KR20170004222A - 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents

알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물 Download PDF

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장승희
박종선
김광표
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서울대학교산학협력단
충남대학교산학협력단
경희대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알파1-안티트립신 억제제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알파1-안티트립신은 폐암의 발병 가능성 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악하는데 사용할 수 있으며, 비침습적으로 간단하게 폐암을 조기 진단할 수 있으므로, 폐암의 예방, 치료 또는 종양 형성 연구에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물{Composotion comprising α1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising α1-antitrypsin}
본 발명은 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
폐암(pancreatic cancer)은 다른 암에 비해 발생 빈도는 낮으나, 기간별 암환자 사망률이 가장 높은 것으로 알려져 있다. 폐암은 조기 진단이 어려운 암으로, 주변 장기나 림프절로 쉽게 전이되는 특징이 있어, 예후가 다른 암들에 비해 좋지 않아 폐암 치료를 위한 여러 노력에도 불구하고, 폐암 발병 후 5년간의 생존율은 지난 30년 동안 개선되지 않았으며, 폐암으로 인한 사망률은 계속 높아져 암 질환으로 인한 사망 중에서 5위를 차지하고 있다. 또한, 보건복지부 암등록 본부에서 공개한 자료에 따르면, 폐암 발병 후 1년 이내의 사망률은 폐암 발병 환자의 약 80%를 차지하는 것으로 조사되어, 폐암 환자의 생존율 또한 매우 낮은 것으로 확인되었다. 폐암을 치료하기 위한 요법으로는 화학요법과 방사선요법이 실시되고 있으나, 치료 효과는 매우 낮으며 폐암에서 가장 많이 사용하는 항암제인 젬시타빈(gemcitabine)의 경우 피리미딘 항대사물질로서 폐암 환자에 사용되고 있으나 그 효율은 6-11%인 것으로 낮아 옥살레이트(Oxalate)나 5-FU(5-fluorouracil) 등의 다른 약물과 함께 병용하여 사용되고 있으나 폐암 환자의 유의적인 생존률 증가에는 영향을 미치지 못하고 있다. 실제로 폐암에 사용되도록 승인받은 약물임에도 불구하고 젬시타빈은 폐암 생존률에는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되고 있어, 폐암을 치료할 수 있는 새로운 약물의 개발 및 다른 약물과 함께 병용할 수 있는 새로운 투여요법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT)은 간세포에서 합성된 후 혈액 내로 분비되며, 혈장 내에 존재하는 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 엘라스타제(elastase), 콜라게나제(collagenase), 트롬빈(thrombin) 및 플라스민(plasmin)과 같은 대부분의 세린계 단백질 분해효소에 대한 저해제들과 함께 설핀족(serpin family)에 속한다. 또한, 알파1-안티트립신은 분자량이 52kD(kilodalton)인 당단백질이며 생리적 기능은 중성 백혈구의 엘리스타제에 대한 저해제로 작용하며, 특히 폐포에 존재하는 탄성섬유(elastic fiber)가 중성백혈구의 엘리스타제에 의해 분해되는 것을 막아준다.
알파1-안티트립신과 관련된 병리학적 증상을 일으키는 선천적인 유전자 변이는 많이 알려져 있으며(Carrell et al., Mol. Biol.Med. 6, 35-42, 1982), 이들 대부분이 혈장 내의 알파1-안티트립신 농도를 감소시켜서 단백질 분해효소-저해제의 균형이 깨어지며, 이로써 허파는 신축성을 잃게 되고 호흡기종으로 진전된다. 이와 같은 유전적 결함에 의한 호흡기종 외에도 과다한 흡연이나 심한 환경공해로 인한 단백질 분해효소 저해제의 불활성화로 인해 호흡기종이 유발되기도 한다. 현재 북미와 유럽의 백인종에서 주로 발견되는 이러한 유전적 질환을 극복하기 위하여 매년 1억$ 이상의 알파1-안티트립신 시장이 형성되어 있고, 혈액에서 추출된 알파1-안티트립신이 치료제로 투여되고 있다. 한편, 쇼크 증후군은 중성백혈구의 갑작스런 대량 방출로 인해 혈장 설핀과 단백질분해효소사이의 균형이 파괴되어 야기되는 것으로 알려져 있다. 알파1-안티트립신은 급성 쇼크 증후군의 치료에도 사용될 수 있다(Robin W. Carrell, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 4,291-297, 1986)고 보고된 바 있다.
