KR20160126918A - Methods of utilizing xylose as a carbon source using secretory expression of xylose isomerase - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to an expression cassette for secretary expression to secret xylose isomerase in yeast, the expression cassette comprising a polynucleotide coding translational fusion partner (TFP) and a polynucleotide coding xylose isomerase, to an expression vector comprising the expression cassette, and to a transgenic microorganism having the expression vector introduced thereinto. In addition, the present invention relates to a method for producing xylose isomerase, comprising a step for culturing the transgenic microorganism, and to a method for producing xylose, comprising a step for culturing the transgenic microorganism in a medium containing xylose as a carbon source. The economical feasibility of bio-ethanol produced from the fiber bio-mass can be secured by using the cassette for expressing xylose isomerase, the vector, and the transgenic microorganism of the present invention and using xylose as a carbon source.

Description

자일로스 이소머라제의 분비발현을 통하여 자일로스를 탄소원으로 이용하는 방법{Methods of utilizing xylose as a carbon source using secretory expression of xylose isomerase}Methods for utilizing xylose as a carbon source through expression of secretion of xylose isomerase [

본 발명은 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 자일로스 이소머라제를 분비시키기 위한 분비 발현용 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질 전환 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 자일로스 이소머라제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환 미생물을 탄소원으로 자일로스를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 질룰로스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환 미생물을 이용하여 바이오 매스 유래 복합당을 당화 및 발효하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a secretory expression for secretion of xylose isomerase in yeast, comprising a polynucleotide encoding a translational fusion partner (TFP) and a polynucleotide encoding a xylose isomerase An expression cassette comprising the expression cassette, and a transformant microorganism into which the expression vector has been introduced. The present invention also provides a method for producing xylose isomerase, comprising culturing the transformed microorganism, and culturing the transformed microorganism in a medium containing xylose as a carbon source. And a method for producing the same. The present invention also relates to a method for saccharifying and fermenting a biomass-derived complex sugar using the above-mentioned transforming microorganism.

화석연료 사용으로 인한 다양한 문제점들이 제기되면서 재생 가능한 바이오에너지에 대한 관심이 높아지고 있다. 현재까지 가장 널리 사용되는 재생가능 바이오에너지는 옥수수와 사탕수수로부터 생산되는 에탄올이다. 그러나 이러한 곡물을 에탄올 생산의 재료로 사용하는 것은 에그플레이션을 유발하게 됨으로써 바이오 에탄올이 또 다른 식량문제를 일으키는 원인이 되고 있다. 따라서 지구상에서 가장 풍부한 유기물인 섬유소 바이오매스를 에탄올 생산을 위한 공급원료로 사용하고자 하는 연구가 폭발적으로 진행되고 있다. With the rise of various problems caused by the use of fossil fuels, interest in renewable bioenergy is increasing. The most widely used renewable bioenergy to date is ethanol produced from corn and sugar cane. However, the use of these grains as a material for ethanol production has led to egg fugitives, causing bioethanol to cause another food problem. Therefore, research is being carried out explosively to use fiber biomass, the most abundant organic matter on the planet, as a feedstock for ethanol production.

섬유소 바이오매스는 40-50%의 셀룰로스, 25-35% 헤미셀룰로스, 15-20%의 리그닌으로 구성되어있다. 셀룰로스는 당화 과정을 거치면 에탄올 발효에 직접 이용할 수 있는 포도당이 생성되는 반면에 또 다른 주요 다당류인 헤미셀룰로스는 주로 5탄당인 자일로스(xylose)의 중합체로 구성되어 있다. 따라서 섬유소 바이오매스로부터 생산되는 바이오에탄올의 경제성을 확보하기 위해서는 셀룰로스 뿐만 아니라 헤미셀룰로스로부터 생성되는 자일로스도 동시에 활용할 수 있는 균주 개발이 필수적이다. Cellulosic biomass consists of 40-50% cellulose, 25-35% hemicellulose, and 15-20% lignin. Cellulose produces glucose that can be directly used for ethanol fermentation through glycosylation, while another major polysaccharide, hemicellulose, is composed of a polymer of xylose, which is mainly pentane. Therefore, in order to secure the economical efficiency of bioethanol produced from the fibrous biomass, it is essential to develop a strain capable of simultaneously utilizing xylose produced from hemicellulose as well as cellulose.

효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 전통적으로 에탄올 발효 및 알콜 함유식품의 제조에 오랜 기간 이용되어 왔으며, 이미 전분 및 당류 유래 자원을 이용한 바이오에탄올 생산에 이용되어 상업적인 가능성을 검증받은 균주이다. 하지만, 야생형 사카로마이세스 세레비지에는 자일로스를 발효하지 못하는 약점이 있다. Saccharomyces cerevisiae has traditionally been used for a long time in the production of ethanol-fermented and alcohol-containing foods and has been used for the production of bioethanol using starch and saccharide-derived resources, to be. However, there is a weak point in the wild-type Saccharomyces cerevisiae that does not allow xylose to be effective.

사카로마이세스 세레비지에는 자일로스 발효 효율은 매우 낮지만, 그 이성질체인 질루로스(xylulose)는 효율적으로 발효하여 에탄올을 생산할 수 있다. 이에, 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 박테리아로부터 확보하여 효모에서 발현을 하였지만, 효소의 발현율이 매우 낮고 활성형 효소가 만들어지지 않는 문제가 있었으며, 고온성 박테리아로부터 얻어진 자일로스 이소머라제 역시 발현은 되었으나 효소 최적온도의 차이로 인해 자일로스 대사에 큰 효과를 얻지 못하였다(Walfridsson 등, Appl. Environ. Microbial. 1996. 62, 4648, Gardonyl and Hahn-Hagerdal, 2003, Enzyme Microb. Technol. 32, 252). 혐기성 곰팡이인 피로마이세스(Piromyces)로부터 분리된 자일로스 이소머라제를 효모에서 세포내 발현하여도 자일로스 대사 효율은 낮았다(Kuyper 등, FEMS Yeast Res. 2003, 4, 69, Maris 등, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007, 108:179-204). Although the efficiency of xylose fermentation is very low in Saccharomyces cerevisiae, its isomer xylulose can be efficiently fermented to produce ethanol. Thus, although xylose isomerase is obtained from bacteria and expressed in yeast, there is a problem that the expression rate of the enzyme is very low and an active enzyme is not produced, and xylose isomerase obtained from the thermophilic bacteria (Walfridsson et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996. 62, 4648, Gardonyl and Hahn-Hagerdal, 2003, Enzyme Microb. Technol. 32 , 252). The intracellular expression of xylose isomerase isolated from the anaerobic fungus Piromyces was also low in yeast cells (Kuyper et al., FEMS Yeast Res. 2003, 4, 69, Maris et al., Adv. Biochem Eng Biotechnol., 2007, 108: 179-204).

진화적 공학을 통해 자일로스 대사를 강화하여 빠른 속도로 에탄올 발효를 성공적으로 수행한 보고는 있으나 바이오매스 유래의 포도당과 자이로스가 동시에 존재하는 경우 여전히 효율이 낮은 문제가 있었다(Kuyper 등, FEMS Yeast Research, 2005, 5, 925; Zhou 등, Metabolic Engineering, 2012, 14, 611). 이는 자일로스와 포도당이 동일한 트랜스포터에 의해서 세포내로 운반되기 때문에 포도당에 의해서 자일로스의 도입이 억제되기 때문이며(Harhangi 등, Arch Microbiol. 2003 180(2):134-41), 이를 해결하기 위하여 섬유소 바이오매스를 포도당까지 분해하지 않고 셀로비오스(cellobiose)까지만 분해 후 세포 내로 도입하여 세포내 β-글루코시다제(β-glucosidase)에 의해 포도당으로 변환하는 균주를 이용하는 기술도 개발되었으나 실제 효소에 의한 바이오매스 당화공정에서 포도당이 형성되지 않도록 하는 것은 쉽지 않은 일이다(Ha 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108, 504).Although ethanol fermentation has been successfully carried out at a rapid rate by enhancing xylose metabolism through evolutionary engineering, there is still a problem of low efficiency when biomass-derived glucose and xylose exist simultaneously (Kuyper et al., FEMS Yeast Research, 2005, 5, 925; Zhou et al., Metabolic Engineering, 2012, 14, 611). This is because the introduction of xylose by glucose is inhibited because xylose and glucose are transported into the cell by the same transporter (Harchang et al., Arch Microbiol 2003, 180 (2): 134-41) Although a technology has been developed that utilizes a strain transformed into glucose by β-glucosidase by intracellularly degrading biomass into cellobiose without decomposing it to glucose, It is not easy to prevent the formation of glucose in the mass saccharification process (Ha et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2011 108, 504).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 포도당의 존재 하에서도 자일로스를 탄소원으로 활용하기 위해 연구 노력한 결과, 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 세포 밖으로 고효율 분비시키는 효모 균주를 만들고 배양 중 배지로 분비된 자일로스 이소머라제에 의해 자일로스를 케토스 당인 질룰로스로 변환시켜 탄소원으로 사용하는 본 발명을 완성하였다. Under these circumstances, the present inventors have made efforts to utilize xylose as a carbon source in the presence of glucose. As a result, they have found that a yeast strain capable of efficiently secreting xylose isomerase out of a cell is produced, The present invention has been completed by using xylose as a carbon source by converting xylose into guloseulose, which is a ketose, by means of a rosuisomerase.

본 발명의 하나의 목적은 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자일로스 이소머라제 분비 발현용 발현 카세트를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a method for the expression of xylose isomerase secretagogues, comprising a polynucleotide encoding a translational fusion partner (TFP) and a polynucleotide encoding a xylose isomerase Thereby providing a cassette.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide an expression vector comprising said expression cassette.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터가 도입된 형질 전환 미생물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a transformed microorganism into which the above expression vector has been introduced.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일로스 이소머라제를 분비 생산하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for secretory production of xylose isomerase comprising culturing the transforming microorganism.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 탄소원으로 자일로스를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 질룰로스를 생산하는 방법에 관한 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing gylulose, which comprises culturing the transformed microorganism in a culture medium containing xylose as a carbon source.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 이용하여 바이오 매스 유래 복합당을 당화하고 발효하는 방법에 관한 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for saccharifying and fermenting biomass-derived complex sugar using the above-mentioned transforming microorganism.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자일로스 이소머라제 분비 발현용 발현 카세트를 제공한다.In order to accomplish the above object, one aspect of the present invention is to provide a polynucleotide encoding a translational fusion partner (TFP) and a polynucleotide encoding a xylose isomerase, Thereby providing an expression cassette for expressing malase.

하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 피로마이세스 종(Piromyces sp.)으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트를 제공한다.In one embodiment, the present invention provides an expression cassette characterized in that the polynucleotide encoding the xylose isomerase is derived from Piromyces sp .

다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현 카세트를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides an expression cassette characterized in that the polynucleotide encoding the xylose isomerase has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 자일로스 이소머라제는 서열번호 54 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현 카세트를 제공한다.In yet another embodiment, the present invention provides an expression cassette characterized in that the xylose isomerase has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55.

