KR20160138083A - 감소된 효현 활성을 가진 항-사멸 수용체 3(dr3) 길항성 항체 - Google Patents

감소된 효현 활성을 가진 항-사멸 수용체 3(dr3) 길항성 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20160138083A
KR20160138083A KR1020167027209A KR20167027209A KR20160138083A KR 20160138083 A KR20160138083 A KR 20160138083A KR 1020167027209 A KR1020167027209 A KR 1020167027209A KR 20167027209 A KR20167027209 A KR 20167027209A KR 20160138083 A KR20160138083 A KR 20160138083A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
acid sequence
nos
Prior art date
Application number
KR1020167027209A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 밀스
가즈마 도미즈카
존 라우든슬래거
린페이 니와
마미 츠치야
Original Assignee
교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 filed Critical 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Publication of KR20160138083A publication Critical patent/KR20160138083A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명에 따라, 항-사멸 수용체 3(DR3) 길항성 IgG 항체 및 이의 항체 단편으로서, 그들의 결합을 통해 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 나타내거나 DR3에 대한 효현 활성을 나타내지 않는 항체 및 이의 항체 단편, 이들을 포함하는 항체 조성물 및 항체 단편 조성물, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 상기 항체 또는 상기 항체 단편의 아미노산 서열, 상기 항체 또는 상기 항체 단편을 제조하는 방법, 및 그의 결합을 통해 DR3에 대한 항체의 효현 효능을 감소시키는 방법이 제공된다.
[대표도]
도 1

Description

감소된 효현 활성을 가진 항-사멸 수용체 3(DR3) 길항성 항체{ANTI-DEATH RECEPTOR 3 (DR3) ANTAGONISTIC ANTIBODIES WITH REDUCED AGONISTIC ACTIVITY}
본 발명은 감소된 효현 활성을 가진 항-사멸 수용체 3(DR3) 길항성 항체에 관한 것이다.
사멸 수용체 3(DR3)은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼-패밀리(TNFRSF)의 구성원이고 종양 괴사 인자 수용체 수퍼-패밀리 25(TNFRSF25), 사멸의 림프구 관련 수용체(LARD), APO-3, TRAMP 및 WSL-1로서 공지되어 있다. DR3은 주로 T 세포, 및 내피세포, 상피세포, 조골세포, B 세포, 천연 살해 T(NKT) 세포 및 2형 선천성 림프 세포(ILC2)(NPL 1)를 비롯한 일부 다른 세포들 상에서 발현된다. DR3 활성화는 내피세포뿐만 아니라 림프구, 혈장세포, 수지상세포, 대식세포 및 단핵세포(NPL 2)에서도 발현되는 TNF 유사 리간드인 TL1A(TNF 수퍼-패밀리 15; TNFSF15)에 의해 매개된다. DR3에 결합하는 TL1A 리간드는 T 세포의 증식 및 활성화를 유발하고, T 세포로부터 인터페론-γ(IFN-γ), 인터류킨(IL)-2, IL-13, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로서 염증성 사이토카인의 분비를 증가시킨다. DR3은 생체내 NKT 세포(NPL 3) 및 ILC2 사이토카인, 특히 IL-13 생성을 조절하는 것으로도 밝혀져 있다. 따라서, 전이유전자(transgene)-매개된 TL1A 과다발현은 마우스에서 IL-13 의존적 장 병리를 촉진한다(NPL 4).
TL1A와 DR3의 맞물림은 여러 염증성 질환들, 예컨대, 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 결장염, 크론병, 류마티스성 관절염, 천식 및 다발성 경화증과 관련되어 있다.
항-DR3 항체에 따르면, 웬(Wen et al)(NPL 5)은 DR3에 대한 효현 활성을 가진 항-DR3 마우스 단일클론 항체 F05를 개시하고, 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)는 ELISA에 적용될 수 있는 항-DR3 마우스 단일클론 항체 1H2를 공급하고 있고(NPL 6), 유(Yu et al)(PTL 1) 및 티틀(Tittle et al)(PTL 2)은 T 세포 증식을 억제하는 항-TR3 항체를 개시한다. 다른 한편으로, 미곤(Migone et al)(PTLs 3, 4)은 마우스 단일클론 항체 11H08이 DR3에 결합하고 DR3 수용체를 활성화시키고, DR3 수용체를 통해 TL1A의 활성을 억제할 수 있는 단량체성 항-DR3 단편을 수득하기 위해 11H08의 항-DR3 Fab 단편을 생성한다고 개시한다. 또한, 안데르센(Andersen et al)(PTL 5)은 길항성 DR3 리간드, 예컨대, TL1A와 DR3의 결합을 차단하는, DR3에 대한 1가 Fab 단편을 개시한다.
PTL 1: 미국 특허 제7,357,927호 PTL 2: 미국 특허 제6,994,976호 PTL 3: 국제 특허출원 공보 제WO2011/106707호 PTL 4: 미국 특허출원 공보 제2012/0014950호 PTL 5: 국제 특허출원 공보 제WO2012/117067호
NPL 1: Meylan et al., Mucosal Immunol., 2013; doi: 10.1038/mi.2013.1141-11 NPL 2: Fang et al., J Exp Med., 2008; 205:1037-1048 NPL 3: Migone at al., Immunity, 2002; 16: 479-492 NPL 4: Meylan et al., Mucosal Immunol., 2010; 4; 172-185 NPL 5: Wen et al., The Journal of Biological Chemistry, 2003; 278: 39251-39258 NPL 6: 1H2 마우스 단일클론 항체의 데이터 시트, 카탈로그 번호 H00008718-M08
DR3 길항작용은 염증성 반응을 감소시킬 수 있다. 그러나, 종래 공지된 2가 항-DR3 길항성 항체들은 모두 유해한 염증성 반응, 예컨대, T 세포 증식 및 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 촉진할 수 있는 효현 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 모든 종래 공지된 DR3 길항성 항체들은 Fab의 1가 포맷으로만 소염용으로 제안되어 있다.
IgG 항체 및 이의 항체 단편은 일반적으로 예측가능한 조성을 나타내고 표준화된 방법의 이용을 통해 용이하게 정제되기 때문에, 치료용으로 Fc 영역을 포함하는 IgG 포맷 또는 항체 단편의 개발 및 생산은 공지된 1가 포맷에 비해 일부 장점을 제공하면서 상당히 간단하다. 본 발명자들은 감소된 효현 활성을 나타내거나/유의한 효현 활성을 나타내지 않는, DR3에 대한 강력한 길항성 IgG 항체 및 이의 길항성 항체 단편을 발견하였다.
본 발명은 하기 (1) 내지 (14)에 관한 것이다.
(1) 사멸 수용체 3(DR3)에 결합하고 TL1A 유도된 DR3 활성화를 길항하는 면역글로불린 G(이하, IgG로서 기재됨) 항체로서, 그들의 결합을 통해 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나 DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는 항체, 또는 이의 항체 단편.
(2) 상기 항목 (1)에 있어서, DR3의 시스테인-풍부 도메인(이하, CRD로서 기재됨)에 제시된 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편.
(3) 상기 항목 (1)에 있어서, DR3의 CRD1 또는 CRD3에 제시된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편.
(4) 상기 항목 (1)에 있어서, IgG 항체, IgG2의 힌지(hinge) 도메인을 포함하는 IgG2 항체 변이체, 및 IgG2와 IgG4 사이에 도메인 교환된 항체로부터 선택된 항체 또는 이의 항체 단편으로서, 이때 EU 넘버링 위치 409에서 아미노산 잔기가 Lys인 항체 또는 이의 항체 단편.
(5) 상기 항목 (1)에 있어서, TL1A 리간드 결합을 통해 유도된 DR3의 활성을 중화시키고/시키거나 길항하는 항체 또는 이의 항체 단편.
(6) 상기 항목 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항목에 있어서, 효현 활성이 NF-카파 B의 p65 서브유닛의 인산화, DR3 발현된 세포로부터의 사이토카인 방출, DR3 발현된 세포의 증식 및 DR3 발현된 세포의 아폽토시스로부터 선택된 하나 이상인 항체 또는 이의 항체 단편.
(7) 상기 항목 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항목에 있어서, 하기 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된 하나 이상의 항체인 항체 또는 이의 항체 단편:
(i) 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B와 경쟁적으로 DR3에 결합하는 항체,
(ii) 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B에 의해 인식되는 에피토프에 제시된 에피토프에 결합하는 항체, 및
(iii) 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B에 의해 인식되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
(8) 상기 항목 (1)에 있어서, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
(9) 상기 항목 (1)에 있어서, 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 또는 각각 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
(10) 상기 항목 (1)에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디(diabody), 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 항체의 6개 CDR들을 포함하는 펩티드 및 Fc 융합 단백질로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항체 단편.
(11) 상기 항목 (10)에 있어서, Fc 융합 단백질이 하기 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된, Fc 영역에 융합된 Fab 또는 scFv인 항체 또는 이의 항체 단편:
(i) 2개의 Fab들 또는 scFv들이 IgG 클래스의 Fc 영역에 융합되어 있는 2가 항체,
(ii) 1개의 Fab 또는 scFv가 Fc 영역에 융합되어 있는 1가 항체, 및
(iii) H 쇄 및 Fc-융합된 L-쇄(이하, FL로서 기재됨)를 포함하는 1가 항체.
(12) 상기 항목 (11)에 있어서, Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG4 및 이들의 변이체로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항체 단편.
(13) 상기 항목 (10)에 있어서, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
(14) 상기 항목 (10)에 있어서, 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 또는 각각 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
본 발명의 항체 및 항체 단편이 감소된 효현 활성을 나타내거나 효현 활성을 나타내지 않기 때문에, 이들은 염증성 질환, 자가면역 질환, 암 질환 및 이 질환들과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나 호전시키는 데에 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 각각 항-DR3 단일클론 항체 142A2 및 142S38B의 전형적인 비아코어(Biacore) 센서그램(sensorgrams)을 표시한다. 센서그램의 각각의 선은 0.375 nM부터 12 nM까지 항-DR3 항체 Fab 단편의 각각의 농도를 각각 표시한다. 세로축은 Fab 결합(공명 유닛)을 표시하고 가로축은 Fab 단편 주사 후 시간을 표시한다.
도 2a 및 도 2b는 각각 항-DR3 항체 효현제(agonist) 및 길항제(antagonist) 활성에 대한 이소타입(isotype) 효과의 비교를 표시한다. PBMC들의 NF-kB 활성화에 대한 표시된 142A2 IgG1, IgG2 및 IgG4v 버전들의 효과가 측정되었다. 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 첨가된 항체를 표시한다. TL1A는 40 nM 농도로 첨가되었고, 각각의 항체는 6.67 nM 농도로 첨가되었다.
도 3a 및 도 3b는 항-DR3 단일클론 항체 142A2 및 142S38B의 p65 인산화 수준에 대한 효현작용(agonism)(도 3a) 및 길항작용(antagonism)(도 3b)을 표시한다. 도 3a에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(㎍/㎖)를 표시한다. 도 3b에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(㎍/㎖)를 표시한다. 55%의 세포들이 TL1A 단독 처리 후 인산화된-p65 양성을 나타내었다.
도 4a 및 4b는 항-DR3 단일클론 항체 142A2 및 142S38B에 의한 IL-13 생성의 효현작용(도 4a) 및 길항작용(도 4b)을 표시한다. 도 4a에서, 세로축은 양성 대조군으로서 TL1A-플래그(flag)에 의한 분비 수준과 비교된 분비된 IL-13 농도(pg/㎖)를 표시하고, 가로축은 항체 농도(nM)를 표시한다. 도 4b에서, 세로축은 항체 + TL1A-플래그(1 ㎍/㎖)의 존재 하에서 분비된 IL-13 농도(pg/㎖)를 표시하고, 가로축은 항체 농도(nM)를 표시한다. IL-13 생성 수준은 1 ㎍/㎖ TL1A의 존재 또는 부재 하에서 각각 1300 pg/㎖ 및 750 pg/㎖이었다.
도 5a 및 도 5b는 항-DR3 1가 항체 mv142A2의 p65 인산화 수준에 대한 효현작용(도 5a) 및 길항작용(도 5b)을 표시한다. 도 5a에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(nM)를 표시한다. 도 5b에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(㎍/㎖)를 표시한다. TL1A 단독 또는 배지 단독 처리 후 69.5% 및 2.3%의 세포들이 인산화된-p65 양성을 나타내었다.
도 6a 및 도 6b는 항-DR3 1가 항체 mv142S38B의 p65 인산화 수준에 대한 효현작용(도 6a) 및 길항작용(도 6b)을 표시한다. 도 6a에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(nM)를 표시한다. 도 6b에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(㎍/㎖)를 표시한다. TL1A 단독 또는 배지 단독 처리 후 45% 및 3%의 세포들이 인산화된-p65 양성을 나타내었다.
도 7a 및 도 7b는 항-DR3 항체 IgG2, IgG4 변이체, IgG4244 변이체 및 IgG2422 변이체의 p65 인산화 수준에 대한 효현작용(도 7a) 및 길항작용(도 7b)을 표시한다. 도 7a에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(nM)를 표시한다. 도 7b에서, 세로축은 PBMC들에서 p65 인산화 양성 세포(%)를 표시하고 가로축은 항체 농도(㎍/㎖)를 표시한다. TL1A 단독 또는 배지 단독 처리 후 55% 및 1.8%의 세포들이 인산화된-p65 양성을 나타내었다.
도 8은 항-DR3 단일클론 항체 Fab들 142A2 및 142A2-EQR에 의한 IL-13 생성의 길항작용을 표시한다. 세로축은 항체 + TL1A-플래그(1 ㎍/㎖)의 존재 하에서 분비된 IL-13 농도(pg/㎖)를 표시하고, 가로축은 항체 농도(nM)를 표시한다. 모든 샘플들이 플레이트-결합된 항-CD3(10 ㎍/㎖) 및 가용성 항-CD28(1 ㎍/㎖)로 공자극되었다. IL-13 생성 수준은 1 ㎍/㎖ TL1A의 존재 또는 부재 하에서 각각 1846 pg/㎖ 및 974 pg/㎖이었다.
정의
본원에서 사용된 용어 "항체"는 임의의 항체, 예컨대, 단일클론 항체, 올리고클론 항체 및 다중클론 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 균일한 아미노산 서열로 구성된, 즉 일차 구조가 동일한 항체를 지칭한다. 추가로, 단일클론 항체는 단일 에피토프(항원의 결정인자로서도 지칭됨)만을 인식한다.
본원에서 사용된 용어 "올리고클론 항체" 및 "다중클론 항체"는 2종의 단일클론 항체보다 더 많은 복수의 항체들을 포함하는 항체 조성물을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린(이하, Ig로서 지칭됨)으로서도 지칭되고, 인간 항체는 그의 분자 구조에서의 차이를 기초로 이소타입인 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM으로 분류된다. 아미노산 서열에서 상대적으로 높은 상동성을 가진 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4는 일반적으로 IgG로서 지칭된다. 추가로, 본 발명의 항체는 천연 항체의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 임의의 항체 변이체를 포함한다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 IgG 항체 및 이의 변이체, 보다 바람직하게는 IgG2, IgG2로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, IgG2로부터의 힌지 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, IgG2의 힌지 도메인을 포함하는 IgG4 항체 변이체, 및 IgG2의 힌지 도메인을 포함하는 IgG4 항체 변이체이고, Lys은 EU 넘버링 위치 409에 존재한다.
본원에서 사용된 용어 "천연 항체"는 동물에 천연적으로 존재하는 항체를 지칭하고 알로타입(allotype)으로서 정의된 여러 아미노산 서열들을 가진다.
항체 분자는 중쇄(이하, H 쇄로서 지칭됨) 및 경쇄(이하, L 쇄로서 지칭됨)로서 지칭되는 폴리펩티드들로 구성된다.
추가로, H 쇄는 그의 N-말단부터 H 쇄 가변 영역(VH로서도 지칭됨) 및 H 쇄 불변 영역(CH로서도 지칭됨)인 영역들로 구성되고, L 쇄는 그의 N-말단부터 L 쇄 가변 영역(VL로서도 지칭됨) 및 L 쇄 불변 영역(CL로서도 지칭됨)인 영역들로 구성된다. CH의 경우, 각각의 서브클래스에 대해 α, δ, ε, γ 및 μ 쇄가 공지되어 있다. CL의 경우, λ 및 κ가 공지되어 있다. IgG 항체는 2개의 중쇄들 및 2개의 경쇄들을 갖고, VH 및 VL로 구성된 2개의 항원 결합 부위들을 형성한다. 따라서, IgG 항체는 2가 항체이다.
도메인은 항체 분자의 각각의 폴리펩티드를 구성하는 기능성 구조적 유닛을 지칭한다. 추가로, 본 발명의 Fc 및 Fc 영역은 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된 H 쇄 불변 영역의 부분적 서열 및 부분적 구조를 지칭한다.
추가로, CH는 N-말단부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된다. 본 발명에서 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 Fc 영역은 EU 지수[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]에 따라 N-말단부터 아미노산 잔기의 수에 의해 확인될 수 있다. 아미노산 잔기의 번호는 카바트(Kabat et al)에 의한 EU 지수에 따르고, 본 발명에서 앞 번호의 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 원래의 또는 모 잔기를 표시하고, 뒷 번호의 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 교체된 또는 치환된 아미노산 잔기를 표시한다.
구체적으로, CH1은 EU 지수의 위치 118부터 215에 이르는 아미노산 서열에 의해 확인되고, 힌지는 EU 지수의 위치 216부터 230에 이르는 아미노산 서열에 의해 확인되고, CH2는 EU 지수의 위치 231부터 340에 이르는 아미노산 서열에 의해 확인되고, CH3은 EU 지수의 위치 341부터 447에 이르는 아미노산 서열에 의해 확인된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 항체"는 재조합 기술에 의해 생성된 재조합 항체뿐만 아니라 하이브리도마로부터 수득된 단일클론 항체도 지칭한다. 재조합 항체는 인간 항체 불변 영역과 비-인간 항체 가변 영역의 결합에 의해 제조된 키메라 항체, 비-인간 항체 가변 영역의 H 쇄 및 L 쇄의 상보성 결정 영역(이하, CDR로서 약칭됨)을 인간 항체 가변 영역의 골격 영역(이하, FR로서 약칭됨) 내로 이식함으로써 제조된 인간화된 항체(또는 CDR-이식된 항체), 및 인간 항체 생성 동물을 사용함으로써 제조된 인간 항체 등을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "키메라 항체"는 비-인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열이 인간 항체의 상응하는 VH 및 VL 내에 이식되어 있는 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 단일클론 항체 생성 하이브리도마로부터 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA들을 수득하고, 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하기 위해 이들을 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 가진 동물 세포용 발현 벡터 내에 삽입한 후, 상기 항체를 발현시키기 위해 상기 벡터를 동물 세포 내로 도입함으로써 생성될 수 있다.
용어 "인간화된 항체"는 비-인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR들의 아미노산 서열이 인간 항체의 VH 및 VL의 상응하는 CDR들 내에 이식되어 있는 항체를 지칭한다. VH 및 VL의 CDR들 이외의 영역은 골격 영역(이하, FR로서 지칭됨)으로서 지칭된다.
인간화된 항체는 하기 방식으로 생성될 수 있다: 비-인간 항체의 VH의 CDR의 아미노산 서열 및 임의의 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열로 구성된 VH의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA, 및 비-인간 동물 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열 및 임의의 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열로 구성된 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간화된 항체 발현 벡터를 구축하기 위해 이 cDNA들을 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 가진 동물 세포용 발현 벡터 내로 각각 삽입하고, 상기 항체를 발현시키기 위해 이 벡터를 동물 세포 내로 도입한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 원래 인체에 천연적으로 존재하는 항체를 지칭한다. 그러나, 인간 항체는 인간 항체 파지 라이브러리, 불멸화된 인간 말초혈 림프구의 클로닝, 또는 최근에 유전공학, 세포공학 및 발생공학에서의 기술적 진보에 따라 제조된 인간 항체 생성 형질전환 동물로부터 수득된 항체도 포함한다.
인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자(Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97, 722-7, 2000)를 가진 마우스를 원하는 항원으로 면역화시킴으로써 수득될 수 있다. 추가로, 인간 B 세포로부터의 항체 유전자 증폭에 의해 형성된 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 원하는 결합 활성을 가진 인간 항체를 선별함으로써 면역화를 수행하지 않으면서 인간 항체를 수득할 수 있다(Winter G. et al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55. 1994).
뿐만 아니라, 원하는 결합 활성을 가진 인간 항체 생성 세포를 제조하기 위해 EB 바이러스를 사용하여 인간 B 세포를 불멸화시킴으로써 인간 항체를 수득할 수 있다(Rosen A. et al., Nature 267, 52-54. 1977).
인체에 존재하는 항체는 예를 들면, 하기 방식으로 정제될 수 있다: 인간 말초혈로부터 단리된 림프구를 EB 바이러스를 사용한 감염 등으로 불멸화시킨 후 클로닝함으로써, 항체를 생성하는 림프구를 배양할 수 있고 배양물로부터 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는 인간 B 세포로부터 준비된 항체 유전자를 파지의 유전자 내에 삽입함으로써 그의 표면 상에서 항체 단편, 예컨대, Fab 및 scFv를 발현하게 되는 파지들의 라이브러리이다. 항원-고정된 기판에 대한 결합 활성을 지표(index)로서 사용함으로써 원하는 항원 결합 활성을 가진 항체 단편을 발현하는 파지를 이 라이브러리로부터 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은 유전공학 기법에 의해 2개의 완전한 H 쇄들 및 2개의 완전한 L 쇄들로 구성된 인간 항체 분자로 전환될 수도 있다.
인간 항체 생성 형질전환 동물은 인간 항체 유전자를 숙주 동물의 염색체 내에 삽입함으로써 수득된 동물을 지칭한다. 구체적으로, 인간 항체 유전자를 마우스 ES 세포에 도입하고 상기 ES 세포를 또 다른 마우스의 초기 배아에 이식한 후, 배아를 발생시킴으로써, 인간 항체 생성 형질전환 동물을 제조할 수 있다.
인간 항체 생성 형질전환 동물로부터 인간 항체를 제조하는 방법으로서, 인간 이외의 포유동물을 사용하여 실시하는 표준 하이브리도마 제조 방법으로 인간 항체 생성 하이브리도마를 수득한 후 배양함으로써, 인간 항체를 배양물에서 생성하고 축적할 수 있다.
구체적으로, 상기 항체는 하이브리도마 또는 항체 생성 세포에 의해 생성된 비-인간 동물 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체에서 CL의 아미노산 서열은 인간 항체의 아미노산 서열 및 비-인간 동물 항체의 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다. 인간 항체 Cκ 또는 Cλ의 아미노산 서열이 바람직하다.
본 발명의 항체에서 CH는 면역글로불린에 속하는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 임의의 γ1(IgG1), γ2(IgG2) 및 γ4(IgG4), 및 이들의 변이체들이 인간 IgG 클래스에 속하고, 보다 바람직하게는 γ2(IgG2) 및 이의 변이체가 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체 단편"은 특정 항원 DR3에 결합할 수 있는 임의의 항체 단편을 지칭한다. 예를 들면, 상기 용어는 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 복수의 CDR들을 포함하는 펩티드 및 항체의 6개 CDR들을 포함하는 펩티드, 추가로 임의의 Fc 융합 단백질, 예컨대, Fc 영역에 융합된 Fab(Cater et al, Nature Med., 2006; 6; 343-357), Fc 영역에 융합된 scFv(Carter et al, Nature Med., 2006; 6; 343-357), 1개의 Fab가 Fc 영역에 융합되어 있는 1가 항체, 항체의 H 쇄 및 Fc 영역에 융합된 L 쇄(이하, FL 융합 폴리펩티드로서 기재됨)로 구성된 1가 항체(미국 특허출원 공보 제2007/0105199호) 등을 포함한다(Labrjin et al, Curr. Opin in Immunol., 2008; 20; 479-485).
Fab는 IgG 항체를 프로테아제 파파인(papain)으로 처리함으로써 수득되는 단편들(H-쇄의 아미노산 잔기의 위치 224에서 절단됨) 중에서 디설파이드 결합(S-S 결합)을 통해 서로 결합되어 있는 N-말단의 대략 절반 H-쇄 및 전체 L-쇄, 약 50000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가진 항체 단편을 지칭한다.
F(ab')2는 IgG를 프로테아제 펩신(pepsin)으로 처리함으로써 수득되는 단편들(H-쇄의 아미노산 잔기의 위치 234에서 절단됨) 중에서 힌지 영역의 S-S 결합을 통해 서로 결합된 Fab보다 약간 더 길고 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가진 항체 단편을 지칭한다.
Fab'는 F(ab')2의 힌지 영역의 S-S 결합을 절단함으로써 수득되고 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 가진 항체 단편이다.
scFv는 적절한 펩티드 링커(P), 예컨대, 4개의 Gly 잔기들 및 1개의 Ser 잔기로 구성된 임의의 수의 링커(G4S)를 연결함으로써 제조된 링커 펩티드를 사용하여 1개의 VH를 1개의 VL에 연결함으로써 수득된 VH-P-VL 또는 VL-P-VH 폴리펩티드인, 항원 결합 활성을 가진 항체 단편이다.
디아바디는 동일한 또는 상이한 항원 결합 특이성을 보이는 scFv들로 형성된 이량체로서의 항체 단편이고, 이 항체 단편은 동일한 항원에 대한 2가 항원 결합 활성을 갖거나 상이한 종류의 항원들에 대한 2종의 특이적 항원 결합 활성을 가진다.
dsFv는 VH 및 VL 각각에서 1개의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있고 폴리펩티드들이 이 시스테인 잔기들을 사이의 S-S 결합을 통해 연결되어 있는 항체 단편이다.
CDR을 포함하는 펩티드는 VH 또는 VL의 CDR의 적어도 하나 이상의 영역으로 구성된다. 복수의 CDR들을 포함하는 펩티드에서, CDR들은 직접적으로 또는 적절한 펩티드 링커를 통해 서로 결합될 수 있다.
상기 펩티드는 본 발명의 항체의 VH 및 VL의 CDR들을 코딩하는 DNA들을 구축하고, 이 DNA들을 원핵생물 또는 진핵생물용 발현 벡터 내에 삽입하고, 발현을 위해 이 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. CDR을 포함하는 펩티드는 화학적 합성 방법, 예컨대, Fmoc 방법 또는 tBoc 방법에 의해 제조될 수도 있다.
Fc 융합 단백질, 예컨대, Fab-Fc, scFv-Fc, (Fab)2-Fc, 1개의 Fab가 Fc 영역에 융합되어 있는 1가 항체, 및 항체의 H 쇄 및 FL 융합 폴리펩티드로 구성된 1가 항체는 Fc 영역을 가진 항체로부터 유래된 요구된 단편에 융합된 아미노산 서열을 제조하고, Fc 융합 단백질을 코딩하는 cDNA를 발현 벡터 내로 구축하고, 적절한 숙주 세포에서 Fc 융합 단백질을 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "변이체"는 DR3 폴리펩티드, 이의 DR3 폴리펩티드 단편, 항체 또는 이의 항체 단편과 유사하거나 동일한 활성을 보유하지만, 모 항체 또는 이의 항체 단편(또는 원래의 항체 또는 이의 항체 단편)과 비교될 때 유사한 아미노산 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 지칭한다. 유사한 아미노산 서열을 가진 항체 변이체는 항-DR3 항체 또는 이의 항체 단편의 가변 영역, 예컨대, VH 또는 VL, 또는 CDR들의 아미노산 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 나아가, 본 발명의 변이체는 항체의 불변 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 임의의 변이체를 포함한다. 항체 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하거나 포함하지 않는 항체의 불변 영역의 각각의 도메인, 예컨대, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에서 임의의 도메인 교환된(또는 도메인 교체된) 항체도 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체 변이체는 IgG2, IgG2로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, IgG2 및 IgG4 항체로부터 유래된 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, IgG2로부터의 힌지 도메인 및 IgG4로부터의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, 및 IgG2로부터의 힌지 도메인 및 IgG4로부터의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG2 변이체를 포함하고, 이때 CH3 도메인 내의 EU 넘버링 위치 409에서 아미노산 잔기는 Lys이다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 의해 인식되고/되거나 결합되는 항원의 표면 상에 위치하는 임의의 아미노산 서열 및 임의의 3차원적 구조를 지칭한다. 예를 들면, 단일클론 항체에 의해 인식되고 결합되는 단일 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열의 입체형상(conformation), 변형 잔기, 예컨대, 당쇄, 아미노 기, 카복실 기, 포스페이트, 설페이트 등과 결합된 아미노산 서열, 및 변형 잔기와 결합된 아미노산 서열의 입체형상이 포함된다. 상기 입체형상은 단백질의 천연 생성 3차원적 구조이고, 세포 내에서 발현되거나 세포의 원형질막 상에서 발현되는 단백질의 입체형상을 지칭한다.
본 발명의 에피토프는 DR3 폴리펩티드의 연속적 아미노산 서열, 비-연속적 아미노산 서열 또는 입체형상적 구조로부터 구성된 선형 에피토프일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 에피토프는 DR3 폴리펩티드의 세포외 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프이다. 다른 실시양태에서, 에피토프는 TL1A 리간드에 결합된 DR3의 분자 표면에 존재하는 에피토프이다.
본원에서 사용된 용어 "사멸 수용체 3", "DR3", "DR3 펩티드", "DR3 단백질" 또는 "DR3 폴리펩티드"는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 유니플롯(Uniplot) 번호 Q93038의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 2 또는 유니플롯 번호 Q93038로 표시된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)가 결실되어 있거나, 치환되어 있거나 추가되어 있는 아미노산 서열을 포함하고 DR3의 활성을 가진 폴리펩티드; 서열번호 3 또는 유니플롯 번호 Q93038로 표시된 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함하고 DR3의 활성을 가진 폴리펩티드; 및 SNP 변이체 등을 비롯한 관련 폴리펩티드를 지칭한다. 관련 폴리펩티드는 바람직하게는 DR3 활성/기능을 보유하는 SNP 변이체, 스플라이스(splice) 변이체, 단편, 치환, 결실 및 삽입을 포함한다. 종양 괴사 인자 수용체 수퍼-패밀리 25(TNFRSF25), 사멸의 림프구 관련 수용체(LARD), APO-3, TRAMP 및 WSL-1도 DR3의 동의어로서 공지되어 있고, 이들은 필연적으로 DR3과 동일하다.
