KR20170028199A - 유방암세포 센싱용 lc 마이크로액적, 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서 - Google Patents

유방암세포 센싱용 lc 마이크로액적, 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적, 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 설명하면, LC 마이크로액적의 허셉틴 항체와 이의 항원을 갖는 유방암세포와의 결합에 의한 LC 마이크로액적의 LC 분자 배열 변화를 확인함으로써, 유방암세포를 센싱할 수 있는 LC 마이크로액적, 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.

Description

유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적, 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서{Liquid crystal microdroplets for sensing of breast cancer cells, Sensing method of breast cancer cells using the same and Biosensor using the same}
본원발명은 허셉틴 항체를 도입한 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적 (liquid crystal microdroplets), 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.
바이오센서는 전형적으로 바이오-인식 구성요소, 바이오변환 구성요소 및 전자 시스템으로 구성되며, 이는 신호 증폭기, 프로세서 및 디스플레이를 포함한다. 인식 구성요소는 종종 바이오 수용체라 불리며, 관심있는 분석물과 상호작용하는 생물학적 시스템 이후에 설계된 수용체 또는 유기체로부터의 바이오분자를 사용한다. 이러한 상호작용은 샘플에서 표적 분석물의 존재에 비례하는 측정가능한 신호를 출력하는 바이오 변환기에 의해 측정된다. 바이오센서의 일반적인 설계 목적은 샘플이 입수된 곳에서 관심 또는 치료의 시점에 빠르고 편리하게 시험할 수 있도록 하는 것이다.
표면과학은 기초과학 및 큰 규모의 산업 생산을 포함하는 분야의 넓은 영역에서 발생한다. 액정은 특히 이 점에서 흥미로운데 이는 표면의 효과가 벌크 위상(bulk phase)으로 깊숙이 확장되기 때문이다. 따라서 디렉터 배향(director orientation)은 표면의 모양 및 이의 화학적 조성과 같은 계면 특성에 민감하다. LCD와 같은 대부분의 액정 적용에 있어서, 표면은 액정의 정확한 고정이 이루어지도록 처리된다. 평면 고정은 표면을 문질러서 이루어지지만, 호메오트로픽 고정은 기질에 대한 계면활성제의 부착에 의해 이루어진다. 유사하게, 이러한 분자는 LC와 물 사이의 경계면에 흡수될 수 있고, LC의 배열을 변화시킨다. 고정 각도는 계면활성제 농도에 매우 민감하기 때문에, 이러한 시스템은 센서로서 사용될 수 있다. 고정은 또한 벌크 액정에 영향을 미치며, 변화는 액정의 장거리 배향 질서(long range orientational order)를 통해 증폭되어 편광 현미경 하에 용이하게 관찰될 수 있다. 따라서, LC 경계면은 LC-물 경계면에서의 인지질을 포함하는 다양한 화학물질, 단백질 결합, 바이러스, 박테리아 및 pH 측정을 탐지하는 센서로서 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 변화들을 관찰하는 최근의 방법들은 여전히 육안으로 관찰하는 것을 기반으로 하고 있으며, 이러한 방식으로는 고정의 작은 변화들은 탐지될 수 없다.
최근 수십 년 동안 LC 물질 기술의 빠른 발전으로, 많은 다양한 실용적인 장치들이 개발되어왔고 상용화되었다. LC 장치는 이미징, 현미경 관찰, 분광학, 광학 프로빙과 같은 분야에 다양하게 적용되어 왔다. 다양한 LC 기반 센서들은 무표지의 고분자전해질, 이온, 분자 및 생물학적 시스템을 분석하기 위해 개발되어 왔다. 이러한 LC 센서들의 탐지 원리는 표면 구조에서 극미한 변화에 대한 LC 분자의 고 민감성 배향 반응을 기반으로 한다.
LC 물질 및 기술은 복잡한 고가의 기구 없이 무표지, 고 민감성 실시간 탐지기의 결합체에 기여할 수 있다. LC 물질은 단순하고, 편리하며, 다양한 화학적, 생물학적 사건을 육안으로도 볼 수 있는 광학 반응으로 변환하기 위한 센싱 장치를 만드는데 효율적이라는 것이 밝혀졌다. LC-기반 센서들은 환경 오염물질, 효소 반응, 단백질 상호작용, 리간드-수용체 상호작용, 항원-항체 면역검정 상호작용 및 DNA 혼성화의 탐지를 포함하는, 주위 밝기 조건에서 다양한 센싱 적용에 유용한 것으로 확인되었다. LC-기반 센싱 기술은 단순하고, 중앙 연구소로부터 떨어진 샘플을 빠르게 평가하기 위한 휴대용의 저렴한 스크리닝 검정 개발에 유용하다. 더욱이, 화학, 생체의약품 및 환경과학과 같은 분야에서의 잠재적인 적용가능성으로 인해, 과학자들은 LC의 연구 개발에 흥미를 가져왔는데, 이는 LC가 실시간 탐지 센서에 잠재적으로 사용가능하기 때문이다.
한편, 유방암 스크리닝의 이익과 피해의 균형에 대해 논란이 많다. 코크런 보고서에서는 유방 X선 조영법의 스크리닝이 좋은지 유해한지 명확하지 않다고 설명하고 있다. US Preventive Services Task Force의 2009년 보고서에서는 40 ~ 70대 연령의 사람들에게서 유방암 스크리닝 이점의 증거를 발견하여, 이 단체에서는 50 ~ 74세 연령의 여성들에게 2년마다 스크리닝하는 것을 추천하고 있으나, 유방 X선 조영법은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어진다. 또한, X 선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 생길 가능성도 배제 할 수 없다.
