KR20160133120A - Feed or feed additive with IgY for prevention of edema disease of swine - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 돼지부종병 예방용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 난황항체인 IgY를 함유하는 돼지부종병 예방용 사료 또는 사료 첨가제에 관한 것이다.
The present invention relates to a feed or feed additive for preventing swine edema disease, and more particularly to a feed or feed additive for preventing swine edema disease containing IgY which is an egg yolk antibody.
돼지부종병(edema disease of swine, 豚浮腫病)은 대장균증의 하나로 8~12주령의 영양상태가 양호한 자돈에 발생하는데, 폐사율이 80%에 달하는 급성병이다. 이유 후 여러가지 스트레스에 의해 특정 혈청형의 대장균(0-138, 0-139, 0-141 등)이 소장에 침입해 급격히 증식함으로써 발생하는데, 내독소 등 여러 가지 성분이 소장에서 흡수되는 결과 중독이나 과민증 형태로 발병하는 것으로 보고되어 있다. Edema disease of swine (swine edema disease) is one of the E. coli, 8 to 12 weeks of well-nourished piglets with good mortality, the mortality rate is up to 80% acute disease. After the induction, various serotypes of Escherichia coli (0-138, 0-139, 0-141, etc.) enter the small intestine and multiply rapidly due to various stresses. Various components such as endotoxins are absorbed in the small intestine. It is reported to develop in the form of hypersensitivity.
한편, 면역난황항체(IgY)는 이미 여러 연구에 의해 질병의 예방 및 치료효과가 증명되어 왔으며, 고농도로 사용하는 경우, 항생제와 거의 같은 수준의 치료효과를 기대할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, IgY는 완전식품인 계란에서 유래하므로 안전성에 대한 염려가 전혀 없는 매우 유용한 물질이라 할 수 있다. On the other hand, immunoglobulin antibody (IgY) has already been proved to be effective in the prevention and treatment of diseases by various studies. It has been reported that when used at a high concentration, the therapeutic effect can be expected to be almost the same as that of antibiotics. In addition, IgY is derived from a complete food egg, so there is no concern about safety.
난황항체는 조류의 면역체계를 이용한 수동면역의 한 형태로, 어미 닭이 능동면역으로 획득한 면역항체는 난황 중으로 이행되어 자손에게 면역능이 전해진다. 난황 내 항체 중 가장 많은 비율을 차지하는 것이 IgY이다. IgY는 분자량이 약 160~180 kDa으로 포유류의 IgG보다 크며, 상기에서 살펴본 바와 같이 포유류의 항체가 갖지 못하는 여러 장점을 가지고 때문에 이용 범위가 넓다.
The egg yolk antibody is a form of passive immunization using the avian immune system. The immune antibody obtained by the active immunization of the mother chicken is transferred to the egg yolk, and the immune system is transmitted to the offspring. The IgY is the most abundant of the antibodies in the egg yolk. IgY has a molecular weight of about 160 to 180 kDa, which is larger than that of mammalian IgG, and has a wide range of use because it has various advantages that mammalian antibodies do not have, as described above.
본 발명은 국내 양돈산업에서 큰 경제적 피해를 유발하는 돼지부종병을 효과적으로 예방하기 위하여, 기존의 백신접종 예방법과는 다른 방안으로, 닭이 계란 내에 생산하는 특이 난황항체인 IgY를 사료에 첨가하는 방법으로 돼지부종병에 대한 방어 효능이 발휘될 수 있는 방안을 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
The present invention relates to a method for preventing pig swine disease that causes large economic damage in the domestic swine industry, and is a method different from the conventional method for preventing vaccination, which comprises adding IgY, a specific egg yolk antibody produced in a chicken egg, The purpose of this research is to develop and provide a method for demonstrating the defense efficacy against swine edema disease.
본 발명은 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)를 산란계에 접종한 후, 산란계가 낳은 계란의 난황으로부터 분리한 난황항체 IgY를 제공한다. The present invention provides an egg yolk antibody IgY obtained by inoculating E. coli F18 (KCTC 12787BP) into a laying hens and then separating the yolk from the eggs produced by the laying hens.
본 발명에서는 여러 대장균 중 항원으로 E. coli F18 (KCTC 12787BP) 균주를 선발하여 사용하였다. 대장균을 항원으로 사용하여 산란계에 백신(vaccine)할 경우, IgY가 생성될 수 있는데, 항원의 종류 및 상태에 따라 생성된 IgY의 효능은 다양하게 차이가 난다. 본 발명에서는 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)를 선택하였는데, IgY 생성능이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 생성된 IgY가 우수한 돼지부종병 예방능을 발휘함을 확인할 수 있었다. In the present invention, E. coli F18 (KCTC 12787BP) was used as an antigen among several E. coli strains. When Escherichia coli is used as an antigen to vaccinate the laying hens, IgY may be produced. The effectiveness of IgY produced varies depending on the type and condition of the antigen. In the present invention, E. coli F18 (KCTC 12787BP) was selected, and it was confirmed that the IgY production ability was excellent. In addition, it was confirmed that the produced IgY exerts excellent pig swine disease prevention ability.
한편, 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)에 대한 난황항체 IgY는 당업계의 공지의 방법을 통해 생산할 수 있는데, 일 예로 하기와 같은 방법을 통해 생산될 수 있다. 우선, 항원 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)과 ISA70을 혼합하여 사독백신을 제조한다. 그 후, 산란계 가슴에 근육 주사하고 부스팅(Boosting)을 실시한다. 이후, 계란을 수거하고 난황을 분리함으로써, 난황 내 IgY를 분리할 수 있는 것이다. Meanwhile, the egg yolk antibody IgY against E. coli F18 (KCTC 12787BP) can be produced through a method known in the art. For example, the egg yolk antibody IgY can be produced by the following method. First, a Sadox vaccine is prepared by mixing antigen E. coli F18 (KCTC 12787BP) and ISA70. Then, inject the muscle into the chest of the laying hens and perform boosting. Thereafter, the egg is collected and the egg yolk is separated, whereby IgY in egg yolk can be separated.
한편, 본 발명은 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)를 산란계에 접종한 후, 산란계가 낳은 계란의 난황으로부터 분리한 난황항체 IgY를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 사료 또는 사료 첨가제를 제공한다. 이때, 상기 돼지는 일 예로, 이유자돈일 수 있다. 또한, 상기 돼지 사료 또는 사료 첨가제는 바람직하게 돼지부종병 예방용인 것일 수 있다. On the other hand, the present invention provides a pig feed or feed additive characterized by containing an egg yolk antibody IgY obtained by inoculating E. coli F18 (KCTC 12787BP) into a laying hens and then separating the egg yolk from the eggs produced by the laying hens . At this time, the pig may be, for example, a weaning pig. In addition, the pig feed or feed additive may preferably be one for prevention of swine edema disease.
본 발명에서 확인한 바에 따르면, IgY를 이유자돈 사료에 첨가하여 급여하였을 경우, 비록 경도-중도의 부종병 부검 소견을 보이기는 하였으나, 적어도 NC (negative control) 및 PC (positive control) 처리구의 이유자돈보다 경미한 증상을 보임을 명확히 확인할 수 있었다. 또한, 대조군보다 전체 시험기간 동안의 일당증체량과 0~2주차 사료효율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, IgY 첨가구가 NC 및 PC 이유자돈보다 1주차, 2주차, 3주차 분변지수에서 유의적으로 낮게 나타남을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 이유자돈 사료 내 IgY의 첨가가 이유자돈 사육의 생산성 향상을 향상시키고, 자돈 체내의 부종병 발생을 억제하는 효과를 가져오는 것을 의미한다. According to the present invention, when IgY was added to the feed of the weaned pig diets, even though there was a hardness-moderate edema biopsy, at least NC (negative control) and PC (positive control) As shown in Fig. In addition, it was confirmed that the daily gain of body weight during the whole test period and the feed efficiency of 0 ~ 2 weeks were significantly increased compared to the control group. In addition, it was confirmed that the IgY supplementation was significantly lower in the 1st, 2nd and 3rd digits of fecal index than NC and PC. These results suggest that the addition of IgY in weaned pig diets improves the productivity of weanling pigs and inhibits swelling diseases in pigs.