또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 단백질 융합인자(TFP)는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 TFP 1, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 TFP 2, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 TFP 3, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 TFP 4, 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 TFP 5, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 TFP 6, 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 TFP 7, 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 TFP 8, 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 TFP 9, 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성된 TFP 10, 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 TFP 11, 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성된 TFP 12, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 TFP 13, 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성된 TFP 14, 서열번호 20의 아미노산 서열로 구성된 TFP 15, 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성된 TFP 16, 서열번호 22의 아미노산 서열로 구성된 TFP 17, 서열번호 23의 아미노산 서열로 구성된 TFP 18, 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성된 TFP 19, 서열번호 25의 아미노산 서열로 구성된 TFP 20, 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성된 TFP 21, 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된 TFP 22, 서열번호 28의 아미노산 서열로 구성된 TFP 23, 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 구성된 TFP 24로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 발현 카세트를 제공한다.In another embodiment of the present invention, the protein fusion factor (TFP) comprises TFP1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, TFP2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, TFP 3, TFP 4 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, TFP 5 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, TFP 6 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, TFP 7 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: TFP 9 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, TFP 10 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, TFP 11 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, TFP 12 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: , TFP 13 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, TFP 14 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, TFP 15 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, TFP 17 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, TFP 18 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, TFP 19 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, TFP 20 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: , TFP 21 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, TFP 22 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, TFP 23 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and TFP 24 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 ≪ / RTI >

또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 단백질 융합인자(TFP)는 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 TFP 3, 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 TFP 8, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 TFP 13, 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성된 TFP 14, 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성된 TFP 19, 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 구성된 TFP 20으로 이루어진 군에서 선택되는 발현 카세트를 제공한다.In another embodiment of the present invention, the protein fusion factor (TFP) comprises TFP 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, TFP 8 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, TFP 13, TFP 14 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, TFP 19 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and TFP 20 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

본 발명의 다른 양태는, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.Another aspect of the invention provides an expression vector comprising the expression cassette.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환 미생물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a transformed microorganism into which the expression vector has been introduced into a host cell.

하나의 구체예로서, 상기 발현 벡터는 서열번호 54 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 자일로스 이소머라제를 분비하는 발현 카세트를 포함하는 것인 형질전환 미생물을 제공한다.In one embodiment, the expression vector comprises an expression cassette that secretes xylose isomerase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55.

다른 하나의 구체예로서, 상기 형질전환 미생물은 내산성을 가지는 것인 형질전환 미생물을 제공한다.In another embodiment, the transgenic microorganism has acid resistance.

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 형질전환 미생물을 제공한다.In yet another embodiment, the host cell provides a transforming microorganism that is Saccharomyces cerevisiae .

다른 하나의 구체예로서, 상기 숙주 세포는 Y2805△gall80 균주인 형질전환 미생물을 제공한다.In another embodiment, the host cell provides a transformed microorganism that is a Y2805? Gall80 strain.

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 숙주세포는 자일로스 이소머라제를 세포 내 발현하는 것인 형질전환 미생물을 제공한다.In yet another embodiment, the host cell expresses xylose isomerase intracellularly.

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 형질 전환 미생물은 자일로스 이소머라제를 분비하여 자일로스를 질룰로스로 전환하는 형질전환 미생물을 제공한다.In yet another embodiment, the transgenic microorganism secretes xylose isomerase to provide a transforming microorganism that converts xylose to gylulose.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일로스 이소머라제를 생산하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for producing xylose isomerase comprising culturing the transformed microorganism.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 형질전환 미생물을 탄소원으로 자일로스를 포함하는 배지에 배양하는 단계를 포함하는 질룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method of producing a nitrilose comprising culturing the transforming microorganism as a carbon source in a medium containing xylose.

하나의 구체예로서, 상기 배지는 2가 금속이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법을 제공한다.In one embodiment, the culture medium comprises bivalent metal ions.

다른 하나의 구체예로서, 상기 2가 금속이온이 마그네슘 이온(Mg2+), 망간 이온(Mn2+) 또는 바륨 이온인(Ba2+)인 생산 방법을 제공한다.In another embodiment, the bivalent metal ion is a magnesium ion (Mg 2+ ), a manganese ion (Mn 2+ ), or a barium ion (Ba 2+ ).

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 2가 금속이온을 포함하는 배지는 5 내지 25 mM의 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하는 것인 생산 방법을 제공한다.In yet another embodiment, the culture medium containing the divalent metal ions comprises 5 to 25 mM magnesium chloride (MgCl 2 ).

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 2가 금속이온을 포함하는 배지는 0.01 내지 5 mM의 염화망간(MnCl2)을 포함하는 것인 생산 방법을 제공한다.In yet another embodiment, the culture medium containing the divalent metal ion comprises 0.01 to 5 mM manganese chloride (MnCl 2 ).

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 형질전환 미생물은 30℃ 내지 70℃의 범위에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생산 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a production method characterized in that the transforming microorganism is cultured at a temperature in the range of 30 ° C to 70 ° C.

또 다른 하나의 구체예로서, 상기 형질전환 미생물은 pH 6 내지 pH 9의 범위에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생산 방법을 제공한다.In yet another embodiment, the present invention provides a production method characterized in that the transforming microorganism is cultured in the range of pH 6 to pH 9.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 형질전환 미생물을 이용하여 바이오 매스 유래 복합당을 당화 및 발효하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for saccharifying and fermenting a biomass-derived complex sugar using the above-mentioned transforming microorganism.

하나의 구체예로서, 상기 바이오 매스 유래 복합당은 포도당 및 자일로스로 이루어진 것을 특징으로 하는, 당화 및 발효하는 방법을 제공한다.In one embodiment, the biomass-derived complex sugar comprises glucose and xylose.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 양태는 단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모에서 자일로스 이소머라제를 세포 밖으로 분비시키기 위한 분비 발현용 발현 카세트에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a method for producing secretion of xylose isomerase in a yeast, comprising a polynucleotide encoding a translational fusion partner (TFP) and a polynucleotide encoding a xylose isomerase Expression cassette for expression.

본 발명의 용어, "자일로스 이소머라제(xylose isomerase, xylA)"는 자일로스(xylose)와 질룰로스(xylulose) 사이의 이성질화 반응을 촉매하는 효소이다. 본 발명의 목적상 피로마이세스 종(Piromyces sp.) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "xylose isomerase (xylA)" of the present invention is an enzyme that catalyzes the isomerization reaction between xylose and xylulose. For the purpose of the present invention, it may be an enzyme derived from pyromyces sp. , But is not limited thereto.

본 발명의 용어, "자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 상기 xylA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 본 발명의 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "polynucleotide encoding xylose isomerase" of the present invention means a polynucleotide encoding the above xylA and may be a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention, no.

구체적으로, 상기 상기 자일로스 이소머라제는 서열번호 54 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the xylose isomerase may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55, but is not limited thereto.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들 조합에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서 서열 번호 1과 높은 상동성을 갖는 DNA 또는 단백질, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 80%이상의 높은 상동성을 갖는 DNA와 단백질도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.Polynucleotide sequences of the present invention can be readily modified by substitution, deletion, insertion, or a combination of one or more bases. Therefore, DNAs and proteins having high homology with SEQ ID NO: 1, for example, high homology of not less than 70%, preferably not less than 80%, of the homology thereof should be interpreted as being included in the scope of the present invention do.

본 발명의 용어, "상동성(homology)"은 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용 가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.The term "homology " of the present invention is intended to indicate the similarity with the amino acid sequence of the wild type protein or the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, and the amino acid sequence or base sequence of the present invention, ≪ / RTI > or more of the same sequence. This homology can be determined by comparing the two sequences visually, but can be determined using a bioinformatic algorithm that aligns the sequences to be compared and analyzes the degree of homology. The homology between the two amino acid sequences can be expressed as a percentage. Useful automated algorithms are available in the GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA computer software modules of the Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wis. USA). The automated array algorithms in this module include Needleman & Wunsch, Pearson & Lipman, and Smith & Waterman sequence alignment algorithms. Algorithm and homology determination for other useful arrays is automated in software including FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST and CLUSTAL W.

본 발명의 일 실시예에서는, 피로마이세스 종 유래의 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GeneBank)로부터 획득하여, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주가 선호하도록 유전자를 합성하여 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자를 확보하였다.In one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence of the gene coding for xylose isomerase derived from pyromyose species is obtained from NIH Gene Bank, National Institute of Health, Saccharomyces cerevisiae ) Strain was preferred to obtain a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 용어, "단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)"는 목적 단백질의 분비 생산에 유용한 아미노산 또는 핵산으로서, 재조합 발현 시스템 하에서 발현되지 않거나 발현율이 매우 낮은 목적 단백질을 포함하여 어떤 단백질이라도 숙주 세포로부터 분비가 유도되도록 도와주는 역할을 하는 것을 말한다. 본 발명에서 사용하는 TFP는 대한민국 등록특허 제10-0975596호에 개시된 것을 사용하였고, 바람직하게는, 서열번호 6 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 정의되며, 본 발명에서 TFP 1 내지 TFP 24로 표현될 수 있다.The term "translational fusion partner (TFP)" of the present invention is an amino acid or nucleic acid useful for the secretory production of a target protein, and includes any protein that is not expressed or exhibits a very low expression rate under a recombinant expression system, It is a function that helps to induce secretion from cells. The TFP used in the present invention is the one disclosed in Korean Patent No. 10-0975596, and is preferably defined as an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 6 to 29, wherein TFP 1 to TFP 24 Can be expressed.

본 발명의 용어, "단백질 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 서열번호 30 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "polynucleotide encoding a protein fusion factor" of the present invention may mean a polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 30 to 53, but is not limited thereto.

본 발명의 용어, "발현 카세트"는 세포 내에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지닌다. 자연적으로 발생되거나 합성된 핵산구조로서 일반적으로 발현 카세트는 전사되는 핵산과 프로모터를 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 발현 카세트는 단백질 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 자일로스 이소머라제의 분비를 유도하는 자일로스 이소머라제 분비 발현용 발현 카세트일 수 있다.The term "expression cassette " of the present invention has a nucleic acid element capable of affecting the expression of a structural gene in a cell. Naturally occurring or synthesized nucleic acid constructs generally include an expression cassette that contains a transcribed nucleic acid and a promoter. For the purposes of the present invention, the expression cassette may comprise a polynucleotide encoding a protein fusion factor and a polynucleotide encoding a xylose isomerase, and may comprise xylose isomerase secretion leading to the secretion of xylose isomerase Expression cassette for expression.

상기 발현 카세트는, 상기 단백질 융합인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 Kex2p 인식 부위인 Lys-Arg를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 발현 카세트가 코딩하는 융합 단백질이 Kex2p에 의해 프로세싱되어 자일로스 이소머라제가 세포 밖으로 분비되도록 제작된 발현 카세트일 수 있다. 상기 Kex2p는 Lys-Arg를 인식하고 절단하여, 효모에서 분비 과정 중 자일로스 이소머라제만 세포 밖으로 분비되도록 할 수 있다.The expression cassette may further comprise a polynucleotide encoding the protein fusion factor and a polynucleotide encoding Lys-Arg, a Kex2p recognition site, between the polynucleotide encoding the xylose isomerase. Also, the expression cassette may be a fusion cassette in which the fusion protein encoded by the expression cassette is processed by Kex2p to secrete xylose isomerase outside the cell. The Kex2p recognizes and cleaves Lys-Arg so that only the xylose isomerase is secreted out of the cell during the secretion in the yeast.

본 발명의 다른 양태는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.Another aspect of the invention relates to an expression vector comprising said expression cassette.

본 발명의 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 생산물을 의미하며, 특히 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 발현 벡터라고 한다.The term "vector" of the present invention means a DNA product containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the desired protein operably linked to a suitable regulatory sequence so as to be able to express the protein of interest in a suitable host, So as to enable the expression of a gene coding for the target protein to be linked, which is referred to as an expression vector.

