KR20160137039A - Matrigel coating plate for neural stem cell culture - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a neural stem cell culturing plate, and a method for culturing a neural stem cell by using the same. According to the present invention, a matrix capable of replacing laminin mainly used as a material for coating a plate when a cell is cultured and an optimized concentration re provided, so mass-culturing and long-culturing can be economically performed in vitro while multipotency of a neural stem cell is maintained.

Description

마트리겔이 코팅된 신경줄기세포 배양용 플레이트{MATRIGEL COATING PLATE FOR NEURAL STEM CELL CULTURE}[0001] MATRIGEL COATING PLATE FOR NEURAL STEM CELL CULTURE [0002]

본 발명은 신경줄기세포(neural stem cell) 배양용 플레이트 및 이를 이용한 신경줄기세포 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않는 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트 및 이를 이용한 신경줄기세포 배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to a plate for culturing neural stem cells and a method for culturing neural stem cells using the same, and more particularly, to a plate coated with matrigel not containing a feeder cell, And a method for culturing neural stem cells.

신경줄기세포(neural stem cell)는 뉴런(neurons)과 신경교세포(glial cell)와 같은 신경세포(neural cell)로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 신경계질환(neurological disorders)의 치료에 있어서 중요한 의미가 있는 줄기세포(stem cell type)이다.Because neural stem cells have the ability to differentiate into neurons, such as neurons and glial cells, they have important implications for the treatment of neurological disorders It is a stem cell type.

신경줄기세포는 태아 또는 성인의 뇌에서 얻을 수 있고, 신경줄기세포의 체외 증식은 신경발생에 있어서 신경줄기세포의 속성을 연구하는데 도움이 될 수 있을 뿐만 아니라 임상적 이식 실험에서 요구되는 세포의 수를 얻을 수 있다는 점에서도 중요하다.Neural stem cells can be obtained from the fetal or adult brain, and the in vitro proliferation of neural stem cells can not only help to study the properties of neural stem cells in neurogenesis, but also obtain the number of cells required for clinical implantation experiments It is also important in that it is.

뉴로스피어(neurosphere)는 신경줄기세포의 단일세포 서스펜션(single-cell suspension)을 형성한다. 체외에서 신경줄기세포를 증식시키기 위한 방법으로 뉴로스피어의 배양이 자주 사용된다. 그러나 뉴로스피어 배양방법(neurosphere culture method)에는 몇 가지 한계점이 있다.Neurospheres form single-cell suspensions of neural stem cells. Neurosphere cultures are frequently used as a method for propagating neural stem cells in vitro. However, there are some limitations to the neurosphere culture method.

뉴로스피어는 다양한 분화단계의 신경세포를 포함하는 헤테로제너스(heterogeneous)이다(뉴로스피어의 중앙부에 위치한 세포들의 분화가 표면에 위치한 세포들 보다 분화가 더 진행된 상태이다). 또한, 분화단계가 다른 종류의 세포로 인한 증식 및 분화능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 각각의 뉴로스피어에서 세포 밀도(cell density)의 변화에 대한 데이터를 통합하는데 어려움이 발생한다.The neurosphere is heterogeneous, containing neurons of various differentiation stages (the differentiation of cells located in the middle of the neurosphere is more differentiated than the cells located on the surface). Also, since differentiation stages can affect the proliferation and differentiation potential of different types of cells, it is difficult to integrate data on cell density changes in each neurosphere.

반면, 2-dimensional adherent monolayer culture system(2D 단일층 접착 배양 시스템)은 신경줄기세포의 호모제너스(homogenou) 배양이 가능하고, 뉴로스피어 배양 시스템(neurosphere culture system)과 비교하여 단기간에 대량의 세포(larger cell population)를 발생시키는데 적합하다.On the other hand, the 2-dimensional adherent monolayer culture system can be used to culture homogenous neural stem cells, larger cell population.

호모제너스(homogenous) 줄기세포 파퓰레이션(population)은 분화를 조절하거나 분화 메커니즘을 연구하는데 유용하게 활용될 수 있다.Homogenous stem cell populations can be useful for controlling differentiation or studying differentiation mechanisms.

한편, 신경줄기세포의 증식을 위한 단일층(monolayer) 배양에 있어서, 배양 플레이트(culture surface)의 코팅을 위해서 적절한 ECM(extracellular matrix) 분자(molecules)의 사용이 필요하며, 일반적으로 사용되는 ECM은 라미닌(laminin)이다.On the other hand, in monolayer cultures for the growth of neural stem cells, the use of appropriate ECM (extracellular matrix) molecules for the coating of the culture surface is required, and commonly used ECMs are laminin (laminin).

그러나 대량으로 신경줄기세포를 배양할 때 필요로 하는 라미닌은 상당히 고가인 문제점이 있다.However, there is a problem that laminin required for culturing a large amount of neural stem cells is extremely expensive.

반면, 마트리겔은 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체로서(BD Bioscience사의 제품명), 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)와 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 상피세포 성장인자(epiderma growth factor, EFG), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta, TGF-β), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)와 같은 성장인자를 함유한다.On the other hand, Matrigel is a protein complex extracted from breeding cells of EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) mice (product name of BD Bioscience), laminin, collagen, heparan sulfate proteoglycan It has been shown that the same extracellular matrix (ECM) and fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EFG), insulin-like growth factor (IGF) And growth factors such as transforming growth factor-beta (TGF-beta) and platelet-derived growth factor (PDGF).

마트리겔을 이루고 있는 복합체는 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포외 환경을 제공함으로써 세포 배양을 위한 기질로서 이용되고 있다.Matrigel complexes are used as a substrate for cell culture by providing a complex extracellular environment found in many tissues.