한편, 본 발명은 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)를 산란계에 접종한 후, 산란계가 낳은 계란의 난황으로부터 분리한 난황항체 IgY를 돼지에 급여하는 것을 특징으로 하는 돼지 사육방법을 제공한다. 이때, 상기 돼지는 일 예로 이유자돈일 수 있다. On the other hand, the present invention provides a pig breeding method characterized in that the egg yolk antibody IgY obtained by inoculating E. coli F18 (KCTC 12787BP) into a laying hens and separated from egg yolk of an egg laying hens is fed to pigs . At this time, the pig may be, for example, weanling pig.
본 발명의 대장균 (E. coli) F18 (KCTC 12787BP)를 산란계에 접종한 후, 산란계가 낳은 계란의 난황으로부터 분리한 난황항체 IgY는 다른 대장균 균주를 항원으로 사용하여 생산한 IgY에 비해, IgY 생산성이 우수하고, 높은 돼지부종병 예방 효능을 발휘한다.
The egg yolk antibody IgY isolated from the egg yolk of the egg laying hens after inoculation of the E. coli F18 (KCTC 12787BP) of the present invention on the laying hens was significantly higher than that of the IgY produced by using other E. coli strains as the antigen, , And demonstrate the efficacy of preventing swine swine disease.
도 1은 암모니움 설페이트 (Ammonium sulfate)법을 이용한 IgY 항체 분리에 있어서, 암모니움 설페이트 농도별 특이 난황항체 단백질의 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 35% 암모니움 설페이트를 이용하여 분리한 항 E. Coli F18-IgY의 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 항 E. coli F18-IgY의 항원균에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 보여주는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 결과이다.
도 4는 IgY 표준용액 농도별 HPLC 분석 (도 4의 A) 및 표준곡선 작성의 결과 (도 4의 B)를 보여준다.
도 5는 확립된 난황분말 내 IgY 분석조건의 적합성을 보여주는 결과이다.FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE of a specific egg yolk antibody protein according to the concentration of ammonium sulfate in the separation of IgY antibody using the ammonium sulfate method.
Figure 2 shows the result of SDS-PAGE of the E. E. coli F18-IgY isolated using 35% ammonium sulfate.
Figure 3 shows the SDS-PAGE and Western blot results showing the binding affinity of the anti- E. coli F18-IgY to the antifungal.
FIG. 4 shows the HPLC analysis (FIG. 4A) and standard curve creation results (FIG. 4B) of IgY standard solution concentration.
Figure 5 shows the suitability of the established IgY assay conditions in the yolk powder.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following embodiments and experimental examples, and includes modifications of equivalent technical ideas.
[[ 실시예Example 1: 산란계 접종을 통한 1: Through inoculation of laying hens 고역가High station 특이 난황항체 생산] Specific egg yolk antibody production]
1. 산란계 백신 생산 및 접종1. Production and vaccination of laying hens
가. end. 부종병Swelling disease 원인균 항원 생산 Causative antigen production
항원 생산을 위해 E. coli F18 (KCTC 12787BP) 균주를 백금이로 채취하여 블러드 아가 (blood agar)에 도말한 후, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이후, 콜로니를 확인하고, BHI 브로스(broth)에 접종하였으며, 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 110 rpm 조건으로 24시간 배양하였다. 배양된 E. coli는 선택배지에 도말하여 확인하였으며, 배양된 브로스에 0.1% 포름알데하이드(formaldehyde)를 넣고 24시간 동안 불활화하였다. 이후, 7,000 rpm, 4℃, 10 min간 원심 분리하였으며, 항원으로 수거하였다. 0.1% 포름알데하이드를 첨가하여 24시간 동안 불활화한 뒤 UV 스펙트로포토미터를 사용하여 O.D 600nm에서 항원 농도 0.5로 맞추어 사용하였다.
For the production of the antigen, E. coli F18 (KCTC 12787BP) strain was plated on platinum, plated on a blood agar, and cultured in a 37 ° C incubator for 24 hours. Thereafter, the colonies were confirmed, inoculated into BHI broth, and cultured at 37 ° C in a shaking incubator at 110 rpm for 24 hours. Cultured E. coli was identified by plating on selective medium, and incubated in broth containing 0.1% formaldehyde for 24 hours. After centrifugation at 7,000 rpm at 4 ° C for 10 min, the cells were collected as an antigen. After 0.1% formaldehyde was added, it was inactivated for 24 hours and then used with an UV spectrophotometer to adjust the antigen concentration to 0.5 at OD 600nm.
나. 생산된 항원을 이용한 고농도 백신 제조 I. Production of high-concentration vaccine using produced antigen
백신 제조를 위하여 상기에서 배양된 항원과 ISA70을 약 3:7 비율로 혼합한 후 균질기(homogenizer)를 이용하여 사독백신을 제조하였다. 이후, 무균검사와 불활화 확인시험을 거쳐 특이 난황항체 생산을 위한 백신으로 준비하였다. For the preparation of the vaccine, Sadox vaccine was prepared using a homogenizer after mixing the above-cultured antigen with ISA70 at a ratio of about 3: 7. Then, aseptic test and inactivation confirmation test were conducted to prepare a vaccine for the production of specific egg yolk antibody.
다. 산란계 면역 All. Laying immunity
제조된 백신을 22주령 된 Hy-Line Brown 산란계에 0.8 ml씩 가슴에 근육 주사하였으며, 2주 간격으로 1차 접종 후 2회 부스팅(Boosting)을 실시하였다.
The prepared vaccine was injected intramuscularly into the chest with 0.8 ml of Hy-Line Brown laying hens at 22 weeks of age. Boosting was performed two times after the first inoculation at intervals of two weeks.
라. la. 난황Yolk 샘플 수거 Sample collection
난황샘플 수집은 접종일 하루 전부터 매일 계란 수거를 시작, 날짜별로 기입하여 7일 간격으로 수집하였고, 주차별로 역가 검사를 시행하였다. 각 주차별 역가확인용 샘플 채취를 위해 각 주차별 난황 5개를 무작위 수거하여 난황을 분리하였고, 중량 대비 10배에 해당되는 멸균 DW를 혼합하여 50 ml 튜브에 담아 24시간 냉동 보관하였다. 24시간 후 37℃에서 중탕시켜 녹인 후 4℃에서 3,500 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 취해 역가분석용 샘플로 보관하였다.
Egg yolk samples were collected every day from the day before the inoculation to the eggs collected every day at 7 days intervals. Five eggs were randomly collected from each egg yolk, and the sterilized DWs, which were 10 times the weight of the yolk, were mixed and stored in a 50 ml tube for 24 hours. After 24 hours, the mixture was dissolved in a bath at 37 ° C, and the mixture was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes at 3,500 rpm.
마. 특이 hemp. singularity 난황항체Egg yolk antibody 역가의Potent 측정 Measure
(1) 항체 역가 측정을 위한 OMP(Outer membrane protein)의 분리 (1) Separation of OMP (Outer membrane protein) for antibody titration
생산된 항원 E. coli F18을 7,000 rpm에서 50분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 버리고 펠렛을 10 mM HEPES 버퍼로 현탁한 후, 초음파 파쇄하여 세균을 라이시스(Lysis) 하였다. 라이시스한 상등액을 4℃에서 7,000 rpm, 30분간 원심분리하여 상등액을 수확하였다. 수확한 상등액에 1% N-라우로릴 사르코신 (N-Lauroly sarcosine, SIGMA, L-9150)을 최종 농도 0.01%가 되도록 첨가한 후, 실온에서 10분간 처리하였다. 처리 후, 4℃에서, 15,000 rpm 50분간 원심분리하여 N-라우로릴 사르코신을 제거하고, 10mM HEPES 버퍼 50ml로 다시 부유시켜 4℃에서 15,000 rpm로 50분간 원심분리하여 OMP를 수거하였다. 수거된 항원은 BCA법으로 단백질 정량 후, 100 μg/ml이 되도록 설정하여 ELISA용-플레이트에 코팅하여 항체 역가 측정에 사용하였다.
