KR20170024873A - Pharmaceutical composition for prevention or treatment of Gaucher disease containing mesenchymal stem cells - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 고셔병 치료용 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells, or a stem cell therapeutic agent for treating Gaucher disease.
고셔병은 글루코세레브로시다제 유전자(GBA)의 돌연변이에 의해 발생되는 상염색체 열성적 리소좀 축적 질병이다. 고셔병은 효소 GCase의 유전적 결핍에 의해 발생하는데, GCase를 인코딩하는 유전자인 GBA의 돌연변이는 글루코실세라마이드(GluCer)의 분해를 결핍시키고, 이후에는 GluCer가 간, 비장, 골수, CNS에 축적되어 병리학 및 치명적인 신경학적 증상을 나타내게 된다. 임상학적으로, 고셔병의 두가지 주요 카테고리는 비-신경병증형(non-neuropathic) 및 신경병증형(neuropathic) 고셔병이며, 이는 다시 3가지 유형으로 세분화될 수 있다. 제1형 고셔병은 가장 흔한 형태의 질병이고 비-신경병증형 고셔병을 포함한다. 제2형 및 제3형 고셔병은 급성 및 아급성 신경병증형 고셔병을 포함한다. 신경병증형 고셔병 환자의 경우 GluCer의 독성 효과에 의해 신경계에서 신경이 괴사되고 신경이 떨어져나가는 증상을 보인다. 하지만, 이러한 신경 괴사에 이르는 분자적인 반응에 대해서는 밝혀진 바가 거의 없다. 제1형 고셔병을 위한 치료방법으로는 효소 대체 치료법이 널리 행해지고 있으나, 현재 제1형 고셔병보다 치명적이며 사망률이 높은 제2형 및 제3형 고셔병의 치료 방법이 없어 이를 치료하기 위한 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다.Gaucher disease is an autosomal recessive lysosomal disease caused by a mutation of glucocerebrosidase gene (GBA). Gaucher disease is caused by a genetic deficiency of enzyme GCase. The mutation of GBA, a gene encoding GCase, deficiency of glucosylceramide (GluCer) degradation, and then GluCer accumulates in liver, spleen, bone marrow, CNS, And fatal neurological symptoms. Clinically, the two main categories of Gaucher disease are non-neuropathic and neuropathic Gaucher disease, which can be further subdivided into three types.
한편, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 스트로마 기원의 세포로 자가 재생(self-renewal)의 특징을 가지고 있으며 여러 세포 계통으로 분화될 수 있다. 이러한 중간엽줄기세포는 제대혈(umbilical cord blood), 바르톤 젤리(Wharton's jelly), 골수, 태반이나 지방조직으로부터 분리 될 수 있으므로 윤리적 문제를 야기 할 수 있는 다른 종류의 줄기세포보다 세포치료 기법으로 적합하다. 중간엽줄기세포의 또 다른 특징은 염증 부위로의 회귀성(homing ability)이다. 중간엽줄기세포의 회귀 기전은 손상된 조직 또는 골수에서 발현되는 SDF-1(CXCL12)에 의해 그 수용체인 CXCR4를 발현하는 줄기세포가 손상조직 내로 이동하는 것에서 비롯된다고 알려져 있다. 이러한 회귀성으로 인해 중간엽줄기세포는 유전자 치료 및 약물 전달 시스템 자체로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 염증 부위로의 회귀성을 이용하여 약물을 이동시킬 경우, 약물이 염증부위에만 전달되게 되어 다른 장기의 손상 등 부작용을 최소화할 수 있다고 알려 져있다.On the other hand, mesenchymal stem cells are cells of stromal origin and have self-renewal characteristics and can be differentiated into various cell lines. These mesenchymal stem cells can be isolated from umbilical cord blood, Wharton's jelly, bone marrow, placenta, or adipose tissue and are therefore more suitable for cell therapy than other types of stem cells that can cause ethical problems Do. Another characteristic of mesenchymal stem cells is their homing ability to the site of inflammation. It is known that the regression mechanism of mesenchymal stem cells arises from the migration of stem cells expressing its receptor CXCR4 into damaged tissue by SDF-1 (CXCL12) expressed in damaged tissue or bone marrow. Due to this regression, researches on the use of mesenchymal stem cells as gene therapy and drug delivery systems themselves have been actively carried out. In particular, it is known that when the drug is transferred using the regression to the inflammation site, the drug is delivered only to the inflammation site, thereby minimizing adverse effects such as damage to other organs.
현재 급성 및 만성 세균성 염증 질환, 낭포성 섬유증 및 패혈증 등의 염증 관련 질환에 있어 중간엽줄기세포의 효능이 입증되어 그 활용성이 주목받고 있으나, 고셔병과의 관계에 대해서는 전무한 상태이다. Currently, the efficacy of mesenchymal stem cells in inflammatory diseases such as acute and chronic bacterial inflammatory diseases, cystic fibrosis and septicemia has been proved and its utilization has attracted attention, but there is no relation with the Gaucher disease.
이처럼 고셔병을 효과적으로 치료하고 내성을 유발하지 않는 새로운 치료법 및 줄기세포 치료제에 관한 필요성이 절실하다.
Thus, there is an urgent need for new therapies and stem cell therapies that effectively treat Gaucher's disease and do not cause resistance.
본 발명자들은 중간엽줄기세포가 신경성 줄기세포의 자가재생, 분화, 및 증식을 촉진하는 효과가 있음을 확인하였고, 중간엽줄기세포에서 분비되는 수용성 인자인 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 고셔병의 치료를 위한 후보물질로 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors confirmed that mesenchymal stem cells have an effect of promoting autoreplication, differentiation and proliferation of neuroblastoma stem cells, and have found that M-CSF (macrophage colony stimulating factor), which is a soluble factor secreted from mesenchymal stem cells, The present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
본 발명의 다른 목적은 중간엽줄기세포 유래 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 유효성분으로 포함하는 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher's disease, which comprises an mesenchymal stem cell-derived macrophage colony stimulating factor (M-CSF) as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a stem cell treatment agent for treating Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
또한, 본 발명은 중간엽줄기세포 유래 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 유효성분으로 포함하는 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher disease, which comprises an mesenchymal stem cell-derived macrophage colony stimulating factor (M-CSF) as an active ingredient.
또한, 본 발명은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.
The present invention also provides a stem cell treatment agent for treating Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
본 발명의 중간엽줄기세포 또는 중간엽줄기세포 유래 M-CSF는 신경성 줄기세포의 자가재생, 증식 및 분화를 촉진시키는 효과가 있으므로, 고셔병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
The mesenchymal stem cell or mesenchymal stem cell-derived M-CSF of the present invention has an effect of promoting autoreplication, proliferation and differentiation of neural stem cells, and thus can be usefully used for prevention or treatment of Gaucher disease.
도 1은 고셔병 마우스 모델의 NSC (신경성 줄기세포, neuronal stem cell)에서 GCase의 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 2는 고셔병 마우스 모델의 NSC에서 GluCer 수준을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다 (*P < 0.05).
도 3은 BM-MSC (골수유래 중간엽줄기세포, bone marrow-mesenchymal stem cell)의 NSC의 자가재생능 및 증식에 대한 효과를 검증하기 위한 실험 설계를 나타낸 도이다.
도 4는 BM-MSC와 NSC의 간접 공동배양시 NS (neurosphere) 형성의 분석 결과를 나타낸 도이다 (스케일 바, 1 mm).
도 5는 BM-MSC와 NSC의 간접 공동배양시 NSC의 증식 향상 효과 여부를 면역 형광 검출로 확인한 도이다 (스케일 바, 20 mm).
도 6은 BM-MSC의 NSC 증식 향상 효과와 GCase 활성의 관계를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005).
도 7은 BM-MSC가 NSC의 분화에 미치는 효과 분석을 위한 실험 설계를 나타낸 도이다.
도 8은 BM-MSC가 NSC의 분화에 미치는 효과 분석을 위하여 뉴런의 마커인 βⅢ-tubulin-양성 세포의 형광 이미지 및 세포의 정량적 분석 결과를 나타낸 도이다 (스케일 바, 50 mm).
도 9는 BM-MSC가 NSC의 분화에 미치는 효과 분석을 위하여 뉴런의 마커인 βⅢ-tubulin-양성 세포의 형광 이미지를 나타낸 도이다 (스케일 바, 50 mm).
도 10은 BM-MSC가 NSC의 분화에 미치는 효과 분석을 위하여 성상세포의 마커인 MBP-양성 세포의 형광 이미지 및 세포의 정량적 분석 결과를 나타낸 도이다 (스케일 바, 50 mm).