본 발명자들은 새로운 폐암 진단 및 이의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 폐암에서 특이적으로 증가하는 알파1-안티트립신을 발견하고, 이를 이용하여 폐암을 간단하게 진단할 수 있으며, 알파1-안티트립신을 억제할 경우 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암 치료 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT) 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용한 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 알파1-안티트립신 억제제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알파1-안티트립신은 폐암의 발병 가능성 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악하는데 사용할 수 있으며, 비침습적으로 간단하게 폐암을 조기 진단할 수 있으므로, 폐암의 예방, 치료 또는 종양 형성 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 폐 및 폐 세포에서 알파1-안티트립신 발현 여부를 웨스턴 블롯 및 공초점 레이저 주사현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 L132 세포에서 알파1-안티트립신 발현 여부를 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 L132 세포에서 차등 발현 단백질의 단백체 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 상기 차등 발현 단백질의 정량 단백질 추정에 대한 단백질 비율, 및 비율 p 값 및 시료 p 값을 계산하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 5는 상기 차등 발현 단백질의 유전자 온톨로지(gene ontology, GO) 분석 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 STAT5B 및 EEF1A2의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 이중-발광효소 리포터 분석(Dual-Luciferase Reporter Assay) 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내에서 xCELLigence RTCA DP 시스템을 이용하여 실시간 세포 증식, 이동, 및 침윤을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 알파1-안티트립신 과발현 세포 내에서 GOPC 및 BECN1의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내에서 GOPC 발현을 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 BECN1 및 GOPC에 대한 면역침강분석 및 근접결찰분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 만노스-6-포스페이트 수용체(M6PR) 및 클라트린을 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 OPN의 발현을 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 알파1-안티트립신 과발현된 세포의 인간 혈관 신생 배열 및 밀도 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 알파1-안티트립신 과발현된 세포의 크리스탈 바이올렛 분석을 통해 세포이동을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 15일간의 기아 조건하에서 알파1-안티트립신을 증가시킨 세포의 생존을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 알파1-안티트립신 과발현된 세포 내 Bcl-2, 시토크롬 c 및 LC3B의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 알파1-안티트립신이 소포-매개 수송, 생합성 과정, 혈관 신생 촉진, 및 세포 사멸 억제를 통한 세포 생존을 증진시키는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 19는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 밀도 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 Bcl-2, 시토크롬 c, 및 LC3B의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 OPN ELISA 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 혈관 신생 배열 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 TSP-1의 면역염색 밀도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 NNK-처리된 마우스의 폐에서 알파1-안티트립신 및 FGF-2의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 암 세포 이동 및 침윤을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 ICAM-1 및 EpCAM의 웨스턴 블롯 및 면역-형광 분석 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 마우스 폐암 모델의 폐에서 알파1-안티트립신을 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 면역염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 마우스 폐암 모델의 폐에서 알파1-안티트립신을 면역-형광 이미지를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 31은 마우스 폐암 모델의 폐 및 혈청에서 마우스 OPN ELISA 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 알파1-안티트립신이 감소된 마우스 모델의 폐에서 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 33은 알파1-안티트립신이 감소된 마우스 모델의 폐에서 CD31 및 PCNA의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하고, 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 34는 마우스 폐암 모델의 폐에 AAT 에어로졸 전달 후 총 종양의 수 및 부피를 나타낸 도이다.
도 35는 마우스 폐암 모델의 폐 종양의 형성 여부를 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT) 억제제를 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 알파1-안티트립신은 간세포에서 합성된 후 혈액 내로 분비되며, 혈장 내에 존재하는 당단백질로서, 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제한다.
본 발명에 따른 알파1-안티트립신 억제제는 알파1-안티트립신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 알파1-안티트립신 단백질에 직, 간접적으로 결합하여 이의 활성을 저해할 수 있는 모든 물질을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리기며, 본 발명의 목적상, 항체는 알파1-안티트립신에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하며, 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.
상기 알파1-안티트립신 억제제는 AAT 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) 또는 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 shRNA의 타겟 알파1-안티트립신은 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으며, 서열번호 1은 하기와 같다.
5'-GACATCCACAAGTCCTTCCAACACCTCCT-3'
상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암일 수 있으며, 바람직하게는 비소세포폐암이다.