The produced antigen E. coli F18 was centrifuged at 7,000 rpm for 50 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, the pellet was suspended in 10 mM HEPES buffer, and then the microbes were lysed by ultrasonication. The supernatant was harvested by centrifugation at 7,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. 1% N-Lauroly sarcosine (SIGMA, L-9150) was added to the harvested supernatant to a final concentration of 0.01% and treated at room temperature for 10 minutes. After the treatment, N-lauroyl sarcosine was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 50 minutes at 4 ° C, and then suspended again in 50 ml of 10 mM HEPES buffer. The OMP was recovered by centrifugation at 15,000 rpm for 50 minutes at 4 ° C. The collected antigen was quantitated by BCA method, and then set to 100 μg / ml, and coated on an ELISA plate for antibody titer measurement.
(2) ELISA에 의한 항체 역가 타이터(Titer) 측정 (2) Measurement of antibody titer by ELISA
난황 중 특이 난황항체의 역가는 'Indirect ELISA method'를 이용하여 측정하였으며, 난황항체의 활성은 Mine (Mine, Y. 1997. Seperation of Salmonella enteritdis from experimentally containated liquid eggs using a hen IgY immobilized immunomanetic separation system. J. Agric. Food Chem, 45, 3723-3727)이 사용한 ELISA 방법을 응용하여 측정하였다. 먼저, 항원을 100 μg/ml의 농도로 코팅 버퍼 (coating buffer)에 희석하여 각 웰(well) 당 100 μl씩 96 웰 폴리스리렌 플레이트 (well polystyrene plate)에 코팅하고, 4℃에서 오버나이트 시키거나, 37℃에서 1시간 방치시켰다. PBS-T(phosphate buffer saline, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 3회 세척 후, 3% BSA가 함유된 PBS 버퍼로 1시간 동안 37℃에서 블록킹(blocking) 하였으며, 상기와 같은 방법으로 세척하였다. 샘플 처리는 U-플레이트에, 음성 대조군의 경우 5개의 웰에 음성 샘플 20 μl에 PBS 버퍼 200 μl를 넣어 준비하였다. The specificity of egg yolk antibodies in egg yolk was measured using the 'Indirect ELISA method'. The activity of egg yolk antibodies was determined by Mine (Y., 1997. Seperation of Salmonella enteritidis from experimentally enclosed liquid eggs using hen IgY immobilized immunomanetic separation system. J. Agric. Food Chem., 45, 3723-3727). First, the antigen was diluted in a coating buffer at a concentration of 100 μg / ml, coated on a 96-well polystyrene plate in an amount of 100 μl per well, and incubated at 4 ° C. , And allowed to stand at 37 DEG C for 1 hour. After washing three times with PBS-T (phosphate buffer saline, 0.05% Tween 20, pH 7.4), the cells were blocked with PBS buffer containing 3% BSA for 1 hour at 37 ° C and washed in the same manner as described above . Sample preparation was prepared by placing 200 μl of PBS buffer in 20 μl of negative samples in U-plate and 5 wells of negative control.
난황 샘플은 2진 희석을 하기 위해 첫 웰을 제외한 11개의 웰에 PBS 110 μl씩 분주하였다. 난황 샘플 110 μl에 PBS 버퍼 110 μl를 넣어 8 웰 멀티 피펫을 이용하여 2진 희석하고, 블록킹 단계를 끝낸 플레이트에 U-플레이트에 희석하여 준비한 샘플을 100 μl씩 옮겨 분주하고 37℃에서 1시간 정치하였다. 1시간 후 3번 세척하고 'HRP Conjugate Stabilizer (SURMODICS, SZ02-1000)'에 희석한 2차 항체(anti-chicken: Sigma, USA)를 PBS에 적정량 희석하여 각 웰에 100 μl 씩 분주한 후 37℃에 1시간 반응시켰다. 그 후 3번 세척을 하고 'TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate Kit(KPL,50-76-03)'를 1:1로 혼합하여 각 웰에 100 μl씩 분주한 다음 실온에서 약 10분간 반응시키고 정지 용액 (Stop solution) 100 μl을 분주하여 반응을 중지시켜 450 nm의 파장에서 ELISA 리더기로 각 웰의 흡광도를 측정하여 ELISA 값으로 나타내었다. 측정된 결과에 음성의 O.D. 값을 2배수 하고, 처리된 난황의 희석배수를 대입하여 분석 데이터의 역가를 나타내었다.
The egg yolk samples were dispensed in 110 wells of PBS in 11 wells except the first well for binary dilution. 110 μl of the egg yolk sample was added to 110 μl of PBS buffer, and the resultant was subjected to binary dilution using an 8-well multi-pipette. After the blocking step, the sample was diluted with U-plate and transferred to a 100 μl aliquot. Respectively. (Anti-chicken: Sigma, USA) diluted in 'HRP Conjugate Stabilizer (SURMODICS, SZ02-1000)' was diluted to a proper volume in PBS, and 100 μl of each antibody was dispensed into each well. Lt; 0 > C for 1 hour. After washing three times, 100 μl of 'TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate Kit (KPL, 50-76-03)' was mixed at 1: 1 and each well was dispensed at 100 μl. The reaction was stopped by dispensing 100 μl of the stop solution, and the absorbance of each well was measured with an ELISA reader at a wavelength of 450 nm and expressed as an ELISA value. The OD value of the voice was doubled to the measured result, and the dilution ratio of the treated egg yolk was substituted.
(3) ELISA에 의한 항체가 측정 결과 (3) Measurement result of antibody by ELISA
산란계 백신 접종을 통해 생성된 주차별 난황 샘플에 대해 ELISA를 통하여 특이 난황항체 생성여부를 확인하였다. 위 ELISA방법에 의해 시험을 진행하였으며, 표 2의 결과에서 확인할 수 있듯이 이유자돈의 부종병 원인이 되는 병원성 세균 E. coli F18에 대한 IgY의 역가를 수거한 난황 샘플을 통하여 확인하였다.Generation of specific yolk antibodies was confirmed by ELISA on the egg yolk samples obtained from the laying hens. The test was carried out by the above ELISA method. As shown in the results of Table 2, the activity of IgY against the pathogenic bacterium E. coli F18, which is a cause of edema of the weaned piglets, was confirmed by collecting the yolk samples collected.
산란계에서 E. coli F18 백신을 제조하여 면역화 후 얻어진 난황을 이용하여 항원에 대한 IgY 타이터(titer)를 측정한 결과, 1차 접종 2주차부터 역가가 나타나기 시작하여 5차 접종 6주차까지 6,400~25,600의 역가가 나타남을 알 수 있었다.The IgG titer of the antigen was measured using egg yolk obtained after immunization and E. coli F18 vaccine was prepared from the laying hens. As a result, the titers of the antigens were measured from the 2nd week of the first inoculation to 6,400 ~ 25,600 were found to be active.
접종주차
Inoculation Parking
[[ 실시예Example 2: 생산된 특이 2: Produced peculiarities 면역단백질의Of the immune protein 확인] Confirm]
1. 암모니움 설페이트 (Ammonium sulfate)법을 이용한 항체 분리·정제 및 항체 분리 방법의 확립1. Establishment of methods for separation and purification of antibodies and separation of antibodies using Ammonium sulfate method
가. 암모니움 설페이트 처리 농도 설정 end. Ammonium sulfate treatment concentration setting
(1) 농도별 프랙션(fraction) 분리 실험 (1) Fractionation experiment by concentration
생산된 특이 난황항체 단백질을 순수하게 분리하기 위해 암모니움 설페이트 처리법을 이용하여 분리 정제를 진행하였다. 암모니움 설페이트를 각각의 농도에서 처리했을 때 분리 정제가 가장 잘 되는 농도를 확인하고자 실시하였다. Separation and purification were carried out using the ammonium sulfate treatment method to purely separate the produced specific egg yolk antibody protein. Ammonium sulfate was tested at each concentration to determine the best concentration for separation and purification.