마트리겔은 허혈성 동물 모델(ischemic animal model)에서 이식된 심근세포(cardiomyocytes cell)와 내피세포(endothelial cells)의 생존을 강화하기 위해 사용된바 있고, 배아줄기세포는 자기재생능(self-renewability)과 다분화능(pluripotency)이 있기 때문에 마우스와 인간의 배아줄기세포(embryoni stem cell, ESC)를 체외배양 함에 있어서 마트리겔이 사용되어 왔다.Matrigel has been used to enhance the survival of cardiomyocyte cells and endothelial cells in ischemic animal models and embryonic stem cells have been used for self- And pluripotency, matrigel has been used for in vitro culture of mouse embryonic stem cells (ESCs) and human embryonic stem cells (ESCs).

그러나 배아줄기세포와 처리하여야 할 Growth factor, cytokine 등이 전혀 상이할 뿐만 아니라 배양조건이 전혀 다른 신경줄기세포의 체외배양을 위해서 마트리겔이 활용된 바는 없으며, 다분화능을 유지시키면서 경제적인 비용으로 신경줄기세포를 장기 및 대량배양할 수 있는 최적화된 마트리겔의 농도에 관하여도 개시하고 있는 선행문헌은 없다.However, there is no difference between embryonic stem cells and growth factors and cytokines to be treated. Matrigel has not been used for in vitro culture of neural stem cells, which have completely different culture conditions. In addition to maintaining pluripotency, There is no prior literature disclosing the optimized concentration of matrigel that can be used for long-term and large-scale cultivation of the cells.

참고적으로, 본 발명자들은 최근에 정원줄기세포(spermatogonial stem cell, SSC)를 마트리겔을 이용하여 피더세포(feeder cell) 없이 장기간 성공적으로 체외에서 안정적으로 배양할 수 있다는 사실을 실험적으로 확인한 바 있다(한국특허출원 제10-2014-0034632호).For reference, the present inventors have recently experimentally confirmed that spermatogonial stem cells (SSC) can be stably cultured in vitro for a long period of time without using a feeder cell using Matrigel (Korean Patent Application No. 10-2014-0034632).

한편, 본 발명과 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제10-0386880호(세포배양용 배지), 한국등록특허 제10-1389851호(신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도) 등이 있다.Prior art related to the present invention includes Korea Patent No. 10-0386880 (culture medium for cell culture) and Korean Patent No. 10-1389851 (culture method of neural crest stem cells and its use).

본 발명은 체외에서 경제적인 비용으로 다분화능을 유지시키면서 대량의 신경줄기세포(neural stem cell)를 배양할 수 있는 신경줄기세포 배양용 플레이트를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a plate for culturing a neural stem cell capable of culturing a large amount of neural stem cells while maintaining pluripotency at an economical cost in vitro.

또한 본 발명은 체외에서 경제적인 비용으로 다분화능을 유지시키면서 대량의 신경줄기세포(neural stem cell)를 배양할 수 있는 신경줄기세포 배양 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a neural stem cell culturing method capable of culturing a large amount of neural stem cells while maintaining pluripotency at an economical cost in vitro.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 청구범위에 나타낸 수단 및 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.The objects of the present invention are not limited to the above-mentioned objects, and other objects and advantages of the present invention which are not mentioned can be understood by the following description, and will be more clearly understood by the embodiments of the present invention. It will also be readily apparent that the objects and advantages of the invention may be realized and attained by means of the instrumentalities and combinations particularly pointed out in the appended claims.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 신경줄기세포 배양용 플레이트는 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 마트리겔(matrigel)이 코팅된 것을 일 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the plate for culturing a neural stem cell of the present invention does not include a feeder cell and is characterized by being coated with matrigel.

상기 플레이트를 코팅하는 마트리겔은 다양한 농도의 마트리겔을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.02 내지 0.5% 농도의 마트리겔을 사용하여 플레이트를 코팅하는 것이고, 더욱 바람직하게는 0.02% 농도의 마트리겔을 사용하는 것이다. 상기 마트리겔은 1%의 마트리겔 용액을 DPBS로 희석하여 농도를 조절할 수 있다.The matrigel coating the plate may use matrigel in various concentrations, preferably coating the plate using a matrigel in a concentration of 0.02 to 0.5%, more preferably using a matrigel in a concentration of 0.02% . The Matrigel can be adjusted in concentration by diluting a 1% Matrigel solution with DPBS.

한편, 본 발명에 의한 마트리겔이 코팅된 플레이트는 마트리겔의 농도에 따라 신경줄기세포 뿐만 아니라 다양한 줄기세포의 체외배양을 위해서 사용될 수 있고, 신경줄기세포에 한정하여서만 사용될 수 있는 것은 아니다.Meanwhile, the plate coated with Matrigel according to the present invention can be used for in vitro culture of various stem cells as well as neural stem cells depending on the concentration of matrigel, and can not be used only for neural stem cells.

또한, 본 발명의 신경줄기세포 배양방법은 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트를 이용하여 배양하는 것을 일 특징으로 한다.In addition, the neural stem cell culturing method of the present invention is characterized in that culturing is performed using a matrigel-coated plate without containing a feeder cell.

상기 마트리겔이 코팅된 플레이트는 다양한 농도의 마트리겔이 코팅된 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.02 내지 0.5% 농도의 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용하는 것이고, 더욱 바람직하게는 0.02% 농도의 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용하는 것이다. 상기 마트리겔은 1%의 마트리겔 용액을 DPBS로 희석하여 농도를 조절할 수 있다.The plate coated with the matrigel may be coated with a matrigel in various concentrations. Preferably, a plate coated with a matrigel at a concentration of 0.02 to 0.5% is used. More preferably, a plate coated with the matrigel at a concentration of 0.02% A plate coated with a ligase is used. The Matrigel can be adjusted in concentration by diluting a 1% Matrigel solution with DPBS.