도 11은 BM-MSC가 NSC의 분화에 미치는 효과 분석을 위하여 희돌기세포의 마커인 GFAP-양성 세포의 형광 이미지 및 세포의 정량적 분석 결과를 나타낸 도이다 (스케일 바, 50 mm).
도 12는 BM-MSC가 뉴런의 형태발생에 미치는 영향을 확인한 도이다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다 (*P < 0.05, ***P < 0.005).
도 13은 BM-MSC 유래 50개의 서로 다른 사이토카인에 대한 상대적 발현 양상을 분석한 도이다.
도 14는 NSC에서 BM-MSC 유래 사이토카인인 M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2 및 MMP-3의 qRT-PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 BM-MSC와 간접 공동배양된 NSC에서 M-CSF의 발현을 ELISA 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P < 0.05).
도 16은 M-CSF의 NS 형성 능력을 확인한 도이다 (§§§P < 0.005, #P < 0.05).
도 17은 M-CSF의 NSC 증식 촉진 효과를 확인한 도이다 (§P < 0.05, #P < 0.05).
도 18은 M-CSF의 NSC 분화 촉진 효과를 확인한 도이다.FIG. 1 is a graph showing the results of measurement of GCase activity in NSC (neuronal stem cell) of a Gaucher mouse model. All data are expressed as mean ± SEM.
2 is a graph showing the results of confirming the GluCer level in the NSC of the Gaucher mouse model. All data were expressed as mean ± SEM (* P < 0.05).
FIG. 3 is an experimental design for verifying the effect of BM-MSC (bone marrow-mesenchymal stem cell) on the self-renewal and proliferation of NSC.
Fig. 4 is a graph showing the results of analysis of NS (neurosphere) formation in an indirect co-culture of BM-MSC and NSC (scale bar, 1 mm).
FIG. 5 is a chart (scale bar, 20 mm) showing the effect of NSC proliferation enhancement upon indirect co-culture of BM-MSC and NSC by immunofluorescence detection.
FIG. 6 shows the results of confirming the relationship between the effect of enhancing NSC proliferation of BM-MSC and GCase activity. All data were expressed as mean ± SEM (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.005).
FIG. 7 shows an experimental design for analyzing the effect of BM-MSC on NSC differentiation.
FIG. 8 is a graph showing quantitative analysis of fluorescence images and cells (scale bar, 50 mm) of βIII-tubulin-positive cells, which are markers of neurons, for analyzing the effect of BM-MSC on NSC differentiation.
FIG. 9 is a fluorescence image (scale bar, 50 mm) of βIII-tubulin-positive cells, which is a marker of neurons, for the analysis of the effect of BM-MSC on NSC differentiation.
FIG. 10 is a graph showing quantitative analysis of fluorescence images and cells (scale bar, 50 mm) of MBP-positive cells, which are markers of astrocytic cells, for the purpose of analyzing the effect of BM-MSC on NSC differentiation.
FIG. 11 is a graph showing quantitative analysis of fluorescence images and cells (scale bar, 50 mm) of GFAP-positive cells, which are markers of spiral cells, for the analysis of the effect of BM-MSC on NSC differentiation.
Fig. 12 is a view showing the influence of the BM-MSC on the morphogenesis of neurons. All data were expressed as mean ± SEM (* P <0.05, *** P <0.005).
Figure 13 is an analysis of the relative expression patterns of 50 different BM-MSC-derived cytokines.
FIG. 14 shows qRT-PCR results of M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2 and MMP-3 which are BM-MSC derived cytokines in NSC.
FIG. 15 shows the results of ELISA analysis of the expression of M-CSF in indirectly co-cultured NSC with BM-MSC (* P <0.05).
FIG. 16 is a chart for confirming NS-forming ability of M-CSF (§§P <0.005, #P <0.05).
FIG. 17 is a graph showing the effect of promoting NSC proliferation of M-CSF (§P <0.05, #P <0.05).
FIG. 18 is a chart for confirming the NSC differentiation promoting effect of M-CSF. FIG.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
본 발명에서 "고셔병"은 글루코세레브로시다제 유전자(GBA)의 돌연변이에 의해 발생되는 유전병으로, 고셔병은 효소 GCase의 유전적 결핍에 의해 발생한다. 본 발명에서 고셔병은 비-신경병증형 및 신경병증형 고셔병을 모두 포함하나, 바람직하게는 신경병증형 고셔병을 의미한다.In the present invention, "Gaucher disease" is a genetic disease caused by mutation of glucocerebrosidase gene (GBA), and Gaucher disease is caused by genetic deficiency of enzyme GCase. In the present invention, the Gaucher disease includes both non-neuropathic and neuropathic Gaucher disease, but preferably refers to a neuropathic Gaucher disease.
본 발명에서 용어 "중간엽줄기세포"는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 만능 전구 세포를 말한다. 본 발명에서 중간엽줄기세포는 분화되지 않은 상태로 조성물 중에 함유된다. 본 발명의 중간엽줄기세포는 골수, 제대혈, 바르톤 젤리(Wharton's jelly), 태반 및 지방조직에서 유래할 수 있으나, 바람직하게는 골수에서 유래한다. The term "mesenchymal stem cell" in the present invention refers to an allogeneic precursor cell before differentiation into specific organs such as bone, cartilage, fat, tendon, nerve tissue, fibroblast and muscle cell. In the present invention, the mesenchymal stem cells are contained in the composition in an undifferentiated state. The mesenchymal stem cells of the present invention may be derived from bone marrow, umbilical cord blood, Wharton's jelly, placenta and adipose tissue, but are preferably derived from bone marrow.
본 발명의 중간엽줄기세포는 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 포함한다. M-CSF는 사이토카인으로서 중간엽줄기세포에서 분비되는 수용성 인자이다.The mesenchymal stem cells of the present invention include macrophage colony stimulating factor (M-CSF). M-CSF is a cytokine that is a soluble factor secreted from mesenchymal stem cells.
본 발명의 중간엽줄기세포 또는 중간엽줄기세포 유래 M-CSF는 신경성 줄기세포(NSC, neuronal stem cell)의 자가재생능(self-renewal ability)을 회복시키고 증식 및 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 한다.The mesenchymal stem cell or mesenchymal stem cell-derived M-CSF of the present invention is characterized by restoring the self-renewal ability of neuronal stem cells (NSC) and promoting proliferation and differentiation .
본 발명에서 용어 "자가재생능(self-renewal ability)"은 줄기세포(stem cell)가 세포 분열을 하여 또 하나의 동일한 줄기세포를 만드는 것을 의미한다. 이 때 만들어진 줄기세포는 줄기세포가 지닌 고유의 특성인 자가재생능과 분화능을 동일하게 보유한다.The term "self-renewal ability" in the present invention means that a stem cell undergoes cell division to produce another identical stem cell. The stem cells produced in this case have the same self-renewal and differentiation ability as the inherent characteristics of the stem cells.
본 발명에서 용어 "증식(proliferation)"은 세포가 세포분열을 하여 그 수가 증가하는 것을 의미한다. In the present invention, the term "proliferation" means that cells undergo cell division resulting in an increase in the number of cells.
본 발명에서 용어 "분화(differentiation)"는 줄기세포가 특정한 세포로 발달하는 것을 의미한다.The term "differentiation " in the present invention means that a stem cell develops into a specific cell.
본 발명에서 "신경성 줄기세포(neuronal stem cell)"란 자가재생능을 지니며 신경세포(neurons), 성상세포(astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrogytes)로의 분화능력을 가진 세포를 의미한다.In the present invention, the term "neuronal stem cell" refers to a cell having a self-renewal ability and capable of differentiating into neurons, astrocytes, and oligodendrogens.
또한, 본 발명은 중간엽줄기세포 유래 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 유효성분으로 포함하는, 고셔병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher's disease, comprising an mesenchymal stem cell-derived macrophage colony stimulating factor (M-CSF) as an active ingredient.
본 발명에 따른 중간엽줄기세포는 다분화성의 성질을 갖는 한 제한되지 않으며, 인간을 포함한 포유동물, 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체세포로부터 유래할 수 있다. 예를 들어 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방 조직세포), 바르톤 젤리(wharton's jelly)등으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 골수로부터 유래될 수 있다.The mesenchymal stem cells according to the present invention are not limited as long as they have pluripotency, and may be derived from adult cells such as mammals including humans, all known tissues derived from humans, cells and the like. For example, can be derived from bone marrow, umbilical cord blood, placenta (or placental tissue cells), fat (or adipose tissue cells), wharton's jelly and the like, preferably from bone marrow.