상기 비소세포폐암은 폐선암, 편평상피세포암 또는 대세포암을 포함하며, 바람직하게는 폐선암이다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은, AAT 억제제 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 0.0001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 폐암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 화학적 치료, 방사성 치료, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 알파1-안티트립신 억제제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
알파1-안티트립신은 폐암 세포에서 증가하는바, 이를 이용하여 폐암을 진단하는 바이오마커로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커"는 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것으로, 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준은 폐암 세포에서 증가하는바, 알파1-안티트립신을 폐암 진단에 활용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 알파1-안티트립신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는, 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다.
프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폐암 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 발현량을 정상 대조군 시료의 알파1-안티트립신 단백질의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다.
상기 방법에서 "시료"란 생물학적 시료(biological sample)로서 폐암 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현 수준 측정"은 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 일반적으로 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한다.
이를 위한 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용한 방법을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 폐암 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다.
이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩을 이용한 방법을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알파1-안티트립신 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 폐암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하므로, 폐암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 알파1-안티트립신의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준보다 높으면 폐암 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
상기 '폐암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 알파1-안티트립신의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높다'는 것은 다양한 방법에 의해 측정될 때 폐암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 알파1-안티트립신의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 1.0배를 초과, 1.5배를 초과, 2배를 초과, 3배를 초과, 5배를 초과 또는 10배를 초과하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 조성물 및 정보제공방법은 폐암의 발병 가능성 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있으며, 비침습적으로 간단하게 폐암을 조기 진단할 수 있으므로, 폐암의 예방, 치료 또는 종양 형성 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재료의 준비
1-1. 인간 및 마우스 시료의 준비
본 발명에 사용된 인체시료(biospecimens)는 국가중앙인체자원은행(National Biobank of Korea)의 일원인 고려대학교 구로병원 한국인체자원은행로부터 제공 받았으며, 인간 조직을 사용한 본 실험은 서울대학교 임상시험 심사위원회(Seoul National University Institutional Review Board,　SNUIRB-E1201/001-001)에 의해 승인받았다. 또한, 실험에 사용된 모든 마우스는 서울대학교 지침의 동물 프로토콜 하에 보관하였으며, 본 실험은 서울대학교(SNU-121017-1 and SNU-140707-3)의 동물실험윤리위원회(Animal Care and Use Committees)에 의해 승인받았다. 인간 비소세포성 폐암 모델인 A/J 마우스 및 K-ras LA1 마우스는 중앙실험동물(Joongang Laboratory Animal Inc.)(Seoul, Korea) 및 인간 암 컨소시움-국립 암 연구소(National Cancer Institute)(Frederick, MD, USA)로부터 각각 구매하였으며, 온도 및 상대 습도가 23 ± 2°C 내지 50 ± 20%로 유지되는 실험 동물 시설에서 12-시간 명/암 주기 하에 보관하였다. 4-주령 수컷 A/J 마우스에서 4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone으로도 알려진, 티코틴-유래 니트로사민 케톤(NNK)에 의한 폐 종양을 유도하기 위하여, 체중당 100 mg 및 75 mg의 NNK를 1주 간격으로 정맥 내 주사한 후, 19주 후, 마우스를 희생하였다(Lu et al., 2010). 대조군은 생리식염수만을 주사하였다.
또한, 폐암의 진행에 있어 마우스 shAAT(5′-GAC ATC CAC AAG TCC TTC CAA CAC CTC CT-3′)의 효과를 확인하기 위하여, 6-주령 수컷 K-ras LA1 마우스(Chang et al., 2013a; Chang et al., 2012c)를 3개의 군으로 나누었다(그룹당 n = 5). 대조군은 미처리하였으며, 다른 두개의 군은 렌티바이러스-스크램블 또는 렌티바이러스-shAAT를 포함하는 에어로졸에 노출시켰다. 에어로졸 전달을 위하여, K-ras LA1 마우스를 렌티바이러스-shAAT 또는 -스크램블 용액(50 mL, 렌티바이러스의 40 ng/mL의 p24 항원을 포함)을 포함하는 에어로졸에 8주동안 일주일에 두번씩 노출시켰다. 실험 마지막에 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 폐를 수거하였다.