한편, 본 발명의 신경줄기세포 배양방법은 배양대상이 되는 줄기세포의 종류에 따라 다양한 농도의 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용할 수 있고, 신경줄기세포에 한정하여서만 사용될 수 있는 배양방법은 아니다. Meanwhile, the neural stem cell culture method of the present invention can use a plate coated with matrigel at various concentrations depending on the type of stem cells to be cultured, and is not a culture method that can be used only for neural stem cells.

상기와 같은 본 발명은 세포배양시 플레이트를 코팅하기 위한 재료로써 주로 사용되고 있는 라미닌(laminin)을 대체할 수 있는 매트릭스(marix) 및 최적화된 농도를 제공함으로써, 신경줄기세포의 다분화능을 유지시키면서 경제적인 방법으로 체외에서 대량배양 및 장기배양을 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.As described above, the present invention provides a matrix (marix) capable of replacing laminin, which is mainly used as a material for coating a plate during cell culture, and an optimal concentration, thereby providing an economical It is possible to carry out mass culture and organ culture in vitro.

도 1 은 0.1% 젤라틴, 라미닌, 0.01-1.0% 마트리겔이 코팅된 플레이트에 펼쳐진(expanded) 신경줄기세포의 형태를 나타낸 것이다(배양접시 표면의 신경줄기세포를 위상차 현미경(phase contrast microscope)를 이용하여 관찰한 것이다, 0.01% 젤라틴과 0.01% 마트리겔은 신경줄기세포의 부착을 유지시킬 수 없었기 때문에 신경줄기세포의 부착을 유지시킬 수 있는 최소한의 마트리겔 농도는 0.02%이다).(scale bars : 100㎛)
도 2 는 신경줄기세포의 증식을 나타낸 그래프이다(총 세포 수(A)와 생존 세포 수(B)는 6번째 계대까지 각 계대마다 세포수를 센 것이다. 0.02% 마트리겔(M)은 라미닌과 유사하게 신경줄기세포를 증식시킬 수 있음을 나타낸다).
도 3 은 신경줄기세포의 세포 및 분자적 특성을 나타낸 것이다((a)신경줄기세포 특이적 유전자 발현을 확인한 RT-PCR 분석결과이다. Line 1 : murine embryonic fibroblasts(MEF), Line 2 : laminin, Line 3-9 : Matrigel, (b)신경줄기세포 특이적 마커인 Sox2(green), Nestin(red), DAPI(blue)의 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 것이다).(scale bars : 50㎛).
도 4 는 0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포의 다분화능을 나타낸 것이다(뉴런(neurons) 특이적 마커 Tuj1(red), Map2(red), 성상교세포(astrocytes) 특이적 마터 GFAP(green), 희돌기교세포(oligodendrocytes) 특이적 마커 O4(red)) (뉴런, 성상교세포, scale bars : 100㎛; 희돌기교세포, scale bars : 50㎛).1 shows the shape of an expanded neural stem cell on a plate coated with 0.1% gelatin, laminin, 0.01-1.0% matrigel (the neural stem cells on the surface of the culture dish were observed using a phase contrast microscope Since 0.01% gelatin and 0.01% matrigel were not able to maintain the adhesion of neural stem cells, the minimum matrigel concentration that could maintain neural stem cell adhesion was 0.02%. (Scale bars: 100 μm)
Figure 2 is a graph showing the proliferation of neural stem cells (total cell number (A) and number of viable cells (B) are counted in each passage to the 6th passage) 0.02% Matrigel (M) Indicating that neural stem cells can be proliferated.
Figure 3 shows the cell and molecular characteristics of neural stem cells ((a) RT-PCR analysis confirming specific gene expression of neural stem cells Line 1: murine embryonic fibroblasts (MEF), Line 2: laminin, Line 3 -9: Matrigel, (b) Immunocytochemical analysis of neural stem cell specific markers Sox2 (green), Nestin (red) and DAPI (blue).
Figure 4 shows the ability of differentiation of neural stem cells cultured on 0.02% matrigel (neurons specific markers Tuj1 (red), Map2 (red), astrocytes specific marker GFAP (green) Oligodendrocytes-specific marker O4 (red)) (neurons, astrocytes, scale bars: 100 μm; spindle cells, scale bars: 50 μm).

상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기고 한다. 이하, 첨부된 도면들을 함께 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The above and other objects, features and advantages of the present invention will become more apparent from the following description taken in conjunction with the accompanying drawings, in which: FIG. You can do it. In the following description, well-known functions or constructions are not described in detail since they would obscure the invention in unnecessary detail. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

실시예 1. 매트릭스 준비(matrix preparation)EXAMPLES Example 1: Matrix preparation [

마트리겔(matrigel, BD Biosciences) 또는 라미닌(laminin, Sigma-Aldrich)으로 플레이트를 코팅하였으며, 코팅시 사용된 마트리겔의 제조과정과 플레이트 코팅과정을 구체적으로 살펴보면 아래와 같다. Plates were coated with matrigel (BD Biosciences) or laminin (Sigma-Aldrich). The manufacturing process of the matrigel used in the coating and the plate coating process will be described in detail as follows.

(1) 마트리겔 코팅(1) Matrigel coating

마트리겔 병을 4℃ 냉장고에서 액체가 될 때까지 하룻밤 동안 해동시키고, 마트리겔을 300㎕로 나누어 -20℃에서 보관하였다.The Matrigel bottle was thawed overnight at 4 ° C in a refrigerator until it became a liquid, and Matrigel was divided into 300 μl and stored at -20 ° C.