추가로, 서열번호 3 또는 NM_003790.2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드도 포함된다. 본 발명의 DR3을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 NM_003790.2의 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실(들), 치환(들) 또는 추가(들)를 가진 뉴클레오티드 서열을 포함하고 DR3의 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 유전자; 서열번호 3 또는 NM_003790.2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 뉴클레오티드 서열로 구성되고 DR3의 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 유전자; 엄격한 조건 하에서 서열번호 3 또는 NM_003790.2의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA와 혼성화하는 DNA로 구성되고 DR3의 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 유전자 등도 DR3을 코딩하는 유전자로서 포함한다.
서열번호 4 또는 유니플롯 번호 Q93038의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)가 결실되어 있고/있거나, 치환되어 있고/있거나 추가되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이유발[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), or Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)] 등으로 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내로 부위 특이적 돌연변이를 도입함으로써 수득될 수 있다. 결실되거나, 치환되거나 추가되는 아미노산 잔기의 수는 특별히 제한되지 않고, 상기 수는 바람직하게는 1 내지 수십, 예컨대, 1 내지 20, 보다 바람직하게는 1 내지 수개, 예컨대, 1 내지 5이다.
본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA"는 프로브로서 서열번호 3 또는 NM_003790.2의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA를 사용하는 콜로니 혼성화, 플라크 혼성화, 서던 블롯 혼성화, DNA 마이크로어레이 등에 의해 수득되는 DNA를 지칭한다. 이러한 DNA의 구체적인 예는 PCR 생성물 또는 올리고 DNA가 고정되어 있는 필터 또는 슬라이드 유리를 사용하여 0.7 내지 1.0 mol/ℓ 염화나트륨의 존재 하에서 65℃에서 혼성화를 수행한 후, 65℃에서 상기 필터 또는 슬라이드 유리를 0.1배 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액: 150 mmol/ℓ 염화나트륨 및 15 mmol/ℓ 구연산나트륨)으로 세척함으로써 확인될 수 있는 혼성화된 콜로니 유래의 또는 플라크 유래의 DNA이다. 혼성화는 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)] 등에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 혼성화할 수 있는 DNA는 서열번호 3 또는 NM_003790.2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 DNA를 포함한다.
진핵생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열에서, 유전적 다형성(polymorphism)이 종종 인식된다. 본 발명에서 사용되는 DR3 유전자는 작은 변형이 이러한 다형성에 의해 뉴클레오티드 서열에서 발생되어 있는 유전자도 본 발명에서 사용되는 유전자로서 포함한다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명에서 상동성의 수치는 당업자에 의해 공지된 상동성 검색 프로그램을 이용함으로써 계산된 수치일 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 상기 수치는 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 등을 이용함으로써 계산될 수 있고, 아미노산 서열의 경우, 상기 수치는 BLAST2[Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997); Genome Res., 7, 649 (1997); 디폴트 파라미터를 사용함; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] 등을 이용함으로써 계산될 수 있다.
디폴트 파라미터로서, G(갭(gap)을 개방하기 위한 비용)는 뉴클레오티드 서열의 경우 5이고 아미노산 서열의 경우 11이고; -E(갭을 연장하기 위한 비용)는 뉴클레오티드 서열의 경우 2이고 아미노산 서열의 경우 1이고; -q(뉴클레오티드 불일치에 대한 벌점)는 -3이고; -r(뉴클레오티드 일치에 대한 보상)은 1이고; -e(기대 값)는 10이고; -W(워드크기)는 뉴클레오티드 서열의 경우 11개 잔기이고 아미노산 서열의 경우 3개 잔기이고; -y[비트(bits)에서 blast 연장에 대한 드롭오프(dropoff) 값(X)]는 blastn의 경우 20이고 blastn 이외의 프로그램의 경우 7이고; -X[비트에서 갭을 가진 정렬에 대한 X 드롭오프 값)는 15이고; -Z(비트에서 갭을 가진 정렬에 대한 최종 X 드롭오프 값)는 blastn의 경우 50이고 blastn 이외의 프로그램의 경우 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).
서열번호 4 또는 유니플롯 번호 Q93038의 아미노산 서열의 부분적 서열을 포함하는 폴리펩티드는 당업자에 의해 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시키고 상기 DNA를 함유하는 발현 벡터가 도입되어 있는 형질전환체를 배양함으로써 제조될 수 있다. 또한, 상기 방법을 이용함으로써 제조된 폴리펩티드 또는 DNA를 기초로, 서열번호 4 또는 유니플롯 번호 Q93038의 아미노산 서열의 부분적 서열에서 하나 이상의 아미노산(들)이 결실되어 있거나, 치환되어 있거나 추가되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 전술된 방식과 동일한 방식으로 제조될 수 있다. 추가로, 서열번호 4 또는 유니플롯 번호 Q93038의 아미노산 서열의 부분적 서열을 포함하는 폴리펩티드; 또는 서열번호 4 또는 유니플롯 번호 Q93038의 아미노산 서열의 부분적 서열에서 하나 이상의 아미노산(들)이 결실되어 있거나, 치환되어 있거나 추가되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 화학적 합성 방법, 예컨대, 플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 방법 또는 t 부틸옥시카보닐(tBoc) 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서, DR3의 세포외 영역은 예를 들면, 통상적으로 공지된 경막 영역 유추 프로그램 SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/SOSUI/SOSUI_submit.), TMHMM 버전 2(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPASy 프로테오믹스 서버(Proteomics Server)(http://Ca.expasy.org/) 등을 이용함으로써 서열번호 3으로 표시된 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 예측된 영역을 포함한다.
본 발명에서 DR3의 세포외 영역의 예로는 세포외 도메인에서 위치 25 내지 201에 상응하는 영역이 있다. DR3은 세포외 도메인에서 4개의 시스테인-풍부 도메인들(CRD들)인 CRD1 내지 CRD4를 포함하고, 이어서 경막 도메인을 포함하고 세포내 도메인에서 위상(topological) 도메인 및 사멸 도메인을 포함한다. 각각의 CRD는 일반적으로 도메인의 계면에서 3개의 디설파이드 결합들을 형성하는 6개의 시스테인 잔기들을 함유한다.
DR3의 활성/기능은 DR3이 TL1A 리간드와 맞물림으로써 T 세포의 활성화 및 증식을 유도한다는 것을 지칭한다. DR3 활성화는 NF-κB 인산화를 통해 T 세포로부터 인터류킨(IL)-13, IL-17, GM-CSF 및 IFN-γ를 비롯한 사이토카인 방출도 유도한다. 또한, DR3 활성화는 일부 유형의 세포들의 아폽토시스를 나타낸다.
DR3에 대한 용어 "효현작용", "효현 활성", "효현 효능" 또는 "효현 기능"은 결합된 리간드 또는 항체로 DR3을 활성화시키거나 자극하는 것을 지칭한다. 따라서, 이들 결합제들은 NF-κB 인산화, T 세포의 활성화 및 증식, DR3 양성 세포의 아폽토시스 및 T 세포로부터의 사이토카인, 예컨대, 인터류킨(IL)-13, IL-17, GM-CSF 및 IFN-γ 방출을 유도할 수 있다.
DR3에 대한 용어 "길항작용", "길항 활성", "길항 효능" 또는 "길항성 기능"은 결합된 TL1A 리간드에 의해 야기된 DR3의 활성을 억제하거나 방해하는 것을 지칭한다. 따라서, 상기 성질을 가진 길항제는 결합된 TL1A 리간드에 의해 야기된 DR3 및 NF-κB의 인산화, T 세포의 활성화, 증식 및 침윤, DR3 양성 세포의 아폽토시스 및 T 세포로부터의 사이토카인, 예컨대, 인터류킨(IL)-13, IL-17, GM-CSF 및 IFN-γ 방출을 억제할 수 있다.
용어 본 발명의 "DR3에 대한 감소된, 저하된, 경감된/결실된 또는 제거된 효현 활성 또는 효현 활성을 갖지 않는"은 본 발명의 항체가 그 자신의 결합에 의해 유도된 최소한의 효현작용을 나타내거나, 본 발명의 항체가 그 자신의 결합으로 DR3을 본질적으로 활성화시키지 않거나, 자극하지 않거나 작동시키지 않거나, 본 발명의 항체가 그 자신의 결합으로 DR3을 활성화시키지 않거나, 자극하지 않거나 작동시키지 않는다는 것을 지칭한다. 본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 상기 용어는 항체가 말초혈 단핵세포들(PBMC들)에서 NF-κB 및/또는 NF-κB의 p65 서브유닛의 인산화를 본질적으로 유도하지 않고, 항체가 DR3 발현된 세포들 또는 PBMC들에서 사이토카인 방출을 본질적으로 유도하지 않고, 항체가 T 세포 증식을 본질적으로 유도하지 않는다는 것을 지칭한다. 한 구체적인 바람직한 실시양태에서, 상기 용어는 항체가 PBMC들에서 총 세포에 비해 20% 미만, 바람직하게는 10%의 세포에서 NF-κB의 p65 서브유닛의 인산화를 유도한다는 것을 지칭한다.
항-사멸 수용체 3(DR3) 항체
본 발명은 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는 항-DR3 길항성 IgG 항체 및 이의 변이체, 상기 항체를 제조하는 방법, 상기 항체의 아미노산 서열, 상기 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 길항성 IgG 항체의 효현 활성을 감소시키는 방법, 및 상기 항체의 투여를 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 전술된 항체로부터 유래된 항체 단편, 상기 항체 단편을 제조하는 방법, 상기 항체 단편의 아미노산 서열, 상기 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 길항성 IgG 항체 단편의 효현 활성을 감소시키는 방법, 및 상기 항체 단편의 투여를 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항-DR3 항체는 항체 그 자체가 DR3을 거의 활성화시키지 않거나 DR3을 전혀 활성화시키지 않기 때문에 DR3 폴리펩티드의 세포외 영역에 결합할 수 있고 DR3 폴리펩티드의 활성을 차단/중화시킬 수 있고 T 세포 증식을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 그 자신의 결합으로 DR3을 거의 활성화시키지 않거나 DR3을 전혀 활성화시키지 않는다. 즉, 본 발명의 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나/DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 DR3의 중화/차단 활성을 갖고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는 항체, 및 DR3의 세포외 영역에 결합할 수 있고 DR3의 활성을 중화시킬 수 있고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는 항체를 포함한다. DR3의 세포외 영역은 폴리펩티드의 N-말단부터 4개의 시스테인-풍부 도메인들(CRD들)로 나누어지고, CRD1 도메인을 포함하는 N-말단 영역은 전구-리간드 조립 도메인("PLAD"로서 공지됨)으로서 공지되어 있고, PLAD 도메인은 3개의 DR3 단량체들로 구성된 삼량체를 형성하는 역할을 수행한다. 따라서, 본 발명의 항-DR3 항체는 DR3의 하나 이상의 단량체, DR3의 단량체, 및/또는 삼량체성 DR3(삼량체)에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR3의 세포외 영역에 포함된 하나 이상의 에피토프에 결합하고 DR3 삼량체의 형성을 억제하고 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키는 항체로서, DR3에 대한 감소된 효현 활성을 나타내거나/DR3에 대한 효현 활성을 나타내지 않는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 DR3의 세포외 영역에 포함된 하나 이상의 에피토프에 결합하고 DR3에 결합된 TL1A를 차단하고 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키는 항체로서, DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나/DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는 항체를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체는 PLAD 도메인, CRD1 도메인, CRD2 도메인, CRD3 도메인, CRD4 도메인 또는 CDR3과 CDR4의 인터 도메인(inter domain)에 결합하고, DR3 삼량체의 형성을 억제하고 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고, 이때 상기 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 나타내거나/DR3에 대한 효현 활성을 나타내지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 PLAD 도메인, CRD1 도메인, CRD2 도메인, CRD3 도메인, CRD4 도메인 및 CDR3과 CDR4의 인터 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 도메인에 존재하는 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하고, TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고, 이때 상기 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나/DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않고, 항체는 PLAD 도메인, CRD1 도메인, CRD2 도메인, CRD3 도메인, CRD4 도메인 및 CDR3과 CDR4의 인터 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 도메인에 존재하는 에피토프에 결합하고, DR3 삼량체의 형성을 억제하고 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고, 이때 상기 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나/DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 항체는 TL1A와 결합된 DR3의 표면, 또는 DR3의 삼량체화에 관여하는 DR3의 표면에 결합하고, TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고, 이때 상기 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 나타내거나/DR3에 대한 효현 활성을 나타내지 않는다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PLAD 도메인 또는 CRD1 도메인에 결합되는 항체를 포함하고, TL1A 결합을 차단하고, TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고, 이때 상기 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나/DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CRD4 도메인에 결합되고 TL1A 결합을 차단하고 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키는 항체를 포함하고, 이때 상기 항체는 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나/DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 CRD1 도메인에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프, 서열번호 4의 47 내지 71 위치의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 117 내지 123 위치 및 140 내지 170 위치의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합되는 항체를 포함하고, 이때 상기 항체는 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 나타내거나 DR3에 대한 효현 활성을 나타내지 않는다. 추가로, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 전술된 또 다른 특정 항체와 경쟁적으로 DR3에 결합되는 항체, 전술된 또 다른 특정 항체에 의해 인식되는 에피토프에 포함된 에피토프에 결합되는 항체, 및 전술된 또 다른 특정 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합되는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 DR3의 활성을 중화시키고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않고, 이때 상기 항체는 IgG2 클래스 및 이의 변이체로부터 유래된 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함한다. 본 발명에서 IgG2 서브클래스로부터 유래된 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인의 아미노산 서열의 일부는, IgG2 서브클래스로부터 유래된 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인의 아미노산 서열의 일부가 포함되어 있는 항체가 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나 DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는 한, 이들의 영역의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 아미노산 서열의 일부는 임의의 아미노산 서열, 예컨대, 연속적 서열, 산발적 또는 불연속적 서열을 포함할 수 있다. CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인이 본 발명의 IgG2로부터 유래된 항체는 TL1A 결합에 의한 DR3의 활성을 중화시킬 수 있음에도 불구하고 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나 DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는다. 따라서, CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인이 본 발명의 IgG2로부터 유래된 항체는 DR3에 대한 감소된 효현작용을 갖거나 DR3에 대한 효현작용을 갖지 않으면서 DR3 활성을 특이적으로 길항하거나, 차단하거나 중화시킨다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 DR3의 활성을 중화시키고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않고, 이때 상기 항체는 IgG2 클래스 또는 이의 변이체이다. 본 발명의 IgG2 클래스 항체는 TL1A 결합에 의한 DR3의 활성을 중화시킬 수 있음에도 불구하고 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나 DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는다. 따라서, 모든 공지된 IgG 항체들은 DR3 활성을 중화시키고 그 자신의 결합으로 효현 활성을 갖지만, 본 발명의 항체는 DR3에 대한 감소된 효현작용을 갖거나 DR3에 대한 효현작용을 갖지 않으면서 DR3 활성을 특이적으로 길항하거나, 차단하거나 중화시킨다. 즉, 본 발명의 항체의 효현작용이 감소되거나 제거되기 때문에, 상기 항체는 전적으로 또는 오직 DR3에 대한 길항작용을 가진다. 부작용 또는 낮아진 치료 효과가 항체의 효현작용에 의해 야기되는 것으로 간주될 수 있기 때문에, 상기 항체의 성질은 항-DR3 항체를 투여함으로써 DR3 관련 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 데 있어서 큰 장점을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Gm 알로타입, 예컨대, 인간 IgG2의 경우 모두 천연적으로 존재하는 G2(n+ 또는 n-) 및 G2m(23) 등을 포함한다(Hougs et al, Immunogenetics, 2001: 52, 242-248, Brusco et al, Imunogenetics, 1995; 42: 414-417).
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 DR3의 활성을 중화시키고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않고, 이때 상기 항체는 항체의 Fc 영역 내의 234, 235, 237, 250, 300, 309, 339, 331 및 428 위치로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG2 변이체이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 항체는 DR3의 활성을 중화시키고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않고, 이때 상기 항체는 1) 인간 IgG2 항체의 Fc 영역 내의 V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, T339A, P331S 및 M428L로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항체, 2) 인간 IgG2 항체의 Fc 영역 내의 아미노산 치환 T250Q 및 M428L을 포함하는 항체, 3) 인간 IgG2 항체의 Fc 영역 내의 아미노산 치환 V234A, G237A 및 P331S를 포함하는 항체, 4) 인간 IgG2 항체의 Fc 영역 내의 아미노산 치환 F300Y, V309L 및 T339A를 포함하는 항체, 및 5) 인간 IgG2 항체의 Fc 영역 내의 아미노산 치환 V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, T339A, P331S 및 M428L을 포함하는 항체 등으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 IgG2 클래스 항체의 힌지 도메인을 포함하고, 항체 또는 항체 단편은 IgG2 클래스 항체의 힌지 도메인, 및 IgG4 항체의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 항체 또는 항체 단편은 IgG2 클래스 항체의 힌지 도메인, 및 IgG4 항체의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 이때 CH3 도메인 내의 EU 넘버링 위치 409에서 아미노산 잔기는 Lys이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 IgG2의 힌지 도메인을 포함하는 IgG4 항체 변이체, 및 IgG2의 힌지 도메인을 포함하는 IgG4 항체 변이체를 포함하고, Lys은 EU 넘버링 위치 409에 존재한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2, 142S38B 및 이들의 항체 변이체들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 및 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 15의 VH 및 서열번호 21의 VL, 서열번호 76의 VH 및 서열번호 21의 VL, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 77의 VL, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 78의 VL, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 79의 VL, 서열번호 76의 VH 및 서열번호 79의 VL, 또는 서열번호 27의 VH 및 서열번호 33의 VL의 각각의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 91%, 92%, 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체, 및 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들, 또는 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR들 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR들의 각각의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체를 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 항체는 임의의 종류의 스크리닝 방법으로부터 수득되는 임의의 친화성 성숙된 항체 클론도 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2, 142S38B 또는 이들의 항체 변이체들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR들, 또는 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 76의 VH 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 76의 VH 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합되는 항체를 포함한다. 추가로, 본 발명의 항체는 전술된 또 다른 특정 항체와 경쟁적으로 DR3에 결합되는 항체를 포함한다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2, 142S38B 및 IgG2 서브클래스로 재배열되는 이들의 항체 변이체들, IgG2의 힌지 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, IgG2의 힌지 도메인 및 IgG4의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG2 변이체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체, 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체, 및 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 15의 VH 및 서열번호 21의 VL, 또는 서열번호 27의 VH 및 서열번호 33의 VL의 각각의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 91%, 92%, 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체, 및 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR들, 또는 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR들 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR들의 각각의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체를 포함한다. 나아가, 본 발명의 항체는 임의의 종류의 스크리닝 방법으로부터 수득되는 임의의 친화성 성숙된 항체 클론도 포함한다. 예를 들면, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR들, 또는 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 76의 VH 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 서열번호 15의 VH 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체, 및 서열번호 76의 VH 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체가 본 발명에 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2, 142S38B, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체, 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체, 또는 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합되는 IgG2 항체 및 IgG2 변이체를 포함한다. 추가로, 본 발명의 항체는 전술된 또 다른 특정 항체와 경쟁적으로 DR3에 결합하는 IgG2 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 복수의 CDR들을 포함하는 펩티드, 항체의 6개 CDR들을 포함하는 펩티드 및 Fc 융합 단백질, 예컨대, 1개의 Fab가 Fc 영역에 융합되어 있는(Fab-Fc) 1가 항체, 2개의 Fab들이 Fc 영역에 융합되어 있는[(Fab)2-Fc] 2가 항체, 1개의 scFv가 Fc 영역에 융합되어 있는(scFv-Fc) 1가 항체, 2개의 scFv들이 Fc 영역에 융합되어 있는[(scFv)2-Fc] 2가 항체, 항체의 H 쇄 및 Fc 융합된 L 쇄(이하, "FL"로서 기재됨)로 구성된 1가 항체 등을 포함한다. 본 발명의 항체 단편은 TL1A 유도된 DR3 활성을 길항할 수 있고, 이때 상기 항체 단편은 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 VH 및 VL로 구성된 1개 또는 2개의 항원 결합 도메인을 가진 1가 항체 및 2가 항체, 예컨대, Fab 또는 scFv를 포함한다. 본 발명의 한 보다 바람직한 실시양태에서, 1가 항체는 1개의 Fab가 Fc 영역에 융합되어 있는(Fab-Fc) 1가 항체, 1개의 H 쇄, 1개의 경쇄 및 1개의 Fc 영역으로 구성된 1가 항체, 1개의 scFv가 Fc 영역에 융합되어 있는(scFv-Fc) 1가 항체, 1개의 scFv-Fc 및 1개의 Fc 영역으로 구성된 1가 항체, 및 항체의 H 쇄 및 FL 융합 폴리펩티드로 구성된 1가 항체를 포함하고, 이때 상기 1가 항체는 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않으면서 TL1A 유도된 DR3 활성을 길항할 수 있다.
본 발명의 또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 항체 단편은 2개의 Fab들이 IgG2-Fc 영역에 융합되어 있는[(Fab)2-IgG2Fc] 2가 항체, 및 2개의 scFv들이 IgG2Fc 영역에 융합되어 있는[(scFv)2-IgG2Fc] 2가 항체를 포함하고, 이때 상기 2가 항체는 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않으면서 TL1A 유도된 DR3 활성을 길항할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 1가 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B의 6개 CDR 서열들을 포함하는 1가 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 1가 항체, 및 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 1가 항체를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 2가 IgG2 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B의 6개 CDR 서열들을 포함하는 2가 IgG2 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 2가 IgG2 항체, 및 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 2가 IgG2 항체를 포함한다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 1가 항체는 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B의 6개 CDR 서열들을 포함하는 1가 항체, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 1가 항체, 및 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열 및 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 1가 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 1가 항체는 하기 6개의 CDR 서열들을 각각 포함하는 1가 항체들도 포함한다: 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR들, 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR들, 또는 서열번호 16, 80 및 18의 VH의 CDR들 및 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR들.
한 실시양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 임의의 번역 후 변형된 아미노산 잔기가 포함되어 있는 항체를 포함한다. 항체는 번역 후 변형에서 잘 공지되어 있고, 예컨대, 라이신 잔기가 중쇄의 C-말단에서 결핍되어 있고(이하, 소위 "라이신 클립핑(clipping)") 글루타민 잔기가 폴리펩티드의 N-말단에서 피로-글루타민(pyroGlu)으로 변형되어 있다(Beck et al, Analytical Chemistry, 2013; 85 :715-736). 따라서, 본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 항체는 각각의 폴리펩티드의 N/C 말단에서 pyroGlu 및/또는 Lys 클립핑을 포함한다. 이 변형들은 항체의 활성에 본질적으로 영향을 미치지 않고, 본 발명의 항체는 이 변형들을 갖지 않는 항체와 동등한 활성을 가진다.
본 발명은 전술된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체 조성물 또는 항체 단편 조성물도 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 조성물은 DR3의 활성을 중화시키고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는 항체를 포함하는 항체 조성물, TL1A 결합을 차단하고 DR3의 활성을 중화시키고 감소된 효현 활성을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는 항체를 포함하는 항체 조성물, 및 DR3 삼량체의 형성을 억제하고 TL1A 결합을 통한 DR3 활성화를 중화시키고 DR3에 대한 감소된 효현 활성을 갖거나 DR3에 대한 효현 활성을 갖지 않는 항체를 포함하는 항체 조성물을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 조성물은 가변 항체 분자, 예컨대, 각각의 폴리펩티드의 N/C 말단에서 pyroGlu 및/또는 Lys 클립핑을 포함하는 상기 번역 후 변형된 항체 분자, 당형태 변이체 등을 포함할 수 있다.
항체의 성질의 조절
본 발명에서, Fc 영역을 가진 항체는 Fc 수용체 결합 또는 보체 결합을 통해 여러 이펙터 활성들을 나타낼 수 있다.
이펙터 활성은 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 항체 의존적 활성을 지칭한다. 항체 의존적 세포성 세포독성 활성(ADCC 활성), 보체 의존적 세포독성 활성(CDC 활성), 및 식세포, 예컨대, 대식세포, 수지상세포 등에 의해 야기된 항체 의존적 식세포작용(ADP 활성)이 이펙터 활성으로서 공지되어 있다. 본 발명에서, ADCC 및 CDC 활성은 공지된 측정 방법의 이용을 통해 측정될 수 있다[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1933)].
ADCC 활성은 표적 세포 상의 항원에 결합된 항체가 항체의 Fc 영역을 통해 면역세포의 Fc 수용체에 결합함으로써, 면역세포(천연 살해 세포 등)를 활성화시키고 표적 세포를 손상시키는 활성을 지칭한다.
Fc 수용체(이하, 일부 경우들에서 FcR로서 지칭됨)는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭하고 항체의 결합으로 인해 다양한 종류의 이펙터 활성들을 유도한다.
FcR은 항체 서브클래스에 상응하고, IgG, IgE, IgA 및 IgM은 각각 FcγR, FcεR, FcαR 및 FcμR에 특이적으로 결합한다. FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)을 비롯한 서브타입들을 갖고, 서브타입들은 각각 FcγRIA, FcγRIB, FcγRIC, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA 및 FcγRIIIB를 비롯한 동형체들(isoforms)을 가진다. 이들 상이한 종류의 FcγR은 상이한 세포 상에 존재한다[Annu Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]. 인간에서, FcγRIIIB는 호중구에서 특이적으로 발현되고, FcγRIIIA는 단핵세포, 천연 살해 세포(NK 세포) 및 T 세포의 일부에서 발현된다. FcγRIIIA를 통해 야기된 항체 결합은 NK 세포 의존적 ADCC 활성을 유도한다.
CDC 활성은 표적 세포 상의 항원에 결합된 항체가 혈액에서 일군의 보체 관련 단백질들로 구성된 일련의 캐스케이드(cascades)(보체 활성화 경로)를 활성화시킴으로써, 표적 세포를 손상시키는 활성을 지칭한다. 보체 활성화로 인해 생성된 단백질 단편에 의해 면역세포의 이동 및 활성화를 유도하는 것이 가능하다. 항체의 Fc 영역에 대한 결합 도메인을 가진 C1q가 Fc 영역에 결합하고 2개의 세린 프로테아제들로서 C1r 및 C1s가 그에 결합될 때, C1 복합체가 형성됨으로써, CDC 활성의 캐스케이드가 시작된다.
본 발명의 항체의 이펙터 활성을 조절하는 방법은 다음과 같이 예시될 수 있다. 상기 항체의 이펙터 활성을 조절하는 방법의 예로는 IgG1 서브클래스의 Fc의 아미노산 서열을 본 발명의 항체의 Fc로서 사용하여 EU 지수의 위치 297에서 Asn에 결합된 복합체 유형의 N-연결된 당쇄(이하, 일부 경우들에서 복합체 당쇄로서 단순히 약칭됨)의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc)과 α1,6-결합을 형성하는 푸코스(코어 푸코스로서도 지칭됨)의 양을 조절하는 방법(국제 특허출원 공보 제WO 2005/035586호, 제WO 2002/31140호 및 제WO 00/61739호), 또는 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 치환시킴으로써 활성을 조절하는 방법이 있을 수 있다.
1) 당쇄의 변형에 의한 조절
항체의 이펙터 활성은 항체의 Fc 영역에 결합된 복합체 당쇄의 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민에 추가되는 푸코스의 함량을 조절함으로써 증가될 수 있거나 감소될 수 있다.
항체의 Fc 영역에 결합된 복합체 유형의 N-연결된 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 감소시키는 방법은 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자(FUT8)가 결실되어 있는 CHO 세포를 사용하여 항체를 발현시킴으로써 결합된 푸코스를 갖지 않는 항체를 수득하는 것이다. 결합된 푸코스를 갖지 않는 항체는 높은 ADCC 활성을 가진다.
다른 한편으로, 항체의 Fc 영역에 결합된 복합체 유형의 N-연결된 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 증가시키는 방법은 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자가 도입되어 있는 숙주 세포를 사용하여 항체를 발현시킴으로써 결합된 푸코스를 가진 항체를 수득하는 것이다. 결합된 푸코스를 가진 항체는 결합된 푸코스를 갖지 않는 항체보다 더 낮은 ADCC 활성을 가진다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에서, N-연결된 당쇄는 EU 지수의 위치 297에서 Asn 잔기에 결합되지만, 당쇄가 다른 Fc 영역의 Asn 잔기에 결합된다는 보고는 없다. 따라서, 2개의 N-글리코사이드 연결된 당쇄들이 전형적으로 항체의 한 분자에 결합된다.
공지된 N-연결된 당쇄는 고만노스 유형의 당쇄, 복합체 유형의 당쇄 및 하이브리드 유형의 당쇄이다. N-연결된 당쇄가 결합된 푸코스를 갖지 않는 한, 이 당쇄는 결합된 푸코스를 가진 당쇄보다 더 높은 ADCC 활성을 가진다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 결합된 복합체 유형의 당쇄는 하나 이상의 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 또는 갈락토스-N-아세틸글루코스아민(이하, GlcNAc 또는 Gal-GlcNAc로서 지칭됨)이 코어 구조(트리-만노실 코어 구조)의 비-환원 말단에서 만노스(Man)에 α1-2-연결되어 있거나 α1-4-연결되어 있는 당쇄를 포함할 수 있다. 상기 당쇄는 Gal-GlcNAc의 비-환원 말단에서 시알산, 이등분 N-아세틸글루코스아민(이하, 이등분 GlcNAc로서 지칭됨) 등을 가진 복합체 유형의 당쇄도 포함할 수 있다.
본 발명에서, 코어-푸코스 또는 α1,6-푸코스는 푸코스(이하, 일부 경우들에서 Fuc로서 지칭됨)의 1-위치가 복합체 유형의 N-글리코사이드-연결된 당쇄의 α-결합을 통해 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민(이하, 일부 경우들에서 GlcNAc로서 지칭됨)의 6-위치에 결합되어 있는 당쇄 구조를 지칭한다. 추가로, 복합체 유형의 N-글리코사이드-연결된 당쇄의 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민에 결합된 코어 푸코스를 갖지 않는 당쇄는 단순히 푸코스를 갖지 않거나 코어 푸코스를 갖지 않는 당쇄로서 지칭된다.
본 발명에서, 코어 구조 또는 트리-만노실 코어 구조는 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 구조를 지칭한다.
