KR20160139701A - 축우의 혈액 내 비타민 a 함량 분석 방법 및 비타민 a 결핍증 조기진단용 조성물 - Google Patents

축우의 혈액 내 비타민 a 함량 분석 방법 및 비타민 a 결핍증 조기진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 축우의 혈액 내 비타민 A 함량 분석 방법 및 비타민 A 결핍증 조기진단용 조성물 및 그 방법에 관한 것으로, 본 발명을 적용하면 보다 정확하게 비타민A 제한수준 분석이 가능하여 사료 중 비타민A 제한수준 결정을 용이하게 하고, 새로운 개념의 한우 고급육 생산기술을 정착시킬 수 있다. 아울러 비타민A 제한에 따른 결핍증상을 조기에 모니터링 함으로 보다 과학적이고 안전한 비타민 A 제한기술을 가능하게 할 수 있다.

Description

축우의 혈액 내 비타민 A 함량 분석 방법 및 비타민 A 결핍증 조기진단용 조성물{A method for analyzing Vitamin A content in blood of cattle and a composition for diagnosing vitamin A restriction}
본 발명은 축우의 혈액 내 비타민 A 함량 분석 방법 및 비타민 A 결핍증 조기진단용 조성물에 관한 것이다.
비타민 A (retinol) 및 그것의 활성 대사체인 retinoic acid은 여러 조직들의 기능 및 발달에 필수적이다(Beijer MR, G Kraal and JM den Haan, 2014. Immunol, 142: 39-45).
기존 연구들은 비육 단계 III (21-23 월령) 동안 낮은 혈중 Vitamin A 레벨은 높은 마블링 점수의 거세소를 생산하는데 관련된다는 것을 시사한다 (Adachi K, H Kawano, K Tsuno, Y Nomura, N Yamamoto, A Arikawa, A Tsuji, M Adachi, T Onimaru and K Ohwada, 1999. J Vet Med Sci, 61: 961-964).
또한, 피하 지방 조직의 지방산 프로파일에서 사소한 변화가 vitamin A-제한된 Angus 거세소에서 관찰되었고, 이것은 vitamin A가 desaturase 효소 활성에 영향을 미친다는 것을 시사하였다(Gorocica-Buenfil MA, FL Fluharty and SC Loerch, 2008. J Anim Sci, 86: 1609-1616).
일반적으로 소의 vitamin A 제한을 통한 근육내 지방의 레벨을 개량을 목적으로 하는 연구에서 동물 도체(carcass) 나 생검으로부터 모아진 근육 조직이 필수적이다. 그러나 이 두 샘플링 방법은 동물 도축 가격이 비싸고, 생검법은 동물에게 큰 스트레스를 유발하므로 이상적인 방법이 아니다.
따라서 혈액의 사용이 대체적인 방법으로 대두된다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허출원번호 제1020147037128호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 프로테오믹스 및 대사체 연구를 통하여 비타민 A 제한에 반응하는 혈중 대사체 또는 단백질을 발견하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 소의 혈액으로부터 분리한 혈청과 내부 표준용액을 첨가하여 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 혈액 중 비타민 A를 정량하고, 여기서 내부 표준용액은 레티닐 아세테이트(Retinyl acetate)를 이용하여 제조하며,
비타민 A의 양은 (내부 표준의 면적 X 비타민 A의 면적 X 비타민 A의 내부 표준 인자)/ 내부 표준의 면적으로 계산하며, 여기서, 내부 표준 인자는 (내부 표준 면적X 비타민 A 양)/(내부 표준의 양 X 비타민 A 면적)인 것을 특징으로 하는 소의 혈액내 비타민 A 정량 방법을 제공한다.
또 본 발명은 하이버네이션 단백질(hibernation protein) 25를 유효성분으로 포함하는 소의 비타민 A 부족 검출용 생리 지표를 제공한다.
또 본 발명은 소의 혈액에서 단백질을 추출하여 프로테오믹스 방법으로 분석하여 하이버네이션 단백질(hibernation protein) 25의 레벨이 높은 경우에 비타민 A 부족으로 판단하는 것을 특징으로 하는 비타민 A 진단 방법을 제공한다.