약물 타목시펜 또는 랄록시펜은 유방암에 걸릴 위험이 높은 사람들에게 유방암을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 고 위험 여성들에게 있어서 양쪽 유방의 제거 수술은 또 다른 하나의 유용한 예방책이다. 암을 진단받은 사람들에게, 수술, 방사선 치료, 화학요법, 호르몬 요법 및 표적 치료를 포함한 수많은 치료법이 사용될 수 있다. 그러나, 유방암의 성장을 예방하기 위해 효과적인 치료법이 수행될 수 있도록 암을 초기에 탐지하기 위한 진단 장치의 개발이 매우 중요하다.
따라서, 논란이 많은 종래의 유방암 진단법인 유방 X 선 조영법을 대체할 수 있고, 암을 초기 단계에 탐지할 수 있는 장치의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
1. 대한민국 공개특허 2013-0126322호(공개일: 2013. 11. 20.)
본 발명은 논란이 많은 종래의 유방 X 선 조영법을 대체하고, 암을 초기 단계에 탐지할 수 있는 장치를 제공하기 위해 안출된 것으로, 유방암세포를 표지 없이, 고 민감성으로 실시간 탐지할 수 있는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적, 이를 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서를 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 액정(liquid crystal); 허셉틴(Herceptin) 항체가 고정된 블록 공중합체; 및 계면활성제;를 포함하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적(Liquid crystal microdroplets)을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적은 계면활성제에 의해 형성된 마이셀(micelle) 구조로서, 상기 액정은 마이크로액적 내부에 존재하며, 상기 블록 공중합체의 소수성 부분은 마이크로액적 내부에 존재하고, 상기 허셉틴 항체는 상기 블록 공중합체의 친수성 부분과 결합하여 마이크로액적 외부에 노출되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적의 액정은4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'헥실바이페닐 및 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상의 화합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 4-시아노-4'-펜틸바이페닐을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적의 블록 공중합체는 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한, 상기 블록 공중합체는 평균분자량이 5,000 ~ 12,000을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서, x 는50 ~ 75 이고, y는 25 ~ 35 이다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적의 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트 또는 도데실트리메틸암모늄인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적에서 허셉틴 항체는 유방암세포의 항원과 비결합시에는 액정이 방사형 배열(radial conformation)을 가지며, 허셉틴 항체가 유방암세포의 항원과 결합 시에는 액정이 양극성 배열(bipolar conformation)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적에서 허셉틴 항체와 결합하는 유방암세포는 SK-BR3 세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적에서 상기 유방암세포의 항원은 HER2+ 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적에 있어서, 액정을 1.0 × 10-1 ~ 5.0 × 10- 1 mmol로 포함하고, 블록 공중합체는 1.50 × 10-3 ~ 2.0 × 10- 2 mmol로 포함하며, 계면활성제를 5.0 × 10-2 ~ 3.0 × 10- 1 mmol 로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적의 직경은 2.5㎛ ~ 20㎛, 바람직하게는 5㎛ ~ 17.5㎛ 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 직경이 7.5㎛ ~ 15㎛ 인것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 4-시아노-4'-펜틸바이페닐; 허셉틴 항체가 고정된 폴리(스티렌-b-아크릴산); 및 소듐 도데실 설페이트 또는 도데실트리메틸암모늄을 포함하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적(Liquid crystal microdroplets)을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 유방암세포 센싱용 바이오센서에 관한 것으로, 앞서 설명한 다양한 형태의 상기 LC 마이크로액적을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포 센싱용 바이오센서에는 상기 LC마이크로액적이 18 ~ 35℃의 온도 범위에서 유방암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 유방암세포를 센싱하는 방법에 관한 것으로, 앞서 설명한 다양한 형태의 LC 마이크로액적을 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포를 센싱하는 방법은 LC 마이크로액적의 LC 분자 배향 변화를 편광 현미경을 통해 육안으로 용이하게 관찰함으로써 유방암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 18 ~ 35℃의 온도 범위에서 상기 LC 마이크로액적과 유방암세포를 접촉시켜 LC 분자의 배향 변화를 통해 유방암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포를 센싱하는 방법은 pH 7.0 ~ 7.8 하에서, 상기 LC 마이크로액적과 유방암세포를 접촉시켜 LC 분자의 배향 변화를 통해 유방암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암세포를 센싱하는 방법은 체외(in vitro)에서 유방암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적은 유방암세포에 대한 선택성 및 민감성이 높고, 무표지로 유방암세포를 센싱할 수 있으며, 다른 단백질을 포함하는 체외(in vitro) 조건에서도 유방암세포를 선택적으로 센상하는 것이 가능하다.
도 1은 항체-항원 상호작용에 의한 LC 마이크로액적의 배향 변화를 보여주는 개략도이다.
도 2는 PS-b-PA 코팅된 5CB 마이크로액적을 나타내는 POM(polarized optical microscope; 편광 광학 현미경) 이미지로, 도 2의 (a)는 SDS를 사용하지 않았을 때 LC 마이크로액적이 양극성 배열을 나타낸다는 것을 보여주고, (b)는 SDS를 사용하였을 때 LC 마이크로액적이 방사성 배열을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 3은 입자 크기 분석기로 측정한 LC 마이크로액적의 직경 분포를 나타낸 그래프이다.
도 4의 (a)는 5CBPSPA 마이크로액적, (b)는 5CBPAA 마이크로액적의 배열을 보여주는 광학 이미지(위) 및 POM 이미지(아래)이다.
도5의 (a)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적, (b)는 5CBPAA 마이크로액적의 배열을 보여주는 광학 이미지(위) 및 POM 이미지(아래)이다.
도 6의 (a)는 허셉틴-로다민 6G-고정 LC 액적 5CBPSPA -Her- rhd의 형광 이미지(위) 및 POM 이미지(아래)이고, (b)는 허셉틴-로다민 6G-고정 LC 액적 5CBPAA -Her- rhd 의 형광 이미지(위) 및 POM 이미지(아래)이다.