상기 발현 벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성 유전자, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합 인자로서, 상기 단백질 융합인자를 사용함이 바람직하다.The expression vector may be a fragment for suppressing expression, having various functions for suppressing, amplifying, or inducing expression of a target gene, a marker for selecting a transformant, a gene resistant to antibiotics, A gene encoding a signal for the purpose of expression, and a custom-made fusion factor suitable for a hung-off protein. Particularly, it is preferable to use the protein fusion factor as a customized fusion factor suitable for the above-mentioned hardly-hungry protein.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환 미생물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a transforming microorganism into which the expression vector has been introduced into a host cell.

본 발명의 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.The term "transformed" of the present invention means that DNA is introduced into a host cell so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.Any transformation method of the present invention can be used, and can be easily carried out according to a conventional method in the art.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 자일로스 이소머라제 및 24종의 TFP를 도입한 형질전환체를 제작하고, 이를 이용해 자일로스 이소머라제를 분비 생산한 결과, TFP 3, 8, 13, 14, 19 및 20의 자일로스 이소머라제 분비율이 높은 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, a transformant into which xylose isomerase and 24 kinds of TFP were introduced was produced, and xylose isomerase was secreted using the transformant. As a result, TFP 3, 8, 13, 14 , 19 and 20 were found to have a high fraction of xylose isomerase.

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 TFP 3, 8, 13, 14, 19 및 20의 자일로스 이용능을 확인하여, TFP 3 및 14의 자일로스 소모량이 많은 것을 확인하였다(도 3B, 표 1). In another embodiment of the present invention, it was confirmed that the use of xylose in TFPs 3, 8, 13, 14, 19, and 20 was confirmed, and the consumed amounts of xylose in TFP 3 and 14 were large (FIG. 3B, Table 1) .

본 발명의 일 구체적 양태에 의하면, 상기 발현 벡터는 서열번호 54 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 자일로스 이소머라제를 분비하는 발현 카세트를 포함하는 것일 수 있다. According to one specific embodiment of the present invention, the expression vector may comprise an expression cassette which secretes xylose isomerase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55.

본 발명의 일 실시예에서는, 낮은 pH 에서도 자일로스 이용능이 우수한 자일로스 이소머라제 변이 균주를 선별한 결과, 서열번호 54 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 자일로스 이소머라제를 발현하는 형질전환 미생물이 낮은 pH 조건에서도 우수한 자일로스 이용능을 나타내는 것을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, a xylose isomerase mutant exhibiting excellent xylose availability at low pH was selected, and as a result, it was found that transformation to express xylose isomerase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 The microorganisms were found to exhibit excellent xylose availability under low pH conditions.

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 선별된 내산성을 가지는 형질전환 미생물은 pH 7.0 이하에서도 질룰로스 전환 효율이 높게 유지되며, pH가 높아질수록 질룰로스 전환 효율이 감소하는 것을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, the transforming microorganism having the selected acid resistance retains the high conversion efficiency of the nitrilose even at pH 7.0 or lower, and the nitrilulose conversion efficiency decreases as the pH is increased.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 자일로스 이소머라제 유전자의 도입효율과 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 세포를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는, 사카로마이세스 세레비지에, 보다 더 바람직하게 Y2805△gal180 균주일 수 있다.The host cell used for transformation according to the present invention may be any host cell well known in the art. However, it is possible to use a host having high efficiency of introduction and expression efficiency of the xylose isomerase gene of the present invention, For example, bacteria, mold, yeast, plant or animal (e.g., mammalian or insect) cells. Preferably, the host cell may be an ethanol-efficient cell, more preferably Saccharomyces cerevisiae, and even more preferably Y2805? Gal180 strain.

본 발명의 일 실시예에서는, Y2805△gal180 균주에 상기 자일로스 이소머라제 유전자 및 TFP를 도입한 결과, TFP 3번을 이용한 경우에 자일로스 이소머라제 분비 발현량이 가장 많았으며, 자일로스 이용능 또한 우수한 것을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, when the above xylose isomerase gene and TFP were introduced into strain Y2805? Gal180, the expression amount of xylose isomerase was the highest when TFP 3 was used, And excellent results were confirmed.

본 발명의 일 구체적 양태에 의하면, 상기 숙주세포는 자일로스 이소머라제를 세포 내 발현할 수 있다.According to one specific embodiment of the present invention, the host cell can express xylose isomerase intracellularly.

본 발명의 일 실시예에서는, 분비 시그널이 포함되지 않은 발현카세트가 도입된 형질전환 미생물을 제작하여, 자일로스 이소머라제의 분비 발현 균주 보다 세포내 발현 균주가 자일로스 대사 효율이 우수한 것을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, a transgenic microorganism into which an expression cassette containing no secretion signal was introduced was prepared, and it was confirmed that the intracellular expression strain had better xylose metabolism efficiency than the secretory expression strain of xylose isomerase .

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 자일로스 이소머라제의 세포내 발현 균주를 이용하여 자일로스 이소머라제를 세포 내/외에 동시에 발현할 수 있는 형질전환 미생물을 제작하여, 동시 발현 균주가 세포내 또는 세포외 분비 발현 균주 보다 우수한 자일로스 이용능을 가지는 사실을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, a transgenic microorganism capable of simultaneously expressing xylose isomerase in a cell and / or a cell using a cell expressing strain of the xylose isomerase was prepared, Lt; RTI ID = 0.0 > secretory < / RTI > expression.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 자일로스 이소머라제를 생산하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for producing xylose isomerase comprising culturing the transforming microorganism.

상기 형질전환 미생물을 배양하기 위한 배지 및 배양 조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 바람직하게는, 탄소원으로 포도당이 포함된 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)와 자일로스와 포도당이 포함된 YPDX(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 자일로스, 1% 포도당), 자일로스만 포함된 YPX(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 자일로스) 배지에서 40시간 배양하는 것일 수 있다.The medium for culturing the transformed microorganism and the culture conditions may be appropriately selected depending on the host cell. Preferably, YPDX (1% yeast extract, 2% peptone, 1% xylose, 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) containing glucose as a carbon source and YPDX % Glucose), and YPX (1% yeast extract, 2% peptone, 1% xylose) containing xylose alone for 40 hours.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 형질전환 미생물을 이용해 유가식 배양을 수행하여, 자일로스 이소머라제를 확보하였다.In one embodiment of the present invention, fed-batch culture is carried out using the above-mentioned transforming microorganism to obtain xylose isomerase.

본 발명의 용어, "유가식 배양"은 생산물의 높은 최종 농도와 생산성을 가지는 배양 방법으로서, 고농도 세포배양에 매우 자주 이용되며, 초기에 한 번 배지를 채운 후, 새로운 배양액이나 성장제한 기질용액 또는 생산물의 전구체 등을 추가로 공급하지만 반응 생성물은 발효조에 남아있게 하는 방법이다.The term "fed-batch cultivation" of the present invention is a method of culturing having high final concentration and productivity of a product, and is very often used for culturing high-concentration cells. After initially filling the culture medium with a new culture medium, A precursor of the product, etc., but the reaction product remains in the fermenter.

상기 유가식 배양의 바람직한 방법은 50ml의 최소 액체 배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모 질소원 기질, 0.5% 카사미노산, 2% 포도당)에 1단계 종균 배양한 후, 다시 200ml의 YPD 액체배지에서 배양하여 활성화시킨 후, 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하면서 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(15% 효모 추출물, 30% 포도당)를 추가 공급하는 것이다. A preferred method of the above fed-batch culture is a one-stage seed culture in 50 ml of a minimal liquid medium (yeast nitrogen source substrate lacking 0.67% amino acid, 0.5% casamino acid, 2% glucose) and then cultured in 200 ml of YPD liquid medium After incubation, the cells are inoculated into the culture medium and cultured at 30 ° C. for 48 hours. Then, the cells are supplemented with oil culture medium (15% yeast extract, 30% glucose) according to the cell growth rate.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 형질전환 미생물을 탄소원으로 자일로스를 포함하는 배지에 배양하는 단계를 포함하는 질룰로스를 생산하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method of producing a nitrilose comprising culturing the transforming microorganism as a carbon source in a medium containing xylose.

본 발명의 일 실시예에서는, 금속 이온에 따른 자일로스 이소머라제 활성을 측정한 결과, Mg2+, Mn2+, Ba2+와 같은 2가 양이온을 첨가할 경우 효소활성이 증가하지만, Cu2+, Ca2+, Zn2+, EDTA2+를 첨가하는 경우 효소 활성이 감소되는 것을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, the activity of xylose isomerase according to the metal ion was measured. As a result, the addition of divalent cations such as Mg 2+ , Mn 2+ , and Ba 2+ increased the enzyme activity, 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , and EDTA 2+ were added to the cells.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마그네슘 농도에 따른 자일로스 이용능을 측정한 결과, 마그네슘이 존재하는 경우, 바람직하게는 5 내지 25 mM 농도로 포함된 경우, 보다 바람직하게는 10mM 내지 23mM 농도로 포함된 경우, 자일로스 이용능이 증대된 것을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, the ability of using xylose according to the magnesium concentration is measured. When magnesium is present, it is preferably contained at a concentration of 5 to 25 mM, more preferably at a concentration of 10 mM to 23 mM , It was confirmed that the use of xylose was increased.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 망간 농도에 따른 자일로스 이용능을 측정한 결과, 망간이 존재하는 경우, 바람직하게는 0.01 mM 내지 5 mM 농도로 포함된 경우, 보다 바람직하게는 0.1 mM 내지 3mM 농도로 포함된 경우, 자일로스 이용능이 증대된 것을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, when manganese is present, manganese is preferably used in a concentration of 0.01 mM to 5 mM, more preferably 0.1 mM to 3 mM Concentration, it was confirmed that the capacity of xylose was increased.

본 발명의 다른 실시예에서는, 망간 및 마그네슘의 혼합 사용에 따른 자일로스 이용능을 측정한 결과, 0.01 mM 내지 5 mM 망간 및 5 내지 25 mM 마그네슘 농도에서, 보다 바람직하게는 0.1 mM 내지 1.0 mM 망간 및 15 mM 내지 25 mM 마그네슘 농도에서 가장 많은 자일로스를 소모하는 것을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, the ability to use xylose according to the mixed use of manganese and magnesium was measured. As a result, it was found that the concentration of manganese and magnesium was in the range of 0.01 mM to 5 mM of manganese and 5 to 25 mM of magnesium, And at the concentration of 15 mM to 25 mM magnesium, it consumes the most xylose.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 자일로스 이소머라제 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향을 확인한 결과, 자일로스 이소머라제 활성의 최적 조건은 30℃ 내지 70℃의 온도 조건과 pH 6 내지 9의 pH 조건임을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, the effect of temperature and pH on the activity of xylose isomerase was examined. As a result, it was found that the optimum conditions for xylose isomerase activity were a temperature condition of 30 ° C to 70 ° C and a pH of 6 to 9 pH condition.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 형질전환 미생물을 이용하여 바이오 매스 유래 복합당을 당화 및 발효하는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for saccharifying and fermenting a biomass-derived complex sugar using the transgenic microorganism.