또 본 발명은 겔솔린(Gelsolin) a, 보체 인자(Complement factor) B, 알파-1-마이크로블린 및 비쿠닌 전구체(microglobulin bikunin precursor) 및 트랜스티레틴(Transthyretin)으로 구성된 단백질 중에서 하나 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 소의 비타민 A 부족 여부 진단용 생리지표를 제공한다.
또 본 발명은 소의 혈액에서 단백질을 추출하여 프로테오믹스 방법으로 분석하여 겔솔린(Gelsolin) a, 보체 인자(Complement factor) B, 알파-1-마이크로블린 및 비쿠닌 전구체(microglobulin bikunin precursor) 및 트랜스티레틴(Transthyretin)으로 구성된 단백질 중에서 하나 이상의 단백질의 레벨이 낮은 경우에 비타민 A 부족으로 판단하는 것을 특징으로 하는 비타민 A 진단 방법을 제공한다.
또 본 발명은 소의 혈액에서 칼슘 농도, 코티졸 및 코티존의 농도를 측정하여 칼슘의 농도가 높고, 코티졸 및 코티존의 농도가 낮은 경우에 비타민 A 레벨이 낮은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 소의 비타민 A 진단 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 한우 고급육 생산을 위한 비타민A 제한기술을 적용함에 있어 필수적인 한우 혈액 중 비타민A 수준 분석기술 확립 및 비타민A 결핍증상을 조기에 모티터링하기 위한 혈중 생리지표 단백질발굴에 관한 것이다.
본 발명을 적용하면 보다 정확하게 비타민A 제한수준 분석이 가능하여 사료 중 비타민A 제한수준 결정을 용이하게 하고, 새로운 개념의 한우 고급육 생산기술을 정착시킬 수 있다. 아울러 비타민A 제한에 따른 결핍증상을 조기에 모니터링 함으로 보다 과학적이고 안전한 비타민 A 제한기술을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 혈중 Vit A의 dilution에 의한 농도 변화를 나타낸 그림.
도 2는 보관기간에 따른 혈중 Vit A의 농도 변화를 나타낸 그림.
도 3은 한우 혈중 비타민 A 함량에 따른 대사체 분석을 나타낸 그림.
도 4a는 한우 혈중 비타민 A 함량에 따른 단백체 분석을 나타낸 그림.
도 4b는 한우 혈중 비타민 A 함량에 따른 단백체 분석을 나타낸 그림.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:한우 혈액 중 비타민A 분석방법
1) 혈액 샘플 준비
한우의 경정맥에서 혈액을 채취하여 빛이 차단된 혈청튜브에 보관한 후, 3500rpm, 15min 원심분리 후 상층액을 갈색튜브에 넣어 -80℃에서 분석 전까지 보관하였다.
2) 내부 표준용액 (Internal standard, IS)준비
스톡 용액 제조: Retinyl acetate (R7882, Sigma) 100mg를 취하여 0.04% BHT-EtOH 용액에 넣어 최종 농도가 1mg/ml이 되도록 녹여 제조하였다.
워킹 용액 A 제조(25μg/ml): 25ml 상기 스톡용액에 975ml 0.04% BHT-EtOH을 첨가하여 제조,
워킹 용액 B 제조(10μg/ml): 10ml 상기 스톡 용액에 990ml 0.04% BHT-EtOH을 첨가하여 제조
워킹 내부 표준 용액 제조(1ug/ml): 20ml의 상기 워킹 용액 A에 480ml 0.04% BHT-EtOH를 첨가하여 제조
3) 표준용액 (Standard, STD) 준비
Retinoic acid (R7632, Sigma) 25mg을 취하여 0.04% BHT-EtOH 용액에 넣어 최종 농도가 100ug/0.9ml이 되도록 녹여 제조하고, 아래의 방법으로 최종농도 0.05μg/ml까지 희석하여 표준용액 제조을 제조하였다.
4) 표준용액 제조 방법 (Internal response factor, IRF 방법을 이용)
STD 농도 (μg/ml) 표준용액 0.04% BHT-EtOH Solution B
Stock sol 100 900μl의 stock sol
: : : : :
STD 1 12.5 450 μl의 STD 0 450 μl 100 μl
STD 2 6.25 450 μl의 STD 1 450 μl 100 μl
STD 3 3.13 450 μl의 STD 2 450 μl 100 μl
STD 4 1.56 450 μl의 STD 3 450 μl 100 μl
STD 5 0.78 450 μl의 STD 4 450 μl 100 μl
STD 6 0.39 450 μl의 STD 5 450 μl 100 μl
STD 7 0.20 450 μl의 STD 6 450 μl 100 μl
STD 8 0.10 450 μl의 STD 7 450 μl 100 μl
STD 9 0.05 450 μl의 STD 8 450 μl 100 μl
5) 혈중 비타민 A 분석법
비타민 산화를 방지하기 위해 어두운 곳 또는 노란색/ 빨간색 등이 있는 곳에서 추출 과정을 수행하였다.