본 발명의 항체에 결합된 당쇄로서, 바이안테나리(biantennary) N-글리코사이드 연결된 복합체 당쇄(바이안테나리 복합체 당쇄로서도 지칭됨)가 하기 화학식으로 표시된다:
[화학식 1]
Figure pct00001
본 발명의 항체 조성물은 복합체 유형의 당쇄가 항체 분자의 위치 297에서 Asn에 결합되어 있는 Fc 영역을 가진 항체 분자이고, 상기 항체 조성물이 상기 당 구조를 갖는 한, 상기 항체 조성물은 단일 당쇄 또는 복수의 상이한 당쇄들을 가진 항체 분자로 구성될 수 있다.
다시 말해, 본 발명의 항체 조성물은 단일 당쇄 또는 복수의 상이한 당쇄들을 가진 항체 분자, 구체적으로 항체에 포함된 Fc 영역에 결합된 총 N-글리코사이드 연결된 당쇄들 중에서 당쇄의 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민에 결합된 푸코스를 갖지 않는 당쇄가 50% 이상인 항체로 구성된 조성물을 의미한다. 항체 조성물의 또 다른 실시양태에서, Fc 영역에서 푸코실화된 당쇄를 가진 항체 분자로 구성된 항체 조성물은 80% 이상이다.
항체의 ADCC 활성이 증가되거나 감소되는 한, 코어 푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 항체 조성물에서 임의의 비율일 수 있다. 증가된 ADCC에 대한 비율은 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 51% 내지 100%, 훨씬 더 바람직하게는 80% 내지 100%, 특히 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 가장 바람직하게는 100%일 수 있다. 감소된 ADCC에 대한 비율은 바람직하게는 20% 이하일 수 있다.
코어 푸코스를 갖지 않는 당쇄를 50%의 비율로 가진 항체 조성물은 항체 분자의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 결합된 N-글리코사이드 연결된 당쇄들 중 한 당쇄에서 푸코스를 갖지 않는 분자를 100%의 비율로 포함하는 항체 조성물, 및 항체 분자의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 결합된 N-글리코사이드 연결된 당쇄들 중 두 당쇄들에서 푸코스를 갖지 않는 분자를 50%의 비율로 포함하고 항체 분자의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 결합된 N-글리코사이드 연결된 당쇄들 중 두 당쇄들에서 푸코스를 가진 분자를 50%의 비율로 포함하는 항체 조성물 중 임의의 항체 조성물일 수 있다.
본 발명에서, 푸코스가 상기 화학식에서 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민에 결합하지 않는 한, 푸코스를 갖지 않는 당쇄는 비-환원 말단에서 당쇄의 임의의 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서, 당쇄의 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민에 결합된 푸코스의 부재(코어 푸코스의 부재)는 푸코스가 실질적으로 결합되어 있지 않다는 것을 의미한다. "푸코스가 실질적으로 결합되어 있지 않은" 항체 조성물은 푸코스가 후술된 당쇄 분석에서 실질적으로 검출될 수 없는 항체 조성물을 의미한다. "푸코스가 실질적으로 검출될 수 없는"은 푸코스가 검출 한계 미만으로 존재한다는 것을 의미한다. 모든 당쇄들에서 코어 푸코스를 갖지 않는 항체 조성물은 가장 높은 ADCC 활성을 가진다.
복합체 유형의 N-글리코사이드-연결된 당쇄와 결합된 Fc 영역을 가진 항체 분자로 구성된 조성물에 함유된, 푸코스를 갖지 않는 당쇄를 가진 항체 분자의 비율은 공지된 방법, 예컨대, 하이드라진분해(hydrazinolysis) 또는 효소 분해[Biochemical Experimentation Methods 23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), edited by Reiko Takahashi (1989)]를 이용하여 항체 분자로부터 당쇄를 방출시키고 방출된 당쇄의 형광 표지부착 또는 방사성동위원소 표지부착을 수행한 후 표지된 당쇄를 크로마토그래피로 분리함으로써 측정될 수 있다.
또한, 복합체 유형의 당쇄와 결합된 Fc 영역을 가진 항체 분자로 구성된 조성물에 함유된, 푸코스를 갖지 않는 당쇄와 결합된 항체 분자의 비율은 방출된 당쇄를 HPAED-PAD 방법[J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)]으로 분석함으로써 측정될 수 있다.
2) 아미노산 잔기의 치환에 의한 조절
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 ADCC, ADCP 및 CDC 활성은 항체를 구성하는 Fc의 항체 서브클래스를 변경시키거나 Fc 영역의 아미노산 잔기를 치환시킴으로써 증가될 수 있거나 감소될 수 있다.
예를 들면, 항체의 CDC 활성은 미국 특허출원 공보 제2007/0148165호에 기재되어 있는, Fc 영역의 아미노산 서열을 이용함으로써 증가될 수 있다. 또한, 항체의 ADCC 활성 또는 CDC 활성은 미국 특허 제6,737,056호, 제7,297,775호 및 제7,317,091호에 기재되어 있는, 아미노산 잔기의 치환을 수행함으로써 증가될 수 있거나 감소될 수 있다.
ADCC 활성을 증가시키기 위한 특정 치환은 S239D, P247I, F243L, R292P, S298A, Y300L, A330L, I332E, E333A, K334A, A339D, T393A, P396L, H433P 등을 포함할 수 있다. 한편, ADCC 활성을 감소시키기 위한 특정 치환은 L235E, P238A, N297A, K322A, P331S 등을 포함할 수 있다.
CDC 활성은 2개 이상의 아미노산 잔기 치환들의 조합에서 증가될 수 있고, 치환될 아미노산 잔기는 목적에 따라 증가될 수 있다. 바람직하게는, CDC 활성을 증가시키기 위한 아미노산 잔기 치환은 N276K, A339T, T394F 및 T394Y로부터 선택된 하나 이상의 치환, 아미노산 잔기 치환 N276K 및 A339T, 및 아미노산 잔기 치환 K274Q, N276K, Y296F, Y300F, A339T, D356E, L358M, N384S, V397M 및 V422I 등을 포함할 수 있다. 한편, CDC 활성을 감소시키기 위한 특정 아미노산 잔기 치환은 L235E, N297A, K322A, P329A 및 P331S로부터 선택된 하나 이상의 치환 등을 포함할 수 있다.
T250Q, M428L, M252Y, S254T, T256E 등으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 인간 IgG 서브클래스의 Fc 내에 추가함으로써 혈액 반감기도 연장할 수 있다. N-연결된 당쇄가 위치 N297에서 아미노산 돌연변이를 도입함으로써 제거되어 있는 Fc, 인간 IgG2 또는 IgG4 서브클래스의 Fc, IgG2 및 IgG4의 키메라 Fc 등을 사용함으로써 세포 세포독성, 예컨대, ADCC 활성, ADCP 활성, CDC 활성도 감소시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, F300Y, V309L 및 T339A로부터 선택된 하나 이상의 치환을 인간 IgG 항체 내에 추가함으로써 낮은 pH 조건에서 항체 또는 항체 단편을 안정화시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 IgG 항체의 Fc 영역 내의 234, 235, 237, 250, 300, 309, 331, 339, 409 및 428 위치들로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 IgG2 항체의 Fc 영역에서 V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, P331S, T339A 및 M428L로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항체, 인간 IgG2 항체의 Fc 영역에서 아미노산 치환 T250Q 및 M428L을 포함하는 항체, 인간 IgG2 항체의 Fc 영역에서 아미노산 치환 V234A, G237A 및 P331S를 포함하는 항체, 인간 IgG2 항체의 Fc 영역에서 아미노산 치환 F300Y, V309L 및 T339A를 포함하는 항체, 및 인간 IgG2 항체의 Fc 영역에서 아미노산 치환 V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, T339A, P331S 및 M428L을 포함하는 항체 등을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 다음과 같이
(i) IgG1 항체의 Fc 영역 내의 214, 220, 435 및 436 위치들로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환,
(ii) IgG2 항체의 Fc 영역 내의 234, 235, 237, 250, 300, 309, 339, 331, 409, 428, 435 및 436 위치들로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환, 또는
(iii) IgG4 항체의 Fc 영역 내의 131, 133, 228, 235, 409, 435 및 436 위치들로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환
을 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 단편은 다음과 같이
(i) IgG1 항체의 Fc 영역에서 C214S, C220S, H435R 및 Y436F로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환,
(ii) IgG2 항체의 Fc 영역에서 C220S, V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, P331S, T339A, M428L, H435Y 및 Y436F로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환, 또는
(iii) IgG4 항체의 Fc 영역에서 C131S, R133K, C214S, S228P, L235E, R409K, H435R 및 Y436F로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환
을 포함하는 항체 단편을 포함한다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 1가 항체는 다음과 같이
(i) H 쇄에서 C220S 치환을 포함하고 IgG1의 FL 쇄에서 C214S, H435R 및 Y436F 치환을 포함하는 1가 항체,
(ii) H 쇄에서 C220S 치환을 포함하고 IgG1의 FL 쇄에서 C214S, H435R 및 Y436F 치환 및 216-220의 EPKSC의 결실을 포함하는 1가 항체,
(iii) H 쇄에서 C220S, L235E, G237A 및 P331S 치환을 포함하고 IgG1의 FL 쇄에서 C214S, C220S, L235E, G237A, P331S. H435R 및 Y436F 치환을 포함하는 1가 항체,
(iv) H 쇄에서 C220S, L235E, G237A 및 P331S 치환을 포함하고 IgG1의 FL 쇄에서 C214S, L235E, G237A, P331S, H435R 및 Y436F 치환 및 216-220의 EPKSC의 결실을 포함하는 1가 항체,
(v) H 쇄에서 C220S 및 F300Y 치환을 포함하고 IgG2의 FL 쇄에서 C214S, F300Y, H435R 및 Y436F를 포함하는 1가 항체,
(vi) H 쇄에서 C220S, T250Q 및 M428L 치환을 포함하고 IgG2의 FL 쇄에서 C214S, T250Q, M428L, H435R 및 Y436F를 포함하는 1가 항체,
(vii) H 쇄에서 C220S, V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, P331S, T339A 및 M428L 치환을 포함하고 IgG2의 FL 쇄에서 C214S, V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, T339A, P331S, M428L, H435R 및 Y436F를 포함하는 1가 항체,
(viii) H 쇄에서 C220S, V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, P331S, T339A 및 M428L 치환을 포함하고 IgG2의 FL 쇄에서 C214S, V234A, L235E, G237A, T250Q, F300Y, V309L, T339A, P331S, M428L, H435R 및 Y436F를 포함하는 1가 항체,
(ix) H 쇄에서 C131S 및 R409K 치환을 포함하고 IgG4의 FL 쇄에서 C214S, R409K, H435R 및 Y436F 치환을 포함하는 1가 항체, 및
(x) H 쇄에서 C131S, R133K, S228P, L235E 및 R409K 치환을 포함하고 IgG4의 FL 쇄에서 C214S, S228P, L235E, R409K, H435R 및 Y436F 치환을 포함하는 1가 항체
를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체 및 이의 항체 단편을 제조하는 방법으로서, a) 상기 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는 방법도 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은
a) 항체의 불변 영역에서 IgG2 서브클래스로부터 유래된 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인의 일부로 교체하는 단계, b) 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, c) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 d) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법,
a) 항체의 Fc 영역에서 IgG2 서브클래스로 교체하는 단계, b) 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, c) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 d) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법,
a) 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, IgG2 항체 또는 IgG2 항체 변이체를 제조하는 방법,
a) 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, IgG2 항체 또는 IgG2 항체 변이체를 제조하는 방법, 및
a) IgG 항체, 또는 IgG2 항체의 힌지 도메인 및 IgG4의 CH1, CH2 및 CH3 도메인들을 포함하는 IgG2 항체 변이체의 Fc 영역 내의 234, 235, 237, 250, 300, 309, 331, 339, 409, 428, 435 및 436 위치들로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계로서, CH3 도메인 내의 위치 409에서 아미노산 잔기가 Lys인 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, IgG2 항체 또는 IgG2 항체 변이체를 제조하는 방법
을 포함한다.
본 발명은
a) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체의 항체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 단편을 제조하는 방법,
a) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 단편을 제조하는 방법, 및
a) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체의 Fc 영역을 포함하는 1가 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, b) 상기 세포를 배양하고 배양 상청액을 회수하는 단계, 및 c) 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 단편을 제조하는 방법
도 포함한다. 추가로, 전술된 항체 단편을 제조하는 임의의 방법이 본 발명의 방법에 포함될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 방법은
a) 항체의 불변 영역에서 IgG2 서브클래스로부터 유래된 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인의 일부로 교체하는 단계, b) 재조합 항체를 생성하는 단계 및 c) 상기 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법, 및
a) 항체의 Fc 영역에서 IgG2 서브클래스 또는 IgG2 항체 변이체로 교체하는 단계, b) 재조합 항체를 생성하는 단계 및 c) 상기 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법
을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 a) 항체의 Fc 영역에서 IgG2 서브클래스 또는 IgG2 항체 변이체로 교체하는 단계, b) 재조합 항체를 생성하는 단계 및 c) (i) DR3의 인산화, (ii) NF-κB의 인산화, (iii) T 세포의 증식, (iv) DR3 양성 세포의 아폽토시스 및 (v) T 세포로부터의 사이토카인, 예컨대, 인터류킨(IL)-13, IL-17, GM-CSF 및 IFN-γ 방출로부터 선택된 하나 이상의 분석에서 상기 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 방법은
a) IgG1, IgG2, IgG4 또는 각각의 항체 변이체의 항체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터를 구축하는 단계, b) 재조합 항체를 생성하는 단계 및 c) 상기 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체 단편의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법,
a) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터를 구축하는 단계, b) 재조합 항체를 생성하는 단계 및 c) 상기 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체 단편의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법, 및
a) IgG1, IgG2, IgG4 또는 각각의 항체 변이체의 Fc 영역을 포함하는 1가 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터를 구축하는 단계, b) 재조합 항체를 생성하는 단계 및 c) 상기 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체 단편의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법
을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 a) IgG1, IgG2, IgG4 또는 각각의 항체 변이체의 Fc 영역을 포함하는 1가 항체를 재구축하는 단계, b) 재조합 1가 항체를 생성하는 단계 및 c) (i) DR3의 인산화, (ii) NF-κB의 인산화, (iii) T 세포의 증식, (iv) DR3 양성 세포의 아폽토시스 및 (v) T 세포로부터의 사이토카인, 예컨대, 인터류킨(IL)-13, IL-17, GM-CSF 및 IFN-γ 방출로부터 선택된 하나 이상의 분석에서 상기 1가 항체의 효현 활성을 검출하는 단계를 포함하는, 항체의 효현작용을 감소시키거나 결실시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 항체를 제조하는 방법, 질환을 치료하는 방법 및 질환을 진단하는 방법은 이하에 구체적으로 기재되어 있다.
1. 단일클론 항체의 제조 방법
(1) 항원의 제조
DR3의 전체 길이 또는 이의 부분적 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등 내로 도입함으로써 DR3 폴리펩티드 또는 DR3 단백질 발현 세포를 항원으로서 수득할 수 있다. 추가로, DR3은 다량의 DR3을 발현하는 다양한 인간 종양 세포주들, 인간 조직 등으로부터 정제될 수 있다. 상기 종양 세포주 및 조직은 항원으로서 사용되도록 허용될 수 있다. 나아가, 화학적 합성 방법, 예컨대, Fmoc 방법 또는 tBoc 방법으로 DR3의 부분적 서열을 가진 합성 펩티드를 제조할 수 있고 항원으로서 사용할 수 있다. 추가로, 임의의 종, 예컨대, 인간, 원숭이, 래트, 마우스 등의 DR3 단백질이 발현되고 제조된다.
본 발명에서 사용된 DR3은 예를 들면, 하기 방법에 따라 문헌(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997))에 기재된 방법 등을 이용하여 숙주 세포에서 DR3을 코딩하는 DNA를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
먼저, DR3 또는 이의 단편을 코딩하는 영역을 포함하는 전장 cDNA를 적절한 발현 벡터의 프로모터의 다운스트림(downstream) 내에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제조한다. 이때, 필요하다면, 전장 cDNA에 기초한 폴리펩티드를 코딩하는 영역을 함유하는 적절한 길이를 가진 DNA 단편을 상기 전장 cDNA 대신에 사용할 수 있다. 다음으로, 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주 세포 내로 도입함으로써 DR3을 생성하는 형질전환체를 수득할 수 있다.
발현 벡터는 사용될 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 전사될 수 있는 위치에서 적절한 프로모터를 포함하는 염색체 내에 삽입될 수 있는 벡터를 포함한다.
숙주 세포는, 목적 유전자를 발현할 수 있는 한, 임의의 숙주 세포일 수 있다. 예로는 에스케리키아 속, 예컨대, 에스케리키아 콜라이, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 속하는 미생물이 있다.
원핵생물, 예컨대, 에스케리키아 콜라이가 숙주 세포로서 사용될 때, 본 발명에서 사용된 재조합 벡터는 원핵생물에서 자율적으로 복제가능하고 프로모터, 리보좀 결합 서열, DR3을 코딩하는 부분을 포함하는 DNA 및 전사 종결 서열을 포함한다. 재조합 벡터는 전사 종결 서열을 가질 필요가 없으나, 전사 종결 서열은 바람직하게는 구조 유전자 바로 아래에 배치된다. 재조합 벡터는 유전자 조절 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 리보좀 결합 서열인 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열(SD 서열로서도 지칭됨)과 출발 코돈 사이의 공간이 적절한 거리(예를 들면, 6개 내지 18개 뉴클레오티드들)까지 조절되어 있는 플라스미드이다.
나아가, DR3을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 발현되기에 적합한 코돈이 되도록 또 다른 염기로 치환됨으로써, 목적 DR3의 생산성을 개선할 수 있다.
발현 벡터가 사용될 숙주 세포에서 작용할 수 있는 한, 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 발현 벡터의 예로는 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics)에 의해 제작됨), pKK233-2(파마샤(Pharmacia)에 의해 제작됨), pSE280(인비트로겐(Invitrogen)에 의해 제작됨), pGEMEX-1(프로메가(Promega)에 의해 제작됨), pQE-8(퀴아젠(QIAGEN)에 의해 제작됨), pKYP10(일본 미심사 특허출원 공보 제110600/83호), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(-)(스트라타진(Stratagene)에 의해 제작됨), pTrs30[에스케리키아 콜라이 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 제조됨], pTrs32[에스케리키아 콜라이 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 제조됨], pGHA2[에스케리키아 콜라이 IGHA2(FERM BP-400)로부터 제조됨, 일본 미심사 특허출원 공보 제221091/85호], pGKA2[에스케리키아 콜라이 IGKA2(FERM BP-6798)로부터 제조됨, 일본 미심사 특허출원 공보 제221091/85호], pTerm2(미국 특허 제4686191호, 미국 특허 제4939094호, 미국 특허 제5160735호), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX(파마샤에 의해 제작됨), pET 시스템(노바겐(Novagen)에 의해 제작됨), pME18SFL 등이 있다.
프로모터가 사용될 숙주 세포에서 작용할 수 있는 한, 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예로는 에스케리키아 콜라이, 파지 등으로부터 유래된 프로모터, 예컨대, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 및 T7 프로모터가 있다. 또한, 인위적으로 디자인되고 변형된 프로모터, 예컨대, 2개의 Ptrp가 직렬로 연결되어 있는 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터 및 letI 프로모터가 사용될 수 있다.
숙주 세포의 예로는 에스케리키아 콜라이 XL1-Blue, 에스케리키아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리키아 콜라이 DH1, 에스케리키아 콜라이 MC1000, 에스케리키아 콜라이 KY3276, 에스케리키아 콜라이 W1485, 에스케리키아 콜라이 JM109, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 No. 49, 에스케리키아 콜라이 W3110, 에스케리키아 콜라이 NY49, 에스케리키아 콜라이 DH5α 등이 있다.
재조합 벡터 도입 방법이 DNA를 숙주 세포 내로 도입하는 방법인 한, 임의의 재조합 벡터 도입 방법이 이용될 수 있고, 예로는 칼슘 이온을 사용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), methods described in Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]이 있다.
동물 세포가 숙주로서 사용될 때, 발현 벡터가 동물 세포에서 그의 기능을 발휘하는 한, 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있고, 이의 예로는 pcDNAI, pCDM8(후나코시 컴파니(Funakoshi co.)에 의해 제작됨), pAGE107[일본 특허 공보 제H3-22979호; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3(일본 특허 공보 제H2-227075호), pcDNAI/Amp(인비트로겐에 의해 제작됨), pcDNA 3.1(인비트로겐에 의해 제작됨), pREP4(인비트로겐에 의해 제작됨), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93(국제 특허출원 공보 제WO 97/10354호), N5KG1val(미국 특허 제6,001,358호), Tol2 트랜스포존(transposon) 벡터(국제 특허출원 공보 제WO 2010/143698호, 국제 특허출원 공보 제WO2013/005649호) 등이 있을 수 있다.
프로모터가 동물 세포에서 작용할 수 있는 한, 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예로는 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시 초기(IE) 유전자의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 프로모터, SR α 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터 또는 인핸서 등이 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서가 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 숙주 세포의 예로는 인간 백혈병 세포 나말와(Namalwa), 원숭이 COS 세포, 인간 백혈병 세포 PER.C6, 중국 햄스터 난소 CHO 세포(Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.883-900)), CHO/DG44, CHO-K1(ATCC CCL-61), DUkXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 카탈로그 번호 11619), Pro-3 세포, 래트 골수종 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(YB2/0으로서도 공지되어 있음), 마우스 골수종 세포 NSO, 마우스 골수종 세포 SP2/0-Ag14, 시리아 햄스터 세포 BHK 또는 HBT5637(일본 미심사 특허출원 공보 제000299/88호) 등이 있다.
재조합 벡터 도입 방법이 DNA를 동물 세포 내로 도입하는 방법인 한, 임의의 재조합 벡터 도입 방법이 이용될 수 있고, 예로는 전기천공[Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 칼슘 포스페이트 방법(일본 미심사 특허출원 공보 제227075/90호), 지질감염(lipofection) 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 등이 있다.
DR3은 DR3을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 가진, 미생물, 동물 세포 등으로부터 유래된 형질전환체를 배지에서 배양하여 배양물에서 DR3을 형성하고 축적하고 배양물로부터 DR3을 회수함으로써 생성될 수 있다. 배지에서 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에서 이용되는 통상적인 방법에 따라 수행된다. DR3이 진핵생물로부터 유래된 세포에서 발현될 때, 당 또는 당쇄에 결합된 DR3이 수득될 수 있다. 유도가능한 프로모터를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이 배양될 때, 필요하다면 유도체가 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이 배양될 때 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 등이 배지에 첨가될 수 있거나; trp 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이 배양될 때 인돌아크릴산(indoleacrylic acid) 등이 배지에 첨가될 수 있다.
동물 세포를 숙주 세포로서 사용함으로써 수득한 형질전환체가 배양될 때, 배지는 일반적으로 사용되는 RPMI 1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 이글(Eagle)의 MEM 배지[Science, 122, 501 (1952)], 둘베코(Dulbecco)의 변형된 MEM 배지[Virology, 8, 396 (1959)] 및 199 배지[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], 이스코브(Iscoove)의 변형된 둘베코의 배지(IMDM), 태아 소 혈청 등이 첨가된 배지 등을 포함한다. 배양은 일반적으로 5% CO2의 존재 하에서 1일 내지 7일 동안 6 내지 8의 pH 및 30℃ 내지 40℃에서 수행된다. 필요하다면, 배양 동안 항생제, 예컨대, 카나마이신, 페니실린 또는 젠타마이신이 배지에 첨가될 수 있다.
DR3을 코딩하는 유전자의 발현 방법에 대하여, 직접적인 발현 이외에 분비 생산, 융합 단백질 발현 등이 문헌(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, DR3 융합 단백질은 DR3 Fc 융합 단백질, DR3 Fc 융합 단백질의 세포외 영역, CRD 도메인 Fc 융합 단백질, DR3 히스티딘 태그(His-태그로서 약칭됨) 융합 단백질, DR3 플래그 융합 단백질 등을 포함한다. 임의의 경우, 임의의 DR3, DR3 변이체 및 이들의 단편이 Fc, His-태그, 플래그-태그, 글루타티온-S 트랜스퍼라제(GST)-태그 등에 융합될 수 있고 생성될 수 있다.
DR3을 제조하는 방법은 숙주 세포에서 세포내 발현시키는 방법, 숙주 세포로부터 세포외 분비시키는 방법, 숙주 세포 막 외피 상에서 제조하는 방법 등을 포함한다. 적절한 방법은 사용되는 숙주 세포 및 생성되는 DR3의 구조를 바꿈으로써 선택될 수 있다.
DR3이 숙주 세포 내에서 또는 숙주 세포 막 외피 상에서 생성될 때, DR3은 문헌[Paulson et al., J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]의 방법, 문헌[Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)]의 방법, 일본 미심사 특허출원 공보 제336963/93호 및 국제 특허출원 공보 제WO 94/23021호에 기재된 방법 등에 따라 전적으로 세포외로 분비될 수 있다. 또한, DR3의 생산량은 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 사용하는 유전자 증폭 시스템을 활용하는, 일본 미심사 특허출원 공보 제227075/90호에 기재된 방법에 따라 증가될 수 있다.
생성된 DR3은 예를 들면, 다음과 같이 단리될 수 있고 정제될 수 있다. DR3이 용해된 상태로 세포내에서 발현될 때, 배양 후 세포를 원심분리로 회수하고 수성 완충제에 현탁한 후 초음파처리기, 프렌치 프레스(French press), 맨톤 가울린(Manton Gaulin) 균질화기, 다이노밀(dynomill) 등을 이용하여 파괴함으로써 세포 무함유 추출물을 수득한다. 세포 무함유 추출물을 원심분리하여 상청액을 수득하고, 단독으로 이용될 수 있거나 병용될 수 있는 일반적인 효소 단리 및 정제 기법들, 예컨대, 용매 추출; 황산암모늄 등을 사용하는 염석; 탈염; 유기 용매를 사용하는 침전; 수지, 예컨대, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스인 DIAION HPA-75(미츠비시 케미칼(Mitsubishi Chemical)에 의해 제작됨)를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피; 수지, 예컨대, S-세파로스 FF(파마샤에 의해 제작됨)를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피; 수지, 예컨대, 부틸-세파로스 또는 페닐-세파로스를 사용하는 소수성 크로마토그래피; 분자체를 사용하는 겔 여과; 친화성 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 전기영동, 예컨대, 등전점 포커싱 등으로 상기 상청액을 처리함으로써 정제된 제제를 수득할 수 있다.
DR3이 봉입체를 형성함으로써 세포내에서 발현될 때, 세포를 동일한 방식으로 회수하고 파괴하고 원심분리하고, DR3의 봉입체를 침전 분획으로서 회수한다. 단백질의 회수된 봉입체를 단백질 변성제로 가용화시킨다. 가용화된 용액을 희석하거나 투석함으로써 상기 단백질을 정상적인 3차원적 구조로 만든 후, DR3의 정제된 제제를 전술된 단리 정제 방법과 동일한 단리 정제 방법으로 수득한다.
DR3, 이의 변이체 또는 이들의 단편, 예컨대, 글리코실화된 생성물이 세포외로 분비될 때, DR3 또는 유도체, 예컨대, 글리코실화된 생성물을 배양 상청액으로부터 회수할 수 있다. 즉, 배양물을 전술된 방식과 동일한 방식으로 원심분리와 같은 방법으로 처리하여 배양 상청액을 수득하고, 전술된 단리 정제 방법과 동일한 단리 정제 방법으로 배양 상청액으로부터 DR3의 정제된 제제를 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 DR3은 화학적 합성 방법, 예컨대, Fmoc 방법 또는 tBoc 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 어드밴스드 켐텍(Advanced ChemTech), 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 파마샤(Pharmacia), 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트(Protein Technology Instrument), 신테셀-베가(Synthecell-Vega), 퍼셉티브(PerSeptive), 시마주 코포레이션(Shimadzu Corporation) 등에 의해 제작된 펩티드 합성기를 이용하여 상기 DR3을 화학적으로 합성할 수 있다.
(2) 동물의 면역화 및 융합용 항체 생성 세포의 제조
3주령 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터를 상기 (1)에서 제조된 항원으로 면역화시키고, 동물의 비장, 림프절 또는 말초혈로부터 항체 생성 세포를 채취한다. 또한, 상기 동물에서 충분한 역가의 증가가 낮은 면역원성으로 인해 인식될 때, DR3 넉아웃 마우스를 면역화될 동물로서 사용할 수 있다.
면역화는 피하, 정맥내, 복강내 또는 림프절내 주사를 통해 적절한 보강제(adjuvant)(예를 들면, 완전 프로인트 보강제, 수산화알루미늄 겔과 백일해 백신의 조합물 등)와 함께 항원을 동물에게 투여함으로써 수행된다. 항원이 부분적 펩티드일 때, 항원으로서 사용되는, 담체 단백질, 예컨대, BSA(소 혈청 알부민), KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 등을 가진 접합체가 생성된다.
항원의 투여는 첫 번째 투여 후 1주마다 또는 2주마다 5회 내지 10회 수행된다. 각각의 투여 후 3일째 날 내지 7일째 날, 눈의 안저 또는 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하고, 혈청과 항원의 반응성을 예를 들면, 효소 면역분석[Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 등으로 시험한다. 면역화를 위해 사용된 항원에 대한 충분한 항체 역가를 그의 혈청에서 보이는 동물을 융합용 항체 생성 세포의 공급원으로서 사용한다.
항원의 최종 투여 후 3일 내지 7일에서, 항체 생성 세포를 함유하는 조직, 예컨대, 비장 또는 림프절을 면역화된 동물로부터 절개하여 항체 생성 세포를 채취한다. 비장 세포/림프절 세포가 사용될 때, 조직을 절개하고 느슨하게 한 후 원심분리한다. 그 다음, 적혈구를 제거함으로써 융합용 항체 생성 세포를 수득한다.
(3) 골수종 세포의 제조
마우스로부터 수득된 확립된 세포주가 골수종 세포로서 사용된다. 예로는 (BALB/c로부터 유래된) 8 아자구아닌 내성 마우스 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495 (1975)] 등이 있다.
이 세포주들을 적절한 배지, 예컨대, 8-아자구아닌 배지[8-아자구아닌을 글루타민, 2-머캡토에탄올, 젠타마이신 및 태아 소 혈청(이하, "FCS"로서 지칭됨)으로 보충된 RPMI-1640 배지에 첨가함으로써 수득된 배지], 이스코브의 변형된 둘베코의 배지(이하, "IMDM"으로서 지칭됨) 또는 둘베코의 변형된 이글 배지(이하, "DMEM"으로서 지칭됨)에서 하위배양한다. 세포를 세포 융합 전에 표준 배지(예를 들면, 10% FCS를 함유하는 DMEM)에서 3일 내지 4일 동안 하위배양하여 융합 당일 2x107개 이상의 수의 세포를 확보한다.