도 7의 (a)는 허셉틴, 허셉틴-로다민 6G 및 로다민 6G의 UV-Vis 스펙트럼이고, (b)는 로다민 6G의 구조이다.
도 8은 5CBPSPA 마이크로액적의 표면에 서로 다른 농도의 허셉틴을 이용한 형광 이미지(위) 및 POM 이미지(아래)로, (a)는 1㎍/mL, (b)는 10㎍/mL, (c)는 20㎍/mL, (d)는 50㎍/mL 의 허셉틴을 사용하였다.
도 9의 (a) 및 (b)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 SK-BR3 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 KB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이며, (e) 및 (f)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
도 10의 (a) 및 (b)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 SK-BR3 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 KB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이며, (e) 및 (f)는 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
도 11의 (a) 및 (b)는 10% FBS 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 SK-BR3 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 10% FBS 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 KB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이며, (e) 및 (f)는 10% FBS 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
도 12의 (a) 및 (b)는 10% 혈장 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 SK-BR3 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 10% 혈장 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 KB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이며, (e) 및 (f)는 10% 혈장 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
도 13의 (a) 및 (b)는 PBS 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포(흰색), KB 세포(흰색) 및 SK-BR3 세포(파란색)의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 PBS 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포(파란색), KB 세포(파란색) 및 SK-BR3 세포(흰색)의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
도 14의 (a) 및 (b)는 10% FBS 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포(흰색), KB 세포(흰색) 및 SK-BR3 세포(파란색)의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 10% 혈장 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 FB 세포(흰색), KB 세포(흰색) 및 SK-BR3 세포(파란색)의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
도 15의 (a) 및 (b)는 SK-BR3 세포와 5CBPSPA -Her 마이크로액적의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이고, (c) 및 (d)는 SK-BR3 세포와 5CBPAA -Her 마이크로액적의 상호작용을 보여주는 광학 이미지(왼쪽)와 POM 이미지(오른쪽)이다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명을 한다.
상술한 바와 같이, 유방암을 진단하기 위한 종래의 유방 X선 조영법은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어지고, X-선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 발생할 가능성이 있다는 치명적인 문제점이 있었다.
이에 본 발명은, 액정(liquid crystals); 허셉틴(Herceptin) 항체가 고정된 블록 공중합체; 및 계면활성제를 포함하는 LC 마이크로액적을 개발하여 LC 분자의 배향 변화를 통해 유방암 세포의 결합 여부를 확인함으로써 유방암을 진단할 수 있는 방법을 제공하여, 종래의 유방암 진단법을 대체할 수 있도록 하였다.
본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다.
본 발명에서 용어 “바이오센서(biosensor)”는 분석장치로서, 생리학적 환경에서 생물학적 구성요소의 상호작용을 통해 분석물을 탐지하는데 사용하기 위한 것이다.
본 발명에서 용어 “액정(liquid crystal)”은 액체와 고체 사이의 물성을 가지는 물질을 의미하며, 서로 다른 종류의 액정은 편광현미경으로 관찰했을 때 서로 다른 방향성으로 인해 복굴절률(birefringence)등의 광학적 성질이 달리 나타난다. 상기 액정은 당업계에 공지된 다양한 액정을 포함하며, 예컨대, (ⅰ) 온도 변화에 따라 상(phase) 전이가 일어나는 서모트로픽(thermotropic) 액정, (ⅱ) 용매 내에서 액정 분자의 온도 및 농도에 따라 상 전이가 일어나는 리오트로픽(lyotropic) 액정 및 (ⅲ) 유기 및 무기 분자로 이루어졌으며, 온도 및 농도뿐 아니라 무기-유기 분자의 조성비에 따라 상 전이가 일어나는 메탈로트로픽(metallotropic) 액정이 있다. 상기 서모트로픽 액정은 스멕틱 액정, 네마틱 액정 및 콜레스테릭 액정을 포함하며, 이 중 가장 일반적인 액정은 네마틱 액정이고 상업적으로 용이하게 구입할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 액정은 상기 공지된 다양한 종류의 액정을 포함하며, 바람직하게는 서모트로픽 액정이고, 보다 바람직하게는 네마틱 액정이다.
본 발명에서 용어 “배향(orientation)”은 액정의 분자적 배열에 따라 달라지는 물리적 성질을 의미하며, 예컨대 네마틱 액정의 경우 수평 또는 수직 방향의 배열을 가진다.
본 발명에서 용어 "SK-BR3"는 HER2+(Neu/ErbB-2) 유전자 산물을 과다발현하는 인간 유방암 세포주이다.
본 발명에서 용어 "FBS(fetal bovine serum; 소태아혈청)"는 혈액의 자연적인 응고 후에 남는 혈액 부분으로, 이후 남은 모든 적혈구를 제거하기 위해 원심분리한다.
본 발명에서 용어 "혈장(blood plasma)"은 혈구를 제거한 단백질을 함유하는 옅은 노란색의 액체 성분으로 서스펜션에서 혈구에 대한 세포외 기질로 작용한다.
구체적으로, 도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적이 항체-항원 상호작용에 의해 배향이 변화하는 것을 보여주는 개략도로서, 여기에서 양친매성 블록 공중합체인 폴리(스티렌-b-아크릴산)(PS-b-PA)과 소듐 도데실 설페이트(SDS)는 LC 마이크로액적을 제조하기 위해 계면활성제로 사용되었다. 소수성 스티렌 블록은 소수성 4-시아노-4'-펜틸바이페닐(5CB;LC)과 혼성화되는 반면, 친수성 자유 아크릴산 블록 및 허셉틴이 고정된 이들 부분은 마이크로액적의 바깥 표면 부분을 형성한다. 세포 멤브레인에 존재하는 HER2+ 단백질을 갖는 표적 유방암 세포로 향하는 5CB 마이크로액적 표면의 PA 블록에 허셉틴이 고정되었다. 허셉틴의 도입은 방사성에서 양극성으로 LC 분자의 배향 변화를 야기하며, 이러한 변화는 편광 현미경에서 육안으로 용이하게 관찰할 수 있다.