본 발명의 용어, "바이오매스"는 본래 자연에 존재하는 생물체의 질량을 나타내는 말로 쓰였는데, 1970년대 이후 대체에너지에 대한 관심이 높아지면서 '에너지원으로 이용할 수 있는 식물자원'이라는 뜻으로 사용되고 있다. 나무와 풀 그리고 수생식물과 해조류도 바이오매스가 되며, 왕겨 같은 농산폐기물이나 톱밥 같은 임산폐기물 역시 바이오매스가 될 수 있으며, 이런 바이오매스로부터 얻는 에너지를 바이오에너지라고 한다. 상기 바이오 매스로부터 유래되는 복합당은 포도당 및 자일로스로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The term "biomass" of the present invention was originally used to describe the mass of an organism present in nature, and since 1970's interest in alternative energy has been increasingly used to refer to a 'plant resource available as an energy source' . Trees, grasses, aquatic plants and algae also become biomass, and agricultural waste such as rice hulls and forest waste, such as sawdust, can also be biomass, and the energy from these biomass is called bioenergy. The complex sugar derived from the biomass may be composed of glucose and xylose, but is not limited thereto.

본 발명의 용어, "당화"는 다당류를 단당류/이당류로 전환하는 과정을 의미한다. 당화는 바이오에탄올의 원료인 해조류에 함유된 전분 등 다당류가 효소나 화학물질, 물리적 작용에 따라 가수분해 절차를 거쳐 단당류(單糖類)로 변하게 하는 기술이다. 상기 단당류는 발효 때 효모의 에너지원이 되고 2차 산물로 에탄올을 분리하게 된다.The term "glycosylation" of the present invention means the process of converting a polysaccharide into a monosaccharide / disaccharide. Saccharification is a technique in which polysaccharides such as starch contained in algae, a raw material of bioethanol, are converted into monosaccharides through enzymatic or chemical processes and hydrolysis procedures depending on the physical action. The monosaccharide is an energy source of the yeast during fermentation and separates ethanol as a secondary product.

본 발명의 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 분비 발현하는 카세트, 벡터 및 형질전환 미생물을 이용하여 자일로스(xylose)를 탄소원으로 사용함으로써, 섬유소 바이오 매스로부터 생산되는 바이오 에탄올의 경제성을 확보할 수 있다.By using xylose as a carbon source using a cassette, a vector and a transforming microorganism that secrete and express xylose isomerase of the present invention, the economical efficiency of bioethanol produced from the fibrous biomass can be secured .

도 1은 피로마이세스 종(Piromyces species) 유래 xylA 유전자를 24종의 효모 단백질 분비융합인자(TFP)와 GAL10 프로모터에 연결하여 사카로마이세스 세레비지(Saccharomyces cerevisiae)에 균주에 도입을 위한 PCR 및 in vivo recombination 과정을 나타내는 모식도이다. 단백질 융합인자와 자일로스 이소머라제 사이에는 효모 Kex2p 프로테아제가 인식하는 서열을 삽입하여 분비과정에서 자연적으로 프로세싱되어 활성형의 자일로스 이소머라제가 분비되도록 고안되었다.
도 2는 효모 유래의 24개 TFP vector에 Piromyces sp. xylA가 도입되어 형성된 24종의 형질전환체를 각각 YPDG 배지에서 배양하고 배양 상등액을 농축하여 SDS-PAGE(A), Western blot(B) 분석한 결과이다.
도 3은 선별된 xylA 분비발현 벡터(TFP3, 8, 13, 14, 19, 및 20)가 도입되어 형성된 형질전환체들을 각 3개씩 선별하여 글루코스와 자일로스가 포함된 배지(YPDX)에서 배양한 배양상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과(A)와 각 균주별로 자일로스 소모량을 분석한 결과(B)이다.
도 4는 Y2805Δgal80 균주에 xylA 분비발현 벡터(TFP3 및 14)가 도입되어 형성된 형질전환체 각 3개씩 골라서 글루코스(YPD), 글루코스와 자일로스(YPDX), 그리고 자일로스(YPX) 배지에서 배양한 상등액을 SDS-PAGE 분석한 결과(A)와 자일로스 소모량과 배지에 생성된 질루로스의 양을 분석한 결과(B)이다.
도 5는 Piromyces sp. 유래 xylA 유전자 발현벡터, YGaT3-xylA6H를 도식한 그림이다. 단백질 융합인자(TFP3)와 자일로스 이소머라제(xylA) 사이에는 효모 Kep2p 프로테아제가 인식하는 서열을 삽입하여 분비과정에서 자연적으로 프로세싱되어 활성형의 자일로스 이소머라제가 분비되도록 고안되었다.
도 6은 XylA를 발현하는 재조합 효모 균주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA)를 5L 발효조에서 유가식 배양한 결과를 나타내는 배지 공급 속도 및 세포성장 그래프(A) 및 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석(B)한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 발효중 분비 생산된 자일로스 이소머라제 단백질은 화살표로 표시하였다.
도 7은 발효생산된 자일로스 이소머라제 단백질을 Ni-NTA 칼럼을 이용한 정제 크로마토그래피 및 각 분획을 SDS-PAGE 분석한 결과이다.
도 8은 금속이온 종류에 따른 자일로스 이소머라제의 상대적 효소 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 XylA를 발현하는 재조합 효모균주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA)를 마그네슘이 농도별로 첨가된 배지에서 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프(A) 및 글루코스 및 자일로스 소모를 비교(B)한 결과이다.
도 10은 XylA를 발현하는 재조합 효모균주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA)를 망간이 농도별로 첨가된 배지에서 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프(A) 및 글루코스 및 자일로스 소모를 비교(B)한 결과이다.
도 11은 XylA를 발현하는 재조합 효모균주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA)를 망간과 마그네슘을 농도별로 첨가된 배지에서 배양한 결과를 나타내는 세포성장 그래프(A) 및 글루코스 및 자일로스 소모를 비교(B)한 결과이다.
도 12는 재조합 분비 생산된 자일로스 이소머라제의 최적 반응 온도(A) 및 pH(B)를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 자일로스 이소머라제의 세포내와 세포외 분비 발현균주의 자일로스 소모 및 에탄올 생산을 비교한 결과이다.
도 14는 자일로스 이소머라제의 세포내/외 동시발현 균주의 SDS-PAGE 분석 및 자일로스 소모를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 자일로스 이소머라제의 세포내/외 동시발현 균주의 자일로스 소모 및 에탄올 생산을 그래프로 나타낸 것이다.
도 16는 XylA 변이주 라이브러리 제조과정과 변이주 선별과정을 도식한 그림이다.
도 17은 XylA를 발현하는 재조합 효모 균주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA6H)와 XylA 변이유전자를 발현하는 균주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA76)를 50ml 플라스크 배양을 통해 자일로스 소모속도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 XylA를 발현하는 변이주(Y2805Δgal80/YGaT3-xylA76)를 5L 발효조에서 유가식 배양과정중 세포성장 그래프(A) 및 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석(B)한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 발효중 분비 생산된 자일로스 이소머라제 단백질은 화살표로 표시하였다.
도 19는 발효 생산된 자일로스 이소머라제 변이 단백질을 Ni-NTA 칼럼을 이용한 정제 크로마토그래피 및 각 분획을 SDS-PAGE 분석한 결과이다.
도 20은 야생형 xylA 효소와 변이 xylA 효소의 pH에 따른 활성을 비교한 결과이다. 1 is a PCR, and for introducing fatigue My process species (Piromyces species) derived xylA gene in the strain of 24 species of yeast protein secreted fusion factor (TFP) and GAL10 connected to a promoter saccharide My process serenity busy (Saccharomyces cerevisiae) in in vivo recombination process. A sequence recognized by the yeast Kex2p protease was inserted between the protein fusion factor and xylose isomerase and was naturally processed during the secretion process so that active xylose isomerase was secreted.
Fig. 2 is a graph showing the relationship between the number of yeast-derived TFP vectors and Piromyces sp. The results of SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analyzes were obtained by culturing the 24 transformants obtained by introducing xylA into the YPDG medium and concentrating the culture supernatant.
FIG. 3 shows the results of cultivating transformants formed by introducing the selected xylA secretion expression vectors (TFP3, 8, 13, 14, 19, and 20) and culturing them in a medium containing glucose and xylose (YPDX) The results of SDS-PAGE analysis of culture supernatant (A) and the results of analysis of xylose consumption by each strain (B).
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the amount of supernatant obtained from three transformants each formed by introducing xylA secretion expression vectors (TFP3 and 14) into Y2805Δgal80 strain, and cultured in glucose (YPD), glucose and xylose (YPDX), and xylose (A), the amount of xylose consumed, and the amount of vitilus produced in the medium (B).
Figure 5 Piromyces sp. Derived xylA gene expression vector, YGaT3-xylA6H. A sequence recognized by the yeast Kep2p protease was inserted between the protein fusion factor (TFP3) and xylose isomerase (xylA), and it was naturally processed during the secretion process so that the active form of xylose isomerase was secreted.
FIG. 6 is a graph showing the results of SDS-PAGE analysis (B) of the medium feeding rate and cell growth graph (A) showing the results of fed-batch culture of recombinant yeast strains expressing XylA (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA) Electrophoresis image showing a result. The xylose isomerase protein secreted during fermentation is indicated by the arrow.
FIG. 7 shows the results of purification chromatography of the fermented xylose isomerase protein using a Ni-NTA column and SDS-PAGE analysis of each fraction.
FIG. 8 is a graph showing the relative enzymatic activity of xylose isomerase according to the kind of metal ion.
9 is a graph showing a cell growth graph (A) showing the result of culturing a recombinant yeast strain expressing XylA (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA) in a medium supplemented with magnesium in a concentration-dependent manner, and a result obtained by comparing glucose and xylose consumption (B) to be.
10 is a graph showing a cell growth graph (A) showing the result of culturing the recombinant yeast strain (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA) expressing XylA in a medium supplemented with manganese concentration, and a result obtained by comparing glucose and xylose consumption (B) to be.
11 is a graph showing a cell growth graph (A) showing the results of culturing recombinant yeast strains expressing XylA (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA) in a medium supplemented with manganese and magnesium at different concentrations, and comparing glucose and xylose consumption (B) This is a result.
FIG. 12 is a graph showing the results of analysis of optimum reaction temperature (A) and pH (B) of recombinant secreted xylose isomerase.
FIG. 13 shows the results of comparing xylose consumption and ethanol production of intracellular and extracellular secretory expression strains of xylose isomerase.
Fig. 14 is a graph showing SDS-PAGE analysis and xylose consumption of coexpressing cells in vitro and in vivo of xylose isomerase.
15 is a graph showing the xylose consumption and ethanol production of the coexpression / intracellular expression strain of xylose isomerase.
FIG. 16 is a diagram illustrating a process of preparing an XylA mutant library and a mutant selection process.
FIG. 17 is a graph showing the xylose consumption rate through a 50 ml flask culture of a recombinant yeast strain (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA6H) expressing XylA and a strain expressing an XylA mutant gene (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA76).
FIG. 18 is an electrophoresis image showing the cell growth graph (A) during the fed-batch fermentation process and the SDS-PAGE analysis (B) of the culture supernatant over time in the 5 L fermenter (Y2805Δgal80 / YGaT3-xylA76) . The xylose isomerase protein secreted during fermentation is indicated by the arrow.
FIG. 19 shows the results of purification chromatography of a fermented xylose isomerase mutant protein using a Ni-NTA column and SDS-PAGE analysis of each fraction.
Figure 20 shows the results of comparing the activity of the wild-type xylA enzyme with that of the mutant xylA enzyme.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 자일로스 이소머라제(xylose isomerase, xylA)유전자 합성Example 1: Gene synthesis of xylose isomerase (xylA)

피로마이세스 종(piromyces sp.) 유래의 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자(xylA)에 대한 정보 및 염기서열은 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GeneBank)로 부터 획득하였다. 효모 균주에 적용할 xylA 유전자를 확보하기 위해 Codon Usage Database를 근거로 하여 피로마이세스 종의 유전자 코돈을 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주가 선호하는 코돈으로 교체하였으며 ㈜바이오니아에 의뢰하여 유전자를 합성하였다(서열번호 1). 합성된 자일로스 이소머라제 유전자 크기는 1314 bp로서, 438개의 아미노산으로 구성되어 있으며 자일로스 이소머라제 유전자에는 효모에서 인식되는 자체 분비 시그널은 포함하지 않고 있다. Information on the gene (xylA) encoding xylose isomerase derived from pyromyces sp. And the nucleotide sequence were obtained from NIH GeneBank. In order to obtain the xylA gene to be applied to the yeast strain, the gene codon of the pyomyomyces species was replaced with the codon preferred by Saccharomyces cerevisiae strain based on the Codon Usage Database, (SEQ ID NO: 1). The synthesized xylose isomerase gene size is 1314 bp, consisting of 438 amino acids, and the xylose isomerase gene does not contain the self-secretory signal recognized in yeast.