(4) 단일클론 항체를 생성하기 위한 세포 융합 및 하이브리도마의 제조
상기 (2)에 의해 수득된 융합용 항체 생성 세포 및 상기 (3)에 의해 수득된 골수종 세포를 최소 필수 배지(MEM) 또는 PBS(1.83 g의 인산수소이나트륨, 0.21 g의 인산이수소칼륨, 7.65 g의 염화나트륨, 1 리터의 증류수, pH 7.2)로 충분히 세척하고 혼합하여 5 내지 10 : 1의 항체 생성 세포 : 골수종 세포의 비를 제공한 후 원심분리하였다. 그 다음, 상청액을 따라 버린다. 침전된 세포 군을 충분히 느슨하게 한다. 침전된 세포를 느슨하게 한 후, 폴리에틸렌 글리콜-1000(PEG-1000), MEM 및 디메틸설폭사이드의 혼합물을 37℃에서 교반하면서 세포에 첨가한다. 추가로, 1 내지 2 ㎖의 MEM 배지를 1분 또는 2분마다 수회 첨가하고, MEM을 첨가하여 50 ㎖의 총량을 제공한다. 원심분리 후, 상청액을 따라 버린다. 세포를 약간 느슨하게 한 후, 세포를 HAT 배지(하이포잔틴, 타이미딘 및 아미노프테린이 표준 배지에 첨가되어 있는 배지]에 약하게 현탁한다. 현탁액을 37℃에서 7일 내지 14일 동안 5% CO2 항온처리기 내에서 배양한다.
상기 골수종 세포가 8-아자구아닌 내성 세포주, 즉 하이포잔틴/구아닌/포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT) 결핍 세포주일 때, 융합되지 않은 골수종 세포 및 골수종 세포 자체의 융합 세포는 HAT 함유 배지에서 생존할 수 없다. 다른 한편으로, 항체 생성 세포들 서로의 융합 세포 및 항체 생성 세포와 골수종 세포의 하이브리도마는 생존할 수 있으나, 항체 생성 세포들의 융합 세포의 수명은 제한된다. 따라서, 이 세포들이 HAT 함유 배지에서 연속적으로 배양되면, 항체 생성 세포와 골수종 세포의 하이브리도마만이 생존할 수 있고, 그 결과 하이브리도마를 선별할 수 있다.
콜로니 형태로 생장된 하이브리도마의 배지는 HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거함으로써 수득된 배지(이하, "HT 배지"로서 지칭됨)로 교체된다. 그 후, 상청액의 일부를 채취한 후, 이하에 기재된 항체 역가 측정 방법을 이용하여 항체 생성 하이브리도마를 선별할 수 있다.
항체 역가를 측정하는 방법의 예로는 다양한 공지된 기법들, 예컨대, 방사면역분석(이하, "RIA"로서 지칭됨), 효소-연결된 면역흡착 분석(이하, "ELISA"로서 지칭됨), 형광 항체 방법, 예컨대, 유세포분석(flow cytometry) 및 수동 헤마글루틴화가 있다. 검출 민감성, 신속성, 정확성, 작동 자동화의 가능성 등을 고려할 때 이들 중에서 RIA 또는 ELISA가 바람직하다.
항체 역가 측정에 의해 특정 항체를 생성하는 것으로 확인된 하이브리도마를 또 다른 플레이트에 옮기고 클로닝한다. 클로닝 방법의 예로는 1개의 하이브리도마가 플레이트의 각각의 웰에 함유되도록 희석됨으로써 하이브리도마가 배양되는 제한 희석 방법, 콜로니를 회수하기 위해 하이브리도마가 연질 한천 배지에서 배양되는 연질 한천 방법, 미세조작기(micromanipulator)를 이용하여 세포를 하나씩 채취하고 세포를 배양하는 방법, 및 단일 세포가 세포 분류기에 의해 분리되는 "분류기 클로닝" 등이 있다. 제한 희석 방법이 그의 단순성으로 인해 널리 이용된다.
클로닝은 예를 들면, 항체 역가가 확인되는 웰에 대한 제한 희석에 의해 2회 내지 4회 반복되고, 항체 역가가 안정하게 확인되는 하이브리도마는 항-인간 DR3 단일클론 항체 생성 하이브리도마 세포주로서 선별된다.
(5) 정제된 단일클론 항체의 제조
상기 (4)에 의해 수득된 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 0.5 ㎖의 프리스탄(pristane)으로 치료받은 8주령 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스 내에 복강내 주사로 투여한다(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(프리스탄)을 복강내로 투여한 후, 2주 동안 먹이를 제공한다). 하이브리도마는 10일 내지 21일 이내에 복수 종양을 발생시킨다. 복수액을 마우스로부터 채취하고 원심분리하여 고체를 제거하고 40% 내지 50%의 황산암모늄을 사용한 염석으로 처리한 후, 카프릴산으로 침전시키고 DEAE-세파로스 컬럼, 단백질 A 컬럼 또는 겔 여과 컬럼에 통과시켜 정제된 단일클론 항체로서 IgG 또는 IgM 분획을 수집한다.
나아가, 상기 (4)에 의해 수득된 단일클론 항체 생성 하이브리도마를 FBS 등을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하고 상청액을 원심분리로 제거한다. 침전된 세포를, 5% DIGO GF21을 함유하는 하이브리도마 SFM 배지에 현탁시키고 3일 내지 7일 동안 배양한다. 수득된 세포 현탁액을 원심분리한 후 생성된 상청액을 단백질 A 컬럼 또는 단백질 G 컬럼으로 정제하여 IgG 분획을 수집함으로써 정제된 단일클론 항체를 수득할 수 있다.
효소 면역분석으로 서브클래스 타이핑(typing) 키트를 사용하여 항체의 서브클래스를 확인할 수 있다. 단백질의 양을 로우리(Lowry) 방법으로 측정할 수 있거나 280 nM에서의 흡광도[1.4(OD280) = 면역글로불린 1 mg/㎖]로부터 측정할 수 있다.
(6) 단일클론 항체의 선택
본 발명의 항-DR3 단일클론 항체의 결합 활성을 결합 분석 시스템, 예컨대, 오우크테로니(Ouchterlony) 방법, ELISA, RIA, 유세포분석(FCM) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법으로 확인할 수 있다. 오우크테로니 방법은 단순하지만 항체 농도가 낮을 때 농축 작업을 요구한다.
ELISA 또는 RIA가 이용될 때, 배양 상청액을 그 자체로 항원-흡착된 고체상과 결합시키고, 다양한 면역글로불린 이소타입들 및 서브클래스들에 상응하는 항체를 제2 항체로서 사용함으로써, 항체의 이소타입 및 서브클래스를 확인할 수 있다.
정제된 또는 부분적으로 정제된 재조합 인간 DR3을 ELISA 등을 위한 96-웰 플레이트의 고체상 표면 상에 흡착시키고, 항원이 흡착되지 않은 고체상 표면을 항원과 무관한 단백질, 예컨대, 소 혈청 알부민(이하, "BSA"로서 기재됨)으로 차단시킨다.
ELISA 플레이트를, 0.05% 트윈 20을 함유하는 인산염 완충제 식염수(이하, "PBS"로서 기재됨)(이하, 트윈-PBS로서 약칭됨) 등으로 세척한 후 연속적으로 희석된 제1 항체(예를 들면, 마우스 혈청, 배양 상청액 등)와 결합시킴으로써, 항체를 상기 플레이트 상에 고정된 항원에 결합시킨다.
그 후, 바이오틴, 효소(호스 라디쉬 퍼록시다제(horse radish peroxidase); HRP, 알칼리성 포스파타제; ALP 등), 화학발광 물질, 방사성 화합물 등으로 표지된 항-면역글로불린 항체를 제2 항체로서 상기 플레이트에 분배함으로써, 제2 항체를 상기 플레이트에 결합된 제1 항체와 반응시킨다. 상기 플레이트를 트윈-PBS로 충분히 세척한 후, 제2 항체의 표지 물질에 의해 야기되는 반응을 수행으로써, 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 선별한다.
항원 발현 세포에 대한 표적 항체의 결합 활성은 FCM에 의해 측정될 수 있다[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)]. 표적 항체가 세포막 상에서 발현된 막 단백질에 결합하는 경우, 이것은 표적 항체가 천연 생성 항원의 3차원적 구조를 인식하는 항체라는 것을 암시할 수 있다.
SPR의 예로는 비아코어(Biacore)®를 이용한 동역학적 분석이 있다. 예를 들면, 비아코어® T100을 이용함으로써 항원과 대상 물질의 결합에서의 동역학을 측정하고 이의 결과를 기계에 부착된 분석 소프트웨어로 분석한다. 항-마우스 IgG 항체를 아민 커플링 방법으로 센서 칩 CM5 상에 고정시킨 후, 적절한 양의 물질이 항체에 결합하도록 대상 물질, 예컨대, 하이브리도마 배양 상청액 또는 정제된 단일클론 항체를 유동시킨 후, 상이한 수준의 공지된 농도의 항원을 유동시킴으로써, 결합 및 해리를 측정할 수 있다. 1:1 결합 모델로 기계에 부착된 소프트웨어를 이용하여 동역학 분석을 수득된 데이터에 대해 수행함으로써 다양한 파라미터들을 수득한다. 대안적으로, 인간 DR3 단백질을 예를 들면, 아민 커플링 방법으로 센서 칩 상에 고정시킨 후, 상이한 수준의 공지된 농도의 정제된 단일클론 항체를 유동시킴으로써 결합 및 해리를 측정한다. 2가 결합 모델로 기계에 부착된 소프트웨어를 이용하여 동역학 분석을 수득된 데이터에 대해 수행함으로써 다양한 파라미터들을 수득한다.
DR3에 결합하기 위해 본 발명의 항-DR3 항체와 경쟁하는 항체는 대상 항체를 상기 결합 분석 시스템에 첨가하고 상기 항체를 결합시킴으로써 수득될 수 있다. 즉, 대상 항체가 첨가될 때 결합 활성이 억제되는 항체를 스크리닝함으로써, DR3의 세포외 도메인에 결합하기 위해 수득된 항체와 경쟁하는 항체를 수득할 수 있다.
(7) 항-DR3 단일클론 항체의 에피토프의 확인
본 발명에서, 항체의 인식 에피토프는 하기 방식으로 확인될 수 있다. 예를 들면, 부분적 결핍 항원, 상이한 이종 아미노산 잔기를 사용한 아미노산 치환에 의해 수득된 아미노산-치환된 항원, 또는 도메인의 변형에 의해 수득된 변형된 항원을 제조하고, 상기 결핍 항원 또는 아미노산-치환된 항원에 대한 표적 항체의 반응성이 낮아질 때, 이것은 결핍 부위 및 아미노산-치환된 부위가 표적 항체에 의해 인식되는 에피토프라는 것을 명확히 보여준다. 부분적 결핍 항원 또는 아미노산-치환된 항원을 적절한 숙주 세포(에스케리키아 콜라이, 효모, 식물 세포, 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포 등)로부터 분비된 단백질로서 수득할 수 있다. 숙주 세포 표면 상에서 항원을 발현시킴으로써 항원 발현 세포를 제조할 수도 있다. 막-유형 항원의 경우, 항원의 입체형상적 구조(천연 생성 입체형성인 듯함)를 보유하면서 항원을 발현시키도록 항원을 숙주 세포 표면 상에서 발현시키는 것이 바람직하다. 항원의 일차 구조 또는 3차원적 구조를 모방하는 합성 펩티드를 제조함으로써 표적 항체의 반응성을 확인할 수도 있다. 합성 펩티드를 제조하는 방법의 예로는 공지된 펩티드 합성 기법을 이용하여 다양한 분자들을 가진 부분적 펩티드를 제조하는 방법이 있다.
본 발명의 항-DR3 항체의 경우, 표적 항체의 반응성을 확인하기 위해 인간 및 마우스 DR3의 세포외 도메인의 각각의 PLAD 도메인 및 CRD 도메인 1 내지 4를 조합함으로써 수득된 키메라 단백질을 제조함으로써, 항체의 에피토프를 확인할 수 있다. 예를 들면, 마우스 DR3으로부터의 CRD1 및 인간 DR3으로부터의 CRD2 내지 CRD4로 구성된 키메라 DR3 단백질을 CHO 세포 상에서 발현시키고, 키메라 DR3을 가용성 Fc 융합 단백질로서 생성할 수 있다. 시험된 항체가 인간 DR3 단백질/인간 DR3 발현된 세포에 결합할 수 있으나, 상기 항체가 CRD1 키메라 DR3 단백질/CRD1 키메라 DR3 발현된 세포에 결합할 수 없는 경우, 상기 항체는 DR3의 세포외 영역의 CRD1에 존재하고 인간 CRD1과 마우스 CDR1 사이에 상이한 아미노산 잔기인 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프를 가진다는 것이 밝혀진다.
그 후, 당업자에게 공지된 올리고펩티드 합성 기법을 이용함으로써 상응하는 부분, 펩티드의 돌연변이체 등의 다양한 올리고펩티드들을 보다 더 상세히 합성하고, 펩티드에 대한 표적 항체의 반응성을 확인하여 에피토프를 확인한다. 다양한 올리고펩티드들을 수득하는 단순한 방법으로서, 상업적으로 입수가능한 키트[예를 들면, SPOTs 키트(제노시스 바이오테크놀로지스(Genosys Biotechnologies)에 의해 제작됨), 멀티핀(multipin) 합성 방법을 이용하는 일련의 멀티핀/펩티드 합성 키트(키론(Chiron)에 의해 제작됨) 등]를 사용할 수 있다.
DR3의 세포외 도메인에 결합하는 본 발명의 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 전술된 결합 분석 시스템에서 수득된 항체의 에피토프를 확인하고; 확인된 에피토프의 부분적 합성 펩티드, 상기 에피토프의 3차원적 구조를 모방하는 3차원적 구조를 가진 합성 펩티드, 재조합 단백질 등을 제조하고; 면역화를 수행함으로써 수득될 수 있다.
예를 들면, 막 단백질의 경우, 전체 세포외 도메인 또는 세포외 도메인의 부분이 적절한 태그(플래그 태그, His-태그, GST 단백질, 항체의 Fc 영역 등)에 융합되어 있는 재조합 단백질을 제조하고 상기 재조합 단백질을 면역화시킴으로써, 에피토프 특이적 항체를 보다 더 효율적으로 제조할 수 있다.
2. 재조합 항체의 제조
재조합 항체의 제조 예로서, 인간 키메라 항체 및 인간화된 항체를 제조하는 방법이 이하에 제시되어 있다.
(1) 재조합 항체의 발현을 위한 벡터의 구축
재조합 항체의 발현을 위한 벡터는 인간 항체의 CH 및 CL/H 및 L 쇄를 코딩하는 DNA들이 삽입되어 있는 동물 세포용 발현 벡터이고, 인간 항체의 CH 및 CL/H 및 L 쇄를 코딩하는 DNA들 각각을 동물 세포용 발현 벡터 내로 클로닝함으로써 구축된다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL일 수 있다. 예로는 γ1, γ2 또는 γ4 서브클래스에 속하는 CH, κ 클래스에 속하는 CL 등이 있다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA들로서, cDNA가 일반적으로 사용될 수 있고, 엑손 및 인트론을 포함하는 염색체 DNA도 사용될 수 있다. 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자가 발현 벡터 내에 삽입될 수 있고 발현될 수 있는 한, 임의의 발현 벡터가 동물 세포용 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 예로는 pAGE107[Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274[Gene, 27, 223 (1984)], pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)], pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79 (1993)] 등이 있다. 동물 세포용 발현 벡터를 위해 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예로는 SV40 초기 프로모터[J. Biochem., 101, 1307 (1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], 면역글로불린 H 쇄 프로모터[Cell, 41, 479 (1985)] 및 인핸서[Cell, 33, 717 (1983)] 등이 있다.
재조합 항체의 발현용 벡터는 항체 H 쇄를 코딩하는 유전자 및 항체 L 쇄를 코딩하는 유전자가 별도의 벡터들 상에 존재하는 유형(별도 유형), 또는 상기 두 유전자들이 동일한 벡터 상에 존재하는 유형(직렬 유형)의 벡터일 수 있다. 재조합 항체의 발현을 위한 직렬 유형의 벡터의 예로는 pKANTEX93(국제 특허출원 공보 제WO 97/10354호), pEE18[하이브리도마, 17, 559 (1998)], Tol2 트랜스포존 벡터(국제 특허출원 공보 제WO 2010/143698호 및 제WO2013/005649호) 등이 있다. 이 벡터들은 벡터 내에 삽입되어 있는 H 또는 L 쇄를 코딩하는 각각의 유전자로 H 및 L 쇄를 하나씩 별도로 발현시키는 데에도 사용될 수 있다.
(2) 비-인간 동물로부터 유래된 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 수득 및 아미노산 서열의 분석
비-인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA들의 수득 및 아미노산 서열의 분석은 다음과 같이 수행된다.
비-인간 동물로부터 유래된 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성한다. 합성된 cDNA를 벡터, 예컨대, 파지 또는 플라스미드 내에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제조한다. 마우스 항체의 C 영역 또는 V 영역의 일부를 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 함유하는 각각의 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 상기 라이브러리로부터 단리한다. 관심있는 비-인간 동물로부터 유래된 마우스 항체의 VH 및 VL의 전장 뉴클레오티드 서열들을 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상에서 확인하고, VH 및 VL의 전장 아미노산 서열들을 상기 뉴클레오티드 서열들로부터 각각 유추한다.
비-인간 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 제조하기 위한 비-인간 동물의 예로는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등이 있다. 하이브리도마 세포가 동물로부터 생성될 수 있는 한, 임의의 동물이 사용될 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 제조하는 방법의 예로는 구아니딘 티오시아네이트-세슘 트리플루오로아세테이트 방법[Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], 키트, 예컨대, RNA 이지 키트(퀴아젠에 의해 제작됨)의 사용 등이 있다.
총 RNA로부터 mRNA를 제조하는 방법의 예로는 올리고(dT) 고정화된 셀룰로스 컬럼 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 키트, 예컨대, 올리고-dT30 <Super> mRNA 정제 키트(타카라 바이오(Takara Bio)에 의해 제작됨)를 사용하는 방법 등이 있다. 또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 제조하는 키트의 예로는 패스트 트랙(Fast Track) mRNA 단리 키트(인비트로겐에 의해 제작됨), 퀵 프렙(Quick Prep) mRNA 정제 키트(파마샤에 의해 제작됨) 등이 있다.
cDNA를 합성하고 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법의 예로는 공지된 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)]; 키트, 예컨대, cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 수퍼 스크립트 플라스미드 시스템(깁코 비알엘(GIBCO BRL)에 의해 제작됨), ZAP-cDNA 키트(스트라타진에 의해 제작됨) 등을 사용하는 방법 등이 있다.
cDNA가 삽입될 수 있는 한, 하이브리도마 세포로부터 추출된 mRNA를 주형으로서 사용함으로써 합성된 cDNA가 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 삽입되어 있는 벡터는 임의의 벡터일 수 있다. 예로는 ZAP 익스프레스(Express)[Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λzapII(스트라타진에 의해 제작됨), λgt10 및 λgt11[DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)], 람다 BlueMid(클론텍(Clontech)에 의해 제작됨), λExCell 및 pT7T3 18U(파마샤에 의해 제작됨), pcD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18[Gene, 33, 103 (1985)] 등이 있다.
cDNA 라이브러리가 도입될 수 있고 발현될 수 있고 유지될 수 있는 한, 파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축된 cDNA 라이브러리를 도입하기 위한 임의의 에스케리키아 콜라이가 사용될 수 있다. 예로는 XL1-Blue MRF'[Strategies, 5, 81 (1992)], C600[Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088 및 Y1090[Science, 222: 778 (1983)], NM522[J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802[J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], JM105[Gene, 38, 275 (1985)] 등이 있다.
동위원소-표지된 또는 형광-표지된 프로브를 사용하는 콜로니 혼성화 또는 플라크 혼성화 방법이 cDNA 라이브러리로부터 비-인간 항체 등의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA 클론을 선별하는 데에 이용될 수 있다[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
또한, 프라이머를 제조하고 mRNA로부터 제조된 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용함으로써 중합효소 연쇄 반응(이하, "PCR"로서 지칭됨; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997))을 통해 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 제조할 수 있다.
선별된 cDNA를 적절한 제한효소 등으로 절단하고 단편을 플라스미드, 예컨대, pBluescript SK(-)(스트라타진에 의해 제작됨) 내에 클로닝하고 통상적으로 이용되는 뉴클레오티드 분석 방법으로 반응을 수행함으로써 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다. 예를 들면, 반응, 예컨대, 디데옥시 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] 후 자동 뉴클레오티드 서열 분석기, 예컨대, ABI PRISM3700(피이 바이오시스템스(PE Biosystems)에 의해 제작됨) 및 A.L.F. DNA 시퀀서(파마샤에 의해 제작됨)를 이용함으로써 뉴클레오티드 분석을 수행한다.
확인된 뉴클레오티드 서열로부터 VH 및 VL의 전장 아미노산 서열을 추정하고 이를 공지된 항체의 VH 및 VL의 전장 아미노산 서열과 비교함으로써, 수득된 cDNA들이 분비 신호 서열을 함유하는 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 코딩하는지를 확인할 수 있다[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. 분비 신호 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 전장 아미노산 서열을 공지된 항체의 VH 및 VL의 전장 아미노산 서열과 비교함으로써 분비 신호 서열 및 N-말단 아미노산 서열의 길이를 유추할 수 있고[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], 이들이 속하는 하위군도 공지되어 있을 수 있다. 나아가, 수득된 아미노산 서열을 공지된 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열과 비교함으로써 VH 및 VL의 CDR들 각각의 아미노산 서열을 발견할 수 있다[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
뿐만 아니라, 예를 들면, BLAST 방법[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 등에 따라 VH 및 VL의 수득된 전장 아미노산 서열을 사용하여 임의의 데이터베이스, 예를 들면, SWISS-PROT, PIR-Protein 등에서 서열을 사용한 상동성 검색을 수행함으로써 VH 및 VL의 전장 아미노산 서열의 신규성을 조사할 수 있다.
(3) 인간 키메라 항체의 발현용 벡터의 구축
비-인간 동물의 항체의 VH 및 VL 각각을 코딩하는 cDNA를, 상기 (1)에서 언급된 재조합 항체의 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 유전자의 업스트림 내에 클로닝함으로써, 인간 키메라 항체의 발현용 벡터를 구축한다.
예를 들면, 비-인간 동물의 항체의 VH 또는 VL의 3'-말단의 뉴클레오티드 서열 및 인간 항체의 CH 또는 CL의 5'-말단의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA를 결찰시키기 위해, 비-인간 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 각각의 cDNA를, 연결 부분의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 적절한 아미노산을 코딩하도록 제조하고 제한효소의 적절한 인식 서열을 갖도록 디자인한다. 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 수득된 cDNA들 각각이 상기 (1)에서 언급된 인간화된 항체의 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 유전자의 업스트림에서 적절한 형태로 발현되도록 이들 cDNA들을 각각 클로닝함으로써 인간 키메라 항체의 발현용 벡터를 구축한다.
또한, 양 말단들에서 적절한 제한효소의 인식 서열을 가진 합성 DNA를 사용하여 PCR로 비-인간 동물 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 증폭하고 이들 각각을 상기 (1)에서 수득된 재조합 항체의 발현용 벡터 내에 클로닝한다. 나아가, 재조합 항체의 H 쇄 또는 L 쇄를 코딩하는 cDNA를 PCR로 합성하거나 증폭하고, 각각의 cDNA를 상기 (1)에서 수득된 재조합 항체의 발현용 벡터 내에 클로닝한다.
(4) 인간화된 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간화된 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA들을 다음과 같이 수득할 수 있다. 비-인간 동물 항체로부터 유래된 항체의 VH 또는 VL 내의 CDR들의 아미노산 서열이 이식되어 있는 인간 항체의 VH 또는 VL 내의 골격 영역(이하, "FR"로서 지칭됨)의 아미노산 서열을 각각 선택한다. FR의 아미노산 서열이 인간으로부터 유래되는 한, 인간 항체의 FR의 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다. 예로는 데이터베이스, 예컨대, 단백질 데이터 은행 등에 등록된 인간 항체의 FR들의 아미노산 서열들, 및 인간 항체의 FR들의 하위군들에 공통된 아미노산 서열[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] 등이 있다. 항체의 결합 활성에서의 감소를 억제하기 위해, 원래의 항체의 VH 또는 VL 내의 FR의 아미노산 서열과 높은 상동성(적어도 60% 이상)을 가진 아미노산 서열을 선택한다.
그 다음, 원래의 항체의 CDR들의 아미노산 서열들을 각각 인간 항체의 VH 또는 VL 내의 FR의 선택된 아미노산 서열에 이식하여 인간화된 항체의 VH 또는 VL의 각각의 아미노산 서열을 디자인한다. 항체의 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 발견된 코돈 사용의 빈도를 고려함으로써, 디자인된 아미노산 서열을 DNA 서열로 전환시키고[Kabat et al, Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], 인간화된 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 디자인한다. 디자인된 뉴클레오티드 서열을 기초로, VH 및 VL의 cDNA들을 합성하고, 적절한 제한효소의 인식 서열을 양 말단들 상에 존재하는 합성 DNA들의 5' 말단에 도입함으로써, 인간화된 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 (1)에서 구축된 인간화된 항체의 발현용 벡터 내에 용이하게 클로닝할 수 있다. 다른 방식으로, 이것은 디자인된 DNA 서열을 기초로 전장 H 쇄 및 전장 L 쇄 각각을 코딩하는 하나의 DNA로서 합성 DNA를 사용함으로써 수행될 수 있다.
(5) 인간화된 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 변형
비-인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 및 VL 내의 CDR들만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR들 내로 단순히 이식함으로써 인간화된 항체를 생성할 때, 그의 항원 결합 활성이 비-인간 동물로부터 유래된 원래의 항체의 항원 결합 활성보다 더 낮다는 것은 공지되어 있다[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. 인간화된 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL 내의 FR들의 아미노산 서열들 중에서 항원에의 결합과 직접적으로 관련된 아미노산 잔기, CDR 내의 아미노산 잔기와 상호작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 3차원적 구조를 유지하고 항원에의 결합과 간접적으로 관련된 아미노산 잔기를 확인하고 모 항체(원래의 항체)에서 발견되는 아미노산 잔기로 변형시킴으로써, 감소된 항원 결합 활성을 증가시킨다.
FR에서 항원 결합 활성과 관련되는 아미노산 잔기를 확인하기 위해, 항체의 3차원적 구조를 구축하고 X-선 결정학[J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)], 컴퓨터-모델링[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] 등으로 분석한다. 추가로, 다양한 시도들이 현재 필요한데, 예를 들면, 각각의 항체의 여러 변형된 항체들을 생성하고 변형된 항체들 각각과 그의 항체 결합 활성 사이의 상관관계를 조사한다. (4)에 기재된 바와 같이 PCR에 따라 변형을 위한 다양한 합성 DNA를 사용하여 인간 항체의 VH 및 VL 내의 FR의 아미노산 서열의 변형을 달성할 수 있다. PCR에 의해 수득된 증폭된 생성물의 경우, 목적 변형이 수행되었는지를 확인하기 위해 (2)에 기재된 방법에 따라 뉴클레오티드 서열을 확인한다.
(6) 인간화된 항체의 발현용 벡터의 구축
구축된 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 각각의 cDNA를 (1)에 기재된 재조합 항체의 발현용 벡터 내의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 업스트림 내에 클로닝함으로써 인간화된 항체의 발현용 벡터를 구축할 수 있다. 추가로, 이러한 벡터는 인간화된 항체의 H 쇄 및 L 쇄를 코딩하는 cDNA를 적절한 벡터 내에 클로닝함으로써 구축될 수도 있다. 예를 들면, 적절한 제한효소의 인식 서열이 (4) 및 (5)에서 인간화된 항체의 VH 또는 VL의 구축에 사용된 합성 DNA들 중에서 양 말단들에 위치하는 합성 DNA들의 5'-말단에 도입되어 있을 때, 이들이 (1)에 기재된 인간화된 항체의 발현용 벡터 내의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 업스트림에서 적절한 형태로 발현되도록 클로닝을 수행할 수 있다.
(7) 재조합 항체의 일시적 발현
생성된 다양한 인간화된 항체들의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가하기 위해, (3) 및 (6)에 기재된 인간화된 항체의 발현용 벡터 또는 이의 변형된 발현 벡터를 사용하여 재조합 항체를 일시적으로 발현시킬 수 있다. 숙주 세포가 재조합 항체를 발현할 수 있는 한, 임의의 세포를 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 일반적으로, COS-7 세포(ATCC CRL1651), CHO-K1(ATCC CCL-61) 또는 CHO-S(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 카탈로그 번호 11619)를 그의 높은 발현 양을 고려하여 사용한다[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)]. 발현 벡터의 도입 후, 배양 상청액에서의 재조합 항체의 발현 양 및 항원 결합 활성을 ELISA, RIA, FCM 등으로 측정할 수 있다.
(8) 재조합 항체를 안정하게 발현하는 형질전환체의 수득 및 재조합 항체의 제조
(3) 또는 (6)에 기재된 재조합 항체의 발현용 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입함으로써 재조합 항체를 안정하게 발현하는 형질전환체를 수득할 수 있다. 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 방법의 예로는 전기천공[일본 미심사 특허출원 공보 제257891/90호, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 등이 있다. 세포가 재조합 항체를 생성할 수 있는 숙주 세포인 한, 임의의 세포를 재조합 항체의 발현용 벡터가 도입되는 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 예로는 CHO-K1(ATCC CCL-61), DUkXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 11619), 래트 골수종 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(YB2/0으로서도 지칭됨), 마우스 골수종 세포 NSO, 마우스 골수종 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호 CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC 번호 CRL1580), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(이하, "dhfr"로서 지칭됨)가 결핍되어 있는 CHO 세포[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)], 렉션(lection) 내성-획득된 Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)], α1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자가 결핍되어 있는 CHO 세포(국제 특허출원 공보 제WO 02/31140호 및 제WO 2005/35586호), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC 번호 CRL1662) 등이 있다.