본 발명의 이러한 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적은 액정, 허셉틴 항체가 고정된 블록 공중합체 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 그리고 바람직하게 상기 블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에 있어서, x 는 50 ~ 75인 정수이고, y 는 25 ~ 35인 정수이다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 평균분자량이 5,000 ~ 12,000 을 가질 수 있고, 바람직하게는 6,500 ~ 9,130을 가질 수 있다.
그리고, 본 발명의 LC 마이크로액적은 상기 블록 공중합체를 1.50 × 10-3 ~ 2.0 × 10- 2 mmol, 바람직하게는 2.0 × 10-3 ~ 5.0 × 10- 3 mmol, 더욱 바람직하게는 2.0 × 10-3 ~ 3.0 × 10-3 mmol로 포함할 수 있다.
본 발명의 LC 마이크로액적 내부에 존재하는 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'헥실바이페닐 및 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 4-시아노-4'-펜틸바이페닐을 사용할 수 있다. 그리고 본 발명의 LC 마이크로액적은 상기 액정을 1.0 × 10-1 ~ 5.0 × 10- 1 mmol, 바람직하게는 1.0 × 10-1 ~ 3.0 × 10- 1 mmol, 더욱 바람직하게는 1.0 × 10-1 ~ 2.5 × 10-1 mmol로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 LC 마이크로액적은 상기 계면활성제를 소듐 도데실 설페이트 또는 도데실트리메틸암모늄으로 사용할 수 있다. 그리고 본 발명의 LC 마이크로액정은 상기 계면활성제를 5.0 × 10-2 ~ 3.0 × 10- 1 mmol, 바람직하게는 1.0 × 10-1 ~ 2.5 × 10- 1 mmol, 더욱 바람직하게는 1.5 × 10-1 ~ 2.0 × 10- 1 mmol로 포함할 수 있다.
도 3의 입자 크기 분석기로 측정한 LC 마이크로액적의 직경 분포 그래프에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 LC 마이크로액적의 직경은 2.5㎛ ~ 20㎛, 바람직하게는 5㎛ ~ 17.5㎛ 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 직경이 7.5㎛ ~ 15㎛ 범위일 수 있다.
앞서 설명한 본 발명의 다양한LC 마이크로액적을 이용하여 유방암세포를 센싱할 수 있다. 구체적으로, 유방암세포의 HER2+ 항원과 LC 마이크로액적의 허셉틴 항체의 결합에 의해 LC 분자의 배향이 변화하는 것을 편광 현미경을 통해 육안으로 관찰하여 유방암세포를 센싱할 수 있다. 유방암세포를 효과적으로 센싱하기 위해서는18 ~ 35 ℃의 온도범위에서, 상기 LC 마이크로액적과 유방암세포를 접촉시켜 센싱하는 것이 좋은데, 이는 18 ~ 35 ℃의 온도범위에서 상기 액정이 네마틱 상태를 나타내기 때문이다. 그리고 pH가 액정 배열에 영향을 줄 수 있으므로, pH가 7.0 ~ 7.8 하에서, 바람직하게는 pH가 7.2 ~ 7.6 하에서, 더욱 바람직하게는 pH가 7.35 ~ 7.45 하에서 상기 LC 마이크로액적과 유방암세포를 접촉시켜 센싱하는 것이 좋다.
또한, 상기 유방암세포 센싱은 체외(in vitro)에서 수행할 수 있다. 이러한 체외 조건은 FBS 또는 혈장과 같은 다른 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
앞서 설명한 다양한 본 발명의 LC 마이크로액적을 이용하여 바이오센서를 제조할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기의 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
5CB PSPA 마이크로액적 형성
O/W 시스템은 마이크로액적 에멀젼의 생성을 위해 사용된다. 이전의 연구들에서, 계면활성제는 액적의 안정성을 위해 사용되었다. 계면활성제는 에멀젼에서의 표면 장력을 감소시킴으로써 액적들 사이의 유착을 막기 위해 사용된다. PS-b-PA는 이의 양친매성 성질로 인해 계면활성제처럼 작용한다. PS 블록은 LC 액적으로 침투함으로써 혼합된(incorporated) 5CB에 강력하게 고정될 수 있고, LC 액적의 표면상의 친수성 PA 블록은 LC 액적들 사이의 유착을 막을 수 있다.
LC 마이크로액적 에멀젼을 제조하기 위해, 10mg(2.50 × 10-3mmol)의 PS-b-PA는 30mL 반응 유리병에 놓아둔 10mL의 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline) 용액에 분산시켰고, 그 후 50mg(0.173mmol)의 SDS가 또한 첨가되었으며, 형성된 혼합물을 1시간 동안 500rpm에서 교반시켰다. PS-b-PA와 SDS를 적절히 혼합한 후, LC 마이크로액적 에멀젼은 용액에 용해된 50mg의 5CB(0.2mmol)를 적하(dropwise)방식으로 첨가하여 제조되었고, 그 결과 형성된 혼합물은 균질 단분산 5CBSDS / PSPA 마이크로액적을 수득하기 위해 19000 rpm에서 1분 동안 균질기를 이용하여 교반하도록 하였다. 그 결과 형성된 혼합물은 5CBPSPA 마이크로액적을 안정시키기 위하여 30분 동안 두고, 상청액(극히 작은 크기의 5CBPSPA 마이크로액적, 반응하지 않은 SDS 및 블록 공중합체를 함유함)을 제거한다. 안정된 5CBPSPA 마이크로액적은 신선한 DPBS 용액으로 두 번 씻어내고, 이후 실험을 위해 DPBS 용액에 담궜다.