실시예 2: xylA 및 24종 단백질 융합인자(TFP) 도입된 형질전환체 제작Example 2 Construction of Transformants Incorporating xylA and 24 Protein Fusion Factor (TFP)

상기 실시예 1에서 합성된 자일로스 이소머라제 유전자 xylA의 분비 발현 벡터를 제작하기 위하여, 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 이용한 1차 PCR (94℃ 5분 1회, 94℃ 30초 55℃ 30초 72℃ 1분 25회, 72℃7분 1회) 반응을 통해 xylA 유전자를 증폭하였다. 1차 PCR로 증폭된 유전자는 다시 LNK39(서열번호 4)와 HisGT50R(서열번호 5) 프라이머로 2차 증폭하여 벡터와 세포 내 재조합 (in vivo recombination)에 필요한 서열이 도입되고 카르복시 말단에는 Histidine-tag이 도입된 유전자를 확보하였다.In order to prepare a secretion expression vector of xylose isomerase gene xylA synthesized in Example 1, primary PCR using the primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 (94 DEG C for 5 minutes, 94 DEG C for 30 seconds 55 , 30 cycles of 72 < 0 > C for 1 min and 25 cycles of 72 < 0 > C for 7 min. The gene amplified by the first PCR was amplified again with a primer of LNK39 (SEQ ID NO: 4) and HisGT50R (SEQ ID NO: 5) to introduce a sequence necessary for in vivo recombination into the vector and a histidine tag The introduced gene was obtained.

상기 증폭된 유전자는 단백질 분비발현을 도와주는 24종의 단백질 분비융합인자(한국특허 제0975596호)를 함유한 선형의 벡터와 함께 효모 균주 Y2805(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52, gal80)에 도입하여 세포 내 재조합을 통하여 형질전환체가 형성되도록 하였다.The amplified gene was transformed with a linear vector containing 24 protein secretion fusion factors (Korean Patent No. 0975596) that helped express the protein secretion, and yeast strain Y2805 (Mat a pep4 :: HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3- 52, gal80) to form a transformant through intracellular recombination.

구체적으로, 상기 LNK39와 HisGT50R 프라이머로 증폭한 중합효소 연쇄반응 산물은 벡터의 링커(linker) 말단과 40염기, GAL7 전사 종결자 말단과 50염기가 동일하기 때문에 선형화된 벡터와 함께 효모 세포로 도입하면 세포내에서 교차가 일어나서 xylA 유전자와 단백질 분비융합인자 벡터가 일정한 방향으로 연결되고 우라실이 없는 선택배지인 SD-Ura 배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.77% uracil이 결핍된 영양보충물, 2% 포도당)에서 선별하면 대장균을 이용한 벡터 제작 과정 없이 곧바로 각각의 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제작할 수 있다 (도 1). Specifically, the polymerase chain reaction products amplified with the LNK39 and HisGT50R primers are introduced into the yeast cells together with the linearized vector because the linker terminus of the vector is 40 bases and the 50 bases are identical to the terminus of the GAL7 transcription terminator The cells were crossed with each other, and SD-Ura medium (0.67% amino acid-deficient yeast substrate, 0.77% uracil-deficient nutritional supplement, 2% glucose), a transformant into which each expression vector has been introduced can be produced directly without vector production using E. coli (FIG. 1).

실시예 3 : TFP 이용 자일로스 이소머라제 분비 생산Example 3 Production of Xylose Isomerase Using TFP

상기 실시예 2에서 제작한 24종의 형질전환체를 이용해 자일로스 이소머라제를 분비 생산하고, 특히 높은 분비율을 보이는 TFP를 확인하기 위해, 각각 YPDG 배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당, 1% 갈락토스)에서 40시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 배양상등액 0.6 ml을 0.4 ml 아세톤(acetone)으로 침전시켜 SDS-PAGE 분석하였다. In order to confirm the TFP showing a particularly high fraction ratio, the YPDG medium (1% yeast extract, 2% peptone, 1% yeast extract, 1% glucose, 1% galactose) for 40 hours. Cells were removed by centrifugation, and 0.6 ml of the culture supernatant was subjected to SDS-PAGE analysis by precipitation with 0.4 ml of acetone.

그 결과, 도 2A에서 보는 바와 같이 49kDa 부근에서 자일로스 이소머라제(xylose isomerase) 단백질로 추정되는 밴드를 확인하였다. 이 단백질 밴드가 자일로스 이소머라제인지 확인하기 위하여 항(anti)-HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅(western blotting)하였다. SDS-PAGE 젤(gel)로 전개된 단백질을 PVDF membrane으로 옮기기 위해서 electrotransfer(Invitrogen)를 이용하여 20 V에서 7분간 전이한 후 TBST 완충액(buffer, 10mM Tris-HCl pH8.0, 0.15M NaCl, tween 20 ml/L)로 헹군 뒤 상온에서 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 함유한 TBST로 블라킹(blocking)하였다. 이 후 TBST로 3회, 5분씩 상온에서 세척하였다. 세척이 완료된 membrane을 1차 마우스(mouse) 유래의 항-His 항체(Sigma)를 0.5% BSA를 함유한 TBST로 3000배 희석한 용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후 TBST 완충액으로 5분 간격으로 3번 반복 세척하여 비 특이적인 항체 결합을 제거하였다. 이후 상기 membrane을 2차 항-마우스 IgG 항체(Sigma)를 1000배 희석한 용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후, 다시 TBST 완충액으로 5분 간격으로 3번 세척하였다. 이후 membrane에 BCIP 용액(Sigma)을 도말하여 발현된 자일로스 이소머라제 단백질 밴드를 확인하였다. As a result, a band deduced as xylose isomerase protein was observed at around 49 kDa as shown in FIG. 2A. To confirm that this protein band was xylose isomerase, Western blotting was performed using an anti-HIS antibody. SDS-PAGE gels were transferred to PVDF membrane using electrotransfer (Invitrogen) at 20 V for 7 min. Then, TBST buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl, tween 20 ml / L) and then blocked with TBST containing 3% bovine serum albumin (BSA) at room temperature for 1 hour. After that, it was washed 3 times with TBST at room temperature for 5 minutes. The washed membrane was reacted with a solution of anti-His antibody (Sigma) derived from the first mouse in 3000 times diluted with TBST containing 0.5% BSA for 1 hour at room temperature, and then incubated with TBST buffer To remove nonspecific antibody binding. Then, the membrane was reacted with a secondary anti-mouse IgG antibody (Sigma) diluted 1000 times at room temperature for 1 hour, and then washed three times with TBST buffer every 5 minutes. The membrane was then plated with BCIP solution (Sigma) to identify expressed xylose isomerase protein bands.

그 결과, 도 2B에서 보는 바와 같이 자일로스 이소머라제는 49kDa 위치에서 확인되었고 거의 모든 TFP에 의해 분비생산되고 있음을 알 수 있었다. 그 중에서도 단백질 분비융합인자 3, 8, 13, 14, 19 및 20번이 높은 분비율을 나타내는 것을 알 수 있었다, 따라서 자일로스 이소머라제 분비율이 높은 단백질 융합인자 3,8,13,14,19, 및 20을 포함하는 균주를 1차 선별하였다.As a result, as shown in FIG. 2B, xylose isomerase was found at 49 kDa position, and it was found that it was secreted by almost all TFP. Among them, protein secretion fusion factors 3, 8, 13, 14, 19 and 20 showed higher fractions. Therefore, protein fusion factors 3, 8, 13, 14, 19, and 20 were firstly screened.

실시예 4: 자일로스 이소머라제가 도입된 균주의 자일로스 이용능 확인Example 4: Confirmation of the ability of the xylose isomerase-introduced strain to use xylose

상기 실시예 3에서는 단일 형질전환체를 분석한 결과가 아니고 다수의 형질전환체를 동시분석한 결과이기 때문에 정확한 분석을 위해서 단일 콜로니로부터 균주를 배양하여 단백질 합성과 자일로스 이용능을 분석하였다. In Example 3, the result of simultaneous analysis of a plurality of transformants, rather than analysis of a single transformant, the strain was cultured from a single colony for accurate analysis, and protein synthesis and xylose utilization ability were analyzed.

상기 실시예에서 선별된 각 TFP 별로(TFP 3,8,13,14,19 및 20) 단일 콜로니를 3개씩 골라서 1% 갈락토스와 1% 자일로스를 탄소원으로 포함하는 배지(YPGX)에서 40시간 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 자일로스 이소머라제의 발현량을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였고(도 3A) 자일로스 소모량은 HPLC [Aminex HPX-87H column, HPLC pump, Refractive inde detector(Agilent technologies), 이동상: 물 + 0.005% 황산, 0.6 ml/min, 온도 65℃]를 이용하여 정량하였다(도 3B). Three single colonies were selected for each TFP (TFP 3, 8, 13, 14, 19, and 20) selected in the above example and cultured in a medium (YPGX) containing 1% galactose and 1% xylose as a carbon source for 40 hours Respectively. The amount of xylose consumed was determined by HPLC (Aminex HPX-87H column, HPLC pump, Refractive inde detector (Agilent technologies)), and the amount of xylose was determined by SDS- (Mobile phase: water + 0.005% sulfuric acid, 0.6 ml / min, temperature: 65 占 폚) (Fig. 3B).

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 선별된 균주에 따라 자일로스 이소머라제의 분비효율이 다양하였으며 대조구로 사용한 Y2805 균주(wt)의 경우 자일로스를 거의 이용하지 못했으나 배지 내 분비 발현된 자일로스 이소머라제의 발현량이 많은 균주일수록 자일로스 소모량이 많은 것을 확인하였다. 그 중 특히 TFP 3번과 TFP 14번 단백질 분비융합인자에 의하여 발현된 자일로스 이소머라제의 발현율이 높았고 10 g/L 자일로스 중 4.8~5.8 g/L 자일로스를 소모하는 것을 확인하였다(도 3B, 표 1). As a result, as shown in FIG. 3A, the secretion efficiency of xylose isomerase was varied according to the selected strains. In the case of Y2805 strain (wt) used as a control, xylose was hardly used, It was confirmed that the amount of xylose consumed was larger in strains having a larger amount of expression of Ross isomerase. Among them, the expression rate of xylose isomerase expressed by TFP 3 and TFP 14 protein secretion fusion factor was high and consumed 4.8 ~ 5.8 g / L xylose in 10 g / L xylose ( 3B, Table 1).