1-2. AAT 가 증가 또는 감소된 세포주의 세포 배양 및 생성
인간 정상 폐 상피 세포 L132를 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)로부터 얻었으며 인간 폐포성 기저암(lung alveolar basal carcinoma) 상피 세포 A549를 ATCC(American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)로부터 얻었다. NCI-H146, -H209, -H226, -H322, -H460, -H520, 및 -H522 세포를 37℃, 5% CO2의 가습 배양기 내 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 제공된 RPMI-1640에서 배양하였다. L132 또는 A549 세포 (1×106)를 T25 플라스크에서 성장시킨 후 TransITR-LT1 시약(Mirus Bio, Madison, WI, USA)을 사용하여 인간 AAT 또는 shRNA(5′-CAG ATC CAT GAA GGC TTC CAG GAA CTC CT-3′; Catalog No. TG309541D)를 포함하는 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질 감염 후, 각 세포는 인간 AAT 과발현을 위한 400 mg/ml의 G418 이황산염(disulfate salt)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 shRNA 형질주입을 위한 1 mg/ml의 퓨로마이신(puromycin)(InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 포함하는 배지를 선택하였다. L132 및 선택된 안정한 세포주(Vector/L132 및 AAT/L132) 또는 A549 및 선택된 안정한 세포주(shScramble/A549 및 shAAT/A549)를 10% FBS 및 1% P/S가 제공된 DMEM(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 또는 10% FBS 및 1% P/S (GibcoBRL)가 제공된 Ham′s F-12 (GibcoBRL)에서, 각각 성장시켰다.
실험예 1. 폐 선암종 조직 및 세포주에서 AAT 의 과발현 여부 확인.
각 시료에서 AAT의 발현 수준을 확인하기 위하여, 인간 및 마우스의 폐, 및 폐 세포를 이용하여 웨스턴 블롯 및 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM) 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1a 내지 1c에 나타낸 바와 같이, 인간 폐암 종양 시료(특히 단계 II) 및 선암종 세포인, A549 및 NCI-H522에서 AAT 단백질 수치가 증가하였다.
또한, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 세포 및 L132와 비교하여 A549 세포에서 AAT 단백질 수치가 증가하였다.
또한, 도 1e 및 1f에 나타낸 바와 같이, K-ras 야생형(WT) 마우스와 비교하여 인간 폐 선암종(K-ras LA1) 마우스 모델의 폐 내에서 AAT 단백질 수치가 유의미하게 증가하였고, 도 1g 및 1h에 나타낸 바와 같이, A/J 마우스의 티코틴-유래 니트로사민 케톤(nicotine-derived nitrosamine ketone, NNK)-유도된 폐 선암종에서 AAT 단백질 수치가 증가하였다. 이는 AAT가 폐 선암종 세포 및 조직 내에서 과발현된다는 것을 나타낸다.
실험예 2. AAT -과발현 L132 세포 내 차등 발현 단백질(differential expressed proteins, DEPs )의 단백체 ( proteomic ) 분석
폐암 진행에 AAT이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 L132 세포 내에서 AAT 발현을 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 벡터-형질주입된 세포(Vec) 및 대조군 세포(Con)와 비교하여 안정적으로 AAT가 증가된 세포(AAT)에서 AAT 단백질 수치가 증가하였음을 확인하였다.
또한, 기준 세포와 비교하여 L132 세포 내 AAT의 과발현과 관련된 변화를 더 확인하기 위하여, TMT 표지 정량적 단백체 분석을 수행하였다. AAT-과발현 세포의 단백질 용해물로부터 얻은 트립신 분해 펩티드(tryptic peptides)를 TMT-128로 표지하고, 벡터-형질주입된(vector-transfected, Vec) 세포 및 대조군 세포 (Con)의 단백질 용해물로부터 얻은 트립신 분해 펩티드를 TMT-126 및 TMT127로 각각 표지한 후, 삼중 MS 분석을 통하여, 총 8,709개의 단백질을 확인하고 정량하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
또한, R 소프트웨어 패키지 동중원소(Isobar) (Isobar released Sep_2014, http://bioinformatics.cemm.oeaw.ac.at)를 이용하여, 각각의 정량 단백질 추정의 기술적 변동성에 대한 단백질 비율, 및 비율 p 값 및 시료 p 값을 계산하였다. 적어도 하나의 복제의 128/126 (AAT/Con) 및 128/127 (AAT/Vec)에서 비율 p 값 및 시료 p 값이 모두 0.05 미만인 경우(Figures 2D and S1, and Table S2) 단백질을 차등 발현 단백질 (DEPs)로서 수거하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내에서 각각 106 및 103개의 단백질이 증가 및 감소된 DEPs인 반면, 총 209개의 단백질이 AAT/Vec 내에서 DEPs로 확인되었다.