로다민 6G를 이용한 허셉틴의 형광 표지
허셉틴의 표지는 Khan 등의 문헌 [Sensors and Actuators B: Chemical, 2014, 202, 516-522]에 보고된 방법에서 약간 변경된 방법을 이용하여 수행하였다. 간단하게, 허셉틴은 화학 결합제, N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide(EDC)(100mg)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)(100mg)가 첨가된1mg/mL 용액을 수득하기 위해 반응 유리병의 DPBS 완충용액(pH=7.4)에 용해시켰고, 허셉틴의 카르복실기를 활성화하기 위해 0에서 1시간 동안 두었다. 이후, 1mg의 로다민 6G가 첨가되었고 상온의 어두운 곳에서 12시간 동안 교반하였다. 포화된 수성 암모늄 클로라이드(NH4Cl) 용액(0.5g/mL)은 혼합물에 적하방식으로 첨가되었고, 반응을 중지시키기 위해 2시간 동안 배양하였다. 표지된 허셉틴(허셉틴-로다민 6G)은 투석액(DPBS)이 깨끗해질 때까지 24시간 동안 투석 배관 셀룰로스 멤브레인 (MWCO, 12264)을 이용하여 투석하였다. 마지막으로 결합된 샘플은 석영 큐벳(quartz cuvette)에 두었고, 4℃의 어두운 곳의 냉각 장치에 보관하였다.
LC 마이크로액적의 표면에 허셉틴의 결합
5CBSDS / PSPA의 합성 후, 과량의 PS-b-PA와 SDS 용액이 제거되었고, LC 액적은 신선한 DPBS 완충제로 두 번 세척했다. 허셉틴을 고정하기 위하여, PA 사슬의 카르복실기를 1시간 동안 0.4M EDC와 0.1M NHS로 활성화시켰다. 활성화된 5CBSDSP / PSPA 액적을 50㎍/mL의 허셉틴을 함유하는 10mL의 DPBS 버퍼에 두었고 허셉틴-고정 5CB 액적을 수득하기 위해 상온에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후, 항체-결합 LC 액적(이하, 5CBPSPA-Her라 함)을 과량의 허셉틴과 활성화된 카르복실기를 제거하기 위해 pH 8.0 PBS 버퍼로 세척하였다. 마지막으로, LC 마이크로액적은 다음의 탐지 실험을 위해 DPBS 완충액에 두었다.
허셉틴-결합 폴리아크릴산에 의한 LC 액적의 제조
SK-BR3 세포의 탐지에 대한 폴리 스티렌 사슬의 효과를 평가하기 위해, 폴리아크릴산(PAA, PS가 없는 호모폴리머)을 함유하는 LC 마이크로액적을 다음과 같이 제조하였다.
LC 마이크로액적 에멀젼을 제조하기 위해, 100mg(0.324mmol)의 도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(DTAB)를 30mL 반응 유리병에 담긴 10mL의 DPBS(phosphate buffer saline) 용액에 분산시켰고 혼합물을 1시간 동안 500rpm에서 교반하였다. 용액에 용해된 50mg(0.2mmol)의 5CB를 적하방식으로 첨가하여 LC 마이크로액적(5CB 액적) 에멀젼을 제조하였고 그 결과 형성된 혼합물은 균질 단분산 LC 액적을 수득하기 위해 1분 동안 19000rpm으로 균질기를 이용하여 교반하도록 하였다. 그 결과 형성된 혼합물은 5CBDTAB 액적을 안정시키기 위해 30분 동안 두었고, 그 후 상청액(극히 작은 크기의 LC 마이크로액적, 반응하지 않은 DTAB 포함)을 제거하였다. 안정된 5CBDTAB 액적은 다음의 실험을 위해 신선한 DPBS 용액으로 두 번 세척하였고 DPBS 용액에 담궈 두었다. 그리고 난 후 마이크로액적은 정전기 상호작용에 의한 PAA-코팅 5CBDTAB(이하, 5CBDTAB / PAA 액적이라 함)를 수득하기 위해 0.5 wt% PAA 용액에 담궜다. 그 후, LC 액적의 표면에 허셉틴을 고정(이하, 5CBPAA -Her 액적이라 함)하기 위한 방법은 상기 기재된 방법과 유사하다.
LC 마이크로액적 에멀젼의 특성
제조된 LC 마이크로액적 에멀젼은 크기 분포가 균일한 것으로 확인되며, LC 액적은 SDS 없이 블록 공중합체를 사용할 때 양극성 배열(도 2의 (a))인 반면, 상온의 소듐 도데실 설페이트의 존재 하에서는 방사성 배열이었다(도 2의 (b)). 이러한 결과를 바탕으로, 우리는 SDS가, 이의 양친매성 특성으로 인해, PA 블록 층을 통해 침투할 수 있고 LC 액적의 표면에 집중될 수 있다는 것을 제시한다. 이러한 연구는 명확하게 LC 분자가 50mg(0.173mmol)의 SDS 및 20mg의 PS-b-PA를 사용할 때 LC 마이크로액적의 20㎛ 미만의 크기 변화 내에서 방사성 배열에서 안정했다.
입자 크기 및 분포는 입자 크기 분석기를 통해 확인될 수 있다(도 3). LC 마이크로액적의 평균 직경은 10.5㎛이다. 1㎛ 미만의 마이크로액적의 배향은 실험에 사용된 편광 현미경에서 검출되는 것이 쉽지 않다. 따라서 이들은 원심분리에 의해 제거되었다.