상기 중간엽줄기세포의 분리방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리되고 정제될 수 있으며 분리된 중간엽줄기세포는 필요에 따라 배양할 수도 있다. Methods for the isolation of mesenchymal stem cells are known in the art. For example, bone marrow, peripheral nerve blood, umbilical cord blood, periosteum, dermis, mesenchymal tissue and the like, and the isolated mesenchymal stem cells may be cultured as needed.
본 발명의 중간엽줄기세포는 세포 단독 혹은 배양기에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스콘치올카(Douglas Kondziolka, Pittsburgh,1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 상기 중간엽줄기세포외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 포함할 수 있다.The mesenchymal stem cells of the present invention can be injected into a patient's body in a state where the cells are cultured alone or in an incubator. For example, Lyndal et al. (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) or Douglas conchiolca (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998). In addition to the mesenchymal stem cells, the formulation may contain conventional pharmaceutically acceptable carriers. In the case of injections, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers may be included. In the case of topical preparations, bases, excipients, Preservatives, and the like.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, no. The composition of the present invention may further contain lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. in addition to the above components.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The composition of the present invention may be prepared in a unit dose form by formulating it with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in an oil or aqueous medium, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 바람직하게는 병변이 발생한 부위에 직접 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.The composition of the present invention can be administered parenterally, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically, and preferably can be administered directly to the affected site. Compositions for parenteral administration (e. G., Injections) of the compositions according to the present invention can be prepared by dispersing and / or dissolving a pharmaceutically acceptable carrier, e. G., Sterile purified water, buffer at about pH 7, or physiological saline, And if necessary, may contain conventional additives such as preservatives, stabilizers and the like.
또한, 본 발명에서 주입되는 중간엽줄기세포의 양은 104-1010cells/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 105-109 cells/회로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5×108cells/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 주입되는 중간엽줄기세포 유래 M-CSF는 50ng-500mg/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 10mg-200mg/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
In addition, the amount of mesenchymal stem cells injected in the present invention may be 10 4 -10 10 cells / sec, preferably 10 5 -10 9 cells / sec, and most preferably 5 × 10 8 cells / cells / circuit, but is not limited thereto. In addition, the mesenchymal stem cell-derived M-CSF injected into the present invention may be administered at 50ng-500mg / cycle, preferably 10mg-200mg / cycle, but is not limited thereto. The dose may be variously prescribed depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and responsiveness of the patient.
또한, 본 발명은 중간엽줄기세포를 포함하는 고셔병 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.The present invention also provides a stem cell treatment agent for treating Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
본 발명에서 용어 "세포 치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)이며, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아 있는 자가, 동종 또는 이종 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.
The term "cell therapeutic agent" in the present invention refers to a medicament (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention of cells and tissues prepared by separation, culture and special manipulation from a human, Diagnosis, and prevention through a series of actions such as alive, homologous or xenogeneic cell propagation, screening, or otherwise altering the biological characteristics of a cell.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 고셔병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prophylactic " means any action that inhibits or slows the progression of Gaucher disease by administration of the composition of the present invention.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 고셔병이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "treatment" refers to any action in which the administration of the composition of the present invention improves or alleviates the Gaucher disease.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Terms not otherwise defined herein have meanings as commonly used in the art to which the present invention belongs.
본 발명의 약학적 조성물은 결핵의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the prevention and treatment of tuberculosis.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following.
제조예Manufacturing example 1 - 고셔병 마우스 모델의 제조 1 - Manufacture of Gaucher Mouse Model
Gbaflox / flox ; nestin-Cre 마우스(이하 'Gba-/- 마우스'라 한다)를 신경병성 고셔병의 모델로 사용하였다 (Enquist et al., 2007). Gba-/- 마우스를 제조하기 위해 Gbaflox/flox 마우스를 정상 대조군인 Gbaflox /+ ; nestin-Cre 마우스(이하 'Gba+/- 마우스'라 한다)와 교배하였다. 교배 후 마우스의 유전형질분석(genotyping)을 위해 꼬리에서 genomic DNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. 모든 과정은 Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee에 의하여 승인된 프로토콜에 따랐으며, 제조된 고셔병 마우스 모델을 온도 조절되며 밤낮이 12시간씩 반복되는 방에서 사육하였다.
Gba flox / flox ; nestin-Cre mice (hereinafter referred to as 'Gba - / - mice') were used as neuropathic Gaucher disease models (Enquist et al., 2007). To prepare Gba - / - mice, Gba flox / flox mice were treated with normal control Gba flox / + ; nestin-Cre mice (hereinafter referred to as " Gba +/- mice "). Genomic DNA was extracted from the tail for genotyping of mice after mating and PCR was performed. All the procedures were followed by protocols approved by the Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee. The manufactured Gaucher mouse model was temperature-regulated and housed in a room that was repeated 12 hours a day and night.
제조예Manufacturing example 2 - NSC(neuronal stem cell, 신경 줄기세포)의 분리, 배양 2 - Isolation and culture of neuronal stem cells (NSCs)
상기 제조예 1에서 제조된 1일된 신생아 Gba+/- 또는 Gba-/- 마우스의 대뇌 피질에서 NSC를 분리하였다. 피질을 제거한 후 얼음으로 차갑게 한 Ca2 +/Mg2 +-free Hank's balanced salt solution (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)에서 유지시켰다. 이후, 피질을 NSC 배양 배지 [Dulbeccomodified Eaglemedium (DMEM)/F12 (Invitrogen), 1% N2 보충물 (Invitrogen), 20 ng/ml 표피 생장 인자 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 20 ng/ml 염기성 섬유모세포 생장인자 (Peprotech)] 에 기계적으로 분리하였다. 세포 현탁액을 40-m cell strainer (BDBiosciences,SanJose,CA,USA)를 통해 필터링했고 6-웰 조직 배양 플레이트(BD Biosciences)의 각 웰에 2×105 세포/웰로 접종하였다. 접종된 NSC는 NSC 배양 배지에서 증식시켰고 NS(neurosphere)로 알려진 응집물을 형성시켰다. 이틀에 한번 각 웰에 있는 배지의 절반을 새로운 NSC 배양 배지로 갈아주었다.
NSC was isolated from the cerebral cortex of the neonatal Gba +/- or Gba - / - mice that were prepared in the above-mentioned Preparation Example 1. After removing the cortex and held in a cooler with ice Ca 2 + / Mg 2 + -free Hank's balanced salt solution (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subsequently, the cortex was cultured in NSC culture medium (Dulbeccomcomodified Eaglemedium (DMEM) / F12 (Invitrogen), 1% N2 supplement (Invitrogen), 20 ng / ml epidermal growth factor (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) Basic fibroblast growth factor (Peprotech)]. The cell suspension were inoculated with 40-
제조예Manufacturing example 3 - BM-MCS(Bone-marrow 3 - BM-MCS (Bone-marrow mesenchymalmesenchymal stem cell, stem cell, 골수유래Bone marrow origin 중간엽줄기세포Mesenchymal stem cells )의 분리, 배양), Culture
4 내지 6주령 정상 마우스를 해부하여 경골 및 대퇴골의 골수를 얻었다. 얻은 마우스의 경골 및 대퇴골의 골수로부터 40-m cell strainer를 이용하여 단일-세포 현탁액을 얻었다. 대략 1×106 세포를 MesenCult MSC Basal Medium and Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 포함하는 25 cm2 플라스크에 뿌려두었다. 세포 배양을 1주일 동안 수행했고 바닥 표면에 부착된 세포를 BM-MSC로 정하여, 이후의 실험에 사용하였다.
Four to six weeks old normal mice were dissected to obtain bone marrow of tibia and femur. A single-cell suspension was obtained from the bone marrow of the tibia and femur of the obtained mice using a 40-m cell strainer. Approximately 1 x 10 < 6 > cells were seeded at 25 cm 2 containing MesenCult MSC Basal Medium and Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) Sprayed in a flask. Cell culture was performed for one week and cells attached to the bottom surface were determined by BM-MSC and used in subsequent experiments.
실시예Example 1 - 제조된 마우스 모델의 NSC에서 1 - NSC of manufactured mouse model GCaseGCase 의 활성 확인Identification of activity
nestin-Cre-매개된 GCase 유전자의 삭제가 GCase의 활성을 방해하는지 확인하기 위하여, 상기 제조예 2에서 얻은 Gba+/- 마우스 및 Gba-/- 마우스의 NSC에서 GCase의 활성을 측정하고 GluCer 수준을 정량화하였다. In order to confirm whether deletion of the nestin-Cre-mediated GCase gene interferes with the activity of GCase, the activity of GCase was measured in NSC of Gba +/- mice and Gba - / - mice obtained in Preparation Example 2 and GluCer levels Respectively.