마트리겔이 코팅된 플레이트를 준비하기 위해 마트리겔 300㎕를 29㎖의 DMEM/F12 배지(Invitrogen)에 희석하여 1% 마트리겔 용액을 준비하였고, 1% 마트리겔 용액을 DPBS(dulbecco's phosphate-buffered saline, Hyclone)으로 희석하여 0.5, 0.25, 0.1, 0.02, 0.01%의 마트리겔 용액을 준비하였다.To prepare a plate coated with Matrigel, 300 μl of Matrigel was diluted in 29 ml of DMEM / F12 medium (Invitrogen) to prepare a 1% Matrigel solution. The 1% Matrigel solution was dissolved in DPBS (dulbecco's phosphate-buffered saline , Hyclone) to prepare Matrigel solutions of 0.5, 0.25, 0.1, 0.02, and 0.01%.

상기 마트리겔 용액을 12-웰 플레이트(웰당 1㎖) 또는 24-웰 플레이트(웰당 0.5㎖)에 가하여 웰 전체 표면을 커버한 후, 15분간 37℃의 세포 배양 인큐베이터(cell culture incubator)에서 보관하였다.The Matrigel solution was added to a 12-well plate (1 ml per well) or a 24-well plate (0.5 ml per well) to cover the whole surface of the wells and then stored in a cell culture incubator for 15 minutes at 37 ° C .

이후, 애스퍼레이션(asperation)을 통해 초과된 잔여 마트리겔 용액을 제거하고 DMEM/F12로 플레이트를 한 번 세척하였다.Subsequently, excess residual Matrigel solution was removed by asperation and the plates were washed once with DMEM / F12.

(2) 라미닌 코팅(2) Laminin coating

라미닌 저장용액(1㎎/㎖)을 50㎕로 나누어 -20℃에서 보관하였다. The laminin stock solution (1 mg / ml) was divided into 50 쨉 l and stored at -20 째 C.

DPBS가 함유된 저장용액으로 희석한 라미닌 워킹 용액(20㎍/㎖)을 12-웰 플레이트(웰당 1㎖) 또는 24-웰 플레이트(웰당 ㎖)로 가하여 준비한 후 2시간 동안 37℃의 세포 배양 인큐베이터(cell culture incubator)에서 보관하였다.(20 μg / ml) diluted with a stock solution containing DPBS was added to a 12-well plate (1 ml per well) or a 24-well plate (per ml of the well) and incubated for 2 hours at 37 ° C. in a cell culture incubator (cell culture incubator).

이후, 초과된 잔여 라미닌 용액을 제거한 후 DPBS로 플레이트를 두 번 세척하였다. Thereafter, the excess residual laminin solution was removed and the plate was washed twice with DPBS.

실시예 2. 세포배양(cell culture)Example 2. Cell culture

신경줄기세포는 C57BL6/N(KoaTech)의 fetus(embryonic day 14.5일) 전뇌(forebrain)로부터 얻었고, 상기 실시예 1에 의해 준비된 마트리겔 또는 라미닌 이 코팅된 12-웰 플레이트(웰당 1.5×105 cells) 또는 24-웰 플레이트(0.75×105 cells)에서 배양하였다.The neural stem cells were obtained from a fetus (embryonic day 14.5 days) forebrain of C57BL6 / N (KoaTech), and a 12-well plate (1.5 × 10 5 cells / well) coated with Matrigel or laminin prepared according to Example 1, or they were cultured in 24-well plate (0.75 × 10 5 cells).

배지는 DMEM/F12 배지를 사용하였으며, 1×N2 supplement(Invitrogen), 1×비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1% 메르캅토에탄올(Invitrogen), 1×페니실린/스트렙토마이신(Welgene), 10ng/㎖ 인간 bFGF(human basic fibroblast growth factor)(Peprotech), 10ng/㎖ 마우스 EFG(mouse epidermal growth factor)(Peprotech)를 supplement로 공급하였다.The medium was DMEM / F12 medium, which was supplemented with 1 × N2 supplement (Invitrogen), 1 × non essential amino acid (Invitrogen), 0.1% mercaptoethanol (Invitrogen), 1 × penicillin / streptomycin (Welgene) bFGF (human basic fibroblast growth factor) (Peprotech) and 10 ng / ml mouse EFG (mouse epidermal growth factor) (Peprotech) were supplemented.

5% CO2 및 37℃의 온도조건에서 세포를 배양하였으며, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.Cells were cultured at a temperature of 5% CO 2 and 37 ° C, and the medium was changed every 2 days.

한편, 신경줄기세포의 증식여부는 6번째 계대까지 각 계대마다 생존 세포(viale cell)의 수를 확인하여 결정하였다.On the other hand, the proliferation of neural stem cells was determined by confirming the number of viable cells in each passage up to the sixth passage.

실험예 1. 신경줄기세포의 부착 및 증식에 있어서 마트리겔의 영향Experimental Example 1 Effect of Matrigel in Adhesion and Proliferation of Neural Stage Cells

상기 실시예 1에 의해 준비된 다양한 농도(0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.02%, 0.01%)의 마트리겔로 코팅된 12-웰 플레이트에 신경줄기세포를 접종하여 신경줄기세포의 부착 및 증식에 있어서 마트리겔의 영향을 평가하였다.Neural stem cells were inoculated into 12-well plates coated with matrigel at various concentrations (0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.02%, 0.01%) prepared in Example 1 to induce adhesion and proliferation of neural stem cells The effect of the ligase was evaluated.