이의 구체적인 예로는 PER.C6, CHO-K1(ATCC CCL-61), DUKXB11(ATCC CCL-9096), Pro-5(ATCC CCL-1781), CHO-S(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 11619), Lec13 세포, 래트 골수종 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC 번호 CRL1662, 또는 YB2/0로서도 지칭됨), 마우스 골수종 세포 NS0, 마우스 골수종 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호 CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC 번호 CRL1580), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(이하, dhfr로서 지칭됨)-결핍 CHO 세포(CHO/DG44)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], 시리아 햄스터 세포 BHK, HBT563 세포, 상기 세포주들의 하위균주, 및 무혈청 배지에서 또는 비-부착 배양 조건 하에서 상기 세포주들을 적응시킴으로써 제조된 세포 등이 있을 수 있다.
추가로, 세포내 당 뉴클레오티드인 GDP-푸코스의 합성과 관련된 효소와 같은 단백질, 푸코스의 1-위치가 복합체 유형의 N-글리코사이드-연결된 당쇄에서 α-결합을 통해 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민의 6-위치에 결합되는 당쇄의 변형과 관련된 효소와 같은 단백질, 또는 세포내 당 뉴클레오티드인 GDP-푸코스를 골지체(Golgi body)로 운반하는 것과 관련된 단백질의 활성이 도입되어 있거나, 감소되어 있거나 결실되어 있는 숙주 세포, 바람직하게는 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자가 국제 특허출원 공보 제WO05/35586호 및 제WO02/31140호에 기재된 바와 같이 결핍되어 있는 CHO 세포도 사용될 수 있다.
발현 벡터의 도입 후, G418 설페이트(이하, "G418"로서 지칭됨), 사이클로헥스이미드(이하, CHX로서 지칭됨) 등과 같은 물질을 함유하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 재조합 항체를 안정하게 발현하는 형질전환체를 선별한다.
동물 세포 배양용 배지의 예로는 RPMI1640 배지(인비트로겐에 의해 제작됨), GIT 배지(니혼 파마슈티칼(Nihon Pharmaceutical)에 의해 제작됨), EX-CELL301 배지, EX-302 배지, EX-325PF(JRH에 의해 제작됨), IMDM 배지(인비트로겐에 의해 제작됨), 하이브리도마-SFM 배지(인비트로겐에 의해 제작됨), 다양한 첨가제들, 예컨대, 태아 소 혈청(이하, "FCS"로서 지칭됨)을 이 배지들에 첨가함으로써 수득된 배지 등이 있다. 선별된 형질전환체를 배지에서 배양함으로써 재조합 항체를 배양 상청액에서 생성할 수 있고 축적할 수 있다. 배양 상청액에서의 재조합 항체의 발현 양 및 항원 결합 활성을 ELISA 등으로 측정할 수 있다. 또한, 형질전환체에서, 일본 미심사 특허출원 공보 제257891/90호에 개시된 방법에 따라 DHFR 증폭 시스템 등을 사용하여 재조합 항체의 발현 양을 증가시킬 수 있다.
단백질 A 컬럼을 사용하여 형질전환체의 배양 상청액으로부터 재조합 항체를 정제할 수 있다[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. 예를 들면, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 한외여과, 단백질 G 컬럼 등을 병용하여 재조합 항체를 정제할 수 있다. 전체로서 정제된 재조합 항체 또는 항체 분자의 H 쇄 또는 L 쇄의 분자량을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(이하, "SDS-PAGE"로서 지칭됨)[Nature, 227, 680 (1970)], 웨스턴 블롯팅[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 등으로 측정한다.
3. 정제된 단일클론 항체 또는 이의 항체 단편의 활성의 평가
본 발명의 정제된 단일클론 항체 또는 이의 항체 단편의 활성을 하기 방식으로 평가할 수 있다. 상기 단락 1의 (6) 및 (7)에 기재된 결합 분석 시스템을 이용하여 DR3 발현 세포주에 대한 결합 활성을 측정할 수 있다. 공지된 측정 방법으로 항원 양성 세포주에 대한 CDC 활성 또는 ADCC 활성을 측정할 수 있다[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
본 발명의 항체에 의한 특이적 리간드 TL1A 의존적 인산화, DR3 또는 NF-κB 신호의 활성화 및 TL1A 중화 활성을 하기 방식으로 측정할 수 있다. DR3 발현 세포 또는 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)를 RPMI1640(FCS 무함유)과 같은 전형적인 배지에서 하위배양하고 DR3 및 NF-κB 인산화 분석을 위해 안정화시킨다. 세포를 37℃에서 수십분 동안 항-DR3 항체의 존재 또는 부재 하에서 수 ng/㎖ 내지 ㎍/㎖의 TL1A와 함께 항온처리한 후, 세포를 용해시키고 침투가능하게 만든다. 그 후, 세포를 인산화된 DR3 및 NF-κB에 대한 웨스턴 블롯팅으로 DR3 및/또는 NF-κB의 인산화 수준에서 분석한다. 그 후, 세포의 추출물을 준비하고, 항-DR3 특이적 항체, 항-NF-κB 특이적 항체 및 하우스 킵핑 유전자(액틴 등) 특이적 항체를 사용하여 각각의 단백질을 면역침전시킨다. 침전된 단백질에 대해 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행한 후, DR3 특이적 항체 및 인산화된 티로신 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써, DR3의 인산화에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다.
대안적으로, 항체가 첨가되어 있는 배양된 세포에 대해 포름알데하이드 및 사포닌을 사용하여 단백질 고정 및 세포막 침투 처리를 수행하고, DR3 특이적 항체, 인산화된 NF-κB 특이적 항체 또는 인산화된 티로신 특이적 항체를 사용하여 FCM 분석을 수행한다. DR3의 인산화도 이 방식으로도 확인할 수 있다. 추가로, DR3의 삼량체화의 경우, 전술된 인산화 검출 시험에서와 동일한 방식으로 배양 및 세포 용해물의 준비를 수행한 후, 침전된 단백질을 검출하기 위해 항-DR3 항체를 사용하여 DR3 단백질을 면역침전시킴으로써, DR3의 삼량체화를 검출할 수 있다.
나아가, TL1A 의존적 T 세포 증식, IL-13, GM-CSF 및 IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인의 방출 등도 동일한 방식으로 분석한다.
4. 본 발명의 항-DR3 단일클론 항체 또는 이의 항체 단편을 사용하여 질환을 치료하는 방법
DR3의 천연 입체형상적 구조(3차원적 구조)를 특이적으로 인식하고 세포외 영역에 결합하는 본 발명의 항체 또는 이의 항체 단편은 DR3과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 본원에 기재된 질환, 장애 또는 증상을 치료하거나, 호전시키거나 예방하는 데에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, DR3의 세포외 도메인에 결합하고 DR3의 활성을 중화시키고 그 자신의 결합으로 DR3을 활성화시키지 않는 본 발명의 항체는 염증성 질환, 자가면역 질환, 암 질환 및 이 질환들과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나 호전시키는 데에 사용된다.
바람직한 실시양태에서, DR3의 세포외 영역에 결합하는 본 발명의 항체, 또는 이의 항체 변이체 또는 단편은 크론병(CD), 궤양성 결장염(UC), 염증성 장 질환(IBD), 알레르기, 급성 또는 만성 반응성 기도 질환, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 아토피성 질환, 아토피성 천식, 아토피성 피부염, 기관지 천식, 호산구 침습성 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 관절염, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 건선, 죽상동맥경화증, 골다공증, 다발성 경화증(MS), 암 골 전이, 혈액암, 고형암, 예컨대, 두경부암, 뇌암, 폐암, 식도암, 위장암, 위암, 장암, 대장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 요도암, 간암, 담낭암, 골암 및 암의 전이를 비롯한 염증성 질환들을 치료하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 조성물에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환은 하기 질환들로부터 선택된 하나 이상의 질환을 포함한다: 다발성 경화증, 류마티스성 관절염(RA), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 신생아 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소자색반(ITP), 자가면역세포감소증, 용혈성 빈혈, 항인지질 증후군, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 심근염, 재발성 다발연골염, 류마티스성 심장 질환, 신경염, 포도막염 안염, 다발내분비병증, 자색반(예를 들면, 헤노흐-쇤라인(Henloch-Scoenlein) 자색반), 레이터병, 강직 증후군, 자가면역 폐 염증, 자폐증, 귈랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM), 및 자가면역 염증성 눈 장애, 자가면역 갑상선염, 갑상선기능저하증(즉, 하시모토 갑상선염), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 굿파스처 증후군, 천포창, 수용체 자가면역, 예컨대, (a) 그레이브스병, (b) 중증근무력증 및 (c) 인슐린 내성, 자가면역 혈소판감소자색반, 류마티스성 관절염, 항-콜라겐 항체를 가진 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 다발근염/피부근염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨병, 불임, 만성 신부전(CRF), 사구체신염(GN), 신장증, IgA 신장병증, 물집유사천포창, 쇼그렌 증후군, 아드레날린성 약물 내성(천식 또는 낭성 섬유증), 만성 활성 간염, 원발성 담관간경화증, 다른 내분비선 부전, 백반증, 혈관염, 포스트-MI, 심장절개 증후군, 두드러기, 아토피성 피부염, 염증성 근병증, 및 다른 염증성, 육아종성, 퇴행성 및 위축성 질환. 상기 확인된 질환들과 관련된 임의의 합병증도 본 발명의 약제에 의해 치료될 수 있는 증상에 포함된다.
투여 경로의 예로는 경구 투여 및 비경구 투여, 예컨대, 협측, 기관, 직장, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여가 있다. 항체 또는 펩티드 제제의 경우, 정맥내 투여가 바람직하다. 제형의 예로는 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽, 에멀전(emulsion), 좌제, 주사제, 연고, 테이프 등이 있다.
경구 투여에 적합한 약학 제제는 에멀전, 시럽, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 포함한다. 물; 당, 예컨대, 수크로스, 소르비톨 및 프럭토스; 글리콜, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 오일, 예컨대, 참깨유, 올리브유 및 대두유; 방부제, 예컨대, p-하이드록시벤조산 에스테르; 향미료, 예컨대, 딸기 향미료 및 페퍼민트 등을 첨가제로서 사용하여 액체 제제, 예컨대, 에멀전 및 시럽을 제조할 수 있다. 부형제, 예컨대, 락토스, 글루코스, 수크로스 및 만니톨; 붕해제, 예컨대, 전분 및 알긴산나트륨; 윤활제, 예컨대, 스테아르산마그네슘 및 탈크; 결합제, 예컨대, 폴리비닐 알코올, 하이드록시프로필셀룰로스 및 젤라틴; 계면활성제, 예컨대, 지방산 에스테르; 가소제, 예컨대, 글리세린 등을 첨가제로서 사용하여 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 제조할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 약학 제제는 주사제, 좌제, 분무제 등을 포함한다. 담체, 예컨대, 염 용액, 글루코스 용액 또는 이들 둘 다의 혼합물을 사용하여 주사제를 제조할 수 있다. 담체, 예컨대, 카카오 버터, 수소첨가된 지방 또는 카복실산을 사용하여 좌제를 제조할 수 있다. 항체 또는 항체 단편을 그 자체로 사용하거나, 환자의 협측 또는 기도 점막을 자극하지 않고 화합물을 미세한 입자로서 분배함으로써 화합물의 흡수를 용이하게 할 수 있는 담체와 함께 항체 또는 항체 단편을 사용하여 분무제를 제조할 수 있다. 담체는 락토스, 글리세롤 등을 포함한다. 약학 제제, 예컨대, 에어로졸 및 건조 산제를 제조할 수 있다. 추가로, 경구 제제용 첨가제로서 예시된 성분들도 비경구 제제에 첨가될 수 있다.
5. 본 발명의 항-DR3 단일클론 항체 또는 항체 단편을 사용하여 질환을 진단하는 방법
본 발명의 단일클론 항체 또는 항체 단편을 사용하여 DR3 또는 DR3을 발현하는 세포를 검출하거나 측정함으로써 DR3과 관련된 질환을 진단할 수 있다. 예를 들면, 다음과 같이 DR3을 검출하거나 측정함으로써 DR3과 관련된 질환들 중 하나인 염증성 질환의 진단을 수행할 수 있다.
면역학적 방법, 예컨대, 유세포분석기(FCM)로 환자의 체내 세포 상에서 발현되는 DR3을 검출함으로써 염증성 질환의 진단을 수행할 수 있다. 면역학적 방법은 표지된 항원 또는 항체를 사용하여 항체 양 또는 항원 양을 검출하거나 측정하는 방법이다. 면역학적 방법의 예로는 방사성 물질-표지된 면역항체 방법, 효소 면역분석, 형광 면역분석, 발광 면역분석, 웨스턴 블롯팅 방법, 물리화학적 수단 등이 있다.
방사성 물질-표지된 면역항체 방법의 예로는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 항원, 항원을 발현하는 세포 등과 반응시킨 후, 방사성 표지부착으로 처리된 항-면역글로불린 항체 또는 이의 결합 단편과 반응시키고, 이어서 신틸레이션 카운터(scintillation counter) 등을 이용하여 측정하는 방법이 있다.
효소 면역분석의 예로는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 항원, 항원을 발현하는 세포 등과 반응시킨 후, 항체 표지부착으로 처리된 항-면역글로불린 항체 또는 이의 결합 단편과 반응시키고 착색된 색소를 분광광도계로 측정하는 방법이 있고, 예를 들면, 샌드위치 ELISA가 이용될 수 있다. 임의의 공지된 효소 표지(Enzyme Immunoassay, published by Igaku Shoin, 1987)가 이미 기재된 바와 같이 효소 면역분석에서 사용되는 표지로서 사용될 수 있다. 예로는 알칼리성 포스파타제 표지부착, 퍼록시다제 표지부착, 루시퍼라제 표지부착, 바이오틴 표지부착 등이 있다.
샌드위치 ELISA는 항체를 고체상에 결합시키고 검출되거나 측정되는 항원을 포획하고 또 다른 항체를 포획된 항원과 반응시키는 방법이다. ELISA에서, 검출되거나 측정되는 항원을 인식하는 2종의 항체들, 또는 항원 인식 부위가 상이한 이의 항체 단편들을 제조하고, 제1 항체 또는 항체 단편을 플레이트(예컨대, 96-웰 플레이트) 상에 미리 흡착시키고, 제2 항체 또는 항체 단편을 형광 물질, 예컨대, FITC, 효소, 예컨대, 퍼록시다제 또는 바이오틴으로 표지한다.
상기 항체가 흡착되어 있는 플레이트를 생체 또는 이의 파괴된 세포 현탁액, 조직 또는 이의 붕해된 용액, 배양된 세포, 혈청, 흉수, 복수, 안액 등으로부터 분리된 세포와 반응시킨 후, 표지된 단일클론 항체 또는 항체 단편과 반응시키고 표지된 물질에 상응하는 검출 반응을 수행한다. 시험될 샘플 중의 항원 농도를 공지된 농도의 항원의 단계적 희석에 의해 작성된 보정 곡선으로부터 계산할 수 있다. 샌드위치 ELISA를 위해 사용되는 항체로서, 임의의 다중클론 항체 및 단일클론 항체가 사용될 수 있거나 항체 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab)2가 사용될 수 있다. 샌드위치 ELISA에서 사용되는 2종의 항체들의 조합물로서, 상이한 에피토프들을 인식하는 단일클론 항체들 또는 항체 단편들의 조합물이 사용될 수 있거나 다중클론 항체와 단일클론 항체 또는 항체 단편의 조합물이 사용될 수 있다.
형광 면역분석은 문헌[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third Edition, Academic Press (1996); Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific (1987)]에 기재된 방법 등을 포함한다. 임의의 공지된 형광 표지[Fluorescent Immunoassay, by Akira Kawao, Soft Science, (1983)]가 이미 기재된 바와 같이 형광 면역분석용 표지로서 사용될 수 있다. 상기 표지의 예로는 FITC, RITC 등이 있다.
문헌[Bioluminescence and Chemical Luminescence, Rinsho Kensa, 42, Hirokawa Shoten (1998)]에 기재된 방법 등을 이용하여 발광 면역분석을 수행할 수 있다. 임의의 공지된 발광 표지가 발광 면역분석을 위해 사용되는 표지로서 포함될 수 있다. 예로는 아크리디늄(acridinium) 에스테르, 로핀(lophine) 등이 있다.
웨스턴 블롯팅은 항원 또는 항원을 발현하는 세포를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)]으로 분획화하고 겔을 PVDF 막 또는 니트로셀룰로스 막 상에 블롯팅하고 상기 막을 항원 인식 항체 또는 항체 단편과 반응시키고 형광 물질, 예컨대, FITC, 효소 표지, 예컨대, 퍼록시다제, 바이오틴 표지 등으로 표지된 항-마우스 IgG 항체 또는 항체 단편과 추가로 반응시키고, 표지를 가시화하여 반응을 확인하는 방법이다. 이의 예는 이하에 기재되어 있다.
서열번호 2로 표시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드가 발현되는 세포 또는 조직을 용액에 용해시키고, 환원 조건 하에서 레인당 단백질 양으로서 0.1 내지 30 ㎍을 SDS-PAGE 방법으로 전기영동한다. 전기영동된 단백질을 PVDF 막으로 옮기고 차단을 위해 30분 동안 실온에서 1% 내지 10%의 BSA를 함유하는 PBS(이하, "BSA-PBS"로서 지칭됨)와 반응시킨다. 이때, 본 발명의 단일클론 항체를 상기 단백질과 반응시키고 0.05% 내지 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS(이하, "트윈-PBS"로서 지칭됨)로 세척하고 2시간 동안 실온에서 퍼록시다제로 표지된 염소 항-마우스 IgG와 반응시킨다.
이것을 트윈-PBS로 세척하고 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(아머샴(Amersham)에 의해 제작됨) 등을 사용하여 단일클론 항체가 결합되어 있는 밴드를 검출함으로써, 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 검출한다. 천연 유형의 3차원적 구조를 갖지 않는 폴리펩티드에 결합될 수 있는 항체가 웨스턴 블롯팅에서 검출을 위해 사용되는 항체로서 사용된다.
항원으로서의 DR3을 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 반응시켜 응집체를 형성하고 이 응집체를 검출함으로써 물리화학적 방법을 구체적으로 수행한다. 물리화학적 방법의 다른 예로는 모세관 방법, 1차원적 면역확산 방법, 면역혼탁도측정, 라텍스 면역혼탁도측정[Handbook of Clinical Test Methods, Kanehara Shuppan, (1988)] 등이 있다. 예를 들면, 라텍스 면역확산 방법에서, 담체, 예컨대, 항체 또는 항원에 의해 감작된 약 0.1 내지 1 ㎛의 입자 크기를 가진 폴리스티렌 라텍스가 사용될 수 있고, 상응하는 항원 또는 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 수행할 때, 반응 용액에서 산란된 광은 증가되는 반면, 투과된 광은 감소된다. 이러한 변화가 흡광도 또는 완전체 구 혼탁도로서 검출될 때, 시험될 샘플에서 항원 농도 등을 측정할 수 있다.
DR3을 발현하는 세포의 검출을 위해, 공지된 면역학적 검출 방법이 이용될 수 있고, 바람직하게는 면역침전 방법, 면역 세포 염색 방법, 면역 조직 염색 방법, 형광 항체 염색 방법 등이 이용된다.
면역침전 방법은 DR3을 발현하는 세포를 본 발명의 단일클론 항체 또는 항체 단편과 반응시킨 후, 항원-항체 복합체가 침전되도록 면역글로불린, 예컨대, 단백질 G-세파로스에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 담체를 첨가하는 방법이다. 또한, 하기 방법도 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 항체 또는 항체 단편을 ELISA용 96-웰 플레이트 상에 고체상으로서 흡착시킨 후 BSA-PBS로 차단한다. 상기 항체가 정제되지 않은 상태, 예컨대, 하이브리도마 세포의 배양 상청액 상태로 존재할 때, 항-마우스 면역글로불린 또는 래트 면역글로불린 또는 단백질 A 또는 단백질 G 등을 ELISA용 96-웰 플레이트 상에 미리 흡착시키고 BSA-PBS로 차단하고, 결합을 위해 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 상기 플레이트에 분배한다. BSA-PBS를 따라 버리고 잔류물을 PBS로 충분히 세척한 후, DR3을 발현하는 세포 또는 조직의 용해된 용액을 사용하여 반응을 수행한다. SDS-PAGE용 샘플 완충제를 사용하여 면역 침전물을 웰-세척된 플레이트로부터 추출하고 전술된 웨스턴 블롯팅으로 검출한다.
면역 세포 염색 방법 및 면역 조직 염색 방법은 항원이 발현되는 세포 또는 조직을 필요하다면 계면활성제, 메탄올 등으로 처리하여 항체가 상기 세포 또는 조직을 용이하게 침투하게 만든 후, 본 발명의 단일클론 항체를 상기 세포 또는 조직과 반응시킨 다음, 형광 표지, 예컨대, FITC, 효소 표지, 예컨대, 퍼록시다제 또는 바이오틴 표지로 처리된 항-면역글로불린 항체 또는 이의 결합 단편과 추가로 반응시키고, 표지를 가시화하고 현미경 하에서 관찰하는 방법이다.
또한, 세포 또는 조직은 세포를 형광-표지된 항체와 반응시키고 유세포분석기[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third Edition, Academic Press (1996), Manual for Experiments of Monoclonal Antibodies, Kodansha Scientific (1987)]로 분석하는 면역형광 염색 방법에 의해 검출될 수 있다. 구체적으로, DR3의 세포외 영역에 결합하는 본 발명의 단일클론 항체 또는 항체 단편은 천연 유형의 3차원적 구조를 유지하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 검출할 수 있다.
추가로, 형광 항체 염색 방법들 중에서 FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)에 의해 제작됨) 등을 이용하는 경우, 형성된 항체-항원 복합체와 항체-항원 복합체의 형성에 관여하지 않는 유리 항체 또는 항원을 분리하지 않고 항원 양 또는 항체 양을 측정할 수 있다.
본 발명은 실시예에 의해 이하에 기재되어 있으나, 본 발명은 하기 실시예로 한정되지 않는다.
실시예
실시예 1 벡터 구축
이하, 항체 또는 항체 단편의 아미노산 잔기의 번호는 EU 넘버링 시스템[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]에 의해 정의된다.
(1) 가용성 인간 플래그-TL1A(EC)를 위한 발현 벡터
인간 TL1A의 세포외 도메인(EC)(서열번호 2)의 아미노 말단에 융합된 플래그® 태그(DYKDDDDK의 아미노산 서열, 이하, 경우에 따라 단지 "플래그"로서 기재됨)로 구성된 재조합 가용성 인간 TL1A 단백질(TNFSF15)(수탁번호 NM_005118.2의 아미노산 잔기 71 내지 251)을 후술된 바와 같이 생성하였다. "중첩 중합효소 연쇄 반응(PCR)" 방법을 이용하여, 키메라 cDNA 단편을 포유동물 발현 벡터 내에 삽입하는 데에 후속적으로 사용되는 플랭킹 제한 부위를 추가하면서 hTL1A(EC)에 융합된 VCAM 신호 펩티드 및 플래그® 태그 서열(서열번호 1)을 코딩하는 cDNA를 생성하였다.
인간 TL1A를 코딩하는 cDNA를 인간 림프종 U-937 세포주(ATCC CRL-1593.2)로부터 단리하였다. 이를 위해, RNeasy® 미니 키트(퀴아젠, 카탈로그 번호 74104)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 U-937 세포로부터 총 RNA를 단리하였다. VILO cDNA 합성 키트(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 11754-050)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 역전사효소(RT) 반응으로 총 cDNA를 생성하였다. KOD 핫 스타트(Hot Start) DNA 중합효소 키트(노바겐(Novagen)/토요보(Toyobo), 카탈로그 번호 71086-3)와 함께 하기 프라이머들을 제조자의 지시에 따라 사용하여 인간 TL1A cDNA를 PCR로 증폭하였다: hTL1A_F(서열번호 41) 및 hTL1A-3'_R(서열번호 42).
포유동물 세포로부터 단백질을 분비시키기 위해, 인간 혈관 세포 부착 분자 1(VCAM-1)로부터의 신호 펩티드에 바로 이어진 플래그 서열을 "중첩 PCR"로 hTL1A의 5' 말단에 도입하였다. 5' 말단에서 추가된 SalI 제한 부위 및 3' 말단에서 추가된 hTL1A를 코딩하는 13개의 뉴클레오티드들을 가진 VCAM-플래그를 코딩하는 PCR 단편을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(각각 VCAM-플래그-SalI-F(서열번호 43) 및 VCAM-플래그_hTL1A_R(서열번호 46))로 생성하였다. 3' 말단에서 추가된 플래그-태그의 말단과 동일한 13개의 뉴클레오티드들, 및 3' 말단에서 나중에 추가된 BamHI 부위를 가진 hTL1A(수탁번호 NM_005118.2)의 아미노산 잔기 71 내지 251을 코딩하는 제2 PCR 단편을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(각각 VCAM-플래그®_hTL1A_F(서열번호 45) 및 hTL1A-EC_BamHI-R(서열번호 44))로 생성하였다.
2개의 상기 PCR 생성물들을 단리하고 제1 PCR 반응의 정방향 프라이머(VCAM-플래그-SalI-F(서열번호 43)) 및 제2 반응의 역방향 프라이머(hTL1A-EC_BamHI-R(서열번호 44))를 사용하는 제3 PCR 반응에 첨가하여, VCAM-플래그-hTL1A 단백질(서열번호 2)을 코딩하는 전장 cDNA를 생성하였다. DNA 리가제(Ligase) 마이티 믹스(Mighty Mix)(타카라(Takara), 카탈로그 번호 6023)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 이 PCR 단편을 pKTABEX-TC26 발현 벡터(국제 특허출원 공보 제WO2013/005649호)의 SalI 및 BamHI 제한 부위에 클로닝하였다. DNA 서열을 생거(Sanger) 서열결정(진위즈(GENEWIZ), 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 확인하였다. VCAM-플래그-hTL1A 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터를 구축하였다.
(2) 가용성 인간 DR3(EC)-hG1Fc를 위한 발현 벡터
인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 DR3의 아미노 말단(N-말단) 세포외(EC) 도메인(TNFRSF25)(NM_003790.2)으로 구성된 가용성 키메라 Fc-융합 단백질을 생성하였다. 인간 DR3의 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA를 인간 TL1A에 대해 전술된 바와 같이 U-937 세포로부터 단리하였고, 프라이머 hDR3_F5'(서열번호 47) 및 hDR3-EC_R(서열번호 48)을 사용하여 DR3(EC)-hG1Fc 단백질을 코딩하는 cDNA를 상기 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 중첩 PCR로 생성하였다.
(전술된) 주형으로서의 cDNA, 정방향 프라이머 hDR3-SalI_F(서열번호 49) 및 역방향 프라이머 hDR3_hG1Fc_R(서열번호 60)을 사용하여 hDR3-EC를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 4의 아미노산 잔기 1 내지 201을 코딩하는 서열번호 3의 1 내지 603)을 PCR로 증폭하였다. SalI 제한 부위 및 인간 IgG1 Fc의 5' 말단을 위한 다수의 뉴클레오티드들을 hDR3의 각각 5' 말단 및 3' 말단에 도입한다. 각각 hDR3_hG1Fc_F(서열번호 51) 및 hG1Fc_BamHI-R(서열번호 42)을 사용하여 hDR3(EC)의 3' 말단과 상동성을 가진 5' 뉴클레오티드들 및 3' BamHI 제한 부위를 추가하면서 아미노산 잔기 216 내지 447(EU 넘버링, Kabat et al)(서열번호 5 및 6)을 코딩하는 인간 IgG1 Fc에 대한 cDNA를 전술된 바와 같이 PCR로 증폭하였다. 조합된 hDR3(EC)의 PCR 생성물과 인간 IgG1 Fc를 주형으로서 사용하고 정방향 프라이머 hDR3-SalI_F(서열번호 49) 및 역방향 프라이머 hG1Fc_BamHI-R(서열번호 52)을 사용하여 제3 PCR 반응에서 완전한 hDR3(EC)-hG1Fc cDNA를 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 pKTABEX-TC26의 SalI 및 BamHI 제한 부위 내에 클로닝하였고, DR3(EC)-hG1Fc 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터를 생성하였다.
(3) 가용성 인간 DR3(CRD1)-마우스 G1Fc를 위한 발현 벡터
개재하는 짧은 폴리글리신 링커 펩티드(아미노산 서열 ASGGGSGGGSGGGS)(서열번호 8)를 통해 마우스 IgG1 Fc 도메인에 융합된, 인간 DR3의 "시스테인-풍부 도메인(CRD) 1"(서열번호 8의 아미노산 잔기 1 내지 71, 신호 펩티드를 포함하는 전체 융합-단백질 서열)을 함유하는 인간 DR3의 보다 짧은 N-말단 영역으로 구성된 가용성 키메라 Fc-융합 단백질을 생성하였다. 전술된 방법과 유사한 "중첩 PCR" 방법을 이용하였다.
각각 5' SalI 부위 및 플랭킹 3' 폴리글리신 cDNA를 추가하는 정방향 프라이머 hDR3-SalI_F(서열번호 49) 및 역방향 프라이머 hDR3-pG-NheI_R(서열번호 53)을 사용하여 전술된 바와 같이 U-937 세포로부터 단리된 cDNA로부터 인간 DR3의 신호 펩티드 및 CRD1(서열번호 8의 아미노산 1 내지 71을 코딩하는 서열번호 7의 1 내지 213의 뉴클레오티드 서열)을 PCR로 증폭하였다. 각각 플랭킹 5' 폴리글리신 cDNA 및 3' BamHI 부위를 추가하는 정방향 프라이머 mG1Fc-pG-NheI_F(서열번호 54) 및 역방향 프라이머 mG1Fc_BamHI-R(서열번호 55)을 사용하여 마우스 IgG1 Fc 단편(서열번호 7의 256 내지 936의 뉴클레오티드 서열)을 증폭하였다. 프라이머 hDR3-SalI_F(서열번호 49) 및 mG1Fc_BamHI-R(서열번호 55)을 사용하여 전술된 바와 같이 제3 PCR에서 hDR3(CRD1)과 mG1Fc cDNA들을 융합시켰다. 전술된 바와 같이 PCR 단편을 pKTABEX-TC26의 SalI 및 BamHI 제한 부위에 클로닝하고 서열결정(진위즈, 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 확인하였다.
