관의 제조

루이스(Lewis) 랫트의 좌골신경(sciatic nerve) 조직을 분리하여 지방조직을 제거하고 10 mm 정도의 길이로 절단하였다(도 1). 그 후 절단된 좌골신경을 3차 증류수를 가득 채운 15 ml 코니컬 튜브(cornical tube)에 넣어(도 2) 25 ℃에서 7시간 동안 세척하였다.

세척된 좌골신경을 5 mM EDTA, 10 KIU/ml 아프로티닌(aprotinin), 및 비이온성 계면활성제(non-ionic detergent)인 2.5 mM triton x-100을 포함한 차가운 저장성 트리스 완충액(ice-cold hypotonic tris buffer)(10 mM tris, pH 8.0) 15 ml에 넣고 37 ℃에서 밤새 배양하였다(도 3).

배양 후, 좌골신경을 PBS 용액으로 15분간 3번 흔들어 세척(shaking washing)하고, 양쪽성 계면활성제(amphoteric detergent)인 100 mM CHAPS, 0.5 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 KIU/ml 아프로티닌을 포함하는 고장성 트리스 완충액(hypertonic tris buffer) 15 ml(50 mM Tris, pH 8.0)에 넣고 37 ℃에서 밤새 배양하였다(도 4).

배양 후, 좌골신경을 PBS 용액으로 15분간 3번 흔들어 세척(shaking washing)하고 4 ℃에 보관하여 빠른 시일 내에 사용하도록 하였다(도 5).

비교예 1. 미국 특허 등록번호 제7,402,319호 방법에 의한 비세포성 신경도 관 제조

실시예 1과 동일하게 루이스 랫트의 좌골신경 조직을 준비하고, 미국 특허 등록번호 제7,402,319호에 기재된 방법대로 비세포성 신경도관으로 만들었다. 구체적으로, 상기 좌골신경 조직을 양쪽성 계면활성제인 설포베타인-10(sulfobetaine-10)을 함유한 용액 내에서 15시간 배양한 후 양쪽성 계면활성제인 설포베타인-16과 음이온성 계면활성제인 트리톤 X-200을 함유한 용액 내에서 24시간 배양하기를 2회 반복함으로써 세포를 제거하였다.

이하 ‘기존 방법’은 비교예 1을 의미한다.

실시예 2. 제조된 비세포성 신경도관의 분석

2-1. 세포 제거 정도 및 세포외 기질 보존 정도 분석

실시예 1에서 제조한 비세포성 신경도관을 4% 파라포름알데히드(parafolmaldehyde)에 고정하고 파라핀으로 블록을 만든 후 H&E 염색하고, 광학현미경으로 관찰하여 세포 제거 정도 및 세포외 기질 보존 정도를 분석하였다. 기존 방법에 따라 제조한 비세포성 신경도관에 대해서도 동일한 분석을 수행하였다. 결과는 하기 표 1과 같다.

[표 1]

상기 표 1에서, 세포 제거 점수가 높을수록 (1점 5점) 탈세포화가 잘 된 것이고, 세포외 기질 보존 점수도 (1점 5점) 높을수록 세포외 기질의 보존이 잘 된 것이다. 기존 방법과 비교하여 본 발명에 의한 방법이 세포 제거 점수는 동일하고 세포외 기질 보존 점수는 더 높음을 알 수 있다.

2-2. 면역조직화학

실시예 1에서 제조한 비세포성 신경도관을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀으로 블록을 만들고 S-100, 콜라겐-I, 라미닌에 대해 각각 면역 염색을 한 후, 세포 제거 정도를 나타내는 점수인 S-100 점수, 세포외 기질인 콜라겐과 라미닌의 보존 정도를 분석하였다. 기존 방법에 따라 제조한 비세포성 신경도관에 대해서도 동일한 분석을 수행하였다. 결과는 하기 표 2와 같다.

[표 2]

상기 표 2에서, S-100 점수가 낮을수록 (1점~5점) 탈세포화가 잘 된 것이고, 콜라겐(collagen)과 라미닌(laminin)은 점수가 높을수록(1점~5점) 세포외 기질이 변성없이 잘 유지되는 것이다. 상기 실험에서도 기존 방법과 비교하여 본 발명에 의한 방법이 세포 제거 점수는 동일하고 세포외 기질인 콜라겐과 라미닌의 보존 정도는 더 높음을 알 수 있다.

실시예 3. 비세포성 신경도관의 동종이식 및 신경 재생 정도 분석

3-1. 비세포성 신경도관의 동종이식

스프라그 돌리 랫트를 졸레틸 및 럼픈으로 복강내 마취하여 깊은 마취 상태를 유도하고, 좌골 신경 부위를 면도하고 70 % 알코올로 소독한 후 외피를 개복하여 좌골신경을 10-12 mm 절제하였다.

상기 랫트에 실시예 1에서 준비한 비세포성 좌골신경을 9-0 나일론(ethilon)으로 연결하고 봉합하고, 외피를 4-0 나일론(ethilon)으로 봉합하였다(도 6).

대조군 랫트에는 동일한 과정을 통해 비교예 1에서 준비한 비세포성 신경도관을 이식하였다.

3-2. 신경 재생 정도 분석

상기 3-1에서 동종이식된 비세포성 신경도관을, 6주 후 수술 부위를 다시 개복하여 회수하였다. 상기 회수된 비세포성 신경도관을 3% 글루타알데히드(glutaldehyde)에 고정하고 1% 오스뭄 테스라오사이드 (osmuim tetraoxide)로 후고정을 시행하였다. 고정된 조직을 에포시 레진 (epoxy resin)에 담근 후 Toluidien blue로 염색하고, 신경 재생 정도를 비교하였다. 대조군 랫트에서도 동일하게 수행하였다. 결과는 하기 표 3과 같다.

[표 3]

상기 표 3에서, 본 발명에 의한 방법이 기존 방법보다 신경 재생 정도가 우수함을 알 수 있다.

Claims

1) 비이온성 계면활성제를 포함하는 저장성 완충액 내에서 신경도관을 배양하는 단계;및
2) 양쪽성 계면활성제를 포함하는 고장성 완충액 내에서 신경도관을 배양하는 단계를 포함하는, 동종이식용 비세포성 신경도관의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 1) 단계를 수행한 후 상기 2) 단계를 수행하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), 트윈 20(Tween 20), 또는 트윈 80(Tween 80)인 방법.

제1항에 있어서, 상기 양쪽성 계면활성제는 CHAPS 계면활성제, 설포베타인-10(sulfobetaine-10), 또는 설포베타인-16(sulfobetaine-16)인 방법.

제1항에 있어서, 상기 완충액은 트리스(Tris) 완충액인 방법.