그 결과 신경줄기세포의 부착(attachment)을 위상차 현미경(phase contrast microscope)으로 확인한 도 1에 나타낸 바와 같이, 0.01% 마트리겔과 0.01% 젤라틴을 제외하고 모든 실험조건에서 신경줄기세포의 2D 증식(2-dimensional expansion))이 가능한 세포형태를 나타내었다. 즉, 0.01% 젤라틴 또는 0.01% 마트리겔이 코팅된 플레이트에서 신경줄기세포의 부착 및 증식이 이루어지지 않았다.As a result, as shown in Fig. 1, in which the attachment of neural stem cells was confirmed by a phase contrast microscope, in all experimental conditions except for 0.01% matrigel and 0.01% gelatin, 2-dimensional expansion) was possible. That is, adhesion and proliferation of neural stem cells were not observed on plates coated with 0.01% gelatin or 0.01% matrigel.

또한, 신경줄기세포의 증식에 대한 실험결과는 도 2에 나타낸 바와 같이 0.02-1.0%의 라미닌과 마트리겔에서 각 계대에서 얻을 수 있는 신경줄기세포의 수는 바로 직전 계대에서의 신경줄기세포 수에 비하여 약 10배가 증가되었다.As shown in Fig. 2, the number of neural stem cells obtained in each passage from 0.02 to 1.0% of laminin and matrigel was about 10 Doubled up.

0.01% 젤라틴과 0.01% 마트리겔에서는 신경줄기세포의 증식이 불가능했던 것에 비하여(도 2A) 0.02-1.0% 마트리겔에서의 계대배양시 모든 계대에서 86-96%의 세포가 생존가능한 세포로 남아있었다(도 2B).In the subculture of 0.02-1.0% matrigel, 86-96% of the cells remained viable cells in all passages (Fig. 2A), whereas 0.01% gelatin and 0.01% matrigel were not capable of proliferating neural stem cells 2B).

한편, 0.02% 마트리겔을 사용한 경우와 비교하여 0.05-1.0%의 마트리겔(또는 라미닌)을 사용한 경우에 세포 2D 증식 및 성장의 측면에서 주목할 만한 현저한 차이를 보이지 않았다.On the other hand, when the matrigel (or laminin) of 0.05-1.0% was used as compared with the case of using 0.02% matrigel, no remarkable difference was observed in terms of the cell 2D proliferation and growth.

실험예 2. RT-PCR 분석(RT-PCR analysis) 및 면역 세포 화학 분석(immunocytochemistry analysis)Experimental Example 2 RT-PCR analysis and immunocytochemistry analysis [

(1) RT-PCR 분석(1) RT-PCR analysis

총 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 분리하고, 총 RNA 500ng을 전체 부피 20㎕에서 Omniscript RT Kit(Qiagen)를 사용하여 cDNA(complementary DNA)로 역전사 시켰고, PCR 증폭은 유전자 특이적 프라이머(표 1)와 Takara Ex Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행하였다. Total RNA was isolated using RNeasy Mini Kit (Qiagen), and 500 ng of total RNA was reverse-transcribed with cDNA (complementary DNA) using Omniscript RT Kit (Qiagen) in a total volume of 20 μl, and PCR amplification was carried out using gene-specific primers Table 1) and Takara Ex Taq DNA polymerase.

Figure pat00001
Figure pat00001

PCR은 94℃에서 30초 동안, 50-65℃에서 30초 동안, 72℃에서 30초 동안 32사이클로 실시하였고, RT-PCR에 의한 결과물은 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동으로 분석하였고, GelRed(Komabiotech) DNA 염색으로 시각화 하였다.The PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds, at 50-65 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds for 32 cycles, and the result by RT-PCR was analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel And visualized by GelRed (Komabiotech) DNA staining.

(2) 면역 세포 화학 분석(2) Immunocytochemical analysis

세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(Sigma-Aldrich)에서 고정시킨 후에 DPBS로 3번 세척하였다.Cells were fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) for 15 min at room temperature and then washed three times with DPBS.

그 다음 0.5% Triton X-100(Sigma-Aldrich), 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) fraction Ⅴ(Sigma-Aldrich), 10% 소태아혈정(fetal bovine serum)를 포함하는 DPBS를 이용하여 실온에서 10분 동안 배양하였다.Then DPBS containing 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 1% bovine serum albumin (BSA) fraction V (Sigma-Aldrich) and 10% fetal bovine serum was used And incubated at room temperature for 10 minutes.

상기 배양한 세포를 DPBS로 세척한 후 1차 항체(primary antibodies)를 처리한 다음에 4℃의 온도조건에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 1시간 동안 배양하였다.The cultured cells were washed with DPBS, treated with primary antibodies, and incubated overnight at 4 ° C or 1 hour at room temperature.

상기 1차 항체는 mouse monoclonal anti-Nestin(R&D Systems, 1:500), rabbit polyclinal anti-Sox2(Millipore, 1:500), mouse monoclonal anti-Tuj1(Chemicon, 1:200), mouse monoclonal anti-Map2(Signa, 1:200), mouse monoclonal anti-GFAP(Santa Cruz Biotechnology, 1:200), mouse monoclonal anti-O4(R&D Systems, 1:200)를 사용하였다.The primary antibodies were prepared from mouse monoclonal anti-Nestin (R & D Systems, 1: 500), rabbit polyclinal anti-Sox2 (Millipore, 1: 500), mouse monoclonal anti- Tuj1 (1: 200), mouse monoclonal anti-GFAP (Santa Cruz Biotechnology, 1: 200) and mouse monoclonal anti-O4 (R & D Systems, 1: 200) were used.

배양을 한 후 세포를 PBS에서 0.5% BSA로 세척한 다음 2차 항체를 처리하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 2차 항체는 anti-mouse IgG(Cell signaling Technologies, 1:200) 또는 anti-rabbit IgG(Cell signaling Technologies, 1:200)를 사용하였다.After incubation, the cells were washed with 0.5% BSA in PBS, treated with secondary antibody, and cultured at room temperature for 1 hour. The secondary antibody used was anti-mouse IgG (Cell signaling Technologies, 1: 200) or anti-rabbit IgG (Cell signaling Technologies, 1: 200).

