KR20170014199A - 치수수복재의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 짧은 경화시간을 가지고, 조작성이 뛰어나고, 치수에 유해작용이 없어 우수한 생체친화성을 가지며, 효과적으로 상아질을 재생시킬 수 있도록 한 치수수복재의 제조방법에 관한 것으로, i) 제2인산칼슘(Calcium Phosphate Dibasic)과 탄산칼슘(Calcium Carbonate)을 각각 Ca/P몰비 1.5와 2.0으로 균일 혼합하여 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)를 합성하는 제 1 단계, ii) α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate), 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate), 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)를 중량비 6:2:2로 혼합한 분말과 산화지르코늄(ZrO2)을 중량비 7:3의 비율로 혼합하는 제 2 단계 및 iii) 상기 제 2 단계에서 제조된 혼합물에 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 용액과 시트르산(Citric Acid) 용액을 혼합한 용액을 가하는 제 3 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 치수수복재의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 인산칼슘을 주성분으로 하는 생체친화성이 우수한 치과용 수복재료의 제조방법에 관한 것이다.
치아는 바깥부분을 형성하고 있는 단단한 조직인 상아질(象牙質, dentin)과 안쪽에 위치하고 있는 연조직의 일종인 치수(齒髓, dental pulp)로 구성되어 있으며, 치수는 세포, 혈관, 신경 등으로 구성되어 있어서 주로 치아에 영양을 공급하고 상아질을 형성하는 기능을 가지고 있다
그런데 치아우식증(충치, 蟲齒, dental caries)이나 치아 외상 등에 의해 상아질이 손상되고 이 손상이 치수까지 전달되면 치수에 염증이 생기고 심한 경우 괴사되는 현상도 발생하게 된다. 이때, 주로 치수 전부를 제거하고 남은 빈 공간에 특정한 물질을 이용하여 충전해주는 소위 근관치료(根管治療, root canal treatment)라는 것을 시행하게 된다.
하지만, 이 과정은 매우 복잡하여 시간 및 비용의 손실이 많이 발생할 뿐 아니라, 어쩔 수 없이 치아의 구멍을 뚫기 때문에 필연적으로 치아구조의 약화를 초래하고 결과적으로 치아수명이 단축되는 결과가 발생한다.
하지만, 충치나 외상 등에 의해 치수가 노출되더라도 이를 적절히 수복해 준다면 치수는 제거될 필요없이 본래의 기능을 유지할 수 있게 되어 치아의 수명도 연장될 수 있다. 이렇게 치수를 막아주는 술식을 치수복조술(pulp capping procedure)이라고 한다.
전통적으로 치수복조술은 수산화칼슘(calcium hydroxide) 또는 MTA(mineral trioxide aggregate)를 이용하여 노출된 치수를 폐쇄한 뒤 복합레진을 이용하여 수복을 시행하는 것이다.
이 방법은 재료 하방에 수복상아질이라는 보호막을 형성하여 치수의 생활력을 유지하는 매우 유용한 술식으로 알려져 있다. 하지만, 수산화칼슘은 물리적인 성질이 떨어져서 오랜 기간 동안 파절면을 봉쇄하지 못한다는 단점이 있어서 점차 MTA로 대체되어가고 있는 실정이다.
MTA를 이용한 조성물로 대한민국 공개특허공보 공개번호 제10-2013-0113724호(2013.10.16.공개)가 있으며, 이 기술은 MTA를 주요 성분으로 하는 치수질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
그런데 이러한 MTA는 경화시간이 매우 길어 적절하게 경화되기 위해서는 최소 6시간 동안 습윤상태에서 있어야 하기 때문에 결과적으로 두 단계의 치료(two-step procedure)가 필요하고, 치아의 변색을 야기할 수 있으며, 가격면에서 매우 고가이며, 조작성이 좋지 않아 적용하기 어려우며, 또한, 현재의 MTA는 단지 생체적합성이 우수한 시멘트이기 때문에 경조직형성효과가 미흡한 문제점이 있다.