또한, AAT 과발현과 관련된 생물학적 과정의 변화를 조사하기 위해, DAVID 생물정보학 자원(Bioinformatics resources)(Huang et al., 2009a; Huang et al., 2009b)을 이용하여 DEPs로부터 생물학적 과정의 유전자 온톨로지(gene ontology, GO) 분석을 수행하였다. Fisher 정확검정(Fisher exact test)에서 p 값이 0.5 미만인 경우 현저히 영향을 주는 GO annotations를 선택하였다. 생물학적 과정은 도 5 로 나타내었으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

 Expression log2 (AAT/Con) Expression log2 (AAT/Vec)
#1 #2 #3 #1 #2 #3
세포 사멸 조절
EEF1A2(Elongation factor 1-alpha 2) 1.04 1.04 1.17 0.98 1.14 1.32
STAT5B(Signal transducer and activator of transcription 5B ) 0.61 0.37 0.43 0.58 0.45 0.52
TSP-1(Thrombospondin-1) 0.68 N/D N/D 1.33 N/D N/D
소포 매개 수송
GOPC(Golgi-associated PDZ and coiled-coil motif-containing protein) 0.35 0.33 0.14 0.26 0.24 0.14
TGF-β1(Transforming growth factor-beta 1) 0.46 0.15 0.17 0.62 0.28 0.53
세포 부착 조절
ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1) -0.03 -0.17 -0.41 0.77 0.48 1.25
유기 화합물의 산화에 의한 에너지 유도
Cytochrome c -0.50 -0.43 -0.47 -0.68 -0.54 -0.57
SOD2(Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial) -0.55 -0.42 -0.47 -0.63 -0.52 -0.69
표 1에 나타낸 바와 같이, 증가된 DEPs가 가장 명백하게 영향을 주는 GO 조건은 소포(vesicle)-매개 수송, 세포 사멸 조절, 및 세포 접착 조절이며, 감소된 DEPs는 유기 화합물의 산화에 의한 에너지 유도와 같은 미토콘드리아 기능 관련 GO 조건에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
실험예 3. 상승된 AAT 가 인간 정상 폐 세포 내 세포 증식 및 캡-의존적(cap-dependent) 단백질 번역에 미치는 영향 확인
단백질 전사 및 번역에 미치는 AAT의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 AAT-과발현 세포 내 STAT5B(signal transducer and activator of transcription 5B) 및 EEF1A2(eukaryotic trans translation elongation factor 1-α2)의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포에서 STAT5B 및 EEF1A2의 발현이 증가함을 확인하였다.
또한, AAT-매개 캡-의존적 단백질 번역을 확인하기 위하여, AAT-과발현 세포 내에서 이중-발광효소 리포터 분석(Dual-Luciferase Reporter Assay)을 수행하였다. 먼저, 세포를 6-웰 플레이트에서 성장시키고 bicistronic 리포터 플라스미드(pcDNA-fLuc-polIRES-rLuc)로 형질주입시켰다. 24 또는 48시간 동안 배양한 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS에서 두번 세척하고 수동적 용해 완충액(passive lysis buffer)(Promega)에서 추출한 후, 반?불이(firefly) 및 레닐라(renilla) 발광효소 활성을 이중-발광효소 리포터 분석 시스템(Dual-Luciferase® Reporter Assay System)(Promega)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, AAT가 과발현되는 경우, 캡-의존적 번역은 24시간 및 48시간 동안 대조군과 비교하여 각각 ~53% 내지 ∼45% 증가하였다. 이는 eIF4E 및 4EBP1의 인산화가 캡-의존적 단백질 번역과 연관되어 있음을 나타낸다.
또한, 증가된 AAT가 증식에 미치는 효과를 확인하기 위하여, AAT-과발현 세포 내에서 실시간으로 세포를 관찰하는 xCELLigence RTCA DP 시스템(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)을 이용하여 실시간 세포 증식, 이동, 및 침윤을 측정하였다. 이때, 세포를 E-plate 16 (증식용; 2.5×103 세포) 또는 CIM-plate 16 (이동용; 2∼8×104 세포, 침윤용; 8×104 세포)의 웰에 두고 배양하였으며, 측정 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내에서 대조군 및 벡터-형질주입된 세포와 비교하여 증식이 현저하게 증가하였으며, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 밀도의 막대 그래프를 통해 48 시간 후에 측정한 xCELLigence의 결과와 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 AAT의 과발현이 전사, 캡-의존적 단백질 번역, 및 세포 증식을 유도함을 나타낸다.