STFP No.STFP No. Xylose 소모량 (g/L)Xylose Consumption (g / L) STFP No.STFP No. Xylose 소모량 (g/L)Xylose Consumption (g / L) 3-13-1 1.75 1.75 14-114-1 4.73 4.73 3-23-2 4.40 4.40 14-214-2 4.79 4.79 3-33-3 5.83 5.83 14-314-3 1.77 1.77 8-18-1 3.13 3.13 19-119-1 0.51 0.51 8-28-2 3.62 3.62 19-219-2 0.74 0.74 8-38-3 3.18 3.18 19-319-3 2.67 2.67 13-113-1 1.64 1.64 20-120-1 1.52 1.52 13-213-2 2.75 2.75 20-220-2 1.97 1.97 13-313-3 2.88 2.88 20-320-3 1.78 1.78

실시예 5. Y2805Δgal80 균주를 이용한 자일로스 이소머라제 분비 생산Example 5 Production of xylose isomerase using Y2805Δgal80 strain

상기 실시예를 통해 수득한 결과를 적용하여, 자일로스 이소머라제를 고분비 생산하는 균주를 얻고자 하였다. 다만, 야생형 효모 균주(Y2805)에서 GAL10 프로모터를 발현하기 위해서는 고가의 인듀서(inducer)인 갈락토스를 필요로 하기 때문에 포도당만으로도 발현유도가 가능한 gal80 변이균주, Y2805Δgal80를 이용하였다. The results obtained through the above examples were applied to obtain a strain producing xylose isomerase in high yield. However, in order to express the GAL10 promoter in the wild-type yeast strain (Y2805), galactoside, which is an expensive inducer, is required. Therefore, a gal80 mutant strain, Y2805Δgal80, which can induce expression by glucose alone, was used.

이에, 자일로스 이소머라제 유전자를 Y2805Δgal80(Mat a pep4::HIS3 gal80:: Tc190, prb1 can1 his3-200 ura3-52)균주에서 발현하기 위해 실시예 4에서 확보된 균주로부터 분리된 플라스미드, YGaT3-xylA6H 벡터와 YGaT14-xylA6H 벡터를 Y2805Δgal80에 형질전환하였다. 상기 수득한 형질전환체는 탄소원으로 포도당이 포함된 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)와 자일로스와 포도당이 포함된 YPDX(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 포도당, 1% 자일로스), 자일로스만 포함된 YPX(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 자일로스)배지에서 40시간 배양하고 상등액을 아세톤으로 침전시킨 후 SDS-PAGE 분석 및 소모된 자일로스를 HPLC를 이용하여 정량하였다(도 4). In order to express the xylose isomerase gene in the strain Y2805Δgal80 (Mat a pep4 :: HIS3 gal80 :: Tc190, prb1 can1 his3-200 ura3-52), the plasmid isolated from the strain obtained in Example 4, YGaT3- The xylA6H vector and the YGaT14-xylA6H vector were transformed into Y2805Δgal80. The obtained transformant was transformed with YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) containing glucose as a carbon source and YPDX (1% yeast extract, 2% , 1% xylose), YPX (1% yeast extract, 2% peptone, 1% xylose) containing xylose was cultured for 40 hours. After the supernatant was precipitated with acetone, SDS-PAGE analysis and consumed xylose Was quantified using HPLC (Fig. 4).

상기 Y2805Δgal80 균주에 도입된 형질전환체에서 발현된 자일로스 이소머라제를 SDS-PAGE로 분석한 결과 Y2805 균주에서 발현된 결과와 유사하게 포도당만을 탄소원으로 사용한 배지에서도 자일로스 이소머라제가 분비 생산되었으며 포도당과 자일로스가 함께 첨가된 배지에서 자일로스 이소머라제 분비 발현량이 가장 많은 것을 확인하였다(도 4A). Analysis of xylose isomerase expressed in the transformant introduced into the strain Y2805Δgal80 by SDS-PAGE revealed that xylose isomerase was secreted in the medium containing only glucose as a carbon source, similar to the result expressed in strain Y2805 And xyla lys were added together in the medium, the amount of expression of xylose isomerase was found to be the largest (Fig. 4A).

또한 TFP 3번을 이용하여 자일로스 이소머라제를 발현한 경우 TFP 14번을 이용한 경우보다 자일로스 이용능 또한 우수한 것을 확인하였다. 탄소원으로 자일로스만 포함된 YPX 배지에서 약 4~4.2 g/L의 자일로스를 소모했으며 자일로스를 단일 탄소원으로 이용했을때 질룰로스(xylulose) 생성을 확인했고, 이는 소모된 자일로스의 약 40~50%에 해당하는 것으로 확인되었다(도 4B).In addition, when xylose isomerase was expressed using TFP # 3, it was confirmed that xylose was also superior to xylose in the case of using TFP # 14. We consumed about 4 ~ 4.2 g / L of xylose in YPX medium containing only xylose as a carbon source and confirmed the production of xylulose when using xylose as a single carbon source, To 50% (FIG. 4B).

최종적으로 피로마이세스 유래의 자일로스 이소머라제를 고분비 발현하는 벡터로 YGaT3-xylA6H를 선정하였다(도 5).Finally, YGaT3-xylA6H was selected as a vector expressing high secretion of xylose isomerase derived from pyromyose (Fig. 5).

실시예 6 : 유가 배양식 발효를 통한 자일로스 이소머라제의 대량 생산Example 6: Mass production of xylose isomerase through fermentation of oil-feeding culture

상기 실시예 5에서 제작한 자일로스 이소머라제 발현벡터 YGaT3-xylA6H(도 5)가 Y2805Δgal80 균주에 도입되어 제작된 자일로스 이소머라제 생산용 형질전환체(Y2805Δgal80/YGaT3-XylA)를 이용하여 자일로스 이소머라제를 대량 생산하고자 5L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다.(Y2805Δgal80 / YGaT3-XylA) for production of xylose isomerase, which was prepared by introducing the xylose isomerase expression vector YGaT3-xylA6H (FIG. 5) prepared in Example 5 into the strain Y2805Δgal80, In order to mass-produce Ross isomerase, a 5 L fermentation tank was used for fed-batch culture.

구체적으로, 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖의 최소 액체배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모 질소원 기질, 0.5% 카사미노산, 2% 포도당)에 1단계 초기 배양한 후, 다시 200 ㎖의 YPD 액체배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 배양하여 활성화시킨 후, 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(15% 효모 추출물, 30% 포도당)를 추가 공급하였다. Specifically, before the present culture was started, the cells were firstly cultured in one step in 50 ml of a minimal liquid culture medium (yeast nitrogen source substrate lacking 0.67% amino acid, 0.5% casamino acid, 2% glucose), and then 200 ml of YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose), and the cells were inoculated into the culture medium and cultured at 30 ° C for 48 hours. (15% yeast extract, 30% glucose) according to the cell growth rate.

상기 배양 방법을 통해 배양한 결과, 도 6에 나타낸 것처럼 48시간 배양동안 세포는 약 140 OD까지 성장하였고, 배양 시간별로 농축하지 않은 발효 배양 배지 샘플을 10㎕를 채취하여 SDS-PAGE 분석한 결과 자일로스 이소머라제 단백질이 배지로 분비되는 것을 확인하였다. 발효를 통해 생산된 단백질은 50 mM 트리스 완충용액(pH 7.5)으로 한외여과(분자량 cut off 30,000)를 이용하여 농축하였다.As shown in FIG. 6, the cells were grown up to about 140 OD during the 48-hour culture as shown in FIG. 6, and 10 μl of a fermentation culture medium sample not concentrated by the incubation time was collected and subjected to SDS- It was confirmed that the protein of Ross isomerase was secreted into the medium. Proteins produced through fermentation were concentrated using ultrafiltration (molecular weight cut off 30,000) in 50 mM Tris buffer (pH 7.5).

실시예 7 : 자일로스 이소머라제의 정제Example 7: Purification of xylose isomerase

순수한 자일로스 이소머라제를 얻기 위해, 상기 실시예 6에서 얻어진 자일로스 이소머라제를 포함하는 발효 농축액을 His-tag 칼럼을 이용하여 정제를 수행하였다. In order to obtain pure xylose isomerase, the fermentation concentrate containing xylose isomerase obtained in Example 6 was purified using a His-tag column.

구체적으로, 20 mM 트리스 완충용액에 0.5M NaCl 완충용액(pH 7.5)으로 Ni-NTA 레진에 충분히 안정화시킨 후 발효농축액 250ml을 로딩하여 0.2 ml/분의 유속으로 0.5M 이미다졸(imidazole)이 포함된 완충용액으로 농도구배를 주면서 단백질을 용출시켰다. 얻어진 분획을 SDS-PAGE 분석한 결과 단일밴드의 순수한 자일로스 이소머라제 효소가 정제되었음을 확인하였다(도 7). Specifically, after stabilizing Ni-NTA resin with 0.5 M NaCl buffer (pH 7.5) in 20 mM Tris buffer solution, 250 ml of the fermentation concentrate was loaded, and 0.5 M imidazole was contained at a flow rate of 0.2 ml / min The protein was eluted with a gradient of concentration in the buffer solution. The obtained fractions were subjected to SDS-PAGE analysis to confirm that a single band of pure xylose isomerase enzyme was purified (Fig. 7).

실시예 8 : 금속 이온에 따른 자일로스 이소머라제 활성 측정Example 8 Measurement of xylose isomerase activity according to metal ion

본 발명에서 분비생산된 자일로스 이소머라제의 금속이온에 대한 특성을 조사하기 위하여 상기 실시예 7에서 정제된 효소에 다양한 금속이온을 첨가하여 자일로스 이소머라제 활성을 측정하였다.In order to investigate the characteristics of the xylose isomerase secreted in the present invention against the metal ion, xylose isomerase activity was measured by adding various metal ions to the enzyme purified in Example 7 above.

기질로 1% 자일로스 용액이 포함된 반응액에 각 금속 이온들을 10 mM 첨가하여 60℃에서 반응한 후 생성된 질룰로스를 HPLC를 이용하여 정량하였다. 그 결과 다양한 금속 이온 중 Mg2+, Mn2+, Ba2+ 와 같은 2가의 양이온을 첨가할 경우 효소활성이 130~160%까지 증가하였다. 그러나 Cu2+, Ca2+, Zn2+, EDTA를 첨가할 경우 효소 활성이 감소되는 것을 확인하였다(도 8).10 mM of each metal ion was added to the reaction solution containing 1% xylose solution as a substrate and reacted at 60 ° C, and the resulting nitrilulose was quantified by HPLC. As a result, the addition of divalent cations such as Mg 2+ , Mn 2+ and Ba 2+ among various metal ions increased enzyme activity to 130 ~ 160%. However, it was confirmed that the addition of Cu 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , and EDTA reduced enzyme activity (FIG. 8).

실시예 9: 마그네슘 농도에 따른 자일로스 이용능 확인Example 9: Confirmation of availability of xylose according to magnesium concentration

상기 실시예 8에서 확인한 바와 같이 자일로스 이소머라제의 활성을 유지하기 위해서는 금속이온을 필요로 하기 때문에 세포 외로 분비되는 자일로스 이소머라제 발현시 배양 배지에 마그네슘을 농도별로 첨가하여 자일로스 이용능에 미치는 영향을 확인하였다. As described in Example 8 above, in order to maintain the activity of xylose isomerase, a metal ion is required. Therefore, when xylose isomerase secreted from the cell is expressed, magnesium is added to the culture medium at different concentrations, .