기존의 MTA가 상기 문제점들을 보유하고 있으므로 노출된 치수를 치료하기 위해서는 무엇보다도 적절하게 치수를 폐쇄시킬 뿐 아니라 반드시 적용된 재료 하방에 치아구조물이 생성되어 궁극적으로 치수가 원래 상태와 유사하게 상아질로 둘러싸인 완전한 형태로 회귀될 수 있도록 개선된 물성 및 생물학적 특성을 가지면서도 적절한 가격을 가진 새로운 치수복조재의 개발이 기대되고 있는 실정이다.
상기한 바와 같은 문제점과 현 실정을 해결하기 위해 발명된 것으로, 본 발명은 짧은 경화시간을 가지고, 조작성이 뛰어나고, 치수에 유해작용이 없어 우수한 생체친화성을 가지며, 효과적으로 상아질을 재생시킬 수 있도록 한 치수수복재의 제조방법을 제공하고자 하는 데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 기존의 MTA에 비해 가격경쟁력이 우수한 치수수복재의 제조방법을 제공하고자 하는 데 목적이 있다.
상기한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명인 치수수복재의 제조방법은,
i) 제2인산칼슘(Calcium Phosphate Dibasic)과 탄산칼슘(Calcium Carbonate)을 각각 Ca/P몰비 1.5와 2.0으로 균일 혼합하여 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)를 합성하는 제 1 단계,
ii) α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate), 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate), 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)를 중량비 6:2:2로 혼합한 분말과 산화지르코늄(ZrO2)을 중량비 7:3의 비율로 혼합하는 제 2 단계 및
iii) 상기 제 2 단계에서 제조된 혼합물에 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 용액과 시트르산(Citric Acid) 용액을 혼합한 용액을 가하는 제 3 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 1 단계는
제2인산칼슘(Calcium Phosphate Dibasic)과 탄산칼슘(Calcium Carbonate)을 각각 Ca/P몰비 1.5와 2.0으로 균일 혼합 후 1450~1530℃로 가열하여 6시간 유지 후 상온에서 자연냉각하는 과정을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 1 단계는
자연냉각 후 볼 밀링(ball milling)을 통해 입자의 크기를 입자를 4~6μ으로 조정하는 과정을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 2 단계에서는
디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate) 분말과 산화지르코늄(ZrO2) 분말은 볼 밀링(ball milling)을 통해 3μ으로 조정한 것을 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 3 단계에서는
인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 용액과 시트르산(Citric Acid) 용액을 혼합한 용액으로 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 0.5M 용액과 시트르산(Citric Acid) 0.3M 용액을 중량비 1:1로 혼합한 용액을 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기한 바와 같은 과제해결수단을 통해, 본 발명인 치수수복재의 제조방법은 짧은 경화시간을 가지고, 조작성이 뛰어나고, 치수에 유해작용이 없어 우수한 생체친화성을 가지며, 효과적으로 상아질을 재생시킬 수 있으며, 기존의 MTA에 비해 가격경쟁력이 우수한 등의 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 치수수복재의 제조방법을 도시한 블록도이다.
본 발명에 따른 치수수복재의 제조방법에 관한 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 치수수복재의 제조방법을 도시한 블록도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 치수수복재의 제조방법은 크게 3개 단계로 나주어지며 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.
1. 제 1 단계(S1)
이 단계는 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)를 각각 제조하는 과정이다.
이 단계에서는 먼저 제2인산칼슘(Calcium Phosphate Dibasic)과 탄산칼슘(Calcium Carbonate)을 각각 Ca/P몰비 1.5와 2.0으로 균일 혼합한 후, 1450~1530℃로 가열하고 이 상태를 6시간 유지 후 상온에서 자연냉각하여 각각 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)를 합성하게 된다.
이후, 볼 밀링(ball milling)을 통해 입자의 크기를 입자를 4~6μ으로 조정하는 과정을 거치게 된다.
2. 제 2 단계(S2)
이 단계는 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)에 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)와 산화지르코늄(ZrO2)을 혼합하는 과정이다.