실험예 4. AAT 가 소포-매개 수송의 증가, 생합성 과정, 혈관 신생, 및 세포 사멸의 음성 조절을 통해 세포 생존을 촉진시키는지 여부
소포-매개 수송의 결과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 AAT-과발현 세포 내에서 GOPC 및 관련 자가소화(autophagy) 단백질인 BECN1의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내 24 및 48 시간 후의 BECN1의 발현이 감소한 반면, GOPC 발현이 증가하였다.
또한, 24시간 후 AAT-과발현 세포 내 GOPC 발현을 면역형광 분석에 의해 확인하였으며, 이를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내 GOPC의 발현이 증가됨을 확인하였다.
또한, Dynabead 단백질 G(Invitrogen)를 이용하여 BECN1 및 GOPC에 대한 면역침강분석(Immuno-precipitation assay, IPA)을 수행하였으며, Duolink® In Situ Kit(Olink Bioscience, Uppsala, Sweden)를 이용하여 이에 대한 근접결찰분석(proximity ligation assay, PLA)을 수행하였다. 실험 절차는 제조업체의 프로토콜을 따랐으며, 골지체에 대한 GM130의 면역염색은 PLA 분석 후 수행되었다. 이의 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, 안정적으로 AAT가 증가된 L132 세포에서 GOPC, Golgi-연관 단백질, 및 BECN1 사이의 결합을 확인하였으며, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 이들 두개의 단백질의 결합 친화도를 확인하였다.
또한, AAT-과발현 세포 내에서 소포-매개 수송에 대한 AAT의 효과를 확인하기 위하여, 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor, M6PR) 및 클라트린(clathrin)(코팅된 비히클의 형성에 중요한 역할을 하는)을 면역형광 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포에서 M6PR 및 클라트린이 유도됨을 확인하였다.
또한, 오스테오폰틴(osteopontin, OPN)은 글리코실화된 인단백질로 알려져 있으며, 폐암을 포함하는 다양한 인간 종양에서 과발현되는 것으로 알려져 있으므로, 증가된 AAT에 의한 생합성 과정시 대표적인 단백질로서, OPN의 발현을 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 통하여 검출하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포에서 OPN이 유도됨을 확인하였다.
또한, 혈관 신생 및 세포에 AAT가 미치는 영향을 확인하기 위해 안정적으로 AAT 과발현된 L132 세포에서 인간 혈관 신생 어레이 및 밀도 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14a 및 14b에 나타낸 바와 같이, 혈관 신생-관련 단백질의 발현은 대조군 세포(Con)와 비교하여 AAT-과발현 L132 세포 (AAT)에서 상당히 증가하였다. 도 15c 및 15d에 나타낸 바와 같이, 이들 단백질 중, 폐 종양에 중요한 역할을 하는 TSP-1를 선택하여 TSP-1의 증가된 수치를 확인하였다. 이 때, 도 15e에 나타낸 바와 같이, AAT 돌연변이가 TSP-1 단백질 발현을 증가시키지 않으므로 증가된 수치는 AAT와 관련이 있음을 나타낸다.
또한, 세포 이동에 AAT가 미치는 영향을 확인하기 위해 크리스탈 바이올렛 분석(Crystal violet assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 세포 이동이 AAT의 증가에 의하여 증가함을 확인하였다.
또한, 15일간의 기아 조건하에서 AAT를 증가시킨 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 옅은 색을 나타낸 대조군에 비하여 뚜렷한 핑크색(세포 생존의 간접 신호)을 나타낸 AAT-과발현 세포 배지의 경우 생존을 길게한다는 것을 나타내므로, 15일간의 기아 조건하에서도 세포 생존은 증가하였음을 확인하였다.
AAT의 증가가 자가소화(autophagy) 또는 세포사멸과 관련성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, AAT-과발현 L132 세포 내에서 Bcl-2, 시토크롬 c 및 LC3B의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 벡터(Vec) 및 대조군(Con)과 비교하여 AAT-과발현 세포 (AAT)에서 Bcl-2의 증가 및 시토크롬 c 및 LC3B의 감소를 확인하였다. 인간 Bcl-2은 미토콘드리아 막의 안정을 통한 시토크롬 c의 방출 억제에 의해 세포 생존을 증가시킬 수 있는 세포사멸 억제(anti-apoptotic), 막-관련 종양단백질(oncoprotein)이며, BECN1-의존 자가소화를 억제하므로, 세포 생존을 돕는다. 따라서, 상기 결과는 AAT의 증가가 소포-매개 수송, 생합성 과정, 혈관 신생 촉진, 및 세포 사멸 억제를 통한 세포 생존을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 이를 간단히 도 18에 나타내었다.