5CB PSPA , 5CB PSPA -Her , 5CB PAA 및 5CB PAA -Her 액적의 배향
수성 배지에 분산된 아무것도 결합되지 않은 5CB 액적은 다른 곳에서 보고된 바와 같이 양극성 배열을 나타낸다. 방사성 배열은 친수성 헤드기의 특성으로부터의 효과와 관계없이 5CB 분자로 계면활성제의 소수성 꼬리의 흡착으로 인한 것이다. 도 4는 방사성 배열을 나타내는 5CBSDS / PSPA와 5CBDTAB / PAA의 광학(왼쪽) 및 POM(오른쪽) 이미지를 보여준다. 이와 같은 결과를 바탕으로, 계면활성제(SDS 및 DTAB)는, 이들의 양친매성 특성으로 인해, 고분자전해질(PS-b-PA 및 PAA) 층을 통해 침투할 수 있고 LC 액적의 표면으로 집중될 수 있다. 따라서, 계면활성제의 존재는 액적에서의 LC 배열에 영향을 준다.
도 5는 PS-b-PA 또는 PAA로부터의 활성화된 카르복실기에 각각 허셉틴을 고정한 후 방사성 배열을 나타내는 5CBPSPA -Her과 5CBPAA -Her의 광학(왼쪽) 및 POM(오른쪽) 이미지를 보여준다. 이 결과로 허셉틴의 화학적 고정이 LC 액적의 배열에 영향을 주지 않았으며 둘 다 각각 방사성 형태를 나타낸다는 것을 확인하였다.
LC 마이크로액적에 고정된 허셉틴의 확인
블록 공중합체의 PA 사슬에 허셉틴이 고정된 것을 확인하기 위하여, 도 6에 도시된 바와 같이 5CBPSPA -Her- rhd 액적을 관찰하기 위해 형광 현미경이 사용되었다. 액적은 5CBPSPA -Her- rhd의 형광 이미지에서 녹색의 구모양으로 명확하게 보이는 반면, 나머지 다른 영역은 검게 나타났으며, 이는 허셉틴이 PA 사슬에 성공적으로 고정되었고 방사성 배열로 남아있음을 나타낸다. 도 7은 허셉틴-로다민 6G, 허셉틴 및 로다민 6G의 UV-Vis 스펙트라를 보여준다. 허셉틴-로다민 6G의 스펙트럼은 240nm에서 223nm까지의 특징적인 허셉틴 피크의 청색 이동(blue shift)을 갖는 순수 로다민 6G에 대해 530nm에서 관찰된 동일하고 강력한 흡광도를 특징으로 하였고, 이는 PA와 허셉틴 사이의 아미드 결합의 형성을 나타낸다(도 7 참조). 이 데이터는 로다민 6G로 허셉틴을 성공적으로 표지하였음을 나타낸다. 그 후, 허셉틴-로다민 6G는 5CBPSPA 액적에 사용했던 방법과 동일한 방법을 사용하여 5CBPAA 액적에 고정되었다. 허셉틴-로다민 6G 마이크로액적은 반응하지 않은 허셉틴-로다민 6G를 제거하기 위해 DPBS로 세척하였고, 결과적으로 형성된 허셉틴-로다민 6G-고정 LC 액적 5CBPSPA -Her-rhd와 5CBPAA -Her- rhd는 도 6에 도시된 바와 같이 디지털 카메라에 결합된 형광 현미경으로 관찰되었다.
표면에 허셉틴을 고정한 후, LC 마이크로액적의 배향에 대한 영향을 평가하기 위해, 서로 다른 농도의 허셉틴-로다민 6G(1, 10, 20, 50㎍/mL)를 사용하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 이러한 결과는 서로 다른 농도의 허셉틴-로다민 6G를 이용하여, 더 높은 농도가 사용된 경우 더 많은 양의 허셉틴이 결합 될 수 있고, 더 밝고 짙은 녹색을 보인다는 것을 나타내었다. 또한, 허셉틴의 화학적 고정은 LC 액적의 배향에 영향을 주지 않았으며, 서로 다른 농도에서 방사성 배열을 보여준다.
SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포와 5CB PSPA -Her 마이크로액적 에멀젼
SK-BR3 세포의 탐지에 있어서 허셉틴-결합 LC 마이크로액적 에멀젼의 민감성을 평가하기 위해, 5CBPSPA -Her 마이크로액적은 SK-BR3 세포(인간 유방암세포), KB 암세포(상피암세포) 및 FB 세포(섬유아세포)와 5000 cells/mL의 세포 농도에서 3시간 동안 30 ℃로 배양하였고, 그 후 LC 마이크로액적의 명시야(bright field) 및 편광(교차 극성) 이미지가 도 9에 보여지는 바와 같이 액적에서의 LC 분자의 디렉터 프로파일(director profile)에 따라 기록되었다. SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포의 존재 하에 5CBPSPA -Her 액적의 명시야 이미지(도 9의 (a), (c) 및 (e))는 원으로 나타낸 바와 같이 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 KB 세포(도 9의 (c)), FB 세포(도 9의 (e)) 및 SK-BR3 세포(도 9의 (a))의 상호작용을 확인하였다. 이러한 세포들의 상호작용이 LC 마이크로액적의 배향 상태에 미치는 영향을 평가하기 위해, 편광 현미경 사진이 각각 SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포와 상호작용하는 5CBPSPA -Her 마이크로액적(도 9의 (b), (d) 및 (f))에 대해 기록되었다. SK-BR3 세포(도 9의 (b))의 존재 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적의 POM 이미지는 LC 액적의 배향이 방사성에서 양극성으로 변환된다는 것을 나타낸다. KB 세포(도 9의 (d)) 및 FB 세포(도 9의 (f))와 5CBPSPA -Her 마이크로액적 에멀젼의 상호작용은 나타낸 바와 같이 각각 방사성에서 양극성으로의 배향 변화를 보이지 않았다.