(4) 표면-결합된 인간 또는 마우스 DR3 ΔDD를 발현하기 위한 벡터
세포질 "사멸 도메인"의 대부분을 결여하는 인간 또는 마우스 DR3 단백질의 세포 표면 발현을 위해 벡터를 구축하였다. 인간 DR3의 세포질 도메인의 막-원위 카복실-말단(C-말단) 영역 내에서 아미노산 잔기 346 내지 417(Migone et al., Immunity, 2002; 16: 479-492) 또는 332 내지 412(Wang et al., Immunogenetics, 2001, 3553:59-63)로서 다양하게 정의되는 "사멸 도메인"은 TNFR1, Fas, DR4, DR5, 및 DR6을 비롯한 다른 TNFR 수퍼패밀리 구성원들과 공통되고, DR3이 외생적으로 과다발현될 때 이 단백질들의 관찰된 세포독성의 원인이 되는 것으로 밝혀져 있다. 정방향 프라이머 hDR3-SalI_F(서열번호 49), 역방향 프라이머 hDR3ΔDD_BamHI_R(서열번호 56) 및 주형으로서 미리 제조된 DR3(EC)의 cDNA를 사용하여 이 사멸 도메인-결실된 인간 DR3, 즉 hDR3ΔDD(서열번호 10의 아미노산 잔기 1 내지 345를 코딩하는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열)를 PCR로 증폭하였다. PCR 생성물을 사이클로헥스이미드(CHX) 내성 유전자가 네오마이신 내성 유전자(NEO)로 교체되어 있는 pKTABEX-TC26 벡터 내에 삽입하였고, hDR3-ΔDD 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터를 생성하였다.
나아가, DD를 결여하는 마우스 DR3 단백질을 위해, 프라이머 mDR3_Fwd(서열번호 57) 및 mDR3_3'_R(서열번호 58)을 사용하여 C57/BL6 마우스의 비장으로부터 마우스 DR3의 cDNA를 제조하였고, 정방향 프라이머 mDR3-SalI_F(서열번호 59), 역방향 프라이머 mDR3(1-324)_BamHI_R(서열번호 60) 및 주형으로서 mDR3 cDNA를 사용하여 PCR로 mDR3-ΔDD 단백질을 코딩하는 cDNA를 제조하였다. 최종적으로, mDR3-ΔDD 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터를 이전 방법과 동일한 방법으로 생성하였다.
실시예 2 안정한 세포주 생성
(1) 표면 인간 DR3ΔDD를 발현하는 안정한 마우스 EL4 세포주
발현 벡터를 모 림프종 세포주 EL4(ATCC, 카탈로그 번호 TIB-39) 내로 도입함으로써 표면 재조합 인간 DR3을 발현하는 안정한 마우스 세포주를 생성하였다. 이를 수행하기 위해, 1x107개의 EL4 세포들을 빙냉 PBS로 세척하고 400 ㎕의 빙냉 PBS에 현탁한 후, hDR3-ΔDD를 위한 10 ㎍의 발현 벡터 및 25 ㎍의 Tol2 트랜스포자제(transposase) 발현 벡터(국제 특허출원 공보 제WO2013/005649호)를 세포 현탁액에 혼합하고 0.4 cm 갭 큐벳(바이오-라드(Bio-Rad), 카탈로그 번호 165-2088)에 옮기고 진 펄서(Gene Pulser) 장치((바이오-라드, 카탈로그 번호 165-2075)[설정: 300 V, 960 μF]를 이용하여 전기영동하였다. 형질감염 후 24시간 후, 세포를 19일 동안 1 mg/㎖ 제네티신("G418"로서도 기재됨, 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 10131-035)에 의해 선별되는 조건 하에 두었다. FACSAria(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 이용하여 인간 DR3의 높은 세포-표면 발현을 가진 세포를 분류하였는데; 이를 위해, 세포를 바이오틴 항-인간 DR3(TRAMP) 항체(클론 JD3 바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 307104)에 이어 스트렙타비딘-파이코에리쓰린(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 카탈로그 번호 016-110-084)으로 염색하였다. 생성된 세포주가 hDR3의 안정한 높은 표면 발현을 갖는지를 후속 시점들에서 유세포분석으로 확인하였다.
(2) 표면 인간 또는 마우스 DR3ΔDD를 발현하는 안정한 CHO-K1 세포주
재조합 표면 인간 또는 마우스 DR3을 발현하는 현탁 CHO-K1 안정한 세포주도 EL4-DR3 세포주에 대해 기재된 바와 같이 생성하였다. 요약하건대, 350V 및 500 μF를 사용하여 상기 실시예 2의 (1)에 기재된 벡터와 동일한 벡터의 전기천공을 수행하였고, 제한 희석을 이용하여 고발현 클론을 선별하기 전에 17일 동안 0.5 내지 1 mg/㎖ G418에서의 선별을 수행하였다.
(3) 포유동물 일시적 발현에 의한 가용성 재조합 단백질 및 항체 생성
대다수의 항체들 및 단백질들을 생성하기 위해, Opti-MEM 배지(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 31985-070)에 희석된 DNA 대 프리스타일(FreeStyle)™ MAX 형질감염 시약의 1:1(중량/부피) 비로 제조자의 지시에 따라 프리스타일™ MAX 형질감염 시약(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 16447-100) 및 1.25 ㎍의 벡터 DNA/㎕ 배양물을 사용하여 프리스타일™ 293-F 세포(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 R790-07) 또는 프리스타일™ CHO-S 세포(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 R800-07)의 현탁 배양물을 원하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 그 후, 293-F 세포를 사용하는 경우 프리스타일™ 293 발현 배지(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 12338-018), 또는 CHO-S 세포를 사용하는 경우 프리스타일™ CHO 발현 배지(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 1265-014)에서 6일 동안 형질감염체를 배양하였다. 상청액을 원심분리에 이은 0.22 ㎛ 여과(밀리포어(Millipore), 스테리컵(SteriCup)® 필터 유닛)로 정화하였다. 그 다음, 이 물질을 분석에 직접적으로 사용하였거나, 재조합 단백질, 예컨대, TL1A-플래그, DR3-hG1Fc, DR3-mG1Fc 또는 항체를 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이 정제하였다.
(4) 안정한 CHO-K1 세포로부터의 가용성 인간 DR3(EC)-hG1Fc 생성
가용성 인간 DR3-hG1Fc 단백질의 대규모 생산을 위해 안정한 CHO-K1 세포주를 생성하였다. 400 ㎕ 빙냉 PBS 중의 1x107개 CHO-K1 세포들, 10 ㎍의 발현 벡터 pKTABEXTC26-hDR3-hG1Fc 및 25 ㎍ Tol2 트랜스포자제 벡터를 0.4 cm 갭 큐벳에 옮기고 진 펄서 장치[설정: 350 V, 500 μF]를 이용하여 전기영동하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 즉시 옮기고 4일 후 3 ㎍/㎖ 사이클로헥스이미드(CHX)(시그마, 카탈로그 번호 C4859)를 사용한 선별을 시작하였다. 14일 내지 21일의 선별 후, 샌드위치 ELISA로 가용성 IgG Fc에 대해 웰을 스크리닝하였다. 고역가 웰을 증폭하고 최종 고발현 세포주가 선별될 때까지 세포에 대한 추가 역가 시험을 수행하였다.
CHO CD 효율적 공급원료 A 및 공급원료 B(라이프 테크놀로지스, 각각 카탈로그 번호 A10234-01 및 카탈로그 번호 A10240-01)를 사용하는 유가식 생산 방법을 이용하여 안정한 CHO-K1 세포주로부터의 인간 DR3(EC)-hG1Fc의 생성을 수행하였다. 세포를 원하는 부피까지 규모 확장하고 공급원료 A와 공급원료 B의 혼합물을 공급하였다. 세포의 생존능이 80% 미만으로 떨어졌을 때 배양 상청액을 수거하고 원심분리에 이은 0.22 ㎛ 여과로 정화하였다.
실시예 3 항-DR3 단일클론 항체의 확립
(1) 마우스 면역화
(인간 Ig 유전자 좌위를 함유하는) 기린-메다렉스(Kirin-Medarex)(KM) 마우스들(국제 특허출원 공보 제WO 02/43478호, 국제 특허출원 공보 제WO 02/092812호, Ishida, et al., IBC's 11.sup.th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000); Kataoka, S. IBC's 13.sup.th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002))을 0일째 날, 14일째 날 및 21일째 날에 시그마 보강제 시스템(SAS)(카탈로그 번호 S6322) 중의 50 ㎍ 인간 DR3-Fc 융합 단백질 또는 DR3 발현 EL4 세포로 면역화시켰다. 인간 DR3 발현 CHO 세포에의 유세포분석 결합을 통해 혈청 항-hDR3 역가를 전형적으로 추정하였다. 적절한 역가를 가진(전형적으로 1:10,000의 종점 희석을 나타내는) 마우스들을 DR3-Fc 또는 DR3-EL4 세포로 최종 1회 면역화시켰다. 최종 부스트로부터 3일 후 마우스들을 희생시켰다.
(2) 하이브리도마 생성
면역화된 마우스들로부터 비장을 절개하고 단일 세포 비장세포 현탁액을 제조하였다. 비장세포를 Sp2/0-Ag14(ATCC CRL-1581) 융합 파트너 세포와 1:5로 혼합하고 20 ㎖의 가온된 DMEM(인비트로겐)으로 3회 세척하였다. 최종 세척물로부터 배지를 흡입하고, 1 ㎖의 가온된 PEG1500(뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim))을 약하게 혼합하면서 1분에 걸쳐 세포에 적가하였다. 생성된 PEG1500 세포 현탁액을 약하게 진탕하면서 추가 2분 동안 약하게 혼합한 후 가온된 DMEM을 연속적으로 적가하였다(1분에 걸쳐 1 ㎖, 그 다음 3분에 걸쳐 3 ㎖, 그 다음 1분에 걸쳐 10 ㎖).
융합 혼합물을 37℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 세포를 원심분리를 통해 펠렛화하고 10% 태아 소 혈청(FBS), 50 pg/㎖ 재조합 IL-6(알&디 시스템스(R&D Systems) 206-IL-050)으로 보충된 DMEM에 106개 세포/㎖로 재현탁하였다. 융합 혼합물을 웰당 100 ㎕씩 96-웰 조직 배양 플레이트에 분배하고 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 100 ㎕의 DMEM 2xHAT-보충제(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 함유 배지(이하, DMEM/HAT로서 기재됨)를 첨가하고 플레이트를 추가 3일 동안 배양하였다. 배양 배지의 75%를 1xDMEM/HAT로 교체하고 하이브리도마 세포를 추가 2일 내지 4일 동안 배양하였다.
(3) 항체 선별
인간 DR3 발현 CHO 세포(이하, 경우에 따라 CHO/DR3으로서 기재됨)에의 유세포분석 결합으로 다중웰 플레이트의 상청액을 스크리닝하였다. 4℃에서 15분 동안 96-웰 환저 분석 플레이트에서 웰당 10,000개의 세포를 하이브리도마의 순수한 상청액과 함께 항온처리하였다. 세포를 원심분리를 통해 펠렛화하고 200 ㎕ PBS/0.5% 태아 소 혈청으로 세척하였다. 후속 원심분리 후, 10 ㎍/㎖ 항-인간 IgG-파이코에리쓰린(잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research), 109-115-098)을 함유하는 200 ㎕ PBS/0.5% 태아 소 혈청에 세포를 재현탁하고 4℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 세포를 전술된 바와 같이 세척하고 200 ㎕ PBS/0.5% 태아 소 혈청에 재현탁하였고; LSR 포르테사(Fortessa) 유세포분석기(벡톤 딕킨슨(Beckton Dickinson)) 상에서 5000개 초과의 이벤트를 획득하였다. 플로우조(FlowJo)(트리스타 인코포레이티드(Treestar Inc.))를 이용하여 결과를 분석하였다. 그 결과, 항-DR3 단일클론 항체를 생성하는 142A2 및 142S38B를 비롯한 하이브리도마 클론을 확립하였다.
DR3에 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 증폭하고 상청액의 항체를 통상적인 방법에 따라 정제하였다. 항체 단백질 정제: 재조합 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe) 단백질 A 친화성 수지(지이 헬쓰케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 펜실베니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 배양 배지로부터 인간 단일클론 항체를 정제하였다. 컨디셔닝된 배지를 0.22 ㎛ 진공 필터 유닛(밀리포어, 매사추세츠주 베드포드 소재)으로 여과하고 배지 중의 인간 항체의 양을 일치시키기에 적절한 용량의 단백질 A 컬럼(지이 헬쓰케어 라이프 사이언시스, 펜실베니아주 피츠버그 소재) 상에 적재하였다. 상기 컬럼을 5 컬럼 부피의 PBS로 철저히 세척하고 항체를 0.1 M Gly-HCl(pH 3.6)로 용출하고 1 M 트리스-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다.
분획을 SDS-PAGE로 분석하고 양성 분획을 풀링하고 PBS(pH 7.4)(깁코, 라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아이슬란드 소재)에 대해 투석하였다. 투석 후, 항체 샘플을 원심분리 농축기(비바스핀(Vivaspin), 50,000 MWCO: 사르토리우스(Sartorius), 독일 게팅겐 소재)로 농축하였다. 마지막으로, 0.22 ㎛ 공극 직경을 가진 주사기 필터를 이용하여 항체를 필터 멸균하고 항체 농도를 로우리(Lowry) 방법으로 측정하였다. FDA로부터 허가받은 엔도세이프(Endosafe)-PTS 리뮬러스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL) 분석(찰스 리버 레이보레이토리스(Charles River Laboratories))을 이용하여 발열원 함량을 측정하였다. 이 분석의 검출 한계는 0.01 EU/㎖이었다. 검사가 음성인 경우, 샘플은 내독소 무함유 샘플로서 간주되었다.
정제된 항체를 이하에 기재된 바와 같이 DR3 효현작용/길항작용에 대해 평가하였다. 본 발명자들은 여러 융합들을 통해 142A2 및 142S38B를 비롯한 항-인간 DR3 단일클론 항체를 확립하였고, 이들 2종의 항체들을 유전자 클로닝 및 추가 특징규명에 사용하였다.
실시예 4 항-DR3 단일클론 항체의 유전자 클로닝
(1) 하이브리도마 142A2 및 142S38B로부터 VH 및 VL 유전자의 유전자 클로닝 및 서열결정
5'-SMART-RACE-PCR(cDNA 말단-중합효소 연쇄 반응의 RNA 주형-신속 증폭의 5' 말단에서의 스위칭 기작)을 이용하여 선별된 하이브리도마 세포주 142A2 및 142S38B로부터 신호 펩티드 및 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변(VH) 도메인(본원에서 인간 게놈으로부터의 조합된 가변 유전자(V) + 다양성 유전자(D) + 연결 유전자(J) 영역을 지칭하는 VH), 및 신호 펩티드 및 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 도메인(본원에서 인간 게놈으로부터의 조합된 가변 유전자(V) + 연결 유전자(J) 영역을 지칭하는 VL)을 코딩하는 cDNA를 추출하고 생거 방법으로 서열결정하였다.
이를 수행하기 위해, RNeasy® 키트(퀴아젠 인코포레이티드, 카탈로그 번호 74104)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 각각의 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 정제하였다. 단리된 RNA를 주형으로서 사용하고, 142A2의 경우 SMART RACE cDNA 증폭 키트(클론텍, 카탈로그 번호 634914), 또는 142S38B의 경우 역전사효소 수퍼스크립트™ II(인비트로겐, 카탈로그 번호 18064-014)와 조합된 SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(클론텍, 카탈로그 번호 634923)를 사용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭하였다. 제조자의 지시에 따라, 키트-유래의 프라이머 및 역전사효소를 사용하여 2 ㎍의 하이브리도마-유래의 총 RNA로부터 제1 가닥 cDNA를 생성하였다.
이 cDNA는 키트에 의해 제공된 보편적인 정방향 프라이머와 함께 모든 인간 감마 이소타입(프라이머 IgG1, 서열번호 61) 또는 인간 카파(프라이머 hk-5, 서열번호 62)의 불변 도메인 내에서 어닐링하는 유전자 특이적 역방향 프라이머를 사용하여 VH 또는 VL 영역 및 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 짧은 부분을 PCR 증폭하기 위한 주형으로서 사용되었다. KOD 핫 스타트 DNA 중합효소(노바겐/토요보, 카탈로그 번호 71086-3)를 하기 열-순환 프로그램 내에서 사용하였다: 94℃ 4분; 94℃ 30초, 68℃ 2분의 5 주기; 94℃ 30 초, 66℃ 30 초, 68℃ 1분의 5 주기; 94℃ 30초, 64℃ 30초, 68℃ 1분의 25 주기; 68℃ 5분의 1 주기. 이 반응으로부터 불충분한 142A2 VH cDNA가 단리되었기 때문에, 제1 PCR 반응으로부터의 DNA를 주형으로서 사용하여 부분적-네스티드(partial-nested) PCR의 제2 라운드를 수행하였다. 키트에 의해 제공된 동일한 정방향 프라이머는 중쇄 불변 도메인 내에서 어닐링하는 네스티드 역방향 프라이머(프라이머 IgG2, 서열번호 71)와 페어링되었고, PCR은 전술된 바와 같이 반복되었다. 모든 다른 항체 단편이 제2 라운드 PCR을 요구하지는 않았다. 제로 블런트(Zero Blunt) TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로겐, 카탈로그 번호 K2820)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 증폭된 VH 및 VL cDNA 단편을 PCR 블런트 II-TOPO 플라스미드 내에 클로닝하였다.
VH 또는 VL cDNA 삽입체를 함유하는 다수의 플라스미드들을 (진위즈 인코포레이티드에 의해 수행된) 생거-서열결정으로 서열결정하고 프로그램 시퀀처(Sequencher)(진 코데스 코포레이션(Gene Codes Corp.)에 의해 제작됨)를 이용하여 정렬시켰다. IMGT/V-퀘스트(quest) 프로그램(Brochet, Lefranc et al. 2008), BLAST 및 IgBLAST를 이용하여 VH 및 VL cDNA에 대한 컨센서스 정렬을 분석하였다. 카바트의 정의(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991))를 이용하여 항체의 상보성 결정 영역들(CDR들)을 확인하였다.
확인된 서열은 다음과 같았다: 142A2 VH(서열번호 13의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 14의 신호 펩티드를 포함하는 VH 영역의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH 영역의 아미노산 서열, 및 서열번호 16 내지 18의 HCDR들 1 내지 3), 142A2 VL(서열번호 19의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 20의 신호 펩티드를 포함하는 VL 영역의 아미노산 서열, 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 및 서열번호 22 내지 24의 LCDR들 1 내지 3); 142S38B VH(서열번호 25의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 26의 신호 펩티드를 포함하는 VH 영역의 아미노산 서열, 서열번호 27의 VH 영역의 아미노산 서열, 및 서열번호 28 내지 30의 HCDR들 1 내지 3), 142S38B VL(서열번호 31의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 32의 신호 펩티드를 포함하는 VL 영역의 아미노산 서열, 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열, 및 서열번호 34 내지 36의 LCDR들 1 내지 3).
(2) IgG1, IgG2 및 IgG4 발현 벡터 내로의 VH 및 VL의 클로닝
내생성 신호 펩티드를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 확인된 cDNA를, 각각의 인간 γ 불변 영역(IgG1, IgG2 또는 IgG4 변이체) 또는 인간 카파 불변 도메인(서열번호 37)을 함유하는 발현 벡터에 결찰시킴으로써 142A2 및 142S38B 둘 다의 전장 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 변이체 항체 버전의 발현용 벡터를 구축하였다. 본 실시예에서, IgG4 변이체는 인간 IgG4 불변 영역에서 아미노산 치환 S228P, L235E 및 R409K를 포함하는 널바디(Nullbody)®를 지칭한다(EU 지수에 의해 정의된 아미노산 위치의 번호)(미국 특허출원 공보 제2008-0063635호). 이 경우, 널바디® 유형의 항체는 IgG4-null로서 지칭된다. IgG4 항체 변이체는 IgG4 항체의 원래 결합 성질을 유지하면서 보다 낮은 pH 또는 산성 조건에서 증가된 안정성을 보이는 항체이고, 결과적으로 상기 항체는 항체 정제 과정을 통해 거의 응집되지 않는다. 생성된 번역된 아미노산이 가변-대-불변 연접부에서 하이브리도마-유래된 서열로부터 변화되지 않도록 cDNA의 결찰을 수행하였다.
이를 수행하기 위해, 5' 플랭킹 SalI 제한 부위를 추가하는 정방향 프라이머[142A2의 경우 프라이머 142A2-VH_SalI_F(서열번호 67) 및 142S38B의 경우 프라이머 142S38B_VHF_SalI(서열번호 69)], 및 3' 플랭킹 NheI 제한 부위를 추가하는 역방향 프라이머[(142A2의 경우 프라이머 142A2-VH_NheI_R(서열번호 68) 및 142S38B의 경우 프라이머 F429_VH_R1(서열번호 70)]를 사용하여 신호 펩티드 및 VH 도메인을 증폭하였다. 원하는 이소타입의 면역글로불린 불변 도메인[인간 IgG1(서열번호 38), IgG2(서열번호 39) 또는 IgG4-null(서열번호 40)에 대한 아미노산 서열]에 대한 cDNA를 함유하는 발현 벡터 pKTABEX-TC26 내의 SalI 및 NheI 제한 부위 내에 PCR 생성물을 클로닝하였다. 유사하게, 각각의 항체에 대한 VL 도메인을 증폭하고 인간 카파의 불변 도메인에 대한 cDNA를 함유하는 동일한 또는 또 다른 벡터의 BglII 및 BsiWI 제한 부위 내에 삽입하였다. 신호 펩티드 및 VL을 증폭하고 5' 및 3' 플랭킹 BglII 및 BsiWI 제한 부위를 추가하는 데에 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같았다: 142A2의 경우, 정방향 프라이머 142A2_BglII_F(서열번호 65) 및 역방향 프라이머 142A2_BsiWI_R(서열번호 66); 142S38B의 경우, 정방향 프라이머 142S38B_VLF_BglII(서열번호 63) 및 역방향 프라이머 142P20_VL1_BsiWI_R(서열번호 64). 상기 실시예 2의 (3)에 기재된 바와 같이 CHO-S 세포를 사용하여 항체의 일시적 생성을 수행하였다.
실시예 5 재조합 인간 DR3-인간 IgG1-Fc(huDR3-huFc)에 대한 항-DR3 항체의 결합 활성의 비아코어-기반 평가
재조합 인간 DR3 단백질에 대한 항-DR3 인간 항체 142A2 및 142S38B의 결합 활성을 동역학적으로 분석하기 위해, 항체의 결합 활성을 표면 플라스몬 공명 방법(SPR)으로 측정하였다. 피어스(Pierce) Fab 제조 키트(써모 사이언티픽 피어스(Thermo Scientific Pierce) 번호 44985)에 따라 상기 언급된 항체들의 Fab 항체 단편들을 수득하였다. 비아코어® 3000(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스(GE Healthcare Bio-Sciences)에 의해 제작됨)을 이용하여 하기 조작들 모두를 수행하였다. 재조합 huDR3-huFc 단백질을 아민 커플링 화학반응으로 CM5 센서 칩(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스에 의해 제작됨) 상에 고정시켰다.
구체적으로, 중간 단백질 고정 수준을 달성하기 위해 대략 2000 공명 유닛(RU)의 재조합 단백질을 칩 상에 고정시킴으로써 동역학적 분석을 수행하였다. 그 후, 5개 단계들에서 12 nM 농도부터 희석된 항-DR3 항체 Fab 단편들을 120초 동안 상기 칩 상에 30 ㎕/분의 유속으로 유동시켰다. 해리 시간은 300초이었고 결합 곡선을 25℃에서 측정하였다.
글리신-HCl(pH 1.5)을 사용하여 60초 동안 재생을 수행하였다. 포획된 리간드를 갖지 않는 기준 유동 셀 및 완충제 블랭크로부터의 신호를 차감함으로써 미처리 데이터를 이중 표준화하였다. 각각의 농도에 상응하는 센서그램을 수득하였다. 장치에 부착된 분석 소프트웨어인 비아코어® 3000 평가 소프트웨어(비아코어에 의해 제작됨)를 이용하여 1:1 랭뮤어 피트(Langmuir fit) 모델을 사용하여 분석을 수행함으로써, 재조합 huDR3-huFc 단백질에 대한 결합 속도 상수 ka[1/Ms] 및 해리 속도 상수 kd[1/s]를 계산하였다.
결과적으로, 이로써 수득된 개별 항체의 평형 해리 상수 KD(kd/ka)는 표 1에 제공되어 있다. 각각의 항체의 전형적인 센서그램이 도 1a 및 도 1b에 표시되어 있다. 분석에 따르면, 항-DR3 단일클론 항체 142A2 및 142S38B는 109 차수 초과의 KD 값의 크기로 인간 DR3 단백질에 대한 유의하게 더 높은 친화성을 가졌다. 더욱이, 142A2 항체는 142S38B 항체보다 더 높은 결합 속도 상수(ka)를 가진 반면, 142S38B 항체는 142A2 항체보다 더 높은 해리 속도 상수(kd)를 가졌다.
Figure pct00002
실시예 6 항-DR3 단일클론 항체의 DR3 효현작용 및 길항작용
본 발명에서 확립된 항-DR3 단일클론 항체의 효현작용 및 길항작용을 평가하기 위해, 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 p65(RelA) NF-κB 서브유닛의 인산화 수준을 FCM 방법으로 분석한다. 피콜(Ficoll)을 사용한 차등 밀도 원심분리로 건강한 지원자로부터 PBMC들을 정제하였다. PBMC들에서 기준 NF-κB 활성화 수준을 안정화하기 위해, PBMC들을 무혈청 RPMI1640 배지(인비트로겐)(이하, RPMI로서 기재됨)에서 30분 동안 37℃에서 유지하였다.
항-DR3 단일클론 항체의 길항제 및 효현제 활성에 대한 이소타입 효과를 비교하기 위해, PBMC NF-κB 활성화에 대한 표시된 142A2 IgG1, IgG2 및 IgG4 변이체 버전의 효과를 이하에 기재된 바와 같이 측정하였다. 효현제 분석에서, 세포를 RPMI에서 37℃에서 30분 동안 6.67 nM의 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG1, 142-A2-IgG2 또는 142A2-IgG4v 단독, 또는 양성 대조군으로서 40 nM TL1A-플래그 단독으로 처리하였다. 길항제 분석에서, 세포를 RPMI에서 37℃에서 30분 동안 6.67 nM 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG1, 142-A2-IgG2 또는 142A2-IgG4v의 존재 또는 부재로 전처리한 후, 40 nM TL1A-플래그를 첨가하고 세포를 RPMI에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 각각의 항온처리 후, 세포를 항-인 p65(벡톤 딕킨슨, 카탈로그 번호 558423)로 염색하고 벡톤 딕킨슨 LSR 포르테사 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.
그 다음, 항체의 용량 의존성에 대한 길항제 분석을 위해, 세포를 RPMI에서 37℃에서 30분 동안 각각의 농도에서 항-DR3 단일클론 항체의 존재 또는 부재로 처리하였다. 그 후, 1 ㎍/㎖(40 nM)의 외생성 TL1A-플래그를 항체의 존재 하에서 10분 동안 배지에 첨가한 후, 벡톤 딕킨슨(BD) 사이토픽스(Cytofix)로 고정시키고 비디 포스플로우(BD PhosFlow) 침투가능화 완충제 III(벡톤 딕킨슨, 카탈로그 번호 554714)으로 침투가능하게 만들었다.
항체의 용량 의존성에 대한 효현제 분석을 위해, 세포를 10분 동안 항체 단독, 음성 대조군인 RPMI 단독 또는 양성 대조군인 40 nM 재조합 TL1A로 처리한 후, 전술된 바와 같이 고정시키고 침투가능하게 만들었다. 세포를 항-인 p65(벡톤 딕킨슨, 558423)로 염색하고 벡톤 딕킨슨 LSR 포르테사 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.
도 2a에 표시된 바와 같이, 양성 대조군인 TL1A 단독은 PBMC들에서 인산화된 p65 양성 세포를 대략 45%까지 증가시켰고, 다른 한편으로 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG1 및 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG4v도 인산화된 p65 양성 세포를 대조군의 약 80% 또는 70%까지 증가시켰다. 그러나, 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG2는 인산화된 p65 양성 세포를 단지 대조군의 10분의 1 미만으로 증가시켰다. 따라서, 2가 IgG 항체 포맷의 경우, IgG 클래스의 재배열이 항-DR3 단일클론 항체 결합에 의한 효현작용 효능을 감소시킬 수 있거나 결실시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, IgG2 클래스의 항-DR3 단일클론 항체는 비정상적인 DR3 활성화에 의해 야기된 질환의 치료에서 DR3 항원의 순수한 길항작용에 유용할 수 있다.
더욱이, 도 2b에 나타낸 바와 같이, PBMC들에서 인산화된 p65 양성 세포를 대략 55%까지 증가시킨 TL1A에 비해, IgG1, IgG2 및 IgG4의 모든 항-DR3 단일클론 항체들은 TL1A 결합 시 유도된 p65의 인산화를 거의 완전히 억제하였다. 따라서, IgG2 클래스의 항-DR3 단일클론 항체는 낮아진 효현작용과 함께 또는 효현작용 없이 DR3의 길항작용을 보이는 예상외의 성질을 가진다는 것이 밝혀졌다. 이 실험 결과들은 IgG2 클래스의 항-DR3 단일클론 항체가 비정상적인 DR3 활성화와 관련된 질환에 대한 순수한 길항제의 한 후보로서 선택될 수 있다는 것을 명확히 보여준다.
다른 한편으로, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 항-DR3 IgG4 항체 변이체 142A2 및 142S38B는 항체 용량 의존적 방식으로 PBMC들에서 p65의 인산화를 증가시켰으므로, 이 항체들은 DR3에 대한 효현 활성을 보였고 A2-IgG4v의 효현 활성은 S38-IgG4v보다 더 높은 활성이었다. 다른 한편으로, IgG2의 불변 영역을 가진 A2-IgG2 및 S38-IgG2는 가장 높은 항체 농도에서조차도 PBMC들에서 p65의 인산화를 증가시키지 않았다. 따라서, 이 IgG2 항체들은 효현 활성을 결여하였다.