이 단계에서는 상기 단계에서 제조된 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)에 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)를 혼합하게 되는데, α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate), 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate), 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)의 혼합비는 중량비로 6:2:2로 혼합하게 된다.
이렇게 혼합된 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate), 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate), 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)의 혼합 분말에 다시 산화지르코늄(ZrO2)을 중량비 7:3의 비율로 혼합하게 된다.
여기서, 상기 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate) 분말과 산화지르코늄(ZrO2) 분말은 볼 밀링(ball milling)을 통해 3μ으로 조정한 것을 사용하게 된다.
3. 제 3 단계
이 단계는 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate)과 시트르산(Citric Acid) 혼합 용액을 가하는 과정이다.
이 단계에서는 상기 제 2 단계에서 제조된 혼합물에 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 0.5M 용액과 시트르산(Citric Acid) 0.3M 용액을 중량비 1:1로 혼합한 용액을 가하게 된다.
4. 실험결과
상기한 바와 같은 제조방법을 통해 제조된 치수수복재를 이용하여 생체적합성, 광화유도능 및 수복상아질의 형성 평가를 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
실제 임상환경을 재현하기 위해, 발거된 제3대구치(사랑니)로부터 치수조직을 획득하고 이로부터 치수세포를 배양하여 실험에 이용하였다.
구체적으로, 전북대학교병원의 IRB 승인을 받은 뒤 환자로부터 발거된 제3대구치를 실험실로 운반하여 무균상태에서 치아의 백악-법랑경계(cementodentinal junction) 부위를 #330 bur를 이용하여 절단하여 내부의 치수조직을 채취하였다.
가. 생체적합성 평가
생체적합성은 기본적으로 세포독성(cytotoxicity) 및 세포형태관찰을 통해 평가한다. 세포독성은 MTT 분석법을 통해 측정하였고 재료상에서 배양된 세포형태는 주사전자현미경(scanning electron microscope; SEM)을 이용하여 관찰하였다.
1) 세포독성평가
2x104개의 치수세포를 24-well plate에 분주한 뒤, 초기 부착을 위해 24시간 동안 37℃, 5% CO2가 공급되는 환경에서 배양하였다. 이후, 미리 제조된 재료 추출액을 세포에 적용하고 1, 3, 7, 14일 후에 세포의 생존율(세포가 얼마나 살아있는지 여부)을 MTT 분석법을 통해 측정하였다. 대조군으로는 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS)이 포함된 세포배양액인 MEM하에서 배양된 세포들을 이용하였다.
실험결과 본 발명의 치수수복재를 처리한 군의 세포생존율은 14일 동안 대조군과 통계적으로 유의성이 없는 유사한 값을 나타내었다(p>0.05).
2) 세포형태평가
세포는 적절히 배양되었을 때 그 형태가 방추형으로 길고 많은 세포질돌기(cytoplasmic extension)를 갖는다. 반면에 죽은 세포는 둥근 형태로 세포질 돌기가 관찰되지 않는다. 따라서 재료상에서 세포를 배양하였을 때 세포의 형태가 방추형이고 세포질 돌기가 관찰된다면 재료의 생체적합성이 우수함을 나타내는 것이다. 세포를 관찰하기 위해서 SEM을 이용하였다.
직경 5mm, 두께 1mm의 시편을 제작하고, 시편이 완전히 경화된 뒤, 1x105개의 세포를 재료상에 분주하였다. 세포가 올려져 있는 시편을 24-well plate 내에 넣고 MEM을 well 내부에 넣은 뒤, 이산화탄소 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 이후, 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 2시간 동안 적용하여 세포를 고정시키고 다양한 농도의 에탄올(70,80,90,95,100%)을 이용하여 탈수시켰다. 최종적으로 임계점 건조기(critical point dryer)를 이용하여 완전건조한 뒤, SEM을 이용하여 세포의 형태를 관찰하였다.