1.1 NSC의 1.1 of NSC GCaseGCase 의 활성 확인Identification of activity
NSC의 GCase 활성을 측정하기 위해 효소 활성 분석법을 수행하였다. NSC를 균질화 완충액(homogenization buffer) [50 mM HEPES (Invitrogen), 150 mM NaCl (Sigma), 0.2% Igepal CA-630 (Sigma), 프로테아제 저해제 (Calbiochem, San Diego, CA, USA)]에 용해시켰다. 이후 NSC가 (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)- D-erythro(NBD)-C12-GluCer(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL,USA)를 NBD-C12-ceramide로 변화시키는 촉진 작용의 정도에 의해서 Gcase의 활성을 측정하였고 이를 도 1에 나타내었다(n=5/군). Enzyme activity assay was performed to measure GCase activity of NSC. NSC was dissolved in a homogenization buffer (50 mM HEPES (Invitrogen), 150 mM NaCl (Sigma), 0.2% Igepal CA-630 (Sigma), protease inhibitor (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Since NSCs have been shown to promote the conversion of (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -D-erythro (NBD) -C12-GluCer (AvantiPolarLipids, Alabaster, AL, USA) to NBD- The activity of Gcase was measured by the degree of action, which is shown in FIG. 1 (n = 5 / group).
도 1에 나타낸 바와 같이 Gba+/- NSC와 비교해서 Gba-/- NSC에서 감소된 GCase 활성을 확인하였다. 따라서, 상기 제조예에서 얻은 NSC 및 Gba-/- 마우스가 본 발명 실시예의 목적에 부합하게 제조되었음을 확인하였다.
As shown in Figure 1, GCase activity was reduced in Gba - / - NSC compared to Gba +/- NSC. Thus, it was confirmed that the NSC and Gba - / - mice obtained in the above Preparation Example were produced in accordance with the purpose of the present invention.
1.2 NSC에서 1.2 From NSC GluCerGluCer 수준의 확인 Confirmation of the level
NSC에서 GluCer 수준을 측정하기 위해 지질 추출 및 GluCer 정량을 수행하였다. He et al., 2010에 기재된 바에 따라 지질을 추출한 후, 0.2% Igepal CA-630에 녹인 2 μl의 지질 추출액을 2 μl 의 GluCer 용해 완충액 [0.2 M citrate-phosphate buffer, pH 4.5, 0.3 M NaCl, 50 ng/μl rhAC(인간 재조합 acid ceramidase), 2.5% GCase(Cerezyme, Genzyme Corporation, Cambridge, MA, USA)]에 섞고 37℃에서 한시간 동안 배양하였다. 20 μl 의 NDA derivatization reaction mixture (25 mM borate buffer, pH 9.0, 2.5 mM NDA, 2.5 mM sodium cyanide)를 처리하여 반응을 멈추게 하였다. 상기 반응 혼합액은 에탄올로 1:3으로 희석하였고, 50℃에서 10분 동안 배양한 다음, 13,000 ×g에서 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리한 후 상층액 30 μl를 유리 시료 바이알에 옮기고 이 중 5 μl로 UPLC 시스템을 수행하였다. model 474 scanning fluorescence detector (Waters)를 이용하여 형광 스핑고신 유도체를 관찰했다. 스핑고신 피크(peak)를 스핑고신 표준 검정 곡선에 의해 계산하는 방법으로 정량하였고 이 때 Waters Millennium software를 사용하였다. 시료의 최종 GluCer 함량, 내재된 스핑고신 및 ceramice 신호를 계산하기 위해 GCase가 결핍된 반응 혼합액에서도 마찬가지의 측정을 수행하였고, 이를 정량 결과에서 빼주어 보정하였다. 최종 정량 결과를 도 2에 나타내었다.Lipid extraction and GluCer quantitation were performed to measure GluCer levels in NSC. 2 μl of the lipid extract dissolved in 0.2% Igepal CA-630 was dissolved in 2 μl of GluCer lysis buffer [0.2 M citrate-phosphate buffer, pH 4.5, 0.3 M NaCl, And incubated at 37 ° C for one hour. The cells were cultured in the presence of 50 ng / μl rhAC (human recombinant acid ceramidase), 2.5% GCase (Cerezyme, Genzyme Corporation, Cambridge, Mass., USA) The reaction was stopped by treating with 20 μl of NDA derivatization reaction mixture (25 mM borate buffer, pH 9.0, 2.5 mM NDA, 2.5 mM sodium cyanide). The reaction mixture was diluted 1: 3 with ethanol, incubated at 50 DEG C for 10 minutes, and then centrifuged at 13,000 x g for 5 minutes. After centrifugation, 30 μl of the supernatant was transferred to a glass sample vial and UPLC system was performed with 5 μl of the supernatant. A fluorescent sphingosine derivative was observed using a model 474 scanning fluorescence detector (Waters). The sphingosine peak was quantified by calculating the sphingosine standard curve using Waters Millennium software. Similar measurements were made in the GCase-deficient reaction mixture to calculate the final GluCer content of the sample, the intrinsic sphingosine and the ceramice signal, and corrected by subtracting it from the quantification results. The final quantification results are shown in Fig.
도 2에 나타낸 바와 같이, Gba-/- NSC에서 GluCer 수준이 대조군인 Gba+/- NSC에 비하여 높아짐을 확인하였다. 이러한 결과로부터 상기 1.1에서 확인한 GCase의 감소된 활성에 의해 NSC에 GluCer이 축적되어 GluCer 수준이 높아짐을 알 수 있다.
As shown in FIG. 2, it was confirmed that the level of GluCer in Gba - / - NSC was higher than that of Gba +/- NSC in the control group. From these results, it can be seen that GluCer accumulates in NSC due to the reduced activity of GCase identified in 1.1 above, thereby increasing the level of GluCer.
실시예Example 2 - BM- 2 - BM- MSCMSC 의 of 자가재생능Self-playing ability 및 증식에 대한 효과 확인 And effects on proliferation
BM-MSC가 Gba-/- NSC의 자가재생능 및 증식을 향상시키는 효과를 가지는지 확인하기 위한 실험 설계를 도 3에 간략히 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 NSC를 배양 후 12일에 BM-MSC와 간접 공동배양(indirect co-culture) 한 후 형성된 NS의 수 및 NSC의 증식을 측정하였다.
An experimental design to confirm whether BM-MSC has the effect of improving the self-renewal ability and proliferation of Gba - / - NSC is shown in FIG. As shown in FIG. 3, the numbers of NS formed and NSC proliferation were measured after indirect co-culture with BM-MSC at
2.1 NSC와 BM-2.1 NSC and BM- MSCMSC 의 간접 공동배양(indirect co-culture)(Indirect co-culture)
1.0 μm 의 구멍 크기를 가진 Millicell Hanging Cell Culture Inserts (Millipore, Billerica, MA, USA)를 NCS의 위에 위치하게 한 후 상기 제조예 3에서 제조한 BM-MSC를 3×104 세포/insert 의 밀도로 insert 위에 접종했다. 이러한 과정에서 NSC 및 BM-MSC 사이에 직접적인 접촉은 없게 하였다. 접종 후 7일 동안의 배양 기간 동안, 72시간마다 배지의 절반을 새로운 배지로 갈아주었다.
After placing Millicell Hanging Cell Culture Inserts (Millipore, Billerica, MA, USA) with a pore size of 1.0 μm on the NCS, the BM-MSC prepared in Preparation Example 3 was impregnated at a density of 3 × 10 4 cells / insert. In this process, there was no direct contact between the NSC and the BM-MSC. During the incubation period of 7 days after inoculation, half of the medium was replaced with fresh medium every 72 hours.