이러한 실험은 SK-BR3 세포와 허셉틴-결합 LC 마이크로액적의 상호작용이 유효하며, KB 암세포(도 9의 (c), (d)) 및 FB 세포(도 9의 (e), (f))와의 상호작용과 비교하여, LC 분자의 배향 변화(도 9의 (a), (b))를 일으키는데 중요하고, 이상 유체 PBS에서 SK-BR3의 탐지를 위해 사용될 수 있다는 것을 명확하게 나타낸다.
5CB PSPA -Her 마이크로액적 에멀젼과 장시간 배양된 SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포
SK-BR3 세포의 탐지에 있어서 세포학적 형태 효과를 평가하기 위하여, 모든 세포는 세포막이 펴질 때까지 장시간에 걸쳐 배양하였다. 그 후, LC 마이크로액적은 SK-BR3 세포, KB 암세포 및 FB 세포와 5000 cells/mL의 세포 농도에서 30 ℃로 3시간 동안 배양하였고, 그리고 난 후 5CBPSPA -Her 마이크로액적의 명시야 및 편광(교차 극성) 이미지가 도 10에 보여지는 바와 같이 액적에서의 LC 분자의 디렉터 프로파일(director profile)에 따라 기록되었다.
SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포의 존재 하에 5CBPSPA -Her 액적의 명시야 이미지(도 10의 (a), (c) 및 (e))는 원으로 나타낸 바와 같이 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 KB 세포(도 10의 (c), FB 세포(도 10의 (e)) 및 SK-BR3 세포(도 10의 (a))의 상호작용을 확인하였다. 이러한 세포들의 상호작용이 LC 마이크로액적의 배향 상태에 미치는 영향을 평가하기 위해, 편광 현미경 사진이 각각 SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포와 상호작용하는 5CBPSPA -Her 마이크로액적(도 10의 (b), (d) 및 (f))에 대해 기록되었다. SK-BR3 세포의 존재 하에 5CBPSPA -Her 마이크로액적의 POM 이미지(도 10의 (b))는 LC 액적의 배향이 방사성에서 양극성으로 변환된다는 것을 나타낸다. KB 세포(도 10의 (d)) 및 FB 암세포(도 10의 (f))와 5CBPSPA -Her 마이크로액적의 상호작용은 나타낸 바와 같이 각각 방사성에서 양극성으로의 배향 변화를 보이지 않았다.
이러한 실험은 SK-BR3 세포와 허셉틴-결합 LC 마이크로액적의 상호작용이 유효하며, KB 암세포(도 10의 (c), (d)) 및 FB 세포(도 10의 (e), (f))와의 상호작용과 비교하여, LC 분자의 배향 변화(도 10의 (a), (b))를 일으키는데 중요하고, 장시간의 배양 연구에서도 SK-BR3의 탐지를 위해 사용될 수 있다는 것을 명확하게 나타낸다.
FBS 또는 인간 혈장에서의 5CB PSPA -Her 마이크로액적 에멀젼과 SK-BR3 세포, FB 세포 및 KB 세포
SK-BR3 세포의 탐지에 있어서 허셉틴-결합 LC 마이크로액적 에멀젼의 민감성을 평가하기 위해, 5CBPSPA -Her 마이크로액적은 SK-BR3 세포, KB 암세포 및 FB 세포와 5000 cells/mL의 세포 농도에서 30 ℃로 3시간 동안 배양하였고, 그 후 5CBPSPA -Her 마이크로액적의 명시야 및 편광 이미지가 도 11에 보여지는 바와 같이 액적에서의 LC 분자의 디렉터 프로파일(director profile)에 따라 기록되었다. SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포의 존재 하에 5CBPSPA -Her 액적의 명시야 이미지(도 11의 (a), (c) 및 (e))는 원으로 나타낸 바와 같이 5CBPSPA -Her 마이크로액적과 SK-BR3 세포(도 11의 (a)) 및 KB 암세포(도 11의 (c))의 상호작용 및 섬유아세포(도 11의 (e))와의 상호작용을 확인하였다. 이러한 세포들의 상호작용이 LC 마이크로액적의 배향 상태에 미치는 영향을 평가하기 위해, SK-BR3 세포, KB 세포 및 FB 세포와 배양된 LC 마이크로액적의 편광 현미경 사진(도 11의 (b), (d) 및 (f))이 각각 기록되었다. SK-BR3 세포의 존재하에 LC 마이크로액적의 POM 이미지는 도 11의 (b)의 서브세트에서의 화살표에 의해 나타낸 바와 같이 LC 액적의 배향이 방사성에서 양극성으로 변환된다는 것을 나타낸 반면, KB 암세포(도 11의 (d)) 및 FB 세포(도 11의 (e))와 LC 마이크로액적 에멀젼의 상호작용은 방사성에서 양극성으로의 배향 변화를 보이지 않았다.
이러한 실험은 SK-BR3 세포와 허셉틴-결합 LC 마이크로액적의 상호작용이 FBS 하에서 유효하며, KB 암세포(도 11의 (c), (d)) 및 섬유아세포(도 11의 (e), (f))와의 상호작용과 비교하여, LC 분자의 배향 변화(도 11의 (a), (b))를 일으키는데 중요하고, SK-BR3 세포의 탐지를 위해 사용될 수 있다는 것을 명확하게 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 10% 혈장으로부터 유사한 결과를 얻었다. 따라서, 이 실험에서 10% FBS 또는 10% 혈장의 효과는 없었다.