(3) 실험결과(3) Experimental results

마트리겔 및 라미닌에서의 신경줄세포 배양은 RT-PCR 분석 및 면역세포화학분석(Immunocytochemistry)에 의해 특징지어 진다.Neuronal cell cultures in Matrigel and Laminin are characterized by RT-PCR analysis and immunocytochemistry.

RT-PCR 분석결과는 도 3a에 나타낸 바와 같이, 0.02% 마트리겔에서의 신경줄기세포 성장은 고농도의 마트리겔 및 라미닌에서 배양한 경우와 비교하여 신경줄기세포 특이적 유전자인 Sox2, Pax6, Nestin, Olig2, Fabp, Glast의 발현에 있어서 차이가 전혀 없음을 보여준다.As shown in FIG. 3A, the RT-PCR analysis showed that neural stem cell growth at 0.02% matrigel was significantly different from that of cultured at high concentrations of matrigel and laminin. The results showed that Sox2, Pax6, Nestin, Olig2, 0.0 > Fabp, Glast < / RTI >

또한, 도 3b에서 알 수 있듯이 면역세포화학(Immunocytochemical) 염색은 0.02% 마트리겔에서 신경줄기포의 성장을 나타내는 마커 단백질(marker protein)인 Sox2와 Nestin의 균일한 발현을 보여주고 있으며, 라미닌에서 배양한 경우와 차이점이 전혀 나타나지 않았다.3b, immunocytochemical staining showed uniform expression of Sox2 and Nestin as marker proteins for the growth of neural bubbles in 0.02% matrigel, There was no difference with the case.

상기와 같은 결과는 0.02% 마트리겔은 신경줄기세포의 증식에 충분히 활용할 수 있고, 이러한 측면에서 라미닌과 유사한 역할을 수행함을 나타낸다.These results indicate that 0.02% matrigel can fully utilize the proliferation of neural stem cells and play a role similar to laminin in this respect.

실험예 3. 신경줄기세포의 체외 분화(in vitro differentiation of neural stem cell)Experimental Example 3 In vitro Differentiation of Neural Stem Cells [

신경줄기세포는 뉴런(neurons), 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)와 같은 3가지 신경세포 타입으로 분화된다. 본 발명에서 0.02% 마트리겔에서 증식시킨 신경줄기세포의 분화능력을 평가하기 위해 신경줄기세포를 3개의 다른 타입의 신경세포인 뉴런(neurons), 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화시켰고, 구체적은 과정은 다음과 같다.Neural stem cells are differentiated into three types of neurons, such as neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. In the present invention, to evaluate the differentiation ability of neural stem cells proliferated in 0.02% matrigel, neural stem cells were differentiated into three different types of neurons, neurons, astrocytes and oligodendrocytes The concrete process is as follows.

(1) 라미닌 또는 0.02% 마트리겔이 코팅된 4-웰 플레이트에 웰당 40,000 cells 밀도로 신경줄기세포를 접종하였다.(1) Neural stem cells were inoculated to a 4-well plate coated with laminin or 0.02% Matrigel at a density of 40,000 cells per well.

(2) 다음날 뉴런(neurons)으로 분화시키기 위해서, (2) To differentiate into neurons the next day,

배지를 1×B27 supplement(Invitrogen), 0.5×N2 supplement, 20ng/㎖ 인간 bFGF(human basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F12 배지로 바꾸었고, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.The medium was changed to DMEM / F12 medium containing 1 x B27 supplement (Invitrogen), 0.5 x N2 supplement, 20 ng / ml human bFGF (human basic fibroblast growth factor), and the medium was changed every 2 days.

4일 후, 1×B27 supplement(Invitrogen), 0.5×N2 supplement를 포함하는 DMEM/F12 배지로 바꾸어 일주일간 배양하였다.After 4 days, the medium was changed to DMEM / F12 medium containing 1 x B27 supplement (Invitrogen) and 0.5 x N2 supplement for one week.

(3) 한편, 성상교세포(astrocytes)로 분화시키기 위해서, (3) On the other hand, in order to differentiate into astrocytes,

배지를 10% 소태아혈정(fetal bovine serum)(Invitrogen), 1×비필수아미노산 솔루션, 20ng/㎖ 인간 bFGF(human basic fibroblast growth factor), 20ng/㎖ 마우스 EFG(mouse epidermal growth factor), 1×페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12 배지로 바꾸어 4일 동안 배양하였고, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.The medium was replaced with 10% fetal bovine serum (Invitrogen), 1 x non essential amino acid solution, 20 ng / ml human bFGF (human basic fibroblast growth factor), 20 ng / ml mouse EFG (mouse epidermal growth factor) The cells were changed to DMEM / F12 medium containing penicillin / streptomycin for 4 days, and the medium was changed every 2 days.

(4) 또한, 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화시키기 위해서, (4) In addition, in order to differentiate into oligodendrocytes,

배지를 2% B27 supplement, 1×L-글루타민(L-glutamine)(Gibco), 30ng/㎖ 트리아이오딘티로닌(triiodothyronine, T3)(Sigma-Aldrich)을 포함하는 Neurobasal 배지로 바꾸어 일주일 동안 배양하였고, 배지는 2일 마다 교체해 주었다.The medium was changed to Neurobasal medium containing 2% B27 supplement, 1 L-glutamine (Gibco), 30 ng / ml triiodothyronine (T3) (Sigma-Aldrich) , And the medium was changed every 2 days.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 뉴런으로 분화된 경우 뉴런의 마커인 MAP2와 Tuj1의 발현을 확인할 수 있었고, 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로의 분화는 각각의 마커인 GFAP와 O4의 발현을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 4, when the cells were differentiated into neurons, the expression of MAP2 and Tuj1, which are neuronal markers, was confirmed, and the differentiation into astrocytes and oligodendrocytes was confirmed by the respective markers GFAP and O4 .