산란계에서 E. coli F18 백신을 접종하여 고역가의 계란을 수거하여 난황 분리기를 이용하여 난백과 알끈을 제거하고, Whatman No.1 필터 페이퍼로 난막을 제거한 뒤, 비커에 난황 만을 분리하였다. 분리한 난황의 양을 측정하여 1차 증류수를 중량 대비 4배의 양을 넣어 1시간 동안 교반한 뒤, 1M HCl을 사용하여 pH 5로 조정하였다. 이 난황액을 -70℃ 초저온냉장고에서 하루 동안 보관하였다. In the laying hens, E. coli The F18 vaccine was inoculated to collect high-frequency eggs, and egg white and arsenic were removed using an egg yolk separator. After removing the egg yolk with Whatman No.1 filter paper, only yolk was removed from the beaker. The amount of egg yolk isolated was measured, and the amount of primary distilled water was adjusted to 4 times by weight. After stirring for 1 hour, the pH was adjusted to 5 using 1M HCl. This egg yolk solution was stored in a -70 ° C ultra-cold refrigerator for one day.
난황액을 실온에 꺼내 하루 정도 녹인 뒤, 10분 동안 원심분리(9,000 rpm, 4)하여 상등액을 얻어 진공펌프를 사용하여 Whatman No.1 필터 페이퍼에 여과하여 준비하였다. 여과된 상등액의 부피를 측정하여 25%에 해당되는 암모니움 설페이트를 얼음 조건에서 조금씩 첨가시켜 충분히 녹여주었다. 암모니움 설페이트 처리된 용액을 4℃에서 오버나이트 정치시킨 뒤, 30분 동안 원심분리(9,000 rpm, 4℃) 하여 펠렛을 수거하여 1×PBS 버퍼에 재현탁시켜 샘플을 수거하였다. 상등액은 부피를 측정하여 다시 30%에 해당되는 암모니움 설페이트를 첨가하여 펠렛과 상등액을 수거하였다. 같은 방법으로 암모니움 설페이트 35%, 50% 동일하게 처리하여 펠렛과 상등액 샘플을 수거하여 SDS-PAGE를 통해 특이난황 항체의 분리 정제 순도를 확인하였다.
The egg yolk solution was taken out at room temperature, dissolved for about one day, and centrifuged (9,000 rpm, 4) for 10 minutes to obtain supernatant, which was then filtered on Whatman No.1 filter paper using a vacuum pump. The volume of the filtered supernatant was measured and 25% ammonia sulfate was added in small portions under ice conditions to sufficiently dissolve it. The ammonium sulfate-treated solution was allowed to stand overnight at 4 ° C., and the pellet was collected by centrifugation (9,000 rpm, 4 ° C.) for 30 minutes and resuspended in 1 × PBS buffer to collect the sample. The supernatant was measured for volume, and the pellet and the supernatant were collected by addition of 30% of ammonium sulfate. The pellet and supernatant samples were collected by treating the same with 35% and 50% of ammonium sulfate, and the purity of the specific egg yolk antibody was determined by SDS-PAGE.
(2) 농도별 프랙션(fraction) 분리 실험 결과 (2) Fractionation test results by concentration
암모니움 설페이트를 처리하였을 때, 어느 농도에서 가장 분리가 잘 되는지 확인하기 위해 12% SDS-PGAE 겔에 각 샘플을 10 μg 로딩하여, 도 1과 같은 SDS-PAGE 결과를 확인하였다. 대조군 일반 IgY의 경우, 70 kDa의 헤비 체인 (heavy chain)과 21 kDa의 라이트 체인 (light chain) 밴드를 확인하였다. 1~8번 샘플의 농도별 분리된 것을 보면, 4~6번이 두 체인의 밴드가 가장 잘 분리되었고, 그 외에 다른 단백질들은 확인되지 않았다. 이 실험을 통해 암모니움 설페이트를 30~35% 농도로 처리하였을 때, 특이 난황항체가 잘 분리됨을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 암모니움 설페이트 농도별 단백질 SDS-PGE 결과이다 (C, Normal chicken IgY; 1, 암모니움 설페이트 25% 처리 후 상층액; 2, 25% 처리 후 펠렛; 3, 30% 처리 후 상층액; 4, 30% 처리 후 펠렛; 5, 35% 처리 후 상층액; 6, 35% 처리 후 펠렛; 7, 50% 처리 후 상층액; 8, 50% 처리 후 펠렛).
When ammonium sulfate was treated, 10 μg of each sample was loaded on a 12% SDS-PGAE gel to confirm the best separation at which concentration, and SDS-PAGE results as shown in FIG. 1 were confirmed. For the control general IgY, a heavy chain of 70 kDa and a light chain band of 21 kDa were identified. From the results of
나. 부종병 특이 난황항체 단백질의 분리·정제 I. Isolation and purification of edible egg specific egg yolk antibody protein
(1) 35% 암모니움 설페이트 처리법 (1) 35% ammonium sulfate treatment method
Anti-E. coli F18-IgY 단백질을 분리하기 위해서 E. coli F18 백신을 접종하여 항체가가 높은 2차 접종 2주차의 계란을 수거하였다. 준비된 계란을 난황 분리기를 이용하여 난백과 알끈을 제거하고, Whatman No.1 필터 페이퍼로 난막을 제거한 뒤, 비커에 난황만을 분리하였다. 분리한 난황의 양을 측정하여 1차 증류수를 중량 대비 4배에 해당되는 양을 넣어서 1시간 동안 교반한 뒤, 1M HCl을 사용하여 pH 5로 조정하였다. 이 난황액을 -70℃ 초저온냉장고에서 하루 동안 보관하였다. 난황액을 실온에 꺼내 하루 정도 녹인 뒤, 10분간 원심분리(9,000 rpm, 4℃)하여 상등액을 얻고 진공펌프를 사용하여 Whatman No.1 필터 페이퍼에 여과하여 사용하였다. 여과된 상등액의 부피를 측정하여 35%에 해당되는 암모니움 설페이트를 4℃ 조건에서 조금씩 첨가시켜 교반하여 녹였다. 이때, 처리한 농도는 위 암모니움 설페이트 농도 확인 실험을 통해 설정하였다. 암모니움 설페이트 처리된 용액을 4℃에서 하루 동안 정치시킨 뒤, 30분 동안 원심분리(9,000rpm, 4℃)하여 상등액은 버리고 펠렛을 수거하여 1×PBS 버퍼에 재현탁시켜 IgY 샘플을 수거하였다. 수거한 샘플은 'BCA protein assay kit (Pierce, 23227)'를 이용하여 단백질 정량을 진행하였고, 그 샘플은 SDS-PAGE 통해 순도를 확인하였다.
To isolate the Anti- E. coli F18-IgY protein, E. coli The F18 vaccine was inoculated and the second round of inoculation was collected. The prepared egg was removed with egg yolk separator, egg yolk was removed with Whatman No.1 filter paper, and egg yolk was separated from the beaker. The amount of egg yolk isolated was measured, and the amount of primary distilled water was adjusted to 4 times by weight, and the mixture was stirred for 1 hour and adjusted to
(2) 35% 암모니움 설페이트 처리 결과 (2) Results of 35% ammonium sulfate treatment
① 항 E. coli F18-IgY의 단백질 정량 및 순도 확인 결과(SDS-PAGE)(1) Results of protein quantification and purity determination of E. coli F18-IgY (SDS-PAGE)
암모니움 설페이트 처리법을 이용하여 분리한 Anti-E. coli F18-IgY를 'BCA protein assay kit'를 이용하여 정량한 결과, 30.2 mg/ml 농도로 확인되었다. 단백질량을 확인한 Anti-E. coli F18-IgY를 12% SDS-PAGE 겔에 5 μg 로딩한 결과, 약 30 kDa과 70 kDa에서 두 개의 밴드를 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 항 E. Coli IgY 항체 분리 SDS-PAGE 결과이다. 시중에 판매되고 있는 Normal chicken IgY와 비슷한 크기의 밴드가 확인된 것으로 보아 생산된 Anti-E. coli F18-IgY는 암모니움 설페이트 처리에 의해 난황 항체 단백질이 분리가 잘 되는 것으로 판단된다.
The amount of Anti- E. coli F18-IgY isolated by ammonium sulfate treatment was quantified using the BCA protein assay kit and was found to be 30.2 mg / ml. As a result of loading 5 μg of Anti- E. coli F18-IgY in a 12% SDS-PAGE gel, the two bands were confirmed at about 30 kDa and 70 kDa (FIG. 2). Figure 2 shows the result of SDS-PAGE analysis of the anti- E. coli IgY antibody. The band of similar size to that of the normal chicken IgY, which is sold in the market, was confirmed. Therefore, it is considered that the egg yolk antibody protein is easily separated by the treatment with the ammonium sulfate of the produced Anti- E. coli F18-IgY.