먼저, 2ml micro tube에 혈청 200μl와 내부 표준용액 20μl 첨가하고, DIW 200μl와 0.04% BHT-EtOH 400μl를 추가적으로 넣은 후 강하게 voltexing한 후, 0.04% BHT-Hexane 800μl 첨가하여 강하게 voltexing한 후, 3500g, 4℃, 10min간 원심 분리하고, 2ml amber tube에 상층액 700μl를 옮기고 N2를 이용하여 증발한 후, 완전히 증발시킨 후 95% 메탄올 500μl을 사용하여 녹이고, Filtration 및 GC amber vial로 옮겨 측정하였다.
6) HPLC 조건
조건은 하기 표 2와 같다.
Items Condition
Equipment Agilent 1100 series
Column Stainless steel Novapak C18 (3.9mm ID x 150mm); reverse phase
Injection volume 20 μl
Detector wavelength 325 nm
Mobile phase methanol : DIW (95:5)
Flow rate 1.0 ml/min
Column temperature 20℃
비타민 A를 포함한 혈 중 대사체의 계산법은 하기와 같다.
회수율: 샘플 내의 IS 면적/ STD 내의 IS 면적
Internal response factor (IRF) = (IS 면적 x SC 양) / (IS 양 x SC 면적)
상기 식에서 IS: internal standard, SC: Specific Compound of Interest
특정 화합물의 양 = (IS 양 x SC 면적 x IRF SC) / IS 면적
실시예 2: 실험 디자인, 동물 및 샘플링
본 발명의 실험은 부산대 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며, 48 두의 한우(14 월령)를 기존 연구(Gorocica-Buenfil MA, FL Fluharty, CK Reynolds and SC Loerch, 2007.J Anim Sci, 85: 2243-2255)에 따라 세 레벨의 vitamin A 사료 첨가를 받은 세 군으로 랜덤하게 나누었다(표 3). 동물들을 개별적으로 환경적으로 통제된 시설에서 사육하고 실험 기간 동안에 사료와 물은 자유 급여하였다. 9개월 후(23 개월), 혈액 샘플을 아침 급여 후 외경정맥을 통하여 얻었다. 혈장 또는 혈청을 헤파린 처리 또는 처리 없이 2,054xg에서 4℃에서 15 분간 원심분리하여 혈액 샘플로부터 회수한 후 필요시까지 -80℃에서 저장하였다.
Parameters
 Vitamin A levels
High
(4.8 IU/g)		 Medium
(2.43 IU/g)		 Low
(1.14 IU/g)
조단백 11.50 11.50 11.50
조지방 4.20 4.20 4.20
조섬유 6.68 6.68 6.68
칼슘 0.70 0.70 0.70
인 0.45 0.45 0.45
전체 소화가능 영양분 74.34 74.34 74.34
Vit. A (IU/g feed) 4.80 2.43 1.14
Dry matter 87.81 87.81 87.81
수분 12.23 12.23 12.23
표 3은 실험 디자인 및 14월 령의 한우(각 그룹 n=16)에 급여된 비타민 A를 포함하는 사료의 근접(% dry matter)조성을 나타내는 표
실시예 3: 비타민 A 혈청 레벨, 대사체 프로파일 테스트( MPT ) 및 스테로이드 농도 측정
비타민 A를 상기 혈청(200 μL/sample)으로 부터 추출하여 95% methanol에서 녹이고 스테레인레스 스틸 Novapak C18 컬럼(3.9 mm I.D x 150 mm; Waters Corporation) 및 Water 486 tunable absorbance detector (Waters
Corporation)를 구비한 시스템을 이용하여 HPLC(High performance liquid chromatography )(Water 600 series; Waters Corporation, Milford, MA, USA)를 수행하였다(Siluk et al., 2007). 기타 조건은 상기 표 2와 같다. 비타민 A의 농도는 retinyl acetate 내부 표준으로 보정한 후 공지된 표준물질(retinol, 95144, Sigma-Aldrich Corp.)의 면적 및 각 개별 샘플의 면적의 비율로 계산되었다.