상기와 같은 결과를 통해 0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포의 분화능력이 라미닌에서 배양된 신경줄기세포와 비교하여 아무런 차이가 없음을 알 수 있었다.These results show that the differentiation ability of neural stem cells cultured on 0.02% matrigel is no different from neural stem cells cultured on laminin.

상기의 실험결과 통해 0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포는 체외에서(in vitro) 3가지 타입의 주요 신경세포로 분화할 수 있음을 알 수 있었고, 이는 신경줄기세포의 다분화능(multipotency)를 나타낸다.
These results indicate that neural stem cells cultured in 0.02% Matrigel can differentiate into three types of major neurons in vitro, indicating multipotency of neural stem cells.

모든 데이터는 평균±SEM으로 표시하였고, GraphPad Prism software, version 5.00(GraphPad software Inc., La Jolla, CA)을 사용하여 분석하였다.
All data were expressed as mean ± SEM and analyzed using GraphPad Prism software, version 5.00 (GraphPad software Inc., La Jolla, Calif.).

실시예 3. 고찰Example 3. Discussion

신경줄기세포는 퇴행성 신경질환의 세포치료(cell replacement therapies) 및 신경질환 치료를 위한 약물 스크리닝에 활용될 수 있는 잠재적인 가능성이 있다. 이러한 신경줄기세포의 응용을 위해서는 안정적이고 대량의 세포배양이 요구되는데, 신경줄기세포의 증식을 위해서는 세포를 쉽게 모니터링 할 수 있고 호모제너스 파퓰레이션(homogenous population)을 유지할 수 있는 2D-부착배양(adherent 2-dimentional culture)이 뉴로스피어(neurosphere) 배양보다 적절한 방법이다.Neural stem cells have the potential to be used for cell replacement therapies of degenerative neurological diseases and drug screening for the treatment of neurological disorders. For the application of such neural stem cells, stable and large-scale cell culture is required. For the proliferation of neural stem cells, 2D-adherent culturing which can easily monitor the cells and maintain homogenous population, dimentional culture is more appropriate than neurosphere culture.

한편, 신경줄기세포의 2D-부착배양을 위해서 ECM, protein, 라미닌이 플레이트를 코팅하기 위한 재료로 주로 사용되고 있으나, 라미닌은 고가일 뿐만 아니라 코팅시간이 최소 1시간 이상이 요구된다. 이에 비용을 절감하고 코팅시간을 단축시키기 위해서 신경줄기세포를 2D-부착배양하기 위한 효율적인 대체 매트릭스(matrix)을 제공하고자 하는 것이 본원발명의 목적이다. 즉, 본 발명에 의한 마트리겔이 코팅된 플레이트를 이용하여 신경줄기세포를 배양할 경우 플레이트를 코팅하기 위한 시간이 10 내지 20분 내외로 소요되기 때문에 신경줄기세포의 체외배양 및 분화에 있어서 라미닌과 동일 또는 유사한 환경을 제공함에도 코팅시간을 최대 1/6 내지 최소 1/3로 단축시킬 수 있어, 결론적으로 세포배양을 위한 전체적인 공정시간을 현저하게 단축시킬 수 있는 장점이 있다.On the other hand, ECM, protein, and laminin are mainly used as materials for coating plates for 2D-adherent culture of neural stem cells, but laminin is not only expensive, but also requires a coating time of at least 1 hour. It is an object of the present invention to provide an efficient alternative matrix for 2D-adherent culturing of neural stem cells in order to reduce cost and shorten coating time. That is, when the neural stem cells are cultured using the matrigel-coated plate according to the present invention, the time required for coating the plates is about 10 to 20 minutes, so that in vitro culture and differentiation of neural stem cells are the same as or different from that of laminin It is possible to shorten the coating time from a maximum of 1/6 to a minimum of 1/3 even though a similar environment is provided, and consequently, the overall process time for cell culture can be remarkably shortened.

마트리겔은 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell)와 인간으로부터 유래한 다분화능(pluripotent) 줄기세포와 같은 다분화능 줄기세포의 부착배양에 사용되어 오고 있었고, 최근 본 발명자들은 마트리겔을 이용하여 마우스 정원줄기세포(mouse spermatogonial stem cell)를 증식 및 장기배양 할 수 있음을 확인한 바 있다(한국특허출원 제10-2014-0034632호).Matrigel has been used for adhesion of pluripotent stem cells such as human embryonic stem cells and human derived pluripotent stem cells. Recently, the present inventors have used mouse matrigel It has been confirmed that mouse spermatogonial stem cells can be proliferated and organs can be cultured (Korean Patent Application No. 10-2014-0034632).

한편, 마트리겔은 인간 ESC, iPSC 및 마우스 SSC의 유지(maintenance)를 위해서 사용될 수 있다고 알려져 있으나, 상기의 세포들을 저장하기 위해서는 10% 농도의 마트리겔이 사용되었다. 고농도의 마트리겔을 사용함으로써 비용적인 측면에서 라미닌과 비교하여 경제적인 이점이 전혀 없었다.On the other hand, Martrigel is known to be used for maintenance of human ESC, iPSC and mouse SSC, but a 10% concentration of Martrigel was used to store the cells. The use of a high concentration of Martrigel did not have any economic advantages over laminin in terms of cost.