2.2 NS 형성 분석법2.2 NS formation assay
BM-MSC와 NSC의 간접 공동배양이 NS 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 NSC에서 NS 형성을 분석하였다. 구체적으로 NS를 기계적으로 분리한 후 생존한 세포를 얻은 뒤 상기 생존 세포를 1×104의 농도로 24-웰 플레이트 (BDBiosciences)에 접종하였다. 접종한 세포를 BM-MSC와 간접 공동배양하였다. 간접 공동배양후 각각의 웰에 새로 형성된 NS를 IX71 현미경 (Olympus Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 카운팅했다. 카운팅된 NS의 최소 지름은 50 mm로 하였다. 형성된 NS의 수를 카운팅한 결과를 도 4에 나타내었다 (n=6/군). To determine the effect of indirect co-culture of BM-MSC and NSC on NS formation, NS formation in NSC was analyzed. Specifically, the surviving cells were obtained after mechanically separating NS, and the viable cells were inoculated into 24-well plates (BDBiosciences) at a concentration of 1 × 10 4 . The inoculated cells were indirectly co-cultured with BM-MSC. After indirect co-cultivation, newly formed NSs were counted in each well using an IX71 microscope (Olympus Co., Tokyo, Japan). The minimum diameter of the counted NS was 50 mm. The results of counting the number of formed NS are shown in Fig. 4 (n = 6 / group).
도 4에 나타낸 바와 같이, BM-MSC과 간접 공동배양되지 않은 대조군의 Gba-/- NSC 배양액에 있는 NS의 수가 Gba+/- NSC 배양액에 있는 NS의 수에 비해서 유의적으로 낮았고, Gba+/- NSC와 BM-MSC의 간접 공동배양 결과 NS 형성이 증가하였으므로 BM-MSC는 Gba+/- NSC 배양액에서 NS 형성 증가를 유도함을 확인하였다 (n=6/군).
As, BM-MSC and Gba the indirect co-culture is not the control shown in Fig. 4 - / - the number of the NS in the NSC culture medium was low in NSC +/- Gba significantly as compared to the number of the NS in the culture medium, Gba + / - The indirect co-culture of NSC and BM-MSC resulted in increased NS formation, thus confirming that BM-MSC induces NS formation in Gba +/- NSC culture (n = 6 / group).
2.3 NSC 증식 분석법2.3 NSC Proliferation Assay
BM-MSC가 NSC의 증식을 향상시키는 효과가 있는지 확인하기 위하여 BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)를 활용한 면역 세포 화학을 이용하여 NSC의 증식 활성을 측정하였다. NS 유래의 단일-세포 현탁액을 poly-l-ornithine (Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 laminin (Invitrogen)으로 코팅된 유리 커버슬립에 밀도 1×104 세포/cm2로 접종했다. 접종 후 세포를 BM-MSC와 함께 7일 동안 배양했고, 10 μM의 BrdU (Sigma)로 라벨링한 뒤 추가적으로 12시간 더 배양하였다. 라벨링 배지를 제거한 후, 세포를 인산염-완충된 4% (w/v) 파라포름알데히드 (Sigma)로 20분 동안 상온에서 고정시켰다. 핵 DNA의 변성을 위해서, 세포를 2 N HCl(Sigma)에서 1시간 동안 배양하였고, 다음 0.15 M 붕산 나트륨(Sigma)으로 15분 동안 처리했다. 처리된 세포를 PBS (phosphate-buffered saline, Invitrogen)로 세척했고, 핵 대조염색 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)와 함께 배양하여 BrdU의 면역 형광을 검출하였으며, 검출 결과를도 5에 나타내었다. The proliferation activity of NSCs was measured by immunocytochemistry using BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine) to determine whether BM-MSC enhances NSC proliferation. NS-derived single-cell suspension to poly-l-ornithine (Sigma, St. Louis, MO, USA) and a density of 1 × 10 4 cells / cm 2 on glass coverslips coated with laminin (Invitrogen) Inoculated. After inoculation, cells were incubated with BM-MSC for 7 days, labeled with 10 μM BrdU (Sigma) and further cultured for an additional 12 hours. After removal of the labeling medium, cells were fixed with phosphate-buffered 4% (w / v) paraformaldehyde (Sigma) for 20 minutes at room temperature. For denaturation of nuclear DNA, the cells were incubated in 2 N HCl (Sigma) for 1 hour and then treated with 0.15 M sodium borate (Sigma) for 15 minutes. The treated cells were washed with PBS (phosphate-buffered saline, Invitrogen) and cultured with DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) Immunofluorescence was detected and the detection results are shown in Fig.
도 5에 나타낸 바와 같이, BM-MSC와 함께 배양되지 않은 대조군 배양액과 비교하여 BM-MSC와 함께 간접 공동배양된 Gba+/ - 및 Gba-/- NSC 배양액 모두에서 BrdU 양성 세포가 증가된 비율로 관찰되었다. 따라서, BM-MSC가 NSC의 증식을 촉진함을 확인하였다 (n=7/군).
As shown in Figure 5, in both Gba + / - and Gba - / - NSC cultures indirectly co-cultured with BM-MSC as compared to control cultures that were not incubated with BM-MSC, BrdU- Respectively. Therefore, it was confirmed that BM-MSC promotes NSC proliferation (n = 7 / group).
2.4 BM-2.4 BM- MSCMSC 의 NSC 증식 향상 효과와 Of NSC proliferation and GCaseGCase 활성의 관계 확인 Identify the relationship of activity
상기 2.3에서 확인한 BM-MSC의 NSC 증식 향상 효과가 GCase의 활성에 의해 매개되는지를 확인하기 위하여 GCase 활성을 분석하였으며 그 결과를 도 6에 나타내었다.The GCase activity was analyzed to confirm whether the effect of enhancing the NSC proliferation of the BM-MSC identified in 2.3 was mediated by the activity of GCase. The results are shown in FIG.
NS 유래의 단일-세포 현탁액을 poly-l-ornithine (Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 laminin (Invitrogen)으로 코팅된 유리 커버슬립에 밀도 1×104 세포/cm2로 접종했다. 접종 후 세포를 BM-MSC와 함께 7일 동안 배양한 후, 커버슬립에 부착된 NSC를 TrypLE™ Select (ThermoFisher)에 용해시켜 모았다. 모아진 NSC를 균질화 완충액(homogenization buffer) [50 mM HEPES (Invitrogen), 150 mM NaCl (Sigma), 0.2% Igepal CA-630 (Sigma), 프로테아제 저해제 (Calbiochem, San Diego, CA, USA)]에 용해시켰다. 이후 NSC가 (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)-D-erythro(NBD)-C12-GluCer(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL,USA)를 NBD-C12-ceramide로 변화시키는 촉진 작용의 정도에 의해서 GCase의 활성을 측정하였고 이를 도 6에 나타내었다 (n=3/군). NS-derived single-cell suspension to poly-l-ornithine (Sigma, St. Louis, MO, USA) and a density of 1 × 10 4 cells / cm 2 on glass coverslips coated with laminin (Invitrogen) Inoculated. After inoculation, cells were incubated with BM-MSC for 7 days, and NSCs attached to cover slips were collected by dissolving in TrypLE ™ Select (ThermoFisher). The collected NSC was dissolved in a homogenization buffer (50 mM HEPES (Invitrogen), 150 mM NaCl (Sigma), 0.2% Igepal CA-630 (Sigma), protease inhibitor (Calbiochem, San Diego, CA, USA) . (NBD) -C12-GluCer (AvantiPolarLipids, Alabaster, AL, USA) to NBD-C12-ceramide The activity of GCase was measured according to the degree of action, which is shown in Fig. 6 (n = 3 / group).
도 6에 나타낸 바와 같이, BM-MSC과 함께 배양되지 않은 대조군과 비교하여 BM-MSC와 함께 간접 공동배양된 Gba+/ - 및 Gba-/- NSC 모두에서 GCase의 활성에는 변화가 없음을 확인하였다.As shown in FIG. 6, there was no change in GCase activity in both Gba + / - and Gba - / - NSC indirectly co-cultured with BM-MSC compared to the control group not cultured with BM-MSC .
즉, BM-MSC는 Gba-/- NSC의 자가재생능 및 증식을 촉진하며, 이러한 효과가 BM-MSC와 NSC의 직접적인 접촉 없이 간접 공동배양에 의해 이루어진 점에 비추어 이러한 효과는 BM-MSC로부터 분비된 신경성(neurogenic) 수용성 인자로부터 발생함을 확인하였다.
In other words, BM-MSC promotes the self-renewal and proliferation of Gba - / - NSC and this effect is secreted from BM-MSC in view of the fact that this effect was achieved by indirect co-culture without direct contact between BM-MSC and NSC Neurogenic < / RTI > water soluble factor.
실시예Example 3 - BM- 3 - BM- MSCMSC 의 NSC 분화에 대한 효과 분석Of NSC Differentiation
추가적인 BM-MSC의 NSC의 분화에 대한 효과를 확인하기 위하여 분화 분석을 수행했으며, 이를 위한 실험 설계를 도 7에 간략히 나타내었다.