실험예 5. AAT 의 감소가 인간 폐암 세포에서 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역을 억제하는지 여부
암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역에 있어 감소된 AAT의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 안정하게 AAT가 감소된 A549 세포에서 RT-PCR, 웨스턴 블롯, xCELLigence을 이용한 실시간 세포 증식, 및 이중-발광효소 분석을 수행하였다.
먼저, AAT 감소 세포(shAAT)에서 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 밀도 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19a 내지 19c에 나타낸 바와 같이, 스크램블-형질주입된 세포(scramble-transfected, shScr) 및 대조군 세포(Con)와 비교하여 AAT 감소 세포에서 감소된 mRNA 및 AAT 단백질 수치를 확인하였다.
또한, AAT 감소 세포에서 암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역을 확인하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20a 내지 20d에 나타낸 바와 같이, AAT 감소 세포에서 암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역 또한 감소하였다.
또한, AAT의 감소와 자가소화 및 세포사멸의 연관성을 확인하기 위하여, AAT 감소 세포에서 Bcl-2, 시토크롬 c, 및 LC3B의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 감소된 AAT는 시토크롬 c 및 LC3B의 증가 및 Bcl-2의 감소를 유발하였다.
상기 결과는 AAT의 감소가 캡-의존적 단백질 번역, 자가소화, 및 세포사멸을 조절함으로써 세포 생존을 억제하는 것을 나타낸다.
실험예 6. AAT 의 감소가 인간 폐암 세포에서 혈관 신생, 이동 및 침윤을 억제하는지 여부
혈관 신생을 유도하는 OPN 발현에 미치는 AAT 감소의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 AAT 감소 세포의 배지에서 인간 OPN ELISA 분석을 수행하였다. 먼저, 배양된 배지 또는 마우스 혈청의 OPN 수치를 인간 또는 마우스/랫트 OPN 면역분석법을 위한 Quantikine ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 관찰 후, 이를 Microplate Reader (Bio-Rad)를 이용하여 OD 450 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, AAT의 감소가 정상 세포 수준과 유사하게 OPN 분비를 저해함을 확인하였다.
또한, 감소된 AAT가 혈관 신생에 미치는 효과를 더 확인하기 위하여, 프로테옴 프로파일러 인간 혈관 신생 어레이 키트(Proteome ProfilerTM Human Angiogenesis Array Kit)를 이용하여 AAT 감소 세포에서 인간 혈관 신생 어레이 분석을 수행하고, TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였으며, 그 결과를 각각 도 23 및 도 24에 나타내었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 혈관 신생-관련 단백질의 발현은 96 시간 후에 대조군 세포(Con)와 비교하여 AAT 감소된 A549 세포 (shAAT)에서 4 ~ 58% 감소하였으며, 도 24에 나타낸 바와 같이, 7일 후 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현이 현저히 감소하였다.
이 때, 도 25에 나타낸 바와 같이, TSP-1의 면역염색 밀도는 AAT 감소 세포에 의해 별개로 감소되었다.
또한, NNK 처리 및 AAT 감소의 관계를 확인하기 위하여, NNK-처리된 마우스의 폐에서 AAT 및 FGF-2의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타낸 바와 같이, AAT 및 FGF-2의 발현은 A549 세포(Con)에서 NNK 처리에 의해 현저히 증가하였으나, 이러한 NNK-매개 증가된 AAT 단백질 발현은 AAT 감소 세포(shAAT)에서 상쇄되었다. FGF-2 단백질 발현 또한 이와 매우 유사한 결과를 나타내었다.
또한, 암 세포 이동 및 침윤에 대한 AAT 감소의 효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 스크램블-형질주입된 세포과 비교하여 AAT 감소 세포에서 암 세포 이동(27a 및 27b) 및 침윤(27c 및 27d)이 현저히 감소하였다.
이와 관련하여, shAAT가 세포 부착에 미치는 효과를 평가하기 위해 ICAM-1 및 EpCAM(epithelial cellular adhesion molecule)과 같은 대표적인 부착 분자의 웨스턴 블롯 및 면역-형광 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, AAT 감소 세포에서 대조군 또는 스크램블-형질주입된 세포와 비교하여 ICAM-1 및 EpCAM의 발현이 감소하였다.