② 항 E. coli F18-IgY의 항원균에 대한 결합 친화도 (binding affinity) 결과 (Western-blot) (2) The binding affinity result (Western-blot) of anti- E. coli F18-IgY against antifungal agent
위에서 생산된 Anti-E. coli F18-IgY의 E. coli F18 균주에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 확인하고자, SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 (Western blot)을 진행하였다. SDS-PAGE는 12% 겔을 이용하여 E. coli F18 균주를 5 μg 로딩하여 확인한 결과로 균주에 대한 밴드를 확인할 수 있었다. 확인한 겔을 100 V에서 1시간 동안 NC 멤브레인에 이송하였으며, '5% skim milk in TBST'에 1시간 동안 블록킹 하였다. 1×TBST 버퍼를 이용하여 3회 세척을 진행한 뒤 1차 항체로 분리한 항 E. coli F18-IgY 2 μg/ml을 1시간 동안 처리하였고, 세척을 3회 진행하였다. 2차 항체로 Anti-Chicken-IgY-HRP를 1:30,000으로 1시간 동안 처리하고, 세척을 3회 진행하고, 'Chemiluminescent HRP Substrate (millipore, WBKLS0100)'를 이용하여 밴드를 확인하였다. 그 결과 E.coli F18 SDS-PAGE 결과로 확인되었던 밴드 중 일부를 웨스턴 블랏 결과에서 동일하게 확인하여 F18 항원의 단백질과 E.coli F18-IgY와 결합됨을 확인할 수 있었고, 생산된 항 E. coli F18-IgY과 E. coli F18항원에 대한 결합 친화도를 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 결과이다.
SDS-PAGE and Western blotting were carried out to confirm the binding affinity of the above-produced Anti- E. coli F18-IgY to E. coli F18 strain. SDS-PAGE was confirmed by loading 5 μg of E. coli F18 strain using 12% gel, and the band for the strain was confirmed. The confirmed gel was transferred to NC membrane at 100 V for 1 hour and blocked in '5% skim milk in TBST' for 1 hour. After washing three times with 1 × TBST buffer, 2 μg / ml of anti- E. coli F18-IgY isolated as the primary antibody was treated for 1 hour and washed three times. Anti-Chicken-IgY-HRP was treated with a secondary antibody at 1: 30,000 for 1 hour, washed three times, and band was confirmed using 'Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, WBKLS0100)'. As a result, some of the bands confirmed by the results of E. coli F18 SDS-PAGE were confirmed in the Western blot results and confirmed to be bound to the F18 antigen protein and E. coli F18-IgY, and the produced E. coli F18 -IgY and E. coli F18 antigen (Fig. 3). Figure 3 shows the results of SDS-PAGE and Western blotting.
2. 지표물질 함량 설정을 위한 기준 및 시험법에 관한 연구2. Study on criteria and test methods for setting the indicator material content
가. HPLC를 이용한 IgY 함량 분석 방법의 확립 end. Establishment of analytical method of IgY content by HPLC
(1) HPLC 분석 조건 (1) HPLC analysis conditions
부종균 난황 분말 내 총 IgY 함량을 측정하기 위하여 표 4와 같은 HPLC 시스템을 이용하였으며, 칼럼온도는 80℃, 검출기는 UV 280nm, 시료 주입량은 2 μl, 이동상은 각각 0.1% TFA를 혼합한 아세토니트릴(AcN)과 물을 사용하여 그래디언트 프로파일 (gradient profile)로 실시하였고, 유속은 0.8 ml/min을 사용하여 실험하였다. In order to measure the total IgY content in the egg yolk powder of spontaneus, the HPLC system as shown in Table 4 was used. The column temperature was 80 ° C, the detector was UV 280 nm, the sample injection amount was 2 μl and the mobile phase was acetonitrile (AcN) and water in a gradient profile and the flow rate was 0.8 ml / min.
HPLC system
Solvent
(min)Time
(min)
(ml/min)Flow
(ml / min)
(2) 표준액 제조 및 직선성(linearity) 측정 (2) Preparation of standard liquid and measurement of linearity
표준시약은 IgY 단백질 (from egg yolk 21 mg/ml, abcam, ad119138)을 구매하여 사용하였으며, H2O(HPLC grade)를 이용하여 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/ml 농도로 제작하여 표준용액으로 사용하였다. 표준곡선은 HPLC 분석 프로그램(Lab solution v5.3, Shimadzu)을 이용하여 제작하였다.
The standard reagents were prepared by using IgY protein (from egg yolk 21 mg / ml, abcam, ad119138) and using H 2 O (HPLC grade) at concentrations of 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 and 1 mg / ml The standard solution was used. Standard curves were prepared using HPLC analysis program (Lab solution v5.3, Shimadzu).
(3) HPLC 시스템 적합성(suitability) 측정 (3) HPLC system suitability measurement
IgY 함량 HPLC 분석조건의 적합성을 측정하기 위하여 IgY 표준용액 0.5 mg/ml를 이용하여 9회 반복 측정하였으며, 분석된 피크의 머무름 시간(RT), 피크면적(peak area) 및 피크 높이 50% 지점 넓이(50% width)의 상대표준편차(RSD, %)의 값이 1.0% 이하의 값을 만족하는지, 최저 이론단수(plate number)의 값이 2,000 이상을 만족하는지 검토하였다.
IgY content To determine the suitability of the HPLC analysis conditions, the measurement was repeated 9 times using 0.5 mg / ml IgY standard solution. The retention time (RT), peak area and peak height at 50% (RSD,%) of 50% width satisfy the value of 1.0% or less and whether the value of the lowest theoretical plate number satisfies 2,000 or more.
(4) 정밀성(precision) 측정 (4) Precision measurement
표준용액을 일간 및 일내 변동을 알아보기 위해 위에서 설정한 5가지 농도를 하루에 5개씩 3일간 반복 측정하여 피크 면적비의 상대표준편차(RSD, %)로 검토하였다. To determine the daily and intra-day variability of the standard solutions, the five standard concentrations (RSD,%) of the peak area ratios were determined by repeating the above 5 concentrations for 3 days.
[수학식 1][Equation 1]
상대표준편차 (RSD, %) = (표준편차/평균) ×100
Relative standard deviation (RSD,%) = (standard deviation / average) x 100
(5) 정확성(Accuracy) (5) Accuracy
HPLC 분석조건의 정확성을 알아보고자 각 농도의 표준용액을 각각 3회 주입하여 획득한 결과를 검량선에 대입하여 얻은 결과와 참값의 오차정도(회수율, %)로 정확성을 평가하였다. To evaluate the accuracy of the HPLC analysis conditions, the accuracy was evaluated based on the results obtained by substituting the results obtained by injecting each standard solution three times at each concentration into the calibration curve and the degree of error (recovery rate,%) of true values.
[수학식 2] &Quot; (2) "
회수율(Recovery, %) = (측정농도/이론농도) ×100
Recovery (%) = (measured concentration / theoretical concentration) × 100
나. 시료 내 IgY 분석 I. IgY analysis in samples
(1) 시료처리 (1) Sample treatment
난황분말을 10배의 물(H2O, HPLC grade)에 혼합 후 1N HCl을 이용하여 pH 5(±0.2)로 보정하여 1분간 균질시켰다. 균질액을 4에서 4,000 rpm으로 30분간 원심분리 후 Whatman No.1 필터 페이퍼로 여과하였으며, 얻은 여액을 0.2 μm 시린지 필터로 다시 여과 후 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.
The egg yolk powder was mixed with 10 times of water (H 2 O, HPLC grade), adjusted to pH 5 (± 0.2) with 1N HCl and homogenized for 1 minute. The homogenate was centrifuged at 4 to 4,000 rpm for 30 minutes, filtered through Whatman No.1 filter paper, and the filtrate was filtered through a 0.2 μm syringe filter and used as a sample for HPLC analysis.