In order to confirm the effect of additional BM-MSC on NSC differentiation, differentiation analysis was carried out, and the experimental design for this was briefly shown in FIG.
3.1 분화 분석법3.1 Differentiation assay
BM-MSC가 NSC가 주요 신경 계통으로의 분화하는 과정에 미치는 영향을 확인하기 위해 면역 세포 화학 분석법을 사용하였다. 구체적으로, NS로부터 얻은 단일-세포 현탁액을 시험관내(in vitro)에서 poly-l-ornithine 및 laminin으로 코팅된 유리 커버슬립에 1×104 세포/cm2 의 밀도로 7일동안 배양했다. 커버슬립을 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM l-글루타민, 10 mg/ml 헤파린, 2% B-27 supplement, 및 3% FBS(fetal bovine serum)이 보충된 Neurobasal-A 배지에서 배양하였으며 모든 시료는 Invitrogen에서 구입하였다. 상기 배양액을 플레이팅하였다. 이후 세포를 4% 파라-포름알데히드를 포함하는 0.1 M PBS로 상온에서 15분 동안 고정시켰고, 이후 PBS에서 5분 동안 0.1% Triton X-100 (Sigma)으로 처리하였다. 백그라운드 신호를 차단하기 위해 처리된 세포를 3% normal goat serum (Vector Laboratories Inc.) 및 2% BSA(bovine serum albumin, Invitrogen)로 0.4% Triton X-100를 포함하는 PBS에서 전 배양(preincubation) 하였다. NSC 분화 분석을 위해, 상기 분화된 배양액을 다양한 일차 항체와 함께 하룻밤동안 4℃에서 배양하였다. 1:400로 희석한 항-βⅢ-tubulin (Chemicon, Temecula, CA, USA) 마우스 단일클론 항체를 뉴런의 마커로서, 1:1,000로 희석한 항-GFAP (Dako, Glostrup, Denmark) 토끼 폴리클론 항체를 성상 세포(astrocyte)의 마커로서, 또는 1:500로 희석한 항-MBP (Abcam, Cambridge, UK) 토끼 폴리클론 항체를 희돌기세포(oligodendrocyte)의 마커로서 사용했다. 일차 항체를 시각화화기 위해서, 1:1,000으로 희석한 적절한 Alexa Fluor 488-접합된 이차 항체 (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)를 배양액에 추가한 뒤 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포에서의 면역 형광을 luoView SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Olympus Co., Tokyo, Japan), 또는 BX51 현미경 (Olympus Co.)의 레이저-스캐닝 공초점 현미경(laser-scanning confocal microscope)을 이용하여 분석했고 대표적인 형광 이미지 및 정량적 분석을 도 8 내지 도 11에 나타내었다. 정량적 분석 결과는 각 군에서 DAPI로 염색된 세포에 대한 마커-양성 세포의 평균 비율로 나타내었다. Immunocytochemistry was used to determine the effect of BM-MSC on the differentiation of NSC into the major nervous system. Specifically, single-cell suspensions from NS were incubated in vitro To a glass cover slip coated with poly-1-ornithine and laminin, 1 x 10 4 cells / cm 2 At a density of And cultured for 7 days. The cover slip was incubated in Neurobasal-A medium supplemented with 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM l-glutamine, 10 mg / ml heparin, 2% B-27 supplement, and 3% fetal bovine serum All samples were purchased from Invitrogen. The culture was plated. The cells were then fixed with 0.1 M PBS containing 4% para-formaldehyde at room temperature for 15 minutes and then treated with 0.1% Triton X-100 (Sigma) in PBS for 5 minutes. Cells treated to block background signals were preincubated with PBS containing 0.4% Triton X-100 with 3% normal goat serum (Vector Laboratories Inc.) and 2% BSA (bovine serum albumin, Invitrogen) . For NSC differentiation analysis, the differentiated cultures were incubated with various primary antibodies overnight at 4 < 0 > C. Anti-GFP (Dako, Glostrup, Denmark) rabbit polyclonal antibody diluted 1: 1,000 as a marker of neurons was immunoprecipitated with anti-βIII-tubulin (Chemicon, Temecula, CA, USA) mouse monoclonal antibody diluted 1: Anti-MBP (Abcam, Cambridge, UK) rabbit polyclonal antibody diluted 1: 500 as a marker for astrocyte was used as a marker for oligodendrocytes. To visualize the primary antibody, an appropriate Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody (Molecular Probes, Carlsbad, Calif., USA) diluted 1: 1,000 was added to the culture and incubated at room temperature for 1 hour. Immunofluorescence in the cells was analyzed using a laser-scanning confocal microscope of the luoView SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Olympus Co., Tokyo, Japan) or BX51 microscope (Olympus Co.) Representative fluorescence images and quantitative analysis are shown in Figures 8-11. Quantitative analysis results were expressed as the average ratio of marker-positive cells to DAPI-stained cells in each group.
도 8 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, BM-MSC와 함께 간접 공동배양되었는지 여부에 상관없이 세 가지 신경 계통 마커(βⅢ-tubulin, MBP 및 GFAP)가 NSC 세포에서 검출되었고, 특히 BM-MSC와 함께 간접 공동배양된 군에서는 신경세포 계통 마커의 발현이 유의적으로 증가한 것으로 보아 BM-MSC는 NSC의 신경세포 분화 효율을 향상시킴을 확인하였다. 한편, 도 10에 나타낸 바와 같이 Gba+/- NSC 배양액과 비교하여 Gba-/- NSC 배양액에서 MBP-양성 세포의 분화율의 감소가 나타났으며 BM-MSC와 간접 공동배양된 경우 MBP 양성 세포 발현이 유의적으로 증가했다. 그러나 도 11에 나타낸 바와 같이 Gba+/- NSC와 비교하여, Gba-/- NSC 배양액에서 GFAP-양성 세포 수의 유의적 변화는 없었다. 따라서 BM-MSC가 선택적으로 NSC의 분화 및 신경세포의 형태형성과 희돌기세포 분화를 촉진함을 확인하였다.
As shown in FIGS. 8-11, three neural gene markers (? III-tubulin, MBP and GFAP) were detected in NSC cells, with or without BM-MSC, In the indirect co-cultured group, the expression of neural cell markers was significantly increased, confirming that BM-MSC improves the neural differentiation efficiency of NSC. On the other hand, as shown in FIG. 10, the differentiation rate of MBP-positive cells was decreased in the culture of Gba - / - NSC compared to the culture of Gba +/- NSC. In the case of indirect co-culture with BM-MSC, Respectively. However, as shown in Fig. 11, there was no significant change in the number of GFAP-positive cells in the Gba - / - NSC culture as compared to Gba +/- NSC. Therefore, it was confirmed that BM-MSC selectively promoted NSC differentiation and neuronal morphogenesis and proliferation.
3.2 분화된 뉴런의 형태적 분석3.2 Morphological analysis of differentiated neurons
분화된 신경세포의 형태적 분석을 위해, MetaMorph software (Universal Imaging Corp., Downingtown, PA, USA)를 이용하여 분화된 신경세포의 총 길이(total outgrowth) 및 신경세포의 가지돌기(dendrite process)를 기록했다. 모든 기록 및 MetaMorph 분석은 맹검 방법(blinded manner)에 의해 수행하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다. 기록시 무작위적으로 선택한 세포를 최소 60 세포/디스크에서 기록하였다 (n=5개의 다른 마우스 유래 디스크). 도 12에 나타낸 바와 같이, BM-MSC는 분화된 신경세포의 가지돌기의 수적 증가 및 뻗어나가는 총 길이를 유의성 있게 증가시킴을 확인하였다. 즉, BM-MSC는 신경세포의 형태형성을 촉진함을 확인하였다.
The total outgrowth of differentiated neurons and the dendritic process of neurons were measured using MetaMorph software (Universal Imaging Corp., Downingtown, Pa., USA) for morphological analysis of differentiated neurons. I wrote. All recordings and MetaMorph analysis were performed in a blinded manner and the results are shown in FIG. At the time of recording, randomly selected cells were recorded at a minimum of 60 cells / disc (n = 5 different mouse-derived discs). As shown in FIG. 12, it was confirmed that the BM-MSC significantly increased the numerical increase and the total length of the dendrites of the differentiated neurons. In other words, it was confirmed that BM-MSC promotes morphogenesis of neurons.