이에, 본 발명자들은 종래 신경줄기세포의 체외 배양에 전혀 사용된바 없는 마트리겔을 사용하였을 뿐만 아니라 다양한 농도의 마트리겔을 평가하여 신경줄기세포의 부착 및 증식을 위해서 가장 최적화된 마트리겔의 농도를 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors not only used matrigel, which has never been used for in vitro culturing of neural stem cells, but also evaluated matrigel of various concentrations to experimentally determine the most optimized matrigel concentration for adhesion and proliferation of neural stem cells The present invention has been completed.

그 결과 0.02% 마트리겔이 비용 대비 최적의 농도인 것으로 나타났으며, 마트리겔을 이용하여 배양된 신경줄기세포는 라미닌에서 배양된 신경줄기세포와 유사하게 일반적인 신경줄기세포에서 발현되는 유전자, 단백질, 마커가 나타나고, 증식비율도 유사하였다.As a result, it was shown that 0.02% matrigel was optimal for cost. Neural stem cells cultured using Matrigel showed genes, proteins, and markers expressed in general neural stem cells similar to neural stem cells cultured in laminin , And the growth rate was similar.

또한 0.02% 마트리겔이 신경줄기세포가 3가지 타입의 신경세포로 분화할 수 있는 환경을 제공해줄 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 0.02% 마트리겔은 뉴런(neurons)과 신경교세포(glial cell)로의 분화에 있어서 라미닌과 동일한 효율을 보였을 뿐만 아니라 비용 및 코팅시간의 측면에서는 그 효율이 라미닌보다 우수함을 알 수 있었다.In addition, it was experimentally confirmed that 0.02% Matrigel can provide an environment in which neural stem cells can differentiate into three types of neurons. 0.02% Matrigel showed the same efficiency as laminin in differentiation into neurons and glial cells, as well as superior efficiency in terms of cost and coating time than laminin.

마트리겔을 이용한 신경줄기세포의 배양은 라미닌을 이용한 경우와 비교하여 비용적으로 매우 경제적이며, 0.02% 마트리겔을 사용할 경우 마트리겔 스탁(matrigel stock) 1㎖는 플레이트를 40회 코팅하기에 충분하다. 동일한 양의 신경줄기세포 체외배양 및 분화를 위해서 요구되는 라미닌과 비용을 비교하였을 때 본 발명에 의한 0.02% 마트리겔이 코팅된 플레이트를 사용할 경우 라미닌 사용시 소요되는 비용대비 1/50 정도만이 소요되기 때문에 경제적으로 매우 유리한 측면이 있다. 더욱이, 간단한 배지의 교체만으로 0.02% 마트리겔에서 신경줄기세포의 분화가 가능하기 때문에 분화를 유도하기 위해서 플레이트를 변경할 필요가 없다.The culture of neural stem cells using matrigel is very economical in comparison with the case of using laminin. When using 0.02% matrigel, 1 ml of matrigel stock is enough to coat the plate 40 times. When comparing the cost of laminin required for in vitro culture and differentiation of the same amount of neural stem cells, the use of the 0.02% matrigel-coated plate according to the present invention requires only about 1/50 of the cost of using laminin, There is a very favorable aspect. Moreover, since it is possible to differentiate neural stem cells in a 0.02% matrigel only by replacing a simple medium, there is no need to change the plate to induce differentiation.

결론적으로, 본 발명은 라미닌 코팅과 비교하여 비용을 현저하게 줄일 수 있는 0.02% 마트리겔을 사용하여 ECM 물질(material)을 코팅한 플레이트에서 신경줄기세포의 2D-증식 시킬 수 있는 최적화된 방법을 제공한다.In conclusion, the present invention provides an optimized method of 2D-proliferating neural stem cells in a plate coated with ECM material using 0.02% matrigel, which can significantly reduce cost compared to laminin coating .

0.02% 마트리겔에서 배양된 신경줄기세포는 세포 및 분자 특성과 다분화능을 유지하고 있었다.Neural stem cells cultured in 0.02% Matrigel maintained cell and molecular characteristics and pluripotency.

따라서 마트리겔을 이용한 신경줄기세포의 배양 및 분화는 경제적으로 매우 유용할 뿐만 아니라 대규모 배양에도 매우 적합하다는 것을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that culturing and differentiation of neural stem cells using matrigel is economically very useful and also suitable for large-scale culture.

이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention. And the like.

Claims (6)

피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 마트리겔(matrigel)이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cell) 배양용 플레이트.
A plate for culturing neural stem cells, characterized in that it does not contain a feeder cell but is coated with matrigel.
제 1 항에 있어서,
0.02% 내지 0.5% 마트리겔이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 배양용 플레이트.
The method according to claim 1,
0.0 >%< / RTI > to 0.5% matrigel.
제 1 항에 있어서,
0.02% 마트리겔이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 배양용 플레이트.
The method according to claim 1,
0.02% matrigel. ≪ / RTI >
피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트를 이용하여 신경줄기세포를 배양하는 방법.

A method for culturing neural stem cells using a matrigel-coated plate without containing feeder cells.

제 4 항에 있어서,
0.02 내지 0.5% 마트리겔이 코팅된 플레이트를 이용하는 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 배양 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the plate coated with 0.02-0.5% matrigel is used.
제 4 항에 있어서,
0.02% 마트리겔이 코팅된 것을 특징으로 하는 신경줄기세포 배양 방법.

5. The method of claim 4,
0.02% matrigel. ≪ / RTI >

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Chris S. Hughes et al., Proteomics, 10, p1886-1890, 2010. *
STEMCELL TECHNOLOIES, TECHNICAL MANUAL Ver.2.0.0.* *

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KR101705245B1 (en) 2017-02-09

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