(2) 시료 내 IgY 함량 분석조건 확립 (2) Establishment conditions for analyzing IgY content in the sample
부종균 난황 분말로부터 제작된 시료 내 IgY 함량 HPLC 분석 조건의 신뢰성이 확립되었는지 알아보기 위하여 한 개의 분석용 시료를 6회 반복 측정하여 머무름 시간 및 피크면적의 상대표준편차를 구하여 정확성을 확인하였으며, 5개의 분석용 시료를 3일간 반복 측정하여 피크면적의 상대표준편차로 정밀성을 검토하였다.
To confirm the reliability of the HPLC assay conditions for the IgY content in the samples prepared from the egg yolk powder, the relative standard deviation of the retention time and the peak area was determined by repeating the measurement of one analytical sample six times. The analytical samples were repeatedly measured for 3 days and the precision was evaluated by the relative standard deviation of the peak area.
다. HPLC를 이용한 IgY 함량 분석 조건의 확립 결과 All. Results of Establishment of Conditions for Analysis of IgY Content by HPLC
(1) HPLC 분석 직선성(linearity)측정 (1) HPLC analysis Linearity measurement
IgY 표준용액의 농도별 HPLC 분석 결과, 도 4의 (A)와 같이 14.5 min의 동일한 머무름 시간(retention time, RT)에 분석되는 피크를 확인할 수 있었다. 각 표준용액에 대하여 작성된 표준곡선으로부터 직선성의 상관계수(R2)를 구한 결과, 도 4의 (B)에서 보는 바와 같이 1.000의 상관관계를 나타내어 직선성이 인정되었다. 도 4는 IgY 표준용액 농도별 HPLC 분석 및 표준곡선 작성의 결과이다. 또한, 표준용액의 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)가 각각 0.001 mg/ml, 0.012 mg/ml로 나타났다(표 4). As a result of HPLC analysis of the concentration of the IgY standard solution, it was confirmed that the peak analyzed at the same retention time (RT) of 14.5 min as in FIG. 4 (A). The correlation coefficient (R 2 ) of the linearity was calculated from the standard curve prepared for each standard solution, and as a result, the correlation was 1.000 as shown in FIG. 4 (B), and the linearity was recognized. Figure 4 shows the results of HPLC analysis and standard curve creation for IgY standard solution concentration. The detection limit (LOD) and the limit of quantification (LOQ) of the standard solution were 0.001 mg / ml and 0.012 mg / ml, respectively (Table 4).
(2) HPLC 분석 시스템 적합성(suiability) 측정 (2) HPLC analysis system suiability measurement
한 개의 표준용액을 반복 측정함으로서 HPLC 분석 시스템의 적합성을 알아본 결과, 머무름 시간(RT), 피크 면적(peak area) 및 피크 높이 50% 지점 넓이(50% width)의 상대표준편차(RSD, %)가 모두 1.0% 이하로 나타났으며, 최저이론단수(plate number) 2000 이상으로 나타나 적합성 기준을 모두 만족하는 결과를 나타내었다 (표 5).
The relative standard deviation (RSD,%) of retention time (RT), peak area and
a)RSD(상대표준편차, %) = (표준편차/평균) ×100
a) RSD (relative standard deviation,%) = (standard deviation / average) x 100
(3) 정밀성(precision) 측정 (3) Precision measurement
각 HPLC 분석결과의 일간 및 일내 변동을 알아본 결과 시험에 사용된 표준물질의 각 농도 측정에서 모두 기준치인 상대표준편차 1.0% 이하의 값을 나타내었다(표 6). The daily and intra-day variations of each HPLC analysis were examined. As a result, the relative standard deviation of the reference standard value was 1.0% or less (Table 6).
a)RSD(상대표준편차, %) = (표준편차/평균) ×100
a) RSD (relative standard deviation,%) = (standard deviation / average) x 100
(4) 정확성(Accuracy) (4) Accuracy
HPLC 분석방법의 정확성을 측정한 결과 정밀성에서의 결과와 마찬가지로 모든 농도에서 기준치인 회수율 100±3%에 부합하는 결과가 측정되었다 (표 7). As a result of the accuracy of the HPLC method, the results were found to correspond to the reference recovery of 100 ± 3% at all concentrations (Table 7).
Max 1.0%RSD (%)
Max 1.0%
a)RSD(상대표준편차, %) = (표준편차/평균) × 100 a) RSD (relative standard deviation,%) = (standard deviation / average) x 100
b)Recovery(회수율, %) = (측정농도/이론농도) × 100
b) Recovery (recovery rate,%) = (measured concentration / theoretical concentration) × 100
이상의 결과로 볼 때 HPLC 시스템을 이용한 IgY 분석 조건은 확립되었음을 알 수 있었으며, 본 연구에서 확립된 분석조건에서의 분석 범위는 0.0625~1 mg/ml로 설정하였다.
From the above results, it was found that the conditions of IgY assay using HPLC system were established, and the range of analysis under the established analytical conditions was set to 0.0625 ~ 1 mg / ml.
라. la. 난황Yolk 분말 시료 내 In the powder sample IgYIgY 분석 analysis
(1) 난황 분무건조 분말시료 내 IgY 함량 분석조건 확립 (1) Conditions for analysis of IgY content in egg yolk spray dried powder samples
HPLC 시스템을 이용한 IgY 분석조건의 시료 내 IgY 분석에 대한 적합성을 알아본 결과, 도 5와 같이 같은 머무름 시간(14.52 min)에 높은 분리능(resolution factor, R=2.5)의 피크를 확인하여 IgY 분석 방법의 적합성을 확인할 수 있었다. 도 5는 확립된 난황분말 내 IgY 분석조건의 적합성을 확인시켜 주는 결과이다. 또한, 정밀성을 측정한 결과 머무름 시간(RT) 및 피크면적의 상대표준편차(RSD, %)가 모두 1.0% 이하로 나타나 정밀성 기준을 만족하는 결과를 보여주었다 (표 8). As a result of examining the suitability of IgY assay conditions using the HPLC system for the IgY analysis in the sample, it was confirmed that the peak of resolution factor (R = 2.5) was observed at the same retention time (14.52 min) The suitability of FIG. 5 shows the results of confirming the suitability of the IgY assay conditions in the established egg yolk powder. Also, as a result of measurement of precision, the relative standard deviation (RSD,%) of retention time (RT) and peak area were all below 1.0%.
Max1.0%RSD (%)
Max1.0%
areaPeak
area
a)RSD(상대표준편차, %) = (표준편차/평균) × 100
a) RSD (relative standard deviation,%) = (standard deviation / average) x 100
시료 내 IgY 분석방법의 정확성은 측정된 IgY 함량의 일내 및 일간 변동을 상대표준편차(RSD, %)로 계산한 결과 모두 1% 이내로 분석되어 정확성 기준에 적합한 결과를 보여주었다 (표 9). 이로써 시료 내 IgY 분석 방법은 정립되었다. The accuracy of the IgY assay in the samples was analyzed by the relative standard deviation (RSD,%) within 1% of the measured IgY content within the day and within the day, and the results were appropriate for the accuracy criterion (Table 9). As a result, the method of analyzing IgY in the sample was established.
a)RSD(상대표준편차, %) = (표준편차/평균) ×100
a) RSD (relative standard deviation,%) = (standard deviation / average) x 100
[[ 실시예Example 3: 특이면역 단백질의 효능효과 확인] 3: Identification of efficacy of specific immune protein]
1. One. 이유자돈Weaned pigeon 사료 내 In feed IgYIgY 첨가 급여 사양시험(국내) Additive Feed Specification Test (Domestic)
가. 연구목적 end. Research Purpose
사료 내 항-부종균 IgY 난황분말이 이유자돈의 생산성과 부종병 발생 여부에 미치는 영향에 대해 알아보고자 실시하였다.
To investigate the effect of the anti - subunit IgY yolk powder in feed on the productivity and edema disease of weaned piglets.
나. 재료 및 방법 I. Materials and methods
(1) 시험동물 및 시험설계 (1) Test animals and test design
3원 교잡종 (Landrace×Yorkshire×Duroc) 이유자돈 27두를 공시하였고, 시험 개시시의 체중은 5.22±1.21 kg이었으며, 사양시험은 4주간 실시하였다. 처리구는 1) IgY (99.8% basal diet + 0.2% IgY ), 2) NC (100% basal diet), 3) PC (99.8% basal diet + 0.2% 자사제품)(*자사제품 : 50% IgY + 50% 아이지 가드®, 애드바이오텍 생산)로 3처리, 3반복, 반복당 3마리씩임의 배치하여 반복당 부종균 107, 108, 109cfu/1ml를 각각 경구투여 하였다.