실시예Example 4 - BM- 4 - BM- MSCMSC 유래 인자의 확인 Identification of derived factors
BM-MSC와 NSC의 간접 공동배양에서 NSC의 자가재생능, 증식 및 분화를 촉진하는 유효성분인 BM-MSC 유래 수용성 생물 활성 인자를 동정하기 위해 하기와 같이 수행하였다.
In order to identify the water-soluble biologically active factor derived from BM-MSC, which is an effective ingredient for promoting self-renewal, proliferation and differentiation of NSCs in the indirect co-culture of BM-MSC and NSC,
4.1 항체-기반 마우스 사이토카인 분석4.1 Antibody-Based Mouse Cytokine Analysis
BM-MSC의 유효성분을 동정하기 위해, 50개의 서로 다른 사이토카인의 상대적인 발현양상을 분석하였다. 구체적으로 RayBio Mouse custom Cytokine Antibody Arrays (Raybiotech, Norcross, GA, USA)를 공동 배양 실험에서 얻어진 세포 배양 상등액 분석을 위해 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 막을 2 ml의 차단 완충액(blocking buffer)으로 상온에서 30분 동안 처리하였다. BM-MSC와 간접 공동배양한 시료(Gba+/- + BM-MSC 및 Gba-/- + BM-MSC) 또는 공동 배양하지 않은 시료(Gba+/- 및 Gba-/-)에 조건 배지(conditioned medium)를 약 1 ml 정도를 첨가한 후, 밤새도록 4℃에서 배양하였다. 시료를 decanting한 후, 막을 완충액 I 및 Ⅱ로 상온에서 120 rpm으로 흔들면서 세척하였다. 그 후 막을 비오틴-접합된 항체 (1:250) 1 ml와 함께 밤새도록 4℃에서 배양했고, 세척한 다음, horseradish peroxidase-접합된 스트렙타비딘 (1:1000) 2 ml와 1시간 동안 상온에서 배양했다 그 다음 추가적으로 세척하였다. spot을 시각화하기 위해 검출 완충액 C 및 D를 사용했다. 막을 비닐 랩으로 감싸고 20분 동안 Kodak X-Omat radiographic film (Kodak, Rochester, NY, USA)에 노출시킨 다음, 신호를 필름 현상기를 이용해서 검출하였다. 각각의 필름을 이미지 프로세서에 스캔했고, imaging densitometer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용해서 덴시토메트리 측정(densitometric measurements)을 수행했다. 그 다음 Bio-Rad analysis software로 정량화했다. 덴시토메트리 측정 및 통계적 분석을 면역 블롯 상에서 수행하였으며 그 결과를 도 13에 나타내었다. In order to identify the active components of BM-MSC, the relative expression patterns of 50 different cytokines were analyzed. Specifically, RayBio Mouse custom Cytokine Antibody Arrays (Raybiotech, Norcross, GA, USA) were used according to manufacturer's instructions for cell culture supernatant analysis obtained from co-culture experiments. The membranes were treated with 2 ml blocking buffer for 30 minutes at room temperature. (Conditioned) to samples co-cultured indirectly with BM-MSC (Gba +/- BM-MSC and Gba - / - + BM-MSC) or uncoagulated samples (Gba +/- and Gba - / - medium) was added at about 1 ml, followed by overnight incubation at 4 ° C. After decanting the sample, the membrane was washed with Buffer I and II with shaking at 120 rpm at room temperature. The membrane was then incubated overnight at 4 ° C with 1 ml of biotin-conjugated antibody (1: 250), washed, and incubated with 2 ml of horseradish peroxidase-conjugated streptavidin (1: 1000) Lt; / RTI > and then further washed. Detection buffers C and D were used to visualize the spot. The membrane was wrapped in a plastic wrap and exposed to a Kodak X-Omat radiographic film (Kodak, Rochester, NY, USA) for 20 minutes and then the signal was detected using a film developer. Each film was scanned into an image processor and densitometric measurements were performed using an imaging densitometer (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA). And then quantified with Bio-Rad analysis software. Densitometry measurements and statistical analyzes were performed on immunoblot and the results are shown in FIG.
도 13에 나타낸 바와 같이, BM-MSC와 간접 공동배양되지 않은 군과 비교해서 BM-MSC와 함께 간접 공동배양된 Gba-/- NSC 조건 배지에서 발현이 증가한 사이토카인은 M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2 및 MMP-3임을 확인하였다. 따라서 M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2, 및 MMP-3가 Gba-/- NSC의 자가재생능과 연관되어있음을 알 수 있다.
As shown in Fig. 13, the cytokines that were increased in the GBA - / - NSC conditioned medium indirectly co-cultured with BM-MSC compared with those not indirectly co-cultured with BM-MSC were M-CSF, IL-1ra , MCP-1, MMP-2 and MMP-3. Therefore, it can be seen that M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2 and MMP-3 are associated with the self-renewal ability of Gba - / - NSC.
4.2 4.2 qPCRqPCR 분석 analysis
상기 4.1에서 Gba-/- NSC의 자가재생능과 연관되어있음을 확인한 BM-MSC 유래 사이토카인 M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2 및 MMP-3에 대하여 mRNA 수준을 분석하기 위해 qPCR을 수행하였다. Analysis of mRNA levels for BM-MSC-derived cytokines M-CSF, IL-1ra, MCP-1, MMP-2 and MMP-3 confirmed to be related to the autoregulatory ability of Gba - / - QPCR was performed.
구체적으로, Gba+/- 및 Gba-/- NSC의 세포 용해액으로부터 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 RNA를 추출했다. cDNA Synthesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 5 mg의 total RNA에서 cDNA(complementary DNA)를 합성하였다. 42℃에서 1시간 동안 반응시켰고, 70℃에서 10분 동안 cDNA 합성을 중단시켰다. 합성된 cDNA에 대한 qPCR 분석을 Corbett research RG-6000 thermal cycler (Corbett Life Science, Sydney, Australia)를 이용하여 수행했다. 95℃에서 10초, 58℃에서 15초, 72℃에서 20초의 사이클로 40회 반복하여 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다 : Mcsf 유전자(5'-CTG TCT TCC ACC TGC TG-3' 및 5'-CAC CTG TCT GTC CTC AT-3'), IL-1ra 유전자 (5'-GCA CAG GCT GGT GAA TGA C-3' 및 5'-CCC CGT GGA TGC CCA AG-3'), MCP-1 유전자 (5'-CAG TTA ATG CCC CAC TC-3' 및 5'-CTT ATT GGG GTC AGC AC-3'), Mmp2 유전자 (5'-CGA TGC TGA TAC TGA-3' 및 5'-TCC GCC AAA TAA ACC-3'), Mmp3 유전자 (5'-AAG GAG GCA GCA GAG AA-3' 및 5'-TAG GAT GAG CAC ACA AC-3') 및 GAPDH 유전자 (5'-AGC CTC AAG ATC ATC AGC-3' 및 5'-GCA GGT TTT TCT AGA CGG -3'). qPCR 수행 결과를 도 14에 나타내었다 (n=4/군).Specifically, RNA was extracted from the cell lysates of Gba +/- and Gba - / - NSC using RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). cDNA (complementary DNA) was synthesized from 5 mg of total RNA using cDNA Synthesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. The reaction was allowed to proceed for 1 hour at 42 DEG C, and cDNA synthesis was stopped at 70 DEG C for 10 minutes. QPCR analysis of the synthesized cDNA was performed using Corbett research RG-6000 thermal cycler (Corbett Life Science, Sydney, Australia). The amplification was repeated 40 times at 95 ° C for 10 seconds, 58 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 20 seconds. The primers used for amplification are as follows: Mcsf (5'-GCA CAG GCT GGT GAA TGA C-3 'and 5'-CAC CTG TCT GTC CTC AT-3'), genes (5'-CTG TCT TCC ACC TGC TG- -CCC CGT GGA TGC CCA AG-3 '), MCP-1 gene (5'-CAG TTA ATG CCC CAC TC-3 'and 5'-CTT ATT GGG GTC AGC AC-3'), Mmp2 gene (5'-CGA TGC TGA TAC TGA- (5'-AAG GAG GCA GCA GAG AA-3 'and 5'-TAG GAT GAG CAC ACA AC-3') and the GAPDH gene (5'-AGC CTC AAG ATC ATC AGC-3 'And 5'-GCA GGT TTT TCT AGA CGG -3'). The results of qPCR execution are shown in Fig. 14 (n = 4 / group).