이들 결과는 AAT의 감소가 폐암 세포의 혈관 신생, 이동, 및 침윤을 억제한다는 것을 나타낸다. 또한, AAT의 감소는 암 세포 부착을 방지함으로써 세포 사멸을 유도할 수 있다.
실험예 7. AAT 의 감소가 K- ras LA1 마우스의 폐에서 혈관 신생 및 암 세포 증식의 억제를 통해 폐 종양 형성( tumorigenesis )을 억제하는지 여부
생체내(in vivo)에서 shAAT가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1의 마우스 폐암 모델, K-ras LA1 마우스를 이용하였다. K-rasLA1 마우스의 폐에서 AAT의 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 면역염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 29 및 도 30에 나타내었다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con) 및 스크램블-전달(shScr)군과 비교하여 shAAT에 의해 K-ras LA1 마우스의 폐에서 AAT mRNA 및 단백질 수치가 감소하였음을 확인하였다.
또한, 도 30에 나타낸 바와 같이, AAT의 면역-형광 이미지를 통해 RT-PCR 및 웨스턴 블롯과 동일한 결과를 확인하였다.
또한, AAT의 감소가 K-rasLA1 마우스의 폐에서 혈관 샌생을 변경시키는지 여부를 측정하기 위하여, K-rasLA1 마우스의 폐 및 혈청에서 마우스 OPN ELISA 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, OPN의 수치는 스크램블(shScr) 및 대조군 마우스와 비교하여 K-ras 야생형 마우스(WT)뿐만 아니라 AAT이 감소된 마우스 모델의 혈청에서도 현저히 감소하였다.
또한, 도 32에 나타낸 바와 같이, AAT가 감소된 마우스 모델의 폐에서 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과, TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현이 감소하였다.
또한 암 세포 증식에 미치는 AAT 감소의 효과를 확인하기 위하여, AAT이 감소된 마우스 모델의 폐에서 CD31 및 PCNA의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하고, 이의 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 33에 나타내었다.
도 33에 나타낸 바와 같이, AAT가 감소된 마우스 모델의 폐에서 CD31 및 PCNA의 감소된 수치와 세포 증식 마커를 확인하였으며, 도 34에 나타낸 바와 같이, 14-주령 K-rasLA1 마우스의 폐의 총 종양의 수 및 부피는 shAAT의 에어로졸 전달에 의해 현저히 감소하였다.
또한, 상기 마우스 모델의 폐 종양 형성은 H&E 염색을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타낸 바와 같이, AAT가 감소된 마우스 모델의 폐에서 AAT 감소에 의해 폐 종양의 형성이 억제됨을 확인하였다.
상기 결과는, AAT의 감소가 K-rasLA1 마우스의 폐에서 세포 증식 및 혈관 신생의 저해를 통해 폐암을 억제한다는 것을 나타낸다.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 알파1-안티트립신의 증가는 폐암 세포에서 암세포의 혈관 신생 및 세포 생존을 촉진시키며, 알파1-안티트립신의 감소는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제하므로, 알파1-안티트립신의 발현을 폐암의 진단 마커로서 사용할 수 있음을 확인하였으며, 알파1-안티트립신 억제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하 본 발명의 알파1-안티트립신 억제제을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
알파1-안티트립신 억제제 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
2. 정제의 제조
알파1-안티트립신 억제제 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
3. 캡슐제의 제조
알파1-안티트립신 억제제 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
4. 주사제의 제조
알파1-안티트립신 억제제 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
5. 액제의 제조
알파1-안티트립신 억제제 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Composotion comprising a1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising a1-antitrypsin <130> p-107 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> RNA <213> a1-antitrypsin <400> 1 gacatccaca agtccttcca acacctcct 29

Claims (16)

  1. 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT) 억제제를 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알파1-안티트립신 억제제는 알파1-안티트립신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알파1-안티트립신 억제제는 알파1-안티트립신 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 shRNA의 타겟 알파1-안티트립신은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암인 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폐암은 폐선암인 것을 특징으로 하는, 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물.
  8. 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제제는 알파1-안티트립신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제제는 알파1-안티트립신 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 폐암 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 및 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 키트.
  13. 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 발현량을 정상 대조군 시료의 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준과 비교하여 발현량이 높은 경우 폐암인 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용한 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 수행되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소 반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩을 이용한 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
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