구체적으로, 자일로스 이소머라제 생산 균주(Y2805Δgal80/YGaT3-XylA)를 3ml YPD에 접종하여 24시간 동안 종균 배양한 뒤 포도당 10g/L와 자일로스 10g/L를 탄소원으로 포함하고 5, 10, 20 mM 농도의 염화마그네슘이 포함된 배지에 종균 배양액을 접종하고, 30℃에서 180 rpm으로 배양하면서 12시간 간격으로 시료를 채취하여 세포 성장 및 자일로스 잔량을 측정하였다. Specifically, a strain producing xylose isomerase (Y2805Δgal80 / YGaT3-XylA) was inoculated into 3 ml of YPD and cultured for 24 hours. Then, 10 g / L of glucose and 10 g / L of xylose were contained as a carbon source, mM concentration of magnesium chloride was inoculated into the culture medium and the sample was collected at intervals of 12 hours while culturing at 30 DEG C at 180 rpm to measure the cell growth and the residual amount of xylose.

그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이 배양 36시간까지 세포 성장에 큰 차이를 보이지 않았으나 배양 36시간 이후 마그네슘을 첨가해준 3가지 농도에서 금속이온을 첨가하지 않은 대조구보다 높은 세포 성장을 보였으며 20 mM 농도에서 최고의 효과를 확인하였다. 또한 금속 이온을 첨가하지 않은 대조구의 경우 배양 48시간 이후부터 자일로스를 거의 소모하지 못했으나 금속이온을 첨가해준 경우 배양 72시간까지 지속적으로 자일로스를 소모하였으며 20 mM 농도에서 최대 5.2 g/L 자일로스를 소모하여 금속 이온 첨가로 인해 자일로스 이용능이 증가됨을 확인하였다(도 9B, 표 2). As a result, as shown in FIG. 9A, no significant difference was observed in the cell growth until 36 hours after culturing, but at the three concentrations of magnesium added after 36 hours of culture, the cell growth was higher than that of the control without addition of the metal ion. The best effect was confirmed. In the case of the control without addition of metal ions, xylose was almost consumed after 48 hours of incubation. However, when metal ion was added, xylose was continuously consumed until 72 hours of culture. At 20 mM concentration, maximum 5.2 g / It was confirmed that xylose utilization was increased due to addition of metal ions by consuming the loss (Fig. 9B, Table 2).

종합하면, 마그네슘 이온이 존재하는 경우, 특히 5 mM 내지 25 mM 농도로 포함된 경우, 보다 바람직하게는 10 mM 내지 23 mM 농도로 포함된 경우, 자일로스 이용능이 마그네슘 이온이 존재하지 않는 경우보다 자일로스 이용능이 증대된 것을 확인하였다.In summary, when magnesium ion is present, particularly when it is contained at a concentration of 5 mM to 25 mM, more preferably at a concentration of 10 mM to 23 mM, the ability to use xylose is more likely to be present than when no magnesium ion is present And it was confirmed that the use capacity of Ross increased.

하기 표 2는 마그네슘 함유 배지에서의 Y2805Δgal80/YGaT3-XylA6H의 세포 성장 및 자일로스 소모량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.Table 2 below shows the results of comparison of cell growth and xylose consumption of Y2805Δgal80 / YGaT3-XylA6H in a magnesium-containing medium.

MgCl2농도MgCl 2 concentration Cell growth(A600)Cell growth (A600) 자일로스 소모량(g/L)Xylose Consumption (g / L) -- 17.517.5 2.542.54 5mM MgCl2 5 mM MgCl 2 19.419.4 4.704.70 10mM MgCl2 10 mM MgCl 2 19.219.2 5.155.15 20mM MgCl2 20mM MgCl 2 19.919.9 5.205.20

실시예 10: 망간 농도에 따른 자일로스 이용능 확인Example 10: Ability to use xylose according to manganese concentration

자일로스 이소머라제 발현시 배양 배지에 망간을 농도별로 첨가하여 망간 이온의 농도가 자일로스 이용능에 미치는 영향을 확인하였다. The effect of manganese ion concentration on the xylose utilization was examined by adding manganese to the culture medium at the concentration of xylose isomerase expression.

구체적으로, 자일로스 이소머라제 생산 균주(Y2805Δgal80/YGaT3-XylA6H)를 3ml YPD에 접종하여 24시간 동안 종균 배양한 뒤 포도당 10g/L와 자일로스 10g/L를 탄소원으로 포함하고 0.1, 0.2, 0.5, 1 mM 농도의 염화망간이 포함된 배지에 종균 배양액을 접종하고, 30℃에서 180 rpm으로 배양하면서 12시간 간격으로 시료를 채취하여 세포성장 및 자일로스 잔량을 측정하였다. Specifically, a strain producing xylose isomerase (Y2805Δgal80 / YGaT3-XylA6H) was inoculated in 3 ml of YPD and cultured for 24 hours. Then, 10 g / L of glucose and 10 g / L of xylose were contained as a carbon source and 0.1, 0.2, 0.5 , And 1 mM of manganese chloride. The cells were cultured at 30 ° C at 180 rpm, and samples were collected at intervals of 12 hours to measure cell growth and xylose residual amount.

그 결과, 도 10A에 나타난 바와 같이 배양 24시간까지 세포성장에 큰 차이를 보이지 않았으나 배양 24시간 이후 망간을 첨가해준 3가지 농도에서 금속이온을 첨가하지 않은 대조구보다 높은 세포성장을 보였으며 1 mM 농도에서 최고 효과를 확인하였다. 또한 도 10B에 나타난 바와 같이 배지에 포함된 포도당이 모두 사용된 후 자일로스가 빠르게 사용되기 시작하였다. 금속이온을 첨가하지 않은 대조구의 경우 포도당이 소모된 이후에도 자일로스를 거의 소모하지 못했으나 망간을 1 mM 첨가해준 경우 72시간 배양하면 자일로스를 모두 다 소진하는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 10A, no significant difference was observed in the cell growth until 24 hours after the incubation. However, at the three concentrations of manganese added after 24 hours of incubation, the cell growth was higher than that of the control without addition of the metal ion. The best effect was confirmed. Also, as shown in Fig. 10B, the xylose was rapidly used after the glucose contained in the medium was used up. In the control without addition of metal ions, xylose was almost consumed even after glucose was consumed. However, when 1 mM of manganese was added, it was confirmed that xylose was completely consumed when cultured for 72 hours.

종합하면, 망간 이온이 0.01 mM 내지 5 mM 농도로 포함된 경우, 보다 바람직하게는 0.1 mM 내지 3 mM 농도로 포함된 경우, 자일로스 이용능이 망간 이온이 존재하지 않는 경우보다 자일로스 이용능이 증대된 것을 확인하였다.Taken together, when the manganese ion is contained at a concentration of 0.01 mM to 5 mM, more preferably at a concentration of 0.1 mM to 3 mM, the ability of using xylose increases as compared to the case where no manganese ion is present Respectively.

실시예 11 : 마그네슘과 망간 혼합 사용에 따른 자일로스 이용능 확인Example 11: Confirmation of availability of xylose according to the use of magnesium and manganese

상기 실시예로부터, 자일로스 이소머라제 발현시 20 mM 마그네슘보다 1mM 망간이온이 자일로스를 이용하는데 있어 더 효과적인 것을 확인하였다. 이에, 자일로스 이용능에 가장 큰 효과를 보인 망간이온에 마그네슘을 함께 첨가하여 배양하면 자일로스 이용능이 더 향상될 것으로 생각하여, 0.5mM, 1mM 염화망간에 10mM, 20mM 염화마그네슘을 혼합하여 배양 후 세포성장 및 자일로스 잔량을 측정하였다. From the above example, it was confirmed that 1 mM manganese ion is more effective in using xylose than 20 mM magnesium in expression of xylose isomerase. Therefore, it is thought that the use of xylose by adding magnesium to the manganese ions having the greatest effect on the utilization of xylose will further improve the capacity of xylose. The cells are mixed with 0.5 mM, 1 mM manganese chloride, 10 mM and 20 mM magnesium chloride, Growth and xylose residual amount were measured.

그 결과, 망간만 첨가한 대조구에 비해 두 가지 금속이온을 혼합하여 배양 했을 때 더 높은 세포성장을 보였다. 또한 망간만 첨가한 경우 배양 72시간 동안 9.2~10.4g/L 자일로스를 소모했으나 망간과 마그네슘을 함께 첨가해준 경우 13.3~14.9g/L 자일로스를 소모하여 자일로스 이용능이 모두 증가했으며 0.5mM 망간+20mM 마그네슘 농도에서 가장 많은 자일로스를 소모(14.9g/L)하여 자일로스 이소머라제 활성을 위한 최적 농도임을 확인하였다(도 11). As a result, compared with the manganese supplemented control, higher cell growth was observed when two metal ions were mixed and cultured. In addition, manganese alone consumed 9.2 ~ 10.4g / L xylose for 72 hours in culture, but when manganese and magnesium were added together, 13.3 ~ 14.9g / L xylose was consumed and the capacity of xylose was increased. It was confirmed that the most abundant xylose was consumed (14.9 g / L) at + 20 mM magnesium concentration and was the optimum concentration for xylose isomerase activity (Fig. 11).

실시예 12 : 자일로스 이소머라제 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향Example 12: Effect of temperature and pH on xylose isomerase activity

자일로스 이소머라제가 기질을 가수분해하는데 있어서 반응 온도가 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 효소 활성을 측정하기 위해, 10 mM 염화마그네슘이 첨가된 150 mM 트리스 완충용액(pH 7.5)에 1% 자일로스 용액을 기질로 사용하여 20~80℃의 범위에서 10℃ 구간별로 반응시킨 후 생성된 질룰로스를 HPLC를 이용하여 정량하였고 활성이 가장 높은 온도를 기준으로 하여 상대적인 활성을 나타내었다.The effect of reaction temperature on the hydrolysis of xylose isomerase substrate was investigated. Specifically, in order to measure enzyme activity, 1 mM xylose solution was added to 150 mM Tris buffer solution (pH 7.5) containing 10 mM magnesium chloride, and reacted at a temperature ranging from 20 to 80 ° C. at intervals of 10 ° C. The generated gylulose was quantitated by HPLC and showed relative activity based on the highest temperature.

그 결과 도 12A에 나타난 바와 같이, 최적 반응온도가 60℃인 것을 확인했고, 70℃에서도 최고 활성의 70% 정도에 해당하는 활성을 나타내었다. 또한 30℃~70℃ 비교적 넓은 범위에서 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 한편, 효소활성의 최적 pH는 50 mM 시트레이트(citrate) 완충액(pH3.0~5.0), 말레이트(maleate) 완충액(pH6.0~7.0), 트리스(Tris) 완충액(pH8.0~9.0), 글리신-수산화나트륨(Glycine-NaOH, pH10)를 사용하여 각 pH 완충액에서 상대적인 활성을 조사하였다. 그 결과 도 12B에 나타난 바와 같이, pH7에서 최대 활성을 나타내었으며 pH6~9에서 90% 이상의 잔존 활성을 유지하였으나 pH5 이하에서는 활성이 급격히 저하되었다. 이러한 결과를 통해 자일로스 이소머라제는 중성 및 약 알칼리에서 안정성이 우수한 것을 확인하였다.  As a result, as shown in FIG. 12A, it was confirmed that the optimum reaction temperature was 60 ° C, and 70% of the maximum activity was exhibited even at 70 ° C. Also, it was confirmed that it exhibited high activity in a relatively wide range of 30 ° C to 70 ° C. On the other hand, the optimum pH of the enzyme activity was determined by measuring the concentration of the enzyme in 50 mM citrate buffer (pH 3.0 to 5.0), maleate buffer (pH 6.0 to 7.0), Tris buffer (pH 8.0 to 9.0) , And glycine-sodium hydroxide (Glycine-NaOH, pH 10) were used to investigate the relative activity in each pH buffer. As a result, as shown in FIG. 12B, it showed maximum activity at pH 7 and remained 90% or more at pH 6 to 9. However, the activity was drastically decreased at pH 5 or less. From these results, it was confirmed that xylose isomerase has excellent stability in neutral and weak alkali.