뿐만 아니라, 도 3b에 나타낸 바와 같이, IgG2 또는 IgG4 변이체 불변 영역을 가진 모든 항-DR3 단일클론 항체 142A2 및 142S38B는 TL1A-유도된 p65 인산화를 감소시킴으로써, DR3에 대한 길항제 활성을 나타내었다. 142A2 항체의 길항제 활성은 142S38B 항체의 길항제 활성에 비해 더 높은 길항제 활성을 보였다. IgG4 서브클래스로부터 IgG2 서브클래스로의 재배열은 142A2 항체의 길항제 효능을 약간 감소시킨 반면, 142S38B 항체의 길항제 효능을 약간 증가시켰다.
종래 공지된 2가 항-DR3 길항성 항체와 대조적으로, IgG2 재배열된 항-DR3 항체는 DR3 길항작용을 보유하되, 유의하게 감소된 효현 활성을 보유하거나 효현 활성을 결여한다. 따라서, 2가 IgG2는 DR3을 유의하게 자극하지 않으면서 DR3 기능을 억제하는 데에 유용할 것이다.
실시예 7 TL1A-매개된 IL-13 생성 억제의 길항작용
항-DR3 단일클론 항체의 존재 또는 부재 하에서 T 세포로부터의 염증성 사이토카인의 분비를 분석하기 위해, 염증성 사이토카인들 중 하나로서 IL-13의 분비를 분석하였다. 밀테니이(Miltenyi) 범-T 세포 단리 키트 II(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotech) 130-095-130)를 사용하여 자기 활성화된 세포 분류로 (전술된 바와 같이 피콜을 통해 단리된) 인간 PBMC들로부터 T 세포를 정제하였다. 단리된 T 세포를, 1 ㎍/㎖ 항-CD28 항체(벡톤 딕킨슨, 카탈로그 번호 556620) 및 상기 실시예 2의 (4)에서 제조된 1 ㎍/㎖ 재조합 TL1A-플래그를 가진 96-웰 항-CD3-코팅된 플레이트(2x105개 세포/웰; 이바이오사이언스(eBioscience) 카탈로그 번호 16-0037-85) 상에 시딩하였다. 다양한 농도의 항-DR3 항체를 첨가하고 세포를 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액 IL-13 수준을 ELISA(알&디 시스템스, 카탈로그 번호 D1300B)로 평가하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG2 및 142S38B-IgG2는 PBMC들로부터의 IL-13의 분비를 증가시키지 않았고, 분비된 양은 배지 단독에서의 IL-13 분비와 동일하였다. 따라서, p65 인산화의 분석에서 수득된 결과에 따르면, IgG2 클래스의 항-DR3 단일클론 항체가 염증성 사이토카인 방출에 대한 어떠한 효현 효능도 갖지 않았다는 것이 밝혀졌다. 나아가, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 항-DR3 단일클론 항체 142A2-IgG2 및 142S38B-IgG2는 용량 의존적 방식으로 PBMC들로부터의 IL-13의 TL1A-유도된 분비를 억제하였다.
따라서, IgG2 클래스의 항-DR3 단일클론 항체의 상기 분석에 따르면, IgG2 클래스의 재배열은 항-DR3 단일클론 항체의 효현작용 효능을 완전히 제거하였다. 따라서, IgG2 클래스의 항-DR3 단일클론 항체는 비정상적인 DR3 활성화에 의한 염증성 사이토카인 방출과 관련된 질환에 대한 하나의 순수한 길항제일 수 있다.
실시예 8 항-DR3 단일클론 항체 단편의 제조
(1) 항-DR3 1가 항체의 구축
항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편을 생성하기 위해, H 쇄 및 L 쇄-융합된 Fc(FL 융합 폴리펩티드)로 구성된 1가 항체(이하, 경우에 따라 mvAb로서 기재됨)를 하나의 항체 단편으로서 디자인하였다. 항-DR3 단일클론 항체 142A2 및 142S38B를, 항-DR3 1가 항체를 구축하기 위한 모 항체 클론으로서 사용하고, 항체의 VH의 아미노산 서열을 C131S, R133K, S228P, L235E 및 R409K 치환이 포함되어 있는 인간 IgG4 항체의 불변 영역의 아미노산 서열에 연결함으로써, mvAb를 위한 H 쇄를 구축하였다.
그 다음, 항체의 VL의 아미노산 서열을, C214S, S228P, L235E, R409K, H435R 및 Y436F 치환이 포함되어 있는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 IgG4 항체의 Fc 영역 다음에 위치한 인간 카파 경쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 연결함으로써, FL 융합 폴리펩티드를 구축하였다.
142A2 항체 또는 142S38B 항체로부터 유래된 VH 및 VL의 각각의 아미노산 서열(서열번호 15 및 21, 또는 27 및 33)을, C131S, R133K, S228P, L235E 및 R409K 치환을 포함하는 IgG4 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열(142A2/mvG4_HC; 서열번호 72 및 142S38B/mvG4_HC; 서열번호 73), 또는 C214S, S228P, L235E, R409K, H435R 및 Y436F 치환을 포함하는 힌지, CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 인간 IgG4 중쇄의 Fc 영역 다음에 위치한 인간 카파 경쇄의 불변 영역의 아미노산 서열(142A2/mvG4_LC; 서열번호 74 및 142S38B/mvG4_LC; 서열번호 75)에 접합시켰다. H 쇄 및 FL-융합 폴리펩티드의 각각의 쌍은 항-DR3 1가 항체 mv142A2 및 항-DR3 1가 항체 mv142S38BA를 구성한다.
제한효소 NotI 및 BamHI에 의해 인식되는 각각의 서열이 5'-말단 및 3'-말단에 도입되어 있는 142A2/mvG4_HC(서열번호 72) 또는 142S38B/mvG4_HC(서열번호 73)의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 pKANTEX93(국제 특허출원 공보 제WO 97/10354호) 상의 NotI 및 BamHI 부위 내에 각각 삽입하였다.
추가로, 제한효소 EcoRI 및 KpnI에 의해 인식되는 각각의 서열이 5'-말단 및 3'-말단에 도입되어 있는 142A2/mvG4_LC(서열번호 74) 또는 142S38B/mvG4_LC(서열번호 75)의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을, FL 쇄 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터 pKANTEX93에 각각 삽입하였다. 결과적으로, 항-DR3 1가 항체의 발현 벡터인 pKANTEX93/142A2/mvG4 및 pKANTEX93/142S38B/mvG4가 구축되었다.
(2) 항-DR3 1가 항체의 생성 및 정제
항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편을 생성하기 위해, 중국 햄스터 난소 CHO/DG44 세포(Somatic Cell Mol. Genet., 12, 555, 1986)를 사용하였다. 세포 배양물을 5% CO2 항온처리기 내에서 37℃에서 수행하였다. 다양한 1가 항체들을 발현시키기 위해, 발현 벡터의 도입을 하기 방식으로 수행하였다.
8 ㎍의 다양한 1가 항체 발현 벡터들을 2.0x107개의 CHO/DG44 세포에 첨가하고 유전자를 전기천공 방법으로 도입하였다[Cytotechnology, 3, 133(1990)]. 2 mm 갭의 큐벳을 5분 동안 얼음 상에서 유지한 후, 350 V 및 250 μF의 조건 하에서 전기 펄스를 수행하였다. 펄스 후, 세포를 10% 투석된 태아 소 혈청(이하, dFBS로 약칭됨)을 함유하는 15 ㎖의 IMDM 배지(깁코에 의해 제작됨)[이하, IMDM-(10)으로 약칭됨)로 회수하고, 각각의 세포를 2일 동안 IMDM-(10)에서 배양한 후, 배지를 0.5 mg/㎖ G418 설페이트(나칼라이 테스크 인코포레이티드(NACALAI TESQUE, INC.))를 함유하는 IMDM-(10)[이하, IMDM-(10G)로 약칭됨]로 교체하여 배양을 계속함으로써, G418 내성 세포주를 수득하였다.
상기 배양 하에서 수득된 G418 내성 세포주를 IMDM-(10G)에 현탁하고 175 cm2 플라스크에서 전면생장하는 동안 배양한 후, 세포를 하이퍼플라스크(HYPERflask)™(코닝(Corning), 카탈로그 번호 10020)에 옮기고 7일 내지 11일 동안 0.5 mg/㎖ G418 및 10 ㎍/㎖ 젠타미신으로 보충된 엑셀(Excell)302(SAFC 바이오사이언시스)에 의해 제작됨)에서 배양한 후, 배양 상청액을 회수하였다. 항-DR3 1가 항체 142S38B/mvG4를 위해, 실시예 2의 단락 (3)에 유사하게 기재된 일시적 단백질 발현 시스템을 수행하였다. 형질감염된 세포의 배양 결과로서, 142A2mvG4 및 142S38BmvG4의 배양 상청액을 수득하였다.
mvAb들을 정제하기 위해, 상기 다양한 1가 항체들의 배양 상청액을 맙셀렉트 슈어(밀리포어에 의해 제작됨) 담체로 팩킹된 0.5 ㎖ 부피 컬럼에 0.5 내지 1.0 ㎖/분의 유속으로 통과시켰다. 상기 컬럼을 인산염 완충제 식염수(PBS)로 2회 세척하였고, 0.1 M 구연산염 완충제(pH 4.0)(142A2/mvG4의 경우) 또는 0.1 M 구연산염 완충제(pH 3.9)(142S38B/mvG4의 경우)를 각각의 용출을 위해 각각 사용하였고, 각각 용출된 분획을 2 M 트리스-염산 완충제(pH 8.0)로 즉시 중화시켰다.
높은 단백질 농도를 보이는 용출 분획을, 10 mM 구연산(이의 pH는 수산화나트륨에 의해 6.0으로 조절되었음) 및 150 mM 염화나트륨을 함유하는 완충제(이하, 구연산염 완충제)에 대해 2회 투석하였다. 샘플을 회수하였고 저농도 샘플을 한외여과 필터(밀리포어에 의해 제작됨)로 농축하였고 0.22 ㎛ 필터(밀리포어에 의해 제작됨)를 이용하여 멸균하였다.
샘플을 겔 여과 크로마토그래피로 더 정제하였고 시험관내 활성 시험에서 사용하였다. 수퍼덱스 200 10/300 GL 컬럼(지이 헬쓰케어)을 고속 액체 크로마토그래피 시스템 AKTA 익스플로어 10S(지이 헬쓰케어)에 연결하였고 컬럼 내의 수용액을 구연산염 완충제로 바꾸었고, 상기 완충제를 런닝 완충제로서 사용하였다. 500 ㎕의 준비된 부피의 항체 용액을 수동으로 상기 컬럼에 적용하였고 1.5 컬럼 부피의 완충제를 0.5 ㎖/분의 유속으로 상기 컬럼에 통과시킨 후(1.5 MPa에서 설정된 허용 압력), 0.5 ㎖의 각각의 분획을 회수하였다.
25분 내지 30분 근처에서 주피크로서 검출된 분획을 회수하고 분석을 위해 사용하였다. 정제된 샘플을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고 4℃에서 보존하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도(OD280)로부터 계산하였다. 그 결과, 정제된 항-DR3 1가 항체 mv142A2 및 mv142S38B를 수득하였다.
실시예 9 항-DR3 단일클론 항체 단편의 효현작용 및 길항작용
본 발명에서 항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편으로서 확립된 항-DR3 1가 항체 mv142A2 및 mv142S38B의 효현작용 및 길항작용을 평가하기 위해, 인간 PBMC에서 p65(RelA) NF-κB 서브유닛의 인산화 수준을 상기 실시예 6에 기재된 바와 동일한 FCM 방법으로 분석한다.
그 결과, PBMC들에서 인산화된 p65 양성 세포에서 각각 69.5% 및 2.3%인 TL1A 단독(양성 대조군) 및 배지 단독(음성 대조군) 값에 비해, 항-DR3 단일클론 IgG4 항체 142A2 IgG4는 항체 용량 의존적 방식으로 상기 세포의 집단을 명확히 증가시킨 반면, 항-DR3 1가 항체 mv142A2는 임의의 항체 용량에서 상기 세포의 집단을 거의 증가시키지 않았다(도 5a).
따라서, 항-DR3 1가 항체 mv142A2는 항-DR3 단일클론 항체 142A2 IgG4에 비해 DR3에 대한 낮아진 효현 활성을 명확히 보였거나 DR3에 대한 효현 활성을 거의 보이지 않았다는 것이 발견되었다. 다른 한편으로, 양성 대조군 및 음성 대조군에 비해, 항-DR3 1가 항체 mv142A2 및 항-DR3 단일클론 항체 142A2 IgG4는 항체 용량 의존적 방식으로 PBMC들에서 인산화된 p65 양성 세포의 TL1A 리간드-유도된 집단을 감소시켰고, mv142A2의 억제는 142A2 IgG4의 억제보다 약간 약화되었다(도 5b).
따라서, 항-DR3 1가 항체 mv142A2는 인간 PBMC에서 TL1A-유도된 DR3 활성화에 대한 길항제 활성을 보였고, 이때 상기 항체는 DR3 활성에 대한 감소된 효현 효능을 갖거나 DR3 활성에 대한 효현 효능을 갖지 않는다. mv142A2의 길항제 활성은 142A2 IgG4 항체보다 약간 감소되었다.
항-DR3 1가 항체 mv142S38B의 경우, 이 실험에서 양성 대조군(TL1A 단독, 45%) 및 음성 대조군(배지 단독, 3%) 값에 비해, 항-DR3 단일클론 IgG4 항체 142S38B-IgG4는 항체 용량 의존적 방식으로 PBMC들에서 인산화된 p65 양성 세포를 명확히 증가시킨 반면, 142A2-IgG4와 동일하게 항-DR3 1가 항체 mv142S38B는 임의의 항체 용량에서 인산화된 p65 양성 세포의 집단을 증가시키지 않았다(도 6a).
다른 한편으로, 항-DR3 1가 항체 mvS38B 및 항-DR3 단일클론 항체 142S38B IgG4는 142A2 항체 클론과 동일하게 PBMC들에서 인산화된 p65 양성 세포의 집단을 동등하게 감소시켰다(도 6b). 따라서, 항-DR3 1가 항체 mv142S38B는 인간 PBMC에서 TL1A-유도된 DR3 활성화에 대한 길항제 활성을 보였고, 이때 상기 항체는 감소된 효현 효능을 갖거나 효현 효능을 갖지 않는다.
따라서, 항-DR3 1가 항체는 유의한 효현 효능을 나타내지 않으면서 TL1A-유도된 DR3 활성화를 길항할 수 있다. 나아가, 상기 항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은 상기 항체의 Fc 영역을 함유함으로써 종래 공지된 항-DR3 항체 단편, 예컨대, Fab에 비해 인간 혈청에서 더 긴 반감기 및 더 높은 안정성을 갖는 듯하다. 따라서, 본 발명의 H 쇄 및 Fc-융합된 L 쇄로 구성된 1가 항체를 비롯한 항체 단편은 비정상적인 DR3 활성화와 관련된 질환을 위한 순수한 길항제의 한 후보로서 선택될 수 있다.
실시예 10 힌지 영역 교환된 IgG 변이체의 생성
효현 활성 제거에 있어서 IgG2 항체로부터 유래된 필수 영역을 확인하기 위해, IgG2 서브클래스와 IgG4 서브클래스 사이에 힌지 영역이 교환된 IgG 변이체를 생성하였다. IgG4 항체의 경우, 힌지 영역 내의 위치 228(EU 넘버링)에 존재하는 Ser 잔기가 IgG4 분자의 불안정성, 예컨대, 반감기와 관련되어 있는 것으로 공지되어 있지만, 앞서 기재된 "널바디"에 포함된 S228P 치환을 포함하는 IgG4 힌지 영역을 사용하였다. IgG4 항체로부터 유래된 CH1, CH2 및 CH3 도메인, 및 IgG2 항체로부터 유래된 힌지 도메인을 포함하는 IgG 변이체를 "4244" 변이체로서 표기하였고, IgG2 항체로부터 유래된 CH1, CH2 및 CH3 도메인, 및 IgG4 항체로부터 유래된 힌지 도메인을 포함하는 IgG 변이체를 "2422" 변이체로서 표기하였다.
IgG4-null 항체의 힌지가 인간 IgG2의 힌지로 교체되어 있는 142A2-IgG4244 변이체 중쇄 불변 영역을 생성하기 위해 발현 벡터를 생성하였다. 인간 "IgG4-null" 불변 중쇄 내의 힌지 도메인(ESKYGPPCPPCP)을 코딩하는 cDNA를 인간 IgG2 불변 중쇄의 힌지 도메인(ERKCCVECPPCP)을 코딩하는 cDNA로 교체하였고, 142A2-IgG4244 변이체를 코딩하는 cDNA를 앞서 기재된 바와 같이 발현 벡터 상의 적절한 제한 부위 내에 삽입하였다. IgG4244 변이체와 동일하게, 142A2-IgG2422 변이체를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 생성하였다. 마지막으로, 정제된 각각의 항체를 실시예 1 및 2에 기재된 상기 절차와 동일한 절차로 수득하였다.
이 수득된 142A2 항체 변이체를 실시예 6에 기재된 분석과 동일한 길항제 및 효현제 분석에서 평가하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 142A2 항체들 및 이들의 변이체들은 TL1A 리간드에 의해 유도된 p65 인산화에 대한 강력한 길항제 활성을 나타내었고, 특히 IgG4244 및 IgG2422 변이체들은 각각의 모 IgG2 또는 IgG4-항체 변이체에 비해 더 높은 길항제 활성을 나타내었다(도 7b). 다른 한편으로, IgG4 및 IgG2422 항체 변이체들이 유의한 효현 활성을 나타내었지만, IgG2 항체 및 IgG4244 항체는 현저히 감소된 효현 활성을 나타내었다(도 7a).
이 결과들은 IgG2 서브클래스로의 IgG 불변 영역의 재배열이 길항제 활성을 감소시키지 않으면서 항-DR3 항체 142A2의 효현 활성을 감소시킨다는 것을 명확히 보여준다. 나아가, IgG2 클래스 항체의 힌지 영역은 항-DR3 항체의 효현 활성을 감소시키기 위해 재배열의 필수 부분을 함유한다. 따라서, IgG2 서브클래스로부터 유래된 힌지 영역을 가진 항-DR3 항체가 유의하게 감소된 효현 활성과 함께 순수한 길항제 활성을 나타내기에 매우 유용한 항체라는 것이 발견되었다.
실시예 11 142A2 항체 변이체의 확립
증가된 친화성을 가진 항체 변이체를 확립하기 위해, 표준 축퇴 올리고뉴클레오티드 방법을 이용하여 142A2 변이체 단일 쇄 Fv(scFv) 조합적 파지-디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 돌연변이를 142A2 항체의 모든 6개 CDR 영역들에 우선적으로 표적화시켰다. 상기 실시양태에서 수득된 고정된 재조합 DR3-Fc 융합 단백질에 대한 패닝(panning)으로 DR3 결합 활성을 가진 파지 변이체를 먼저 확인하였다.
스크리닝된 scFv 파지 클론의 해리 상수(KD)를 문헌(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-4010)에 기재된 경쟁적 결합 알파스크린(AlphaScreen)으로 평가하였다. 모 142A2 scFv에 비해 증가된 KD를 가진 돌연변이체를 세균 발현 벡터 내에 서브클로닝하고 표준 분자생물학 기법을 이용하여 scFv 단백질을 정제하였다. 추가 시험을 위해 CDR 돌연변이들을 유지하면서, 모 항체 클론으로부터 유래된 아미노산 서열을 유지하기 위해 항체 변이체에서 CDR들 외부의 모든 돌연변이들을 모 142A2 아미노산 서열로 다시 복귀시켰다. 나아가, VH의 경우 위치 112에 존재하는 Gly을 Arg으로 치환시켰다.
그 결과, VH 및 VL의 각각의 아미노산 서열, 예컨대, VH_G112R(서열번호 76), VL_A51E(서열번호 77), VL_L54Q(서열번호 78) 및 VL_A51E/L54Q(서열번호 79)가 확립된다. 돌연변이된 CDR의 각각의 아미노산 서열은 HCDR_G112R(서열번호 80), LCDR2_A51E(서열번호 81), LCDR2_L54Q(서열번호 82) 및 LCDR2_A51E/L54Q(서열번호 83)로서 표시된다(표 2).
Figure pct00003
142A2 VL_A51E, VL_L54Q 및/또는 VH_G112R을 포함하는 재조합 IgG1 버전들 및 이들의 조합물을 구축하였고, Fab 단편을 전술된 바와 같이 생성하였다. 전술된 분석과 동일한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 통해 이 142A2 변이체들의 DR3 결합 친화성을 측정하였다. 모든 생성된 142A2 항체 변이체들은 모 142A2에 비해 DR3 단백질에 대한 개선된 결합 친화성을 나타내었다(표 3). 특히 VH 및 VL에서 A51E, L54Q 및/또는 G112R 치환을 포함하는 각각의 항체 변이체(A2-E, Q, EQ, ER 또는 EQR)는 다른 변이체보다 DR3 단백질에 대한 가장 높은 결합 친화성을 가졌고, 각각 대략 1.8배, 1.2배, 1.9배, 2.0배 또는 2.2배 증가를 가졌다. 따라서, 이것은 DR3 길항제 요법에 대한 매우 유망한 후보이다.
Figure pct00004
나아가, 142A2 변이체 A2-EQR을 길항제 활성의 효능에서 분석하였다. Fab 항체 단편의 이 길항제 활성을 상기 실험에서 동일한 분석에서 측정한다. 그 결과, 이 항체들은 용량 의존적으로 IL-13 방출을 억제하였고 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 조합물의 존재 하에서 10 nM에서 TL1A 리간드-유도된 IL-13 분비를 완전히 억제하였다. 뿐만 아니라, A2-EQR 항체 변이체는 모 A2 항체에 비해 훨씬 더 높은 길항제 활성을 가졌다. 따라서, 항-DR3 길항성 항체 변이체 A2-EQR이 TL1A 리간드 유도된 T 세포 활성화를 차단하는 데에 매우 유용하다는 것이 발견되었다.
본 발명이 그의 구체적인 실시양태들에 관하여 상세히 기재되어 있지만, 그의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 그 안에서 다양한 변화들 및 변경들을 만들 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 본원은 미국 가출원 제61/975,214호(2014년 4월 4일 출원)에 기초하고, 상기 가출원의 내용은 참고로 본원에 도입된다.