(Landrace × Yorkshire × Duroc) Weighed 27 dogs were weighed and weighed 5.22 ± 1.21 kg at the start of the test. The treatments were 1) IgY (99.8% basal diet + 0.2% IgY), 2) NC (100% basal diet) and 3) PC (99.8% basal diet + 0.2% % AIJI guard ®, add Biotech production) the 3 treatment, three replications, 3 rats per repeating unit to a random arrangement seed 10 7, 10 8, 10 9 cfu / 1ml per repetition were each administered orally.
(2) 시험사료 및 사양관리 (2) Management of test feeds and specifications
사양시험은 단국대학교 시험농장에서 실시하였으며, 시험사료는 NRC(2012) 요구량에 따라 배합한 옥수수-대두박 위주의 사료로 무한 급여하였으며, 물은 자동급수기를 이용하여 자유로이 먹을 수 있도록 조절하였다.
The test was conducted at Dankook University test farm. Feeds were fed infinitely to corn-soybean meal based on NRC (2012) requirement and water was adjusted to be freely fed using an automatic water dispenser.
(3) 조사항목 (3) Survey items
① 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율 ① daily gain, daily dietary intake and feed efficiency
체중 및 사료 섭취량은 공격접종 1주 전, 공격 접종 1주 후 및 종료 시 (공격접종 후 3주)에 측정하여 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율을 계산하였다.
Body weight and feed intake were measured at 1 week before, 1 week after, and 3 weeks after the inoculation, and daily body weight gain, daily feed intake and feed efficiency were calculated.
② 분변지수 ② Fecal index
분변지수는 매주 측정하였으며, 스코어(score)로 수치화하였다. (Score 1 = hard, dry pellets in a small, hard mass; 2 = hard, formed stool that remains firm and soft; 3 = soft, formed, and moist stool that retains its shape; 4 = soft, unformed stool that assumes the shape of the container; 5 = watery, liquid stool that can be poured.)
Fecal index was measured weekly and scored as a score. 2 = hard, formed stool that remains firm and soft; 3 = soft, formed, and moist stool that retains its shape; 4 = soft, unformed stool that assumes the 5 = watery, liquid stool that can be poured.
③ 부종병 발생 ③ edema
부종병 발생 여부는 시험 개시 후 22일자에 이유자돈의 눈꺼풀, 귀, 얼굴, 몸 등의 여러 부위에 부종의 여부와 신경증상을 전문 수의사가 관찰하여 수치화 (0:정상, 1:경미, 2:심각)하였다.
The presence or absence of edema was assessed by a professional veterinarian (n = 0: normal, 1: mild, 2: severe) by observing edema and neurological symptoms in various parts of eyelid, ear, face, ).
④ 부검 ④ Autopsy
시험 개시 후 22일자에 전문 수의사가 부검하여 복수저류, 장사이막 임파절 출혈, 부종의 크기, 장관막, 장벽의 수종성 비후를 육안으로 관찰하여 수치화 (0:정상, 1:경미, 2:심각)하였다.
On the 22nd day after the initiation of the test, the veterinarian autopsied and quantified (0: normal, 1: mild, 2: severe) by observing multiple reservoirs, enlargement of the jejunal membrane, size of the edema, thickening of the intestinal wall, Respectively.
(4) 통계처리 (4) Statistical processing
모든 자료는 SAS (2001)의 'General Linear Model Procedure'를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 유의성이 있을 경우 'Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)'로 처리 평균간의 유의성을 검정하였다.
All data were analyzed using the 'General Linear Model Procedure' of SAS (2001), and the significance of the mean between the treatment averages was tested with Duncan's multiple range test (Duncan, 1955).
다. 사양시험 결과 All. Specification Test Result
(1) 생산성 (1) Productivity
IgY 첨가 급여가 이유자돈의 생산성에 미치는 영향은 표 10에 나타내었다. 0~2주차 일당증체량에 있어서 IgY 처리구가 NC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났으며, 사료효율에 있어서 IgY 처리구가 NC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.05). 또한, 2~4주차의 일당증체량에 있어서는 IgY 처리구가 NC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다 (P>0.05). 전체 시험기간 동안 일당증체량에 있어선 IgY 처리구가 NC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.05).The effects of IgY supplementation on the productivity of weaned piglets are shown in Table 10. The IgY treatment group showed significantly higher IgE treatment groups than the NC treatments ( p <0.05). In addition, IgY treatment group was significantly higher ( p > 0.05) than the NC treatment group at 2 ~ 4th day of gestation. During the whole test period, IgY treatment was significantly higher ( p <0.05) in the daily gain than the NC treatment.
1)Abbreviation: IgY, NC + IgY 0.2%; NC, Basal diet(No antibiotics); PC, NC + additive 0.2% 1) Abbreviation: IgY, NC + IgY 0.2%; NC, Basal diet (No antibiotics); PC, NC + additive 0.2%
2)Standard error. 2) Standard error.
a,b Means in the same row with different superscripts differ (P < 0.05).
a, b Means in the same row with different superscripts differ ( P <0.05).
(2) 분변지수 (2) Fecal index
IgY 첨가 급여가 이유자돈의 분변지수에 미치는 영향은 표 11에 나타내었다. 공격접종 후 1주차, 2주차, 3주차 분변지수에 있어서 IgY 처리구가 NC와 PC 처리구보다 유의적으로 낮게 나타났다 (P<0.05).The effects of IgY supplementation on fecal indices of weaned piglets are shown in Table 11. IgY treatment was significantly lower ( P <0.05) in the 1, 2, and 3 feces indexes after challenge than NC and PC treatments.
1)Abbreviation: IgY, NC + IgY 0.2%; NC, Basal diet(No antibiotics); PC, NC + additive 0.2% 1) Abbreviation: IgY, NC + IgY 0.2%; NC, Basal diet (No antibiotics); PC, NC + additive 0.2%
2)Standard error. 2) Standard error.
3)Fecal scores : 1 hard, dry pellet; 2 firm, formed stool; 3 soft, moist stool that retains shape; 4 soft, unformed stool that assumes shape of container; 5 watery liquid that can be poured. 3) Fecal scores: 1 hard, dry pellet; 2 firm, formed stool; 3 soft, moist stool that retains shape; 4 soft, unformed stool that assumes shape of container; 5 watery liquid that can be poured.
a,b Means in the same row with different superscripts differ (P < 0.05).
a, b Means in the same row with different superscripts differ ( P <0.05).
(3) 부종병 발병 유무 (3) presence or absence of edema disease
IgY처리구 이유자돈 부검 시 모두 경도-중도 부종병 부검 소견을 보였으나, IgY 처리구 이유자돈이 NC 와 PC 처리구보다 경미한 증상을 보였다.
IgY treatment We detected both hardness and moderate edema at autopsy, but IgY treated weaned piglets showed milder symptoms than NC and PC treatment.
(4) 부종병 농도별 효과 (4) Effect of edema disease concentration
부종병균 농도에 따른 IgY 첨가 급여가 이유자돈의 생산성에 미치는 영향은 표 12에 나타내었다. The effects of IgY supplementation on the productivity of weaned piglets according to edema germ concentration are shown in Table 12.
1)Abbreviation: IgY, NC + IgY 0.2%; NC, Basal diet(No antibiotics); PC, NC + additive 0.2% 1) Abbreviation: IgY, NC + IgY 0.2%; NC, Basal diet (No antibiotics); PC, NC + additive 0.2%
2)Standard error. 2) Standard error.
a- dMeans in the same row with different superscripts differ (P < 0.05).
a- d Means in the same row with different superscripts differ (P <0.05).