상기 MPT는 Toshiba Accute Biochemical Analyzer-TBA-40FR (Toshiba Medical
Instruments, Otawara-shi, Tochigi-ken, Japan)로 수행하였다. 전체 단백질, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), γ-glutamyltranspepidase, 혈중 우레아 질소, calcium (Ca), 무기 인산(IP), magnesium (Mg), high-density lipoproteins, low-density lipoproteins, 총 콜레스테롤, triglyceride, 포도당, 알부민, 및 크레아틴을 포함하는 15개의 MPT 기준 물질을 분석하였다. 이 과정에서 필요한 모든 시약들은 Wako Pure Chemical Industries,Ltd. (Chuo-ku, Osaka, Japan)로부터 구입하였다.
cortisol, cortisone,11-dehydrocorticosterone 및 corticosterone을 포함하는 네 관심있는 스테로이드를 single-quadrupole Agilent 5975 mass selective detector (Agilent Technologies; Palo Alto, CA,USA)로 인터페이스된 Agilent 6890 plus 가스 크로마토그래피로 결정하였다. 데이터들은 vitamin A 식이 보충 레벨에 따른 모아진 혈청에 대한 측정된 값으로 나타내었다. 또한 11b-HSD 타입 2 활성은11-dehydrocorticosterone(대사체) 대 corticosterone(전구체)의 비율로 계산하였다.
실시예 4: 2차원 전기영동(2-DE)
상기 표 3의 high (H),medium (M), 및 low (L) 그룹에서 동물로부터 얻어진 단백질 샘플의 Aliquots을 2-DE 기술에 의하여 분리하였다. The detailed methods of ESI-Q-TOF/MS 분석 및 단백질들의 동정과 관련된 상세한 방법은 Wang T, HG Lee, JH Hwang, JJ Oh, JN Lim, HS Kang, JK Joo and KS Lee, 2013. Food Sci Biotechnol, 22: 1-6에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 실험의 vitamin A 농도 및 대사체 프로파일 테스트(MPT)의 데이터는 평균±표준편차로 나타내고(n=16) 변량의 one-way 분석(one-way ANOVA, SPSS Inc., Chicago, IL,USA)을 사용하여 분석하였다. 모든 경우에, 차이를 P<0.05이면 유의적인 것으로 간주하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
먼저, 도 1에서와 같이 한우 혈청에 대한 희석조사(Dilution test) 결과 희석 농도에 따른 혈중 Vit A농도의 감소가 확인되었다. 따라서 본 분석 방법의 측정감도가 인정되어진다.
또한, 도 2의 결과는 채혈 후 혈청으로 분리하여 1개월간 -80℃보관 한 후 본 측정계에서 분석한 결과 농도변화가 거의 없는 것으로 확인된바 -80℃에서 1개월간 보관하여도 측정이 가능함을 시사한다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 또 Low 그룹의 Vitamin A 농도는 High 또는 Medium 그룹에 비하여 유의적으로 낮았다(P<0.05). Low 그룹에서 칼슘 농도는 High 그룹에 비하여 더 높았다 (P<0.05). Medium 그룹에서 총 콜레스테롤 농도는
High 그룹(P<0.05)에 비하여 더 높았다. 또한 본 발명자들은 다른 MPT 계수에서 확실한 차이는 관찰하지 못하였다(도 3). 스테로이드 중에서, Low 그룹에서 코티졸 및 코티존의 농도는 High 그룹에 것에 비하여 더 낮았다. 반면에 Low 그룹에서 11-HSD type 2의 활성은 High 그룹에 비하여 더 낮았다(도 3).
프로테오믹스 분석에서는 비타민 A가 낮은 군에서는 하나의 업레귤레이트된 단백질(hibernation protein 25) 및 네 개의 다운 레귤레이트된 단백질(gelsolin a, alpha-1-microglobulin/bikunin precursor, transthyretin, 및 complement factor B)이 동정되었다(도 4a 및 b 참조).
따라서, 분석결과, 대사체에서는 Ca, Total cholesterol, cortisol, cortisone와 11β-HSD type 2 효소 활성도, 그리고 Gelsolin a, Complement factor B, AMBP, HP-25와 Transthyretin 단백질들은 한우 거세우의 Vit A결핍 조기진단용 생리지표로 활용할 수 있다.