관찰 결과 본 발명의 치수수복재 상에서 배양된 세포는 방추형이면서 많은 세포질 돌기가 관찰되었다. 이는 제조된 본 발명의 치수수복재가 세포의 부착(adhesion) 및 증식(growth)에 적합함을 나타내는 것이며, 실제 임상에 적용되었을 때, 치수세포들이 재료에 부착하여 증식함으로써 수복상아질을 형성할 수 있는 생체 내 환경을 제공할 수 있다고 추론할 수 있다.
나. 광화유도능 평가
실제 임상에서 치수가 노출된 부분에 재료를 적용할 때 가장 중요한 궁극적 목적은 노출된 치수를 보호하고 치수의 건전성(integrity)을 지속적으로 유지시킬 수 있는 수복상아질의 형성을 촉진하는 것이다.
수복상아질은 상아질의 일종으로 삼차상아질(tertiary dentin)이라고도 한다. 상아질은 맹출할 때 이미 형성되어 있는데 이를 일차상아질(primary dentin)이라고 하며, 연령이 증가하면서 지속적으로 상아질이 형성된다. 이렇게 맹출 후 연령증가에 따라 형성되는 상아질을 이차상아질(secondary dentin)이라고 하며, 이는 생리적으로 자연스럽게 형성되는 것이다. 연령이 증가하면서 치아의 색상이 어두워지는 이유이기도 하다. 이렇게 생리적인 형성과는 다르게 우식 또는 외상 등에 의해 상아질이 파괴되어 내부의 치수조직이 노출되는 경우, 이를 적절하게 보호 또는 밀폐해주면 또 다른 형태의 상아질이 형성되는데 이를 삼차상아질이라고 명명한다. 즉, 삼차상아질은 병적인 환경에서 치수의 치유를 도모함으로써 형성될 수 있고 치아를 수복하는 의미를 갖기 때문에 이를 수복상아질이라고 명명하기도 한다. 일반적으로 수복상아질이라는 용어가 널리 사용된다.
수복상아질이 형성되기 위해서는 여러 가지 조건이 충족되어야하는데 치수 위에 위치되는 치수복조재의 생체적합성이 우수하여 하부의 치수조직에 염증을 유발하거나 괴사(necrosis)시키지 않아야 한다. 이를 평가하기 위해 전술한 생체적합성 평가를 시행한 것이다. 아울러 수복상아질도 뼈나 치아같은 광화조직(mineralized tissue)이므로 광화를 촉진할 수 있는 생체 내 기전(mechanism)이 작동되는 것이 중요하다. 이를 광화유도능이라고 하며 여러 가지 실험적 방법을 통해 평가하는데 주로 광화와 관련된 유전자의 발현(expression) 정도를 정량적으로 분석하여 유전자의 발현이 증가하면 광화유도능이 우수하다고 평가할 수 있다. 광화와 관련된 유전자는 여러 가지가 있으며, 특히 치아의 광화를 조절하는 유전자로는 alkaline phosphatase(ALP), dentin sialophosphoprotein(dspp), dentin matrix protein 1(dmp1), osteonectin(on) 등을 들 수 있다. 그 외에도 많은 유전자들이 관여하지만 본 평가에서는 상기 유전자들을 표지인자(marker)로 삼았다.
유전자의 발현을 측정하는 방법은 (1)유전자의 전사과정(transcription)에서 생성되는 mRNA를 채취하여 이를 이용하여 상보적인 DNA(cDNA)를 역전사(reverse transcription)시켜 합성한 뒤, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 기법으로 DNA를 증폭시켜 이를 측정하는 방법과, (2)유전자가 translation과정을 통해 합성되는 단백질을 채취하여 이를 측정하는 방법이 있다. 단백질을 측정하는 방법으로는 전기영동법(SDS-PAGE) 및 western blotting을 이용하는 것과 세포를 면역염색하여 관찰하는 방법 등이 있고 본 연구에서는 실시간 PCR(real-time PCR)법과 western blotting 및 면역형광염색법(immunofluorescence analysis)법을 이용하여 평가하였다. 아울러 ALP의 활성은 특성화된 kit를 이용하여 그 활성을 평가하였다.