자돈의 체중에 있어, 부종병균 투여 후 7일차에서 IgY 처리구 중 부종병균 107cfu/1ml, 108cfu/1ml, 109cfu/1ml를 투여한 그룹과 PC 처리구 중 108cfu/1ml를 투여한 처리구가, NC 처리구의 109cfu/1ml를 투여한 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.05). 14일차에서 IgY 처리구 중 부종병균 108cfu/1ml, 109cfu/1ml를 투여한 그룹과 PC 처리구 중 108cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났고 (P<0.05), NC 처리구의 109cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다 (P<0.05). In the piglet weight, swelling of the after swelling germs administration treatment groups at 7
실험 0~2주차에선 일당증체량이 모든 IgY 처리구 (부종병균 107cfu/1ml, 108cfu/1ml, 109cfu/1ml 투여) 및 PC 처리구 중 108cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났고 (P<0.05), NC 처리구의 109cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다 (P<0.05). In the 0th and 2nd weeks of the experiment, the daily weight gain was significantly higher in all IgY treatments (10 7 cfu / 1 ml, 10 8 cfu / 1 ml, 10 9 cfu / 1 ml of swelling germ) and 10 8 cfu / ( P <0.05). The treatment group treated with 10 9 cfu / 1 ml of NC treatment showed the lowest value ( P <0.05).
사료효율에선 모든 IgY 처리구 (부종병균 107cfu/1ml, 108cfu/1ml, 109cfu/1ml투여) 및 PC 처리구 중 부종병균 108cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났고 (P<0.05), NC처리구의 107cfu/1ml, 109cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다 (P<0.05). Feed efficiency was significantly higher in all IgY treatments (10 7 cfu / 1 ml, 10 8 cfu / 1 ml, 10 9 cfu / 1 ml of edema germs) and 10 8 cfu / ml of edema germ in PC treatments ( P <0.05). The treatment group treated with 10 7 cfu / 1 ml and 10 9 cfu / 1 ml of NC treatment showed the lowest ( P <0.05).
실험 2~4주차에서의 일당증체량에서는, IgY 처리구 중 부종병균 108cfu/1ml, 109cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났고 (P<0.05), PC 처리구의 부종병균 107cfu/1ml를 투여한 처리구가 유의적으로 가장 낮게 나타났다 (P<0.05). In the 2 nd and 4 th weeks of gestation, the IgE treatment group showed the highest ( p <0.05) the treatment groups with 10 8 cfu / 1 ml and 10 9 cfu / 1 ml edema germs, 10 7 cfu / 1 ml was significantly lower than the control group ( P <0.05).
전체 실험기간 동안 일당증체량에 있어 IgY 처리구 중 부종병균 108cfu/1ml, 109cfu/1ml을 투여한 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났고 (P<0.05), NC 처리구 중 부종병균 109cfu/1ml를 투여한 처리구가 가장 낮게 나타났다 (P<0.05).
Edema of it IgY treatment during the whole experiment period, daily gain germs 10 8 cfu / 1ml, 10 9 cfu / 1ml one treatment a was the highest significantly with administration of (P <0.05),
(5) 부검 (5) Autopsy
① IgY 처리구 : 소량의 복수저류 소견을 보이며 경도의 장간막, 임파절 출혈 및 경도의 장벽 수종성 비후 소견을 보였임. ① IgY treatment: There was a small amount of multiple retention findings and showed mild mesenteric, lymphatic hemorrhage and mild variceal thickening.
② NC 처리구 : 다량의 복수 저류 및 경도-중도의 장간막, 임파절 출혈 및 중도의 장벽 수종성 비후 소견을 보임. ② NC treatment: Large amount of multiple retention and hardness - Midterm mesentery, lymph node hemorrhage and moderate intimal thickening.
③ PC 처리구 : 소량의 복수저류 소견을 보이며 경도의 장간막, 임파절 출혈 및 경도의 장벽 수종성 비후 소견을 보임.
③ PC treatment: Small amount of multiple retention findings, showing mild mesentery, lymphatic hemorrhage and mild thickening of the wall.
상기의 결과를 종합하자면, 이유자돈 사료 내 IgY를 첨가하였을 때 NC처리구보다 전체 시험기간 동안의 일당증체량과, 0~2주차 사료효율이 유의적으로 증가하였다. 분변지수에서는 IgY 첨가구가 NC 및 PC 이유자돈보다 1주차, 2주차, 3주차 분변지수에서 유의적으로 낮게 나타났다. 부종병의 발병에서는 IgY 첨가구에서 모두 경도-중도의 부종병 부검 소견을 보였으나, NC 및 PC 처리구의 이유자돈보다 경미한 증상을 보였다. 부검결과에서는 IgY 첨가구에서 소량의 복수저류 소견을 보이며 경도의 장간막, 임파절 출혈 및 경도의 장벽 수종성 비후소견을 보였다. 그러나, NC처리구는 다량의 복수 저류 및 경도-중도의 장간막, 임파절 출혈 및 중도의 장벽 수종성 비후 소견을 보였고, PC처리구는 소량의 복수저류 소견을 보이며 경도의 장간막, 임파절 출혈 및 경도의 장벽 수종성 비후 소견을 보였다. In conclusion, the addition of IgY in weanling diets significantly increased the daily gain and the 0 - to - 2 - feed efficiency during the whole test period compared to the NC treatment. In the fecundity index, the IgY additions were significantly lower in the 1, 2, and 3-week fecal indices than NC and PC. In the case of edema disease, all IgY tumors showed mild to moderate edema, but mild symptoms were found in the NC and PC treatments. In the autopsy results, a small amount of multiple retention was seen in the IgY appendages and showed mild mesenteric, lymph node hemorrhage, and mild thickening of the wall. However, NC treatments showed large amounts of multiple reservoirs and mild-to-moderate mesentery, lymph node hemorrhage and moderate thickening of the wall hydronephrosis, PC treatment showed a small amount of multiple retention and mild mesentery, lymphatic hemorrhage and hardness barrier And bilateral hypertrophy.
결과적으로 이유자돈 사료 내 IgY의 첨가 시 생산성 향상 및 설사지수를 감소시키고 자돈 체내의 부종병 발생을 억제하는 효과를 가져오는 것으로 판단되었다.
As a result, it was concluded that the addition of IgY in weaned diets resulted in improved productivity, decreased diarrhea index, and suppressed edema of the pigs.
Claims (6)
Egg yolk antibody IgY isolated from egg yolk of laying hens after inoculation of E. coli F18 (KCTC 12787BP) on the laying hens.
Characterized in that it comprises an egg yolk antibody IgY obtained by inoculating E. coli F18 (KCTC 12787BP) on a laying hens and then separated from the yolk of an egg laid by the laying hens.
상기 돼지 사료 또는 사료 첨가제는,
돼지부종병 예방용인 것을 특징으로 하는 돼지 사료 또는 사료 첨가제.
3. The method of claim 2,
The pig feed or feed additive may contain,
A pig feed or feed additive characterized by the prevention of swine edema.
상기 돼지는,
이유자돈인 것을 특징으로 하는 돼지 사료 또는 사료 첨가제.
3. The method of claim 2,
The pig,
A pig feed or feed additive characterized by being a progeny pig.
An egg yolk antibody IgY obtained by inoculating E. coli F18 (KCTC 12787BP) into a laying hens and then separated from yolk of eggs produced by the laying hens is fed to a pig.
상기 돼지는,
이유자돈인 것을 특징으로 하는 돼지 사육방법.
6. The method of claim 5,
The pig,
A method for breeding pigs characterized in that they are weaned pigs.
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KR (1) | KR20160133120A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20230119818A (en) | 2022-02-08 | 2023-08-16 | 전북대학교산학협력단 | Recombinant Stx2e Protein, Swine Edema Disease Vaccine Composition comprising the same and Oral Dosage Form |
KR20230143693A (en) | 2022-04-06 | 2023-10-13 | 전북대학교산학협력단 | Recombinant Stx2e Protein, Mass Production Method thereof, and Swine Edema Disease Vaccine Composition comprising the same |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20100044813A (en) | 2007-07-03 | 2010-04-30 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | Vaccine for swine edema disease |
-
2015
- 2015-05-12 KR KR1020150065755A patent/KR20160133120A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
KR20100044813A (en) | 2007-07-03 | 2010-04-30 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | Vaccine for swine edema disease |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20230119818A (en) | 2022-02-08 | 2023-08-16 | 전북대학교산학협력단 | Recombinant Stx2e Protein, Swine Edema Disease Vaccine Composition comprising the same and Oral Dosage Form |
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