HP-25는 Siberian chipmunks에서 동면을 조절하는 동면 특이적인 단백질 복합체의 일원이다(Kondo N and J Kondo, 1992. J Biolog Chem, 267: 473-478). 이 동면 특이적인 단백질 복합체는 소 간에서도 발현되고 혈액을 통하여 심장과 신장으로 운반된다(Fujita S, R Okamoto, M Taniguchi, K Konishi, I Goto, K Sugimoto, M Nakamura, K Shiraki, C Buechler and M Ito, 2012. Cardiovasc Res, 93: S92-S127).
Gelsolin 및 또 다른 단백질 villin은 두 중요한 Ca2+-의존적인 actin 조절 단백질이고, 둘다 villin/gelsolin superfamily에 속하며(Pestonjamasp KN, RK Pope, JD Wulfkuhle and EJ Luna, 1997. J Cell Biol, 139: 1255-1269).
AMBP(Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor)는 lipocalin으로 이 단백질은 alpha-1-microglobulin, bikumin, 및 trypstain을 포함하는 세 분리되니 구성요소로 절단될 수 있다(Lindqvist A, 1996. BBA, 1306: 98-106).
Transthyretin는 약 15.73 kDa 분자량을 가지는 다이머-오브-다이머 4차구조를 가지는 호모테트라머이다(Hamilton JA and MD Benson, 2001. Cell Molecul Life Sci, 58: 1491-1521).
Complement factor B는 보체 대안 경로에서 C3 convertase의 촉매 부위를 형성하는 단일 가닥 폴리펩타이드로 혈액을 순환한다(Hourcade DE and LM Mitchell, 2011. J Biol Chem, 286: 35725-35732).

Claims (6)

  1. 소의 혈액으로부터 분리한 혈청과 내부 표준용액을 첨가하여 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 혈액 중 비타민 A를 정량하고, 여기서 내부 표준용액은 레티닐 아세테이트(Retinyl acetate)를 이용하여 제조하며,
    비타민 A의 양은 (내부 표준의 면적 X 비타민 A의 면적 X 비타민 A의 내부 표준 인자)/ 내부 표준의 면적으로 계산하며, 여기서, 내부 표준 인자는 (내부 표준 면적X 비타민 A 양)/(내부 표준의 양 X 비타민 A 면적)인 것을 특징으로 하는 소의 혈액내 비타민 A 정량 방법.
  2. 하이버네이션 단백질(hibernation protein) 25를 유효성분으로 포함하는 소의 비타민 A 부족 검출용 조성물.
  3. 소의 혈액에서 단백질을 추출하여 프로테오믹스 방법으로 분석하여 하이버네이션 단백질(hibernation protein) 25의 레벨이 높은 경우에 비타민 A 부족으로 판단하는 것을 특징으로 하는 비타민 A 조기 진단 방법.
  4. 겔솔린(Gelsolin) a, 보체 인자(Complement factor) B, 알파-1-마이크로블린 및 비쿠닌 전구체(microglobulin bikunin precursor) 및 트랜스티레틴(Transthyretin)으로 구성된 단백질 중에서 하나 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 소의 비타민 A 부족 여부 진단용 조성물.
  5. 소의 혈액에서 단백질을 추출하여 프로테오믹스 방법으로 분석하여 겔솔린(Gelsolin) a, 보체 인자(Complement factor) B, 알파-1-마이크로블린 및 비쿠닌 전구체(microglobulin bikunin precursor) 및 트랜스티레틴(Transthyretin)으로 구성된 단백질 중에서 하나 이상의 단백질의 레벨이 낮은 경우에 비타민 A 부족으로 판단하는 것을 특징으로 하는 비타민 A 진단 방법.
  6. 소의 혈액에서 칼슘 농도, 코티졸 및 코티존의 농도를 측정하여 칼슘의 농도가 높고, 코티졸 및 코티존의 농도가 낮은 경우에 비타민 A 레벨이 낮은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 소의 비타민 A 진단 방법.


KR1020150075050A 2015-05-28 2015-05-28 축우의 혈액 내 비타민 a 함량 분석 방법 및 비타민 a 결핍증 조기진단용 조성물 KR101791737B1 (ko)

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