실험 결과 본 발명의 치수수복재의 추출액을 처리한 세포에서 dspp, dmp1의 발현이 증가함을 보였고, 이는 본 발명의 치수수복재가 치수의 광화를 촉진한다는 것을 단적으로 보여준다고 할 수 있다. 결국, 본 발명의 치수수복재를 노출된 치수에 적용할 경우 수복상아질의 형성이 촉진될 수 있음을 알 수 있다.
다. 동물치아에서 수복상아질 형성의 평가
비록 실험실 평가(in vitro experiment)를 통해 생체적합성이나 광화유도능을 증명했다고 하더라도 실제 생체 내에서 수복상아질의 형성이 촉진되는지 여부를 완전히 입증했다고 볼 수는 없다. 따라서 동물의 치아에 실제 치과술식과 동일한 과정을 시행하여 수복상아질이 형성되었는지 여부를 조직학적으로 관찰하는 과정이 필요하다.
9주령의 수컷 Wistar rat 3마리를 이용하여 실험을 수행하였다. 1/8 round bur를 치과용 핸드피스(치과용 드릴)에 장착한 뒤 이를 이용하여 상악제1대구치 치수를 기계적으로 노출시켰다. 상악제1대구치는 rat의 좌,우측에 각각 1개씩 존재하므로 왼쪽 치아는 본 발명의 치수수복재를 이용하여 노출된 치수를 덮어주고 나서 치과용 수복재료의 일종인 글래스아이오노머를 이용하여 수복하였고 오른쪽 치아들은 글래스아이오노머만을 이용하여 수복하였다.
4주 후, 쥐를 CO2 흡입법을 이용하여 희생시키고 머릿부분을 절단하여 4% paraformaldehyde 용액에 보관하여 조직을 고정(fixation)하고, 18% EDTA를 이용하여 탈회하였다. 이 후, hematoxylin-eosin(H&E) 염색을 시행하고 광학현미경을 이용하여 수복상아질형성여부를 관찰한 결과 수복되었다.
상기한 바와 같은 구성을 통해, 본 발명인 치수수복재의 제조방법은 짧은 경화시간을 가지고, 조작성이 뛰어나고, 치수에 유해작용이 없어 우수한 생체친화성을 가지며, 효과적으로 상아질을 재생시킬 수 있으며, 기존의 MTA에 비해 가격경쟁력이 우수한 등의 이점을 가지게 됨을 알 수 있다.
Claims (4)
- i) 제2인산칼슘(Calcium Phosphate Dibasic)과 탄산칼슘(Calcium Carbonate)을 각각 Ca/P몰비 1.5와 2.0으로 균일 혼합하여 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)를 합성하는 제 1 단계,
ii) α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate), 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate), 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate)를 중량비 6:2:2로 혼합한 분말과 산화지르코늄(ZrO2)을 중량비 7:3의 비율로 혼합하는 제 2 단계 및
iii) 상기 제 2 단계에서 제조된 혼합물에 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 용액과 시트르산(Citric Acid) 용액을 혼합한 용액을 가하는 제 3 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는
치수수복재의 제조방법
- 청구항 1에 있어서,
상기 제 1 단계는
합성된 α-트리-칼슘 포스페이트(α-Tri-Calcium Phosphate) 및 테트라-칼슘 포스페이트(Tetra-Calcium Phosphate)을 볼 밀링(ball milling)을 통해 입자의 크기를 입자를 4~6μ으로 조정하는 과정을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는
치수수복재의 제조방법
- 청구항 1에 있어서,
상기 제 2 단계에서는
디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(Dicalcium phosphate Dihydrate) 분말과 산화지르코늄(ZrO2) 분말은 볼 밀링(ball milling)을 통해 3μ으로 조정한 것을 사용하는 것을 특징으로 하는
치수수복재의 제조방법
- 청구항 1에 있어서,
상기 제 3 단계에서는
인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 용액과 시트르산(Citric Acid) 용액을 혼합한 용액으로 인산수소 암모늄(Ammonium Hydrogen Phosphate) 0.5M 용액과 시트르산(Citric Acid) 0.3M 용액을 중량비 1:1로 혼합한 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는
치수수복재의 제조방법
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2015
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