도 14에 나타낸 바와 같이 대조군 Gba+/- NSC와 비교하여, Gba-/- NSC에서 Mcsf 유전자의 발현은 유의적으로 감소했고 Gba+/- NSC에서와 비교하여 Gba-/- NSC에서 IL-1ra, MCP-1, Mmp2, 및 Mmp3의 mRNA 수준은 증가함을 확인하였다. M-CSF의 발현 감소로 인해 Gba-/- NSC에서 자가재생능의 손상이 발생함을 예측할 수 있다. 따라서 BM-MSC에서 분비된 M-CSF는 자가재생능 결핍을 완화시킬 수 있는 잠재적 후보 분자임을 확인하였다.
And as compared with the control group +/- Gba NSC as shown in 14, Gba - / - expression of the gene in Mcsf NSC had significantly decreased as compared with in the Gba +/- NSC Gba - / - IL -1ra in NSC , MCP-1, Mmp2, and Mmp3 mRNA levels were increased. The decrease in the expression of M-CSF may predict the impairment of autoregulatory ability in Gba - / - NSC. Thus, M-CSF secreted by BM-MSC is a potential candidate molecule for mitigating autoregulation deficiency.
4.3 ELISA 분석4.3 ELISA analysis
상기 4.2에서 잠재적 후보 분자로서 동정한 M-CSF의 분비를 확인하기 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 M-CSF의 농도를 측정하였다. 구체적으로, M-CSF의 농도 측정시 Quantikine Mouse M-CSF ELISA Kit (R&D Systems) 및 허가받은 M-CSF 표준을 사용했다. 제조업자의 지시에 따라서. 각 표준 및 실험 시료에 대해 ELISA 분석을 두 번 반복하였고 결과의 평균을 도 15에 나타내었다. The concentration of M-CSF was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to confirm the secretion of M-CSF identified as a potential candidate molecule in Section 4.2 above. Specifically, the Quantikine Mouse M-CSF ELISA Kit (R & D Systems) and the licensed M-CSF standard were used to measure the concentration of M-CSF. Follow manufacturer's instructions. ELISA analysis was repeated twice for each standard and experimental sample and the average of the results was shown in FIG.
도 15에 나타낸 바와 같이, M-CSF 단백질 수준이 BM-MSC와 간접 공동배양된 Gba-/- NSC에서 공동배양되지 않은 군에 비하여 유의적으로 향상하였고, BM-MSC와 공동배양되지 않은 Gba+/- NSC에서와 비교해서 BM-MSC와 공동배양되지 않은 Gba-/- NSC에서 M-CSF 단백질 수준이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 따라서 BM-MSC에서 유래한 수용성 인자인 M-CSF가 NSC의 자가재생능을 향상시킬 수 있는 후보 분자로 동정하였다.
As shown in FIG. 15, the M-CSF protein level was significantly improved as compared with the group not co-cultured with Gba - / - NSC indirectly co-cultured with BM-MSC, and Gba + / - NSC, the level of M-CSF protein was significantly decreased in Gba - / - NSC not co-cultured with BM-MSC. Therefore, M-CSF, a water-soluble factor derived from BM-MSC, was identified as a candidate molecule capable of improving the self-renewal ability of NSC.
실시예Example 5 - M- 5-M- CSFCSF 의 효과 확인Check the effect of
상기 실시예 3 및 4에서 동정한 M-CSF의 신경성 잠재력(neurogenic potential)을 확인하기 위해서 재조합 쥐과(murine) M-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)의 자가재생능, 증식 및 분화 촉진 효과를 확인하였다.To confirm the neurogenic potential of M-CSF identified in Examples 3 and 4, the recombinant murine M-CSF (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) The effect was confirmed.
M-CSF의 자가재생능 확인을 위해 서로 다른 농도에서 NS 형성 능력에 대한 측정을 하였으며 상기 2.2와 같은 방법에 의하여 수행했다. 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에 나타낸 바와 같이 Gba+/- NS와 비교해서, Gba-/- NS의 자가재생능력은 유의적으로 감소하였으며, M-CSF가 10 및 50 ng/ml의 농도로 처리된 경우 Gba-/- NSC는 NS 형성의 증가를 나타냈다. 또한 이후의 실험에 농도 10 ng/ml의 M-CSF를 사용하였다.In order to confirm the self-renewal ability of M-CSF, NS formation ability was measured at different concentrations and the same procedure as in 2.2 was performed. The results are shown in Fig. If the self-regenerative capacity of NS was significantly decreased, M-CSF is treated with 10 and 50 ng / ml concentration of Gba - - even compared to the Gba +/- NS as shown in 16, Gba - / / - NSC showed an increase in NS formation. M-CSF at a concentration of 10 ng / ml was used for the subsequent experiments.
M-CSF의 증식 촉진 효과 확인을 위해 상기 2.3과 같은 증식 분석법에 의하여 BrdU 양성 세포의 비율을 측정하였고 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에 나타낸 바와 같이 M-CSF에 의해 Gba-/- NSC 내의 BrdU 양성 세포 비율이 증가함을 확인하였다.To confirm the proliferation promoting effect of M-CSF, the ratio of BrdU-positive cells was measured by the proliferation assay as described in 2.3 above, and the results are shown in FIG. As shown in Fig. 17, it was confirmed that the proportion of BrdU-positive cells in Gba - / - NSC was increased by M-CSF.
M-CSF가 NSC의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 상기 실시예 3과 같은 방법에 의해 NSC의 분화를 관찰하였고 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에 나타낸 바와 같이 M-CSF를 처리한 경우 Gba-/- NSC 분화가 촉진되고 총 길이 및 가지돌기가 유의적으로 증가하였으며, Gba+/- NSC에 비해서, Gba-/- NSC의 신경세포는 총 길이 및 가지돌기가 유의적으로 감소함을 확인하였다.In order to confirm the effect of M-CSF on NSC differentiation, NSC differentiation was observed by the same method as in Example 3, and the results are shown in FIG. When treated with M-CSF as shown in FIG. 18 Gba - / - has been NSC differentiation is promoted and the total length of the projection is significantly increased, compared to +/- Gba NSC, Gba - / - NSC of neurons Showed significant decrease in the total length and branching process.
따라서, 도 16 내지 도 18에 나타낸 바와 같이 M-CSF는 NSC의 자기재생능, 증식 및 분화를 촉진하며, NSC의 형태 발생에 있어 중요한 역할을 하므로, 이를 고셔병 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
Therefore, as shown in FIG. 16 to FIG. 18, M-CSF promotes the self-renewal, proliferation and differentiation of NSCs and plays an important role in the morphogenesis of NSCs. Therefore, M-CSF is usefully used as a pharmaceutical composition for treating Gaucher disease Respectively.
제제예Formulation example - 의약품의 제조 - Manufacture of medicines
산제의Sanje 제조 Produce
중간엽줄기세포 5×108 세포 또는 M-CSF 100mg5 x 10 < 8 > cells of mesenchymal stem cells or 100 mg of M-CSF
유당 100mgLactose 100mg
탈 10mg10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
The above components are mixed and filled in airtight bags to prepare powders.
주사제의 제조Injection preparation
중간엽줄기세포 5×108 세포 또는 M-CSF 100mg5 x 10 < 8 > cells of mesenchymal stem cells or 100 mg of M-CSF
주사용 멸균 증류수 적량Sterile sterilized water for injection
pH 조절제 적량pH adjuster
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
(2 ml) per 1 ampoule in accordance with the usual injection method.
액제의Liquid 제조 Produce
중간엽줄기세포 5×108 세포 또는 M-CSF 100mg5 x 10 < 8 > cells of mesenchymal stem cells or 100 mg of M-CSF
설탕 20gSugar 20g
이성화당 20g20g per isomer
레몬향 적량Lemon incense quantity
정제수를 가하여 전체 100ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.Purified water was added to the total volume of 100 ml. The above components are mixed according to a usual method for producing a liquid agent, and then filled in a brown bottle and sterilized to prepare a liquid agent.
Claims (10)
A pharmaceutical composition for preventing or treating a Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cell comprises a macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
The pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher disease according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cells are derived from bone marrow.
The pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher disease according to claim 1, wherein the Gaucher disease is neuropathic Gaucher disease.
The pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher disease according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cell regenerates the self regenerating ability of a neuronal stem cell (NSC).
The pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher disease according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cell promotes proliferation of neuronal stem cells (NSCs).
The pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher disease according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cells promote the differentiation of neuronal stem cells (NSCs).
A pharmaceutical composition for preventing or treating Gaucher's disease, comprising an mesenchymal stem cell-derived macrophage colony stimulating factor (M-CSF) as an active ingredient.
A stem cell therapeutic agent for treating Gaucher disease comprising mesenchymal stem cells.
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