허셉틴-결합 LC 액적에 의한 SK-BR3의 선택적인 탐지
도 13의 명시야 이미지는 염색된 SK-BR3 세포 및 염색되지 않은 통제된 세포와 LC 마이크로액적의 접촉을 나타냈다. SK-BR3 세포(파란색)와 LC 마이크로액적의 상호작용은 파란색으로 염색된 세포와 접촉한 두 개의 LC 마이크로액적에 나타낸 바와 같이 방사성으로부터 양극성으로 배열 변화를 유도했지만 대조군 세포(하얀색)들은 화살표로 나타낸 도 13의 (a), (b)의 서브세트에 보여지는 바와 같이 LC 액적의 배열을 유도하지 않았다. 이러한 연구들은 허셉틴 결합 LC 마이크로액적이 KB 세포 또는 FB 세포의 존재 하에서도 SK-BR3 세포와 효과적으로 상호작용하는데 선택적이었다는 것을 명확하게 나타내었다. 한편으로는, 염색된 메틸렌 블루의 효과를 배제하기 위해, 유사한 실험이 동일한 조건 하에서 염색된 대조군 세포들과 염색되지 않은 SK-BR3을 이용하여 수행되었다. 그 결과, 유사한 결과가 도 13의 (c) 및 (d)에 보여지는 바와 같이 수득되었다.
이러한 결과들은 허셉틴-결합 LC 마이크로액적 에멀젼이 KB 암세포와 다른 대조군 세포들의 존재 하에서도 SK-BR3 세포를 탐지할 수 있고, SK-BR3 세포에 대한 선택성이 KB 암세포와 다른 대조군 세포들의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 명확하게 나타낸다.
또한, 10% FBS 용액(도 14의 (a), (b)) 및 10% 혈장 용액(도 14의 (c), (d))에서도 동일한 결과가 관찰되었다. 따라서, 공동 배양 실험에서 다른 단백질들의 효과는 없다고 말할 수 있다. SK-BR3 세포의 탐지를 위한 LC 마이크로액적 에멀젼의 선택성은 인간 전립선 암세포, HER-2 저발현 유방암 세포 및 결장 종양 세포와 같은 다른 대조군 암세포들의 존재 하에서도 SK-BR3 세포의 탐지를 위한 앱타머 기반 전기화학적 바이오센서에서 보여지는 선택성과 동일하다는 것을 발견하였다.
SK-BR3 세포와 5CB PAA -Her 마이크로액적 에멀젼
SK-BR3 세포의 탐지에 있어서 스티렌 부분(segment)의 효과를 평가하기 위해, PA(폴리아크릴산, PS가 없는 호모폴리머)를 함유하는 LC 마이크로액적이 허셉틴과 결합되었고, 그 후 5000 cells/mL의 세포 농도에서 3시간 동안 30 ℃로 SK-BR3 세포와 배양하였다. LC 마이크로액적의 명시야 및 편광(교차 극성) 이미지가 기록되었고, 액적에서의 LC 분자의 디렉터 프로파일에 따라 도 15에 보여지는 바와 같았다. SK-BR3 세포의 존재 하에 LC 마이크로액적의 명시야 이미지는 원으로 나타낸 바와 같이 5CBPSPA -Her 마이크로액적(도 15의 (a)) 및 5CBPAA - Her마이크로액적(도 15의 (b))과 SK-BR3 세포의 상호작용을 확인시켜주었다. 그러나 5CBPSPA -Her 마이크로액적은 도 15의 (b)의 서브세트에서 화살표로 나타낸 바와 같이 방사성에서 양극성으로의 배향변화를 나타냈지만, 5CBPAA - Her마이크로액적(허셉틴-고정 PAA와 결합된 LC 마이크로액적)은 도 15의 (d)의 서브세트에서 화살표로 나타낸 바와 같이 방사성에서 양극성으로의 배향 변화를 나타내지 않았다.

Claims (11)

  1. 액정(liquid crystals);
    허셉틴(Herceptin) 항체가 고정된 블록 공중합체; 및
    계면활성제; 를 포함하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets).
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로액적은 계면활성제에 의해 형성된 마이셀(micelle) 구조로서,
    상기 액정은 마이크로액적 내부에 존재하며, 상기 블록 공중합체의 소수성 부분은 마이크로액적 내부에 존재하고, 상기 허셉틴 항체는 상기 블록 공중합체의 친수성 부분과 결합하여 마이크로액적 외부에 노출되어 있는 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  3. 제1항에 있어서, 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'헥실바이페닐 및 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  4. 제1항에 있어서, 상기 블록 공중합체는 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적;
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    상기 화학식 1에서, x 는 50 ~ 75 이고, y 는 25 ~ 35 이다.
  5. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트 또는 도데실트리메틸암모늄인 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  6. 제1항에 있어서, 상기 허셉틴 항체가 유방암세포의 항원과 비결합시에는 상기 액정이 방사형 배열(radial conformation)을 가지며, 상기 허셉틴 항체가 유방암세포의 항원과 결합 시에는 상기 액정이 양극성 배열(bipolar conformation)을 갖는 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유방암세포는 SK-BR3 세포인 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  8. 제6항에 있어서, 상기 유방암세포의 항원은 HER2+ 단백질인 것을 특징으로 하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  9. 4-시아노-4'-펜틸바이페닐;
    허셉틴 항체가 고정된 폴리(스티렌-b-아크릴산); 및
    소듐 도데실 설페이트 또는 도데실트리메틸암모늄을 포함하는 유방암세포 센싱용 LC 마이크로액적.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LC 마이크로액적을 포함하는 유방암세포 센싱용 바이오센서.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 LC 마이크로액적을 이용하여 유방암세포를 센싱하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190019351A (ko) * 2017-08-17 2019-02-27 경북대학교 산학협력단 Paa-apba로 코팅된 액정 미세액적, 이의 제조방법 및 이를 이용한 비효소 기반 글루코스 바이오센서

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