서열목록 자유 텍스트
서열번호 1 - TL1A-플래그의 뉴클레오티드 서열
서열번호 2 - 합성 구축물
서열번호 5 - hDR3-Fc의 뉴클레오티드 서열
서열번호 6 - 합성 구축물
서열번호 7 - hDR3-mG1Fc의 뉴클레오티드 서열
서열번호 8 - 합성 구축물
서열번호 9 - hDR3-DD의 뉴클레오티드 서열
서열번호 10 - 합성 구축물
서열번호 11 - mDR3-DD의 뉴클레오티드 서열
서열번호 12 - 합성 구축물
서열번호 13 - 142A2-VH 전체의 뉴클레오티드 서열
서열번호 14 - 합성 구축물
서열번호 15 - 142A2-VH의 아미노산 서열
서열번호 16 - 142A2-HCDR1의 아미노산 서열
서열번호 17 - 142A2-HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 18 - 142A2-HCDR3의 아미노산 서열
서열번호 19 - 142A2-VL 전체의 뉴클레오티드 서열
서열번호 20 - 합성 구축물
서열번호 21 - 142A2-VL의 아미노산 서열
서열번호 22 - 142A2-LCDR1의 아미노산 서열
서열번호 23 - 142A2-LCDR2의 아미노산 서열
서열번호 24 - 142A2-LCDR3의 아미노산 서열
서열번호 25 - 142S38B-VH 전체의 뉴클레오티드 서열
서열번호 26 - 합성 구축물
서열번호 27 - 142S38B-VH의 아미노산 서열
서열번호 28 - 142S38B-HCDR1의 아미노산 서열
서열번호 29 - 142S38B-HCDR2의 아미노산 서열
서열번호 30 - 142S38B-HCDR3의 아미노산 서열
서열번호 31 - 142S38B-VL 전체의 뉴클레오티드 서열
서열번호 32 - 합성 구축물
서열번호 33 - 142S38B-VL의 아미노산 서열
서열번호 34 - 142S38B-LCDR1의 아미노산 서열
서열번호 35 - 142S38B-LCDR2의 아미노산 서열
서열번호 36 - 142S38B-LCDR3의 아미노산 서열
서열번호 37 - hCL 카파의 아미노산 서열
서열번호 38 - hIgG1_CH의 아미노산 서열
서열번호 39 - hIgG2_CH의 아미노산 서열
서열번호 40 - hIgG4 변이체의 아미노산 서열
서열번호 41 - hTL1A_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 42 - hTL1A-3'_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 43 - VCAM-플래그R-SalI_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 44 - hTL1A-EC_BamHI-R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 45 - VCAM-플래그_hTL1A_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 46 - VCAM-플래그_hTL1A_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 47 - hDR3_F5'의 뉴클레오티드 서열
서열번호 48 - hDR3-EC_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 49 - hDR3-SalI_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 50 - hDR3_hG1Fc_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 51 - hDR3_hG1Fc_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 52 - hDR3_hG1Fc_BamHI-R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 53 - hDR3-pG-NheI_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 54 - mG1Fc-pG-NheI_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 55 - mG1Fc_BamHI-R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 56 - hDR3ΔDD_BamHI_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 57 - mDR3_Fwd의 뉴클레오티드 서열
서열번호 58 - mDR3_3'_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 59 - mDR3-SalI_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 60 - mDR3(1-324)_BamHI의 뉴클레오티드 서열
서열번호 61 - IgG1 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 62 - hk5 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 63 - 142S38BA_VLF_BglI의 뉴클레오티드 서열
서열번호 64 - 142P20_VL1_BsiWI의 뉴클레오티드 서열
서열번호 65 - 142A2_BglII_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 66 - 142A2_BsiWI_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 67 - 142A2-VH_SalI_F의 뉴클레오티드 서열
서열번호 68 - 142A2-VH_NheI_R의 뉴클레오티드 서열
서열번호 69 - 142S38BA_VHF_SalI의 뉴클레오티드 서열
서열번호 70 - F429_VH_R1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 71 - IgG2 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 72 - 142A2_mvG4_HC의 아미노산 서열
서열번호 73 - 142A2_mvG4_LC의 아미노산 서열
서열번호 74 - 142S38B_mvG4_HC의 아미노산 서열
서열번호 75 - 142S38B_mvG4_LC의 아미노산 서열
서열번호 76 - 142A2-VH_G112R의 아미노산 서열
서열번호 77 - 142A2-VL_A51E의 아미노산 서열
서열번호 78 - 142A2-VL_L54Q의 아미노산 서열
서열번호 79 - 142A2-VL_A51E/L54Q의 아미노산 서열
서열번호 80 - 142A2-HCDR_G112R의 아미노산 서열
서열번호 81 - 142A2-LCDR2_A51E의 아미노산 서열
서열번호 82 - 142A2-LCDR2_L54Q의 아미노산 서열
서열번호 83 - 142A2-LCDR2_A51E/L54Q의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> ANTI-DEATH RECEPTOR 3 (DR3) ANTAGONISTIC ANTIBODIES WITH REDUCED AGONISTIC ACTIVITY <130> W518296 <150> 61/975,214 <151> 2014-04-04 <160> 83 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: TL1A-flag <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <400> 1 atg cct ggg aag atg gtc gtg atc ctt gga gcc tca aat ata ctt tgg 48 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 ata atg ttt gca gct tct caa gct gac tac aag gac gac gat gac aag 96 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 30 cta aaa gga cag gag ttt gca cct tca cat cag caa gtt tat gca cct 144 Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala Pro 35 40 45 ctt aga gca gac gga gat aag cca agg gca cac ctg aca gtt gtg aga 192 Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val Arg 50 55 60 caa act ccc aca cag cac ttt aaa aat cag ttc cca gct ctg cac tgg 240 Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp 65 70 75 80 gaa cat gaa cta ggc ctg gcc ttc acc aag aac cga atg aac tat acc 288 Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr 85 90 95 aac aaa ttc ctg ctg atc cca gag tcg gga gac tac ttc att tac tcc 336 Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser 100 105 110 cag gtc aca ttc cgt ggg atg acc tct gag tgc agt gaa atc aga caa 384 Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln 115 120 125 gca ggc cga cca aac aag cca gac tcc atc act gtg gtc atc acc aag 432 Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys 130 135 140 gta aca gac agc tac cct gag cca acc cag ctc ctc atg ggg acc aag 480 Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys 145 150 155 160 tct gta tgc gaa gta ggt agc aac tgg ttc cag ccc atc tac ctc gga 528 Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly 165 170 175 gcc atg ttc tcc ttg caa gaa ggg gac aag cta atg gtg aac gtc agt 576 Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser 180 185 190 gac atc tct ttg gtg gat tac aca aaa gaa gat aaa acc ttc ttt gga 624 Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly 195 200 205 gcc ttc tta cta tag 639 Ala Phe Leu Leu 210 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp 1 5 10 15 Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 30 Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala Pro 35 40 45 Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val Arg 50 55 60 Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp 65 70 75 80 Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr 85 90 95 Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser 100 105 110 Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln 115 120 125 Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys 130 135 140 Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys 145 150 155 160 Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly 165 170 175 Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser 180 185 190 Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly 195 200 205 Ala Phe Leu Leu 210 <210> 3 <211> 1254 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1254) <400> 3 atg gag cag cgg ccg cgg ggc tgc gcg gcg gtg gcg gcg gcg ctc ctc 48 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 ctg gtg ctg ctg ggg gcc cgg gcc cag ggc ggc act cgt agc ccc agg 96 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 tgt gac tgt gcc ggt gac ttc cac aag aag att ggt ctg ttt tgt tgc 144 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 aga ggc tgc cca gcg ggg cac tac ctg aag gcc cct tgc acg gag ccc 192 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 tgc ggc aac tcc acc tgc ctt gtg tgt ccc caa gac acc ttc ttg gcc 240 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 tgg gag aac cac cat aat tct gaa tgt gcc cgc tgc cag gcc tgt gat 288 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 gag cag gcc tcc cag gtg gcg ctg gag aac tgt tca gca gtg gcc gac 336 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 acc cgc tgt ggc tgt aag cca ggc tgg ttt gtg gag tgc cag gtc agc 384 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 caa tgt gtc agc agt tca ccc ttc tac tgc caa cca tgc cta gac tgc 432 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 ggg gcc ctg cac cgc cac aca cgg cta ctc tgt tcc cgc aga gat act 480 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 gac tgt ggg acc tgc ctg cct ggc ttc tat gaa cat ggc gat ggc tgc 528 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 gtg tcc tgc ccc acg agc acc ctg ggg agc tgt cca gag cgc tgt gcc 576 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 gct gtc tgt ggc tgg agg cag atg ttc tgg gtc cag gtg ctc ctg gct 624 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala 195 200 205 ggc ctt gtg gtc ccc ctc ctg ctt ggg gcc acc ctg acc tac aca tac 672 Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr 210 215 220 cgc cac tgc tgg cct cac aag ccc ctg gtt act gca gat gaa gct ggg 720 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 atg gag gct ctg acc cca cca ccg gcc acc cat ctg tca ccc ttg gac 768 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 agc gcc cac acc ctt cta gca cct cct gac agc agt gag aag atc tgc 816 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys 260 265 270 acc gtc cag ttg gtg ggt aac agc tgg acc cct ggc tac ccc gag acc 864 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 275 280 285 cag gag gcg ctc tgc ccg cag gtg aca tgg tcc tgg gac cag ttg ccc 912 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 agc aga gct ctt ggc ccc gct gct gcg ccc aca ctc tcg cca gag tcc 960 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 cca gcc ggc tcg cca gcc atg atg ctg cag ccg ggc ccg cag ctc tac 1008 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 gac gtg atg gac gcg gtc cca gcg cgg cgc tgg aag gag ttc gtg cgc 1056 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg 340 345 350 acg ctg ggg ctg cgc gag gca gag atc gaa gcc gtg gag gtg gag atc 1104 Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile 355 360 365 ggc cgc ttc cga gac cag cag tac gag atg ctc aag cgc tgg cgc cag 1152 Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln 370 375 380 cag cag ccc gcg ggc ctc gga gcc gtt tac gcg gcc ctg gag cgc atg 1200 Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met 385 390 395 400 ggg ctg gac ggc tgc gtg gaa gac ttg cgc agc cgc ctg cag cgc ggc 1248 Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly 405 410 415 ccg tga 1254 Pro <210> 4 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala 195 200 205 Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr 210 215 220 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys 260 265 270 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 275 280 285 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg 340 345 350 Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile 355 360 365 Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln 370 375 380 Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met 385 390 395 400 Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly 405 410 415 Pro <210> 5 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3-Fc <220> <221> CDS <222> (1)..(1299) <400> 5 atg gag cag cgg ccg cgg ggc tgc gcg gcg gtg gcg gcg gcg ctc ctc 48 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 ctg gtg ctg ctg ggg gcc cgg gcc cag ggc ggc act cgt agc ccc agg 96 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 tgt gac tgt gcc ggt gac ttc cac aag aag att ggt ctg ttt tgt tgc 144 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 aga ggc tgc cca gcg ggg cac tac ctg aag gcc cct tgc acg gag ccc 192 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 tgc ggc aac tcc acc tgc ctt gtg tgt ccc caa gac acc ttc ttg gcc 240 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 tgg gag aac cac cat aat tct gaa tgt gcc cgc tgc cag gcc tgt gat 288 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 gag cag gcc tcc cag gtg gcg ctg gag aac tgt tca gca gtg gcc gac 336 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 acc cgc tgt ggc tgt aag cca ggc tgg ttt gtg gag tgc cag gtc agc 384 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 caa tgt gtc agc agt tca ccc ttc tac tgc caa cca tgc cta gac tgc 432 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 ggg gcc ctg cac cgc cac aca cgg cta ctc tgt tcc cgc aga gat act 480 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 gac tgt ggg acc tgc ctg cct ggc ttc tat gaa cat ggc gat ggc tgc 528 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 gtg tcc tgc ccc acg agc acc ctg ggg agc tgt cca gag cgc tgt gcc 576 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 gct gtc tgt ggc tgg agg cag atg ttc ccc aaa tct tgt gac aaa act 624 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 195 200 205 cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 672 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 720 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 768 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 816 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc 864 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 912 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 960 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1008 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1056 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1104 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 1152 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 1200 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1248 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1296 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 tga 1299 <210> 6 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 <210> 7 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3-mG1Fc <220> <221> CDS <222> (1)..(936) <400> 7 atg gag cag cgg ccg cgg ggc tgc gcg gcg gtg gcg gcg gcg ctc ctc 48 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 ctg gtg ctg ctg ggg gcc cgg gcc cag ggc ggc act cgt agc ccc agg 96 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 tgt gac tgt gcc ggt gac ttc cac aag aag att ggt ctg ttt tgt tgc 144 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 aga ggc tgc cca gcg ggg cac tac ctg aag gcc cct tgc acg gag ccc 192 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 tgc ggc aac tcc acc tgc ctt gct agc gga gga gga tct gga gga gga 240 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 agt gga gga gga tct ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt 288 Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 85 90 95 aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag 336 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 100 105 110 gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta 384 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 115 120 125 gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat 432 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 130 135 140 gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc 480 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 145 150 155 160 aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc atg cac cag gac 528 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 165 170 175 tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gca gct ttc 576 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 180 185 190 cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag 624 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 195 200 205 gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag 672 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 210 215 220 gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac 720 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 225 230 235 240 att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag 768 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 245 250 255 aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac agc 816 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 260 265 270 aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca gga aat act ttc acc 864 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 275 280 285 tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat act gag aag agc 912 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 290 295 300 ctc tcc cac tct cct ggt aaa tga 936 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 8 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 85 90 95 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 100 105 110 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 115 120 125 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 130 135 140 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 145 150 155 160 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 165 170 175 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 180 185 190 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 195 200 205 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 210 215 220 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 225 230 235 240 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 245 250 255 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 260 265 270 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 275 280 285 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 290 295 300 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 9 <211> 1038 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3-DD <220> <221> CDS <222> (1)..(1038) <400> 9 atg gag cag cgg ccg cgg ggc tgc gcg gcg gtg gcg gcg gcg ctc ctc 48 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 ctg gtg ctg ctg ggg gcc cgg gcc cag ggc ggc act cgt agc ccc agg 96 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 tgt gac tgt gcc ggt gac ttc cac aag aag att ggt ctg ttt tgt tgc 144 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 aga ggc tgc cca gcg ggg cac tac ctg aag gcc cct tgc acg gag ccc 192 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 tgc ggc aac tcc acc tgc ctt gtg tgt ccc caa gac acc ttc ttg gcc 240 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 tgg gag aac cac cat aat tct gaa tgt gcc cgc tgc cag gcc tgt gat 288 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 gag cag gcc tcc cag gtg gcg ctg gag aac tgt tca gca gtg gcc gac 336 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 acc cgc tgt ggc tgt aag cca ggc tgg ttt gtg gag tgc cag gtc agc 384 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 caa tgt gtc agc agt tca ccc ttc tac tgc caa cca tgc cta gac tgc 432 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 ggg gcc ctg cac cgc cac aca cgg cta ctc tgt tcc cgc aga gat act 480 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 gac tgt ggg acc tgc ctg cct ggc ttc tat gaa cat ggc gat ggc tgc 528 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 gtg tcc tgc ccc acg agc acc ctg ggg agc tgt cca gag cgc tgt gcc 576 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 gct gtc tgt ggc tgg agg cag atg ttc tgg gtc cag gtg ctc ctg gct 624 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala 195 200 205 ggc ctt gtg gtc ccc ctc ctg ctt ggg gcc acc ctg acc tac aca tac 672 Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr 210 215 220 cgc cac tgc tgg cct cac aag ccc ctg gtt act gca gat gaa gct ggg 720 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 atg gag gct ctg acc cca cca ccg gcc acc cat ctg tca ccc ttg gac 768 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 agc gcc cac acc ctt cta gca cct cct gac agc agt gag aag atc tgc 816 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys 260 265 270 acc gtc cag ttg gtg ggt aac agc tgg acc cct ggc tac ccc gag acc 864 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 275 280 285 cag gag gcg ctc tgc ccg cag gtg aca tgg tcc tgg gac cag ttg ccc 912 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 agc aga gct ctt ggc ccc gct gct gcg ccc aca ctc tcg cca gag tcc 960 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 cca gcc ggc tcg cca gcc atg atg ctg cag ccg ggc ccg cag ctc tac 1008 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 gac gtg atg gac gcg gtc cca gcg cgg tga 1038 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg 340 345 <210> 10 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala 195 200 205 Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr 210 215 220 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys 260 265 270 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 275 280 285 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg 340 345 <210> 11 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mDR3-DD <220> <221> CDS <222> (1)..(975) <400> 11 atg gag gca cgg ctg ctg cgg ggc tgc gtg gtg gag cct ctg ttc cta 48 Met Glu Ala Arg Leu Leu Arg Gly Cys Val Val Glu Pro Leu Phe Leu 1 5 10 15 cca ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctt ggt ggc cag ggc cag ggc 96 Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gln Gly Gln Gly 20 25 30 ggc atg tct ggc agg tgt gac tgt gcc agt gag tcc cag aag agg tat 144 Gly Met Ser Gly Arg Cys Asp Cys Ala Ser Glu Ser Gln Lys Arg Tyr 35 40 45 ggc ccg ttt tgt tgc agg ggc tgc cca aag gga cac tac atg aag gcc 192 Gly Pro Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro Lys Gly His Tyr Met Lys Ala 50 55 60 ccc tgc gca gaa ccc tgt ggc aac tcc acc tgc ctt ccc tgt ccc tcg 240 Pro Cys Ala Glu Pro Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Pro Cys Pro Ser 65 70 75 80 gac acc ttc ttg acc aga gac aac cac ttt aag act gac tgt acc cgc 288 Asp Thr Phe Leu Thr Arg Asp Asn His Phe Lys Thr Asp Cys Thr Arg 85 90 95 tgc caa gtc tgt gat gaa gag gcc ctt caa gtg acc ctt gag aac tgc 336 Cys Gln Val Cys Asp Glu Glu Ala Leu Gln Val Thr Leu Glu Asn Cys 100 105 110 tcg gca aag tcg gac acc cac tgt ggc tgc cag tca ggc tgg tgt gtt 384 Ser Ala Lys Ser Asp Thr His Cys Gly Cys Gln Ser Gly Trp Cys Val 115 120 125 gac tgc tcc acc gag cca tgt ggg aaa agc tca cct ttc tct tgt gtc 432 Asp Cys Ser Thr Glu Pro Cys Gly Lys Ser Ser Pro Phe Ser Cys Val 130 135 140 cca tgc ggg gct aca aca cca gtc cat gag gct cca acc ccc cgg ccc 480 Pro Cys Gly Ala Thr Thr Pro Val His Glu Ala Pro Thr Pro Arg Pro 145 150 155 160 tgc ctg cct ggc ttc tat ata cgt ggc aat gac tgc acg tcc tgc ccc 528 Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Ile Arg Gly Asn Asp Cys Thr Ser Cys Pro 165 170 175 acg ggc ttc agc agc gtt tgc cct aag gct tgc act gct gtc tgt ggc 576 Thr Gly Phe Ser Ser Val Cys Pro Lys Ala Cys Thr Ala Val Cys Gly 180 185 190 tgg aag cag atg ttt tgg gtc cag gtg ctt cta gga gtc gcg ttc ctt 624 Trp Lys Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Gly Val Ala Phe Leu 195 200 205 ttt ggg gct atc ctg atc tgt gca tat tgt cga tgg cag cct tgt aag 672 Phe Gly Ala Ile Leu Ile Cys Ala Tyr Cys Arg Trp Gln Pro Cys Lys 210 215 220 gcc gtg gtc act gca gac aca gct ggg acg gag acc ctg gcc tca cca 720 Ala Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Gly Thr Glu Thr Leu Ala Ser Pro 225 230 235 240 cag act gcc cat ctc tca gcc tca gac agc gcc cac acc ctc ctg gca 768 Gln Thr Ala His Leu Ser Ala Ser Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala 245 250 255 cct cca agc agt act ggg aaa atc tgt acc act gtc cag ttg gta ggc 816 Pro Pro Ser Ser Thr Gly Lys Ile Cys Thr Thr Val Gln Leu Val Gly 260 265 270 aac aac tgg acc cct ggc tta tcc cag act cag gag gtg gtc tgc gga 864 Asn Asn Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gln Thr Gln Glu Val Val Cys Gly 275 280 285 cag gcc tca caa ccc tgg gat cag ctg cca aac aga act ctt gga act 912 Gln Ala Ser Gln Pro Trp Asp Gln Leu Pro Asn Arg Thr Leu Gly Thr 290 295 300 cct ctg gca tct ccg ctc tcg cca gcg ccc cct gcg ggc tct ccg gct 960 Pro Leu Ala Ser Pro Leu Ser Pro Ala Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala 305 310 315 320 gct gtg ctc cag tga 975 Ala Val Leu Gln <210> 12 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Met Glu Ala Arg Leu Leu Arg Gly Cys Val Val Glu Pro Leu Phe Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gln Gly Gln Gly 20 25 30 Gly Met Ser Gly Arg Cys Asp Cys Ala Ser Glu Ser Gln Lys Arg Tyr 35 40 45 Gly Pro Phe Cys Cys Arg Gly Cys Pro Lys Gly His Tyr Met Lys Ala 50 55 60 Pro Cys Ala Glu Pro Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Pro Cys Pro Ser 65 70 75 80 Asp Thr Phe Leu Thr Arg Asp Asn His Phe Lys Thr Asp Cys Thr Arg 85 90 95 Cys Gln Val Cys Asp Glu Glu Ala Leu Gln Val Thr Leu Glu Asn Cys 100 105 110 Ser Ala Lys Ser Asp Thr His Cys Gly Cys Gln Ser Gly Trp Cys Val 115 120 125 Asp Cys Ser Thr Glu Pro Cys Gly Lys Ser Ser Pro Phe Ser Cys Val 130 135 140 Pro Cys Gly Ala Thr Thr Pro Val His Glu Ala Pro Thr Pro Arg Pro 145 150 155 160 Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Ile Arg Gly Asn Asp Cys Thr Ser Cys Pro 165 170 175 Thr Gly Phe Ser Ser Val Cys Pro Lys Ala Cys Thr Ala Val Cys Gly 180 185 190 Trp Lys Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Gly Val Ala Phe Leu 195 200 205 Phe Gly Ala Ile Leu Ile Cys Ala Tyr Cys Arg Trp Gln Pro Cys Lys 210 215 220 Ala Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Gly Thr Glu Thr Leu Ala Ser Pro 225 230 235 240 Gln Thr Ala His Leu Ser Ala Ser Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala 245 250 255 Pro Pro Ser Ser Thr Gly Lys Ile Cys Thr Thr Val Gln Leu Val Gly 260 265 270 Asn Asn Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gln Thr Gln Glu Val Val Cys Gly 275 280 285 Gln Ala Ser Gln Pro Trp Asp Gln Leu Pro Asn Arg Thr Leu Gly Thr 290 295 300 Pro Leu Ala Ser Pro Leu Ser Pro Ala Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala 305 310 315 320 Ala Val Leu Gln <210> 13 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VH full <220> <221> CDS <222> (1)..(456) <400> 13 atg tct gtc tcc ttc ctc atc ttc ctg ccc gtg ctg ggc ctc cca tgg 48 Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 1 5 10 15 ggt gtc ctg tca cag gta cag cta cag cag tca ggt cca gga ctg gtg 96 Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30 aag ccc tcg cag acc ctc tca ctc acc tgt gcc atc tcc ggg gac agt 144 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45 gtc tct ggg tac agt gct gct tgg aac tgg atc agg cag tcc cca tcg 192 Val Ser Gly Tyr Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60 aga ggc ctt gag tgg ctg gga agg aca tac tac agg tcc aag tgg tat 240 Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80 aat gat tat gca gta tct gtg aaa agt cga ata acc atc aac cca gac 288 Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp 85 90 95 aca tcc aag aac cag ttc tcc ctg cag ctg aac tct gtg act ccc gag 336 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110 gac acg gct gtg tat tac tgt gca aga gat tac tat ggt tcg gag agt 384 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser 115 120 125 tat tat aac ggg ggg tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa 432 Tyr Tyr Asn Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 130 135 140 ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 456 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 145 150 <210> 14 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 1 5 10 15 Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45 Val Ser Gly Tyr Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80 Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser 115 120 125 Tyr Tyr Asn Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 130 135 140 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 145 150 <210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VH <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Gly 100 105 110 Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-HCDR1 <400> 16 Gly Tyr Ser Ala Ala Trp Asn 1 5 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-HCDR2 <400> 17 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-HCDR3 <400> 18 Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 19 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VL full <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 19 atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctt ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc cca ggt gcc aga tgt gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc 96 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 ccg ggc att agc agt gct tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa 192 Pro Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 gct cct aag ctc ctg atg tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc 240 Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 288 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 atc agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag 336 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 ttt aat gat tac ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc 384 Phe Asn Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 aaa 387 Lys <210> 20 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Pro Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VL <400> 21 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-LCDR1 <400> 22 Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-LCDR2 <400> 23 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-LCDR3 <400> 24 Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 25 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-VH full <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <400> 25 atg gag ttt ggg ctg agc tgg ctt ttt ctt gtg gct att tta aaa ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc gtt 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val 35 40 45 agc aga tat gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg 192 Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtc tca gct att agt gat agt ggt ggt cgc aca tac tac gca 240 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 gac tcc gtg atg ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac act tcc aag aac 288 Asp Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 acg ctg tat ctc caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta 336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat ttc tgt gcg aaa gag ttc ggt gac tac ctt gac tac tgg ggc cag 384 Tyr Phe Cys Ala Lys Glu Phe Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 408 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 26 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val 35 40 45 Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Lys Glu Phe Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 27 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-VH <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Phe Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-HCDR1 <400> 28 Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-HCDR2 <400> 29 Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-HCDR3 <400> 30 Glu Phe Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 31 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-VL full <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <400> 31 atg gaa gcc cca gct cag ctt ctc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca 48 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 gat acc acc gga gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct 96 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 ttg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtt agc agc tac tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc 192 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 agg ctc ctc atc tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc 240 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc cta gag cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc 336 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 aac tgg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 378 Asn Trp Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 32 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 33 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-VL <400> 33 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-LCDR1 <400> 34 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-LCDR2 <400> 35 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA-LCDR3 <400> 36 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Trp Thr 1 5 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hCL kappa <400> 37 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 38 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hIgG1 CH <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 39 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hIgG2 CH <400> 39 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 40 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: IgG4 variant <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hTL1A_F <400> 41 atggccgagg atctgggact gagctttg 28 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hTL1A-3?f_R <400> 42 ccgttgtccc tgtggaatgc cccctac 27 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: VCAM-FLAGR-SalI_F <400> 43 agagaggtcg accaccatgc ctgggaagat ggtcgtgatc c 41 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hTL1A-EC_BamHI-R <400> 44 agagagggat ccctatagta agaaggctcc aaagaaggtt ttatc 45 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: VCAM-FLAG_hTL1A_F <400> 45 cgacgatgac aagctaaaag gacaggagtt tgcaccttca c 41 <210> 46 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: VCAM-FLAG_hTL1A_R <400> 46 cctgtccttt tagcttgtca tcgtcgtcct tgtagtcagc ttg 43 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3_F5?f <400> 47 gaaggcggaa ccacgacggg cag 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3-EC_R <400> 48 tggtggggtc agagcctcca tcc 23 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3-SalI_F <400> 49 agagaggtcg accaccatgg agcagcggcc gcggggctgc 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3_hG1Fc_R <400> 50 cacaagattt ggggaacatc tgcctccagc cacagacagc 40 <210> 51 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3_hG1Fc_F <400> 51 gaggcagatg ttccccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgc 43 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hG1Fc_BamHI-R <400> 52 agagagggat cctcatttac ccggagacag ggagaggctc 40 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3-pG-NheI_R <400> 53 ctccagatcc tcctccgcta gcaaggcagg tggagttgcc gc 42 <210> 54 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mG1Fc-pG-NheI_F <400> 54 gctagcggag gaggatctgg aggaggaagt ggaggaggat ctcccaggga ttgtggttgt 60 aagc 64 <210> 55 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mG1Fc_BamHI-R <400> 55 agagagggat cctcatttac caggagagtg ggagaggctc ttc 43 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hDR3??DD_BamHI_R <400> 56 agagagggat cctcaccgcg ctgggaccgc gtccatcac 39 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mDR3_Fwd <400> 57 atggaggcac ggctgctgcg gggctg 26 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mDR3_3?f_ R <400> 58 ctgctacgca ggaccacggc agggggttag 30 <210> 59 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mDR3-SalI_F <400> 59 agagaggtcg accaccatgg aggcacggct gctgcggggc tg 42 <210> 60 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: mDR3(1-324)_BamHI <400> 60 agagagggat cctcactgga gcacagcagc cggagagc 38 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: IgG1 primer <400> 61 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: hk5 primer <400> 62 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA_VLF_Bgll <400> 63 atatagatct ccaccatgga agccccagct cag 33 <210> 64 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142P20_VL1_BsiWI_ <400> 64 tatacgtacg tttgatttcc accttggtcc ct 32 <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2_BglII_F <400> 65 atatagatct ccaccatgag ggtccccgct cagctc 36 <210> 66 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2_BsiWI_R <400> 66 atatcgtacg tttgatctcc accttggtcc ctccgc 36 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VH_SalI_F <400> 67 atatgtcgac ccaccatgtc tgtctccttc ctcatcttcc 40 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VH_NheI_R <400> 68 atatgctagc tgaggagacg gtgaccgtgg 30 <210> 69 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142S38BA_VHF_SalI <400> 69 tatagtcgac caccatggag tttgggctga gc 32 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: F429_VH_R1 <400> 70 ttgctagctg aggagacggt gacc 24 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DEscription of the artificial sequence; IgG2 primer <400> 71 gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26 <210> 72 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence; 142A2_mvG4_HC <400> 72 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Gly 100 105 110 Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 355 360 365 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 <210> 73 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence; 142A2_mvG4_LC <400> 73 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 74 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence; 142S38B_mvG4_HC <400> 74 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Phe Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 75 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence; 142S38B_mvG4_LC <400> 75 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 76 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VH_G112R <400> 76 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Arg 100 105 110 Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VL_A51E <400> 77 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Asp Glu Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Dscription of the artificial sequence: 142A2-VL_ L54Q <400> 78 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Gln Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-VL_A51E-L54Q <400> 79 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Asp Glu Ser Ser Gln Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-HCDR_G112R <400> 80 Asp Tyr Tyr Gly Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-LCDR2_A51E <400> 81 Asp Glu Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-LCDR2_L54Q <400> 82 Asp Ala Ser Ser Gln Glu Ser 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: 142A2-LCDR2_A51E/L54Q <400> 83 Asp Glu Ser Ser Gln Glu Ser 1 5

Claims (14)

  1. 사멸 수용체 3(DR3)에 결합하고 TL1A 유도된 DR3 활성화를 길항하는 면역글로불린 G(이하, IgG로서 기재됨) 항체로서, 그들의 결합을 통해 DR3에 대한 감소된 효현 활성(agonistic activity)을 갖거나 효현 활성을 갖지 않는 항체 또는 이의 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, DR3의 시스테인-풍부 도메인(이하, CRD로서 기재됨)에 제시된 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  3. 제1항에 있어서, DR3의 CRD1 또는 CRD4에 제시된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  4. 제1항에 있어서, IgG2 항체, IgG2의 힌지 도메인을 포함하는 IgG2 항체 변이체, 및 IgG2와 IgG4 사이에 도메인 교환된 항체로부터 선택되는 항체 또는 이의 항체 단편으로서, EU 넘버링 위치 409에서 아미노산 잔기가 Lys인 항체 또는 이의 항체 단편.
  5. 제1항에 있어서, TL1A 리간드 결합을 통해 유도된 DR3의 활성을 중화시키고/시키거나 길항하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 효현 활성이 NF-카파 B의 p65 서브유닛의 인산화, DR3 발현된 세포로부터의 사이토카인 방출, DR3 발현된 세포의 증식 및 DR3 발현된 세포의 아폽토시스로부터 선택된 하나 이상인 항체 또는 이의 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기에 기재된 (i) 내지 (iii)으로부터 선택된 하나 이상의 항체인 항체 또는 이의 항체 단편:
    (i) 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B와 경쟁적으로 DR3에 결합하는 항체,
    (ii) 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B에 의해 인식되는 에피토프에 제시된 에피토프에 결합하는 항체, 및
    (iii) 항-DR3 단일클론 항체 142A2 또는 142S38B에 의해 인식되는 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  9. 제1항에 있어서, 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 또는 각각 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  10. 제1항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디, 디설파이드 안정화된 Fv(dsFv), 항체의 6개 CDR들을 포함하는 펩티드 및 Fc 융합 단백질로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항체 단편.
  11. 제10항에 있어서, Fc 융합 단백질이 하기 (i) 내지 (iii)으로부터 선택되는, Fc 영역에 융합된 Fab 또는 scFv인 항체 또는 이의 항체 단편:
    (i) 2개의 Fab들 또는 scFv들이 IgG 클래스의 Fc 영역에 융합되어 있는 2가 항체,
    (ii) 1개의 Fab 또는 scFv가 Fc 영역에 융합되어 있는 1가 항체, 및
    (iii) H 쇄 및 Fc-융합된 L-쇄(이하, FL로서 기재됨)를 포함하는 1가 항체.
  12. 제11항에 있어서, Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG4 및 이들의 변이체로부터 선택되는 것인 항체 또는 이의 항체 단편.
  13. 제10항에 있어서, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 21의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 77의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 78의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 15의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 서열번호 76의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 79의 VL의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 VH의 아미노산 서열 및 서열번호 33의 VL의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
  14. 제10항에 있어서, 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22 내지 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 81 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16 내지 18의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 82 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 각각 서열번호 16, 17 및 80의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 22, 83 및 24의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열; 또는 각각 서열번호 28 내지 30의 VH의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열, 및 각각 서열번호 34 내지 36의 VL의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편.
KR1020167027209A 2014-04-04 2015-04-03 감소된 효현 활성을 가진 항-사멸 수용체 3(dr3) 길항성 항체 KR20160138083A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461975214P 2014-04-04 2014-04-04
US61/975,214 2014-04-04
PCT/JP2015/061298 WO2015152430A1 (en) 2014-04-04 2015-04-03 Anti-death receptor 3 (dr3) antagonistic antibodies with reduced agonistic activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160138083A true KR20160138083A (ko) 2016-12-02

Family

ID=54240732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167027209A KR20160138083A (ko) 2014-04-04 2015-04-03 감소된 효현 활성을 가진 항-사멸 수용체 3(dr3) 길항성 항체

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20170190781A1 (ko)
EP (1) EP3126396A4 (ko)
JP (1) JP2017511381A (ko)
KR (1) KR20160138083A (ko)
CN (1) CN107001462A (ko)
AU (1) AU2015242752A1 (ko)
CA (1) CA2944571A1 (ko)
SG (1) SG11201608253XA (ko)
WO (1) WO2015152430A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023244089A1 (ko) * 2022-06-17 2023-12-21 주식회사 셀렉신 인간 dr3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017077715A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 La Jolla Institute For Allergy & Immunology Method and medicament for treating airway and/or lung diseases
EP3596130A4 (en) * 2017-03-14 2020-12-30 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. DOUBLE TARGET FUSION PROTEINS WITH FC PORTION OF AN IMMUNE LOBULIN
MX2021007797A (es) * 2018-12-28 2021-10-26 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo biespecifico que se une al receptor de transferrina (tfr).
PE20221506A1 (es) 2019-12-17 2022-10-04 Amgen Inc Agonista doble de interleucina-2/receptor de tnf para uso en terapia

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6994976B1 (en) 1999-11-19 2006-02-07 Tittle Thomas V Tr3-specific binding agents and methods for their use
US7357927B2 (en) 1996-03-12 2008-04-15 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
WO2011106707A2 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to dr3
WO2012014950A1 (ja) 2010-07-27 2012-02-02 日精エー・エス・ビー機械株式会社 耐熱容器の加熱成形装置
WO2012117067A1 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Novo Nordisk A/S Antagonistic dr3 ligands

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4478200A (en) * 1999-04-22 2000-11-10 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
CA2391530A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Thomas V. Tittle Tr3-specific binding agents and methods for their use
US8911726B2 (en) * 2004-09-22 2014-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human Igg4 antibodies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7357927B2 (en) 1996-03-12 2008-04-15 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
US6994976B1 (en) 1999-11-19 2006-02-07 Tittle Thomas V Tr3-specific binding agents and methods for their use
WO2011106707A2 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to dr3
WO2012014950A1 (ja) 2010-07-27 2012-02-02 日精エー・エス・ビー機械株式会社 耐熱容器の加熱成形装置
WO2012117067A1 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Novo Nordisk A/S Antagonistic dr3 ligands

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NPL 1: Meylan et al., Mucosal Immunol., 2013; doi: 10.1038/mi.2013.1141-11
NPL 2: Fang et al., J Exp Med., 2008; 205:1037-1048
NPL 3: Migone at al., Immunity, 2002; 16: 479-492
NPL 4: Meylan et al., Mucosal Immunol., 2010; 4; 172-185
NPL 5: Wen et al., The Journal of Biological Chemistry, 2003; 278: 39251-39258
NPL 6: 1H2 마우스 단일클론 항체의 데이터 시트, 카탈로그 번호 H00008718-M08

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023244089A1 (ko) * 2022-06-17 2023-12-21 주식회사 셀렉신 인간 dr3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2944571A1 (en) 2015-10-08
EP3126396A4 (en) 2017-09-06
CN107001462A (zh) 2017-08-01
EP3126396A1 (en) 2017-02-08
WO2015152430A1 (en) 2015-10-08
SG11201608253XA (en) 2016-10-28
AU2015242752A1 (en) 2016-10-20
US20170190781A1 (en) 2017-07-06
JP2017511381A (ja) 2017-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10550181B2 (en) Anti-TIM-3 antibody
US8877913B2 (en) Anti-CD4 antibody
US20120237518A1 (en) Anti-trop-2 antibody
WO2012176779A1 (ja) 抗ｅｒｂＢ３抗体
WO2012074097A1 (ja) 抗ｃｄ３３抗体
US20170190781A1 (en) Anti-death receptor 3 (dr3) antagonistic antibodies with reduced agonistic activity
US10100120B2 (en) Antibody which specifically binds to human CRTH2
JP6803231B2 (ja) 抗ヒトＧａｓ６モノクローナル抗体
US11912775B2 (en) Anti-human CCR1 monoclonal antibody
JP7502281B2 (ja) Ｃｄ４０とｇｐｃ３に結合するバイスペシフィック抗体