실시예 13 : 자일로스 이소머라제의 발현 위치에 따른 자일로스 이용능 확인Example 13: Confirmation of the availability of xylose according to the expression position of xylose isomerase

자일로스 이소머라제를 세포 밖으로 분비발현 했을 때 글루코스 존재 하에서도 자일로스를 더 효율적으로 사용가능하다는 장점이 있으나 실제로 자일로스 이소머라제를 세포내 발현과 세포외로 분비 발현 시켰을 때 자일로스 대사효율에 차이가 있는지 비교해 보았다. When xylose isomerase is secreted outside the cell, xylose can be used more efficiently in the presence of glucose. However, when xylose isomerase is secreted into the cell and ex vivo, I compared the difference.

자일로스 이소머라제를 세포내에서 발현하기 위해서 YGaT3-xylA6H 벡터의 TFP3를 제거하여 분비시그날이 없이 xylA 유전자가 곧바로 GAL10 프로모터에 연결된 발현 카세트를 LEU2 유전자를 선택표지 유전자로 포함하고 있는 벡터에 클로닝하여 YGa-xylA6H 벡터를 제작하였다. 상기 YGa-xylA6H 벡터는 Y2805ℓ(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52, leu2) 균주에 형질전환하여 자일로스 이소머라제를 세포내에 발현하는 균주를 제작하였다. 탄소원으로 2% 글루코스와 자일로스를 함유하는 YP(1% 효모추출물, 2% 펩톤)+1mM 염화망간 배지에서 84시간동안 배양한 후 배지에 존재하는 자일로스와 에탄올을 HPLC 분석을 통해 확인하였다(도 13). In order to express xylose isomerase in a cell, TFP3 of the YGaT3-xylA6H vector was removed and an expression cassette in which the xylA gene was directly linked to the GAL10 promoter without a secretion signal was cloned into a vector containing the LEU2 gene as a selection marker gene YGa-xylA6H vector. The YGa-xylA6H vector was transformed into Y2805 L (Mat a pep4 :: HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52, leu2) to produce a strain expressing xylose isomerase in cells. After culturing for 84 hours in YP (1% yeast extract, 2% peptone) + 1 mM manganese chloride medium containing 2% glucose and xylose as a carbon source, xylose and ethanol present in the medium were confirmed by HPLC analysis 13).

두 균주 모두 84시간동안 자일로스를 다 이용하지 못했으나 자일로스 이소머라제를 세포내로 발현 했을 때 자일로스를 더 빠르게 소모했으며 84시간 동안 16.5g/L의 자일로스를 소모한 것을 확인하였다. 반면, 분비 발현 균주의 경우 8g/L의 자일로스를 소모하였으며, 상기와 같은 결과를 비교했을 때, 세포내 발현균주가 자일로스 대사 효율이 훨씬 좋은 것을 확인하였다. Both strains failed to consume xylose for 84 hours, but when xylose isomerase was expressed intracellularly, it consumed xylose more rapidly and consumed 16.5 g / L of xylose for 84 hours. On the other hand, the secretory expression strain consumed 8 g / L of xylose. When the above results were compared, it was confirmed that the intracellular expression strain had much better xylose metabolism efficiency.

또한 세포내 발현 균주의 경우 배양 60시간에 약 3g/L 질룰로스가 생성 되었는데 이는 세포내 생성된 질룰로스 농도가 높아 세포외로 확산 (diffusion)된 것으로 보인다. 두 균주 모두 글루코스를 소모하여 에탄올이 생산되었으나 자일로스를 소모하는 동안 에탄올 생산량이 증가되지 않아 자일로스를 이용하여 에탄올 발효를 하지 못하는 것을 확인했다. 따라서 자일로스 이소머라제를 세포내/외 동시 발현을 하게 되면 자일로스 대사 능력이 더 향상되고 질룰로스 생성도 증가시켜 에탄올 발효가 가능할 것으로 기대하여 자일로스 이소머라제의 세포내/외 동시발현 균주를 구축하였다.In the case of intracellular expression strains, about 3 g / L of guloseulose was produced in 60 hours of culture, which is thought to be diffusing out of the cell due to high concentration of nitrilulose produced in the cells. Both strains consumed glucose to produce ethanol, but ethanol production did not increase during consumption of xylose, confirming that ethanol was not fermented using xylose. Therefore, simultaneous expression of xylose isomerase intracellularly or intracellularly is expected to increase the metabolism ability of xylose and increase the production of gylulose, and thus it is expected that ethanol fermentation will be possible. Thus, the intracellular / extracellular expression of xylose isomerase .

실시예 14 : 자일로스 이소머라제 세포내/외 동시발현 균주의 에탄올 발효Example 14: Ethanol fermentation of xylose isomerase co-expressing cells inside / outside

자일로스 이소머라제를 세포내/외에 동시 발현하는 균주는 실시예 13에서 제작한 세포내 발현 균주에 YGa-T3-xylA6H 벡터를 추가로 형질전환하는 방법으로 제작하였다. 두 발현벡터 도입여부는 PCR을 통해 확인하였고 자일로스 이소머라제 분비 발현을 확인하기 위해 자일로스가 포함된 배지에서 배양하여 단백질 발현과 자일로스 이용능을 분석하였다. 그 결과 도 14에서 보는바와 같이 자일로스 이소머라제가 도입된 균주들은 모두 발현이 되는 것을 확인하였고 10g/L 자일로스중 3g/L 자일로스를 소모하는 것을 확인하였다. 따라서 자일로스 이소머라제 동시 발현 균주로부터 에탄올 생산이 가능한지 에탄올 발효를 통해 확인하였다. The strain expressing xylose isomerase simultaneously in / outside the cell was prepared by further transforming the YGa-T3-xylA6H vector into the intracellular expression strain prepared in Example 13. In order to confirm the expression of xylose isomerase, the expression of two expression vectors was confirmed by PCR and cultured in a medium containing xylose to analyze protein expression and xylose availability. As a result, as shown in FIG. 14, it was confirmed that all of the strains into which xylose isomerase was introduced were expressed and consumed 3 g / L xylose in 10 g / L xylose. Therefore, it was confirmed through ethanol fermentation that ethanol production from coexpressing xylose isomerase was possible.

에탄올 배양배지(0.5% 효모추출물, 0.5% 펩톤, 제1인산칼륨, 0.2% 황상암모늄, 0.04% 황산마그네슘, pH5.0)에 2% 자일로스와 1mM 염화망간, 20mM 염화마그네슘을 첨가하였고 30℃, 100rpm에서 72시간 동안 배양하였다. 대조구로 자일로스 이소머라제의 세포내 발현 균주와 분비 발현 균주의 자일로스 소모량과 에탄올 생산량을 같이 비교하였다. 그 결과 도 15에서 보는바와 같이 자일로스 이소머라제를 세포내와 세포외로 각각 발현한 균주보다 동시발현 균주의 세포성장이 더 빠른 것을 확인하였다. 자일로스 소모량은 세포내 발현 균주가 7.3g/L, 세포외 분비 발현 균주는 10.7g/L, 동시 발현균주가 14g/L 자일로스를 소모하여 세포내/외로 동시 발현했을 때 자일로스 이용능이 향상된 것을 확인하였다. 2% xylose, 1 mM manganese chloride, and 20 mM magnesium chloride were added to an ethanol culture medium (0.5% yeast extract, 0.5% peptone, potassium phosphate monobasic, 0.2% ammonium sulfate, 0.04% magnesium sulfate, pH 5.0) , And cultured at 100 rpm for 72 hours. The amount of xylose consumed and ethanol production in the intracellular and secretory expression strains of xylose isomerase was also compared. As a result, as shown in FIG. 15, it was confirmed that the cell growth of the co-expressing strain was faster than that of the xylose isomerase-expressing cell and the cell-expressing cell, respectively. The amount of xylose consumed was 7.3 g / L in the intracellular expression strain, 10.7 g / L in the extracellular secretory expression strain, and 14 g / L xylose in the simultaneous expression strain, Respectively.

실시예 15 : 내산성 자일로스 이소머라제 제작Example 15: Production of acid-resistant xylose isomerase

온도와 pH 조건은 미생물의 성장 및 신진대사 등에 큰 영향을 미치므로 상기 변수들은 에탄올 생성 효율에도 중요하게 작용한다. 자일로스를 질룰로스로 전환하는 과정을 매개하는 자일로스 이소머라제의 경우 pH 7.0에서 질룰로스 전환 효율이 가장 높은 것으로 확인되었으나 재조합 효모 균주의 성장과정에서 배지내 pH가 자연적으로 감소하게 되어 배양액 pH의 산성화에 의해 에탄올 발효가 진행될수록 질룰로스 전환효율 또한 감소하게 된다. Since the temperature and pH conditions have a great influence on microbial growth and metabolism, these parameters also play an important role in ethanol production efficiency. In the case of xylose isomerase that mediates the conversion of xylose to gylulose, it was found that the conversion efficiency of the nitrilulose was the highest at pH 7.0. However, the pH of the culture medium naturally decreased during the growth of the recombinant yeast strain, As the ethanol fermentation progresses by the acidification of the fermentation broth, the conversion efficiency of the ferulic acid decreases.

따라서 이를 개선하기 위해 낮은 pH조건에서도 자일로스 이용이 우수한 자일로스 이소머라제 변이균주를 제작 하고자 하였다. Therefore, in order to improve it, we tried to produce xylose isomerase mutant strain which is superior in the use of xylose even at low pH.

변이 유도 중합효소연쇄반응 (error-prone PCR)을 이용하여 자이로스 이소머라제 유전자에 무작위 적으로 변이가 도입된 유전자 라이브러리를 제작하였다. 상기 실시예 4에서 결정한 YGaT3-xylA6H의 단백질 융합인자를 제외한 활성형의 자일로스 이소머라제의 서열을 주형으로 LNK39, GT50R 프라이머와 변이 유도 효소연쇄중합반응 키트(PCR random mutagenesis kit, Clontech)를 이용하여 error-prone PCR을 수행하였다. 변이 유도는 제품에 포함된 protocol에 의거하여 1kb당 3개의 변이가 유도되도록 하였으며, 94℃에서 30초 동안 1회; 94℃ 30초간, 68℃ 1분30초간 반응을 25회; 68℃에서 1분간 1회 반응 조건으로 수행하였다. 상기 수득한 PCR 산물은 in vivo recombination을 통해 사카로마이세스 세레비지에 Y2805Δgal80(Mat a pep4::HIS3 gal1::Tc190, prb1 can1 his3-200 ura3-52)균주에 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하였다(도 16). A gene library in which a mutation was randomly introduced into a gyrosis isomerase gene was prepared using a mutagenesis PCR (error-prone PCR). The sequence of the active form of xylose isomerase except for the protein fusion factor of YGaT3-xylA6H determined in Example 4 was used as a template using LNK39, GT50R primer and PCR random mutagenesis kit (Clontech) And error-prone PCR was performed. Mutagenesis was induced by inducing 3 mutations per 1 kb according to the protocol included in the product, once at 30 seconds at 94 ° C; Reaction at 94 占 폚 for 30 seconds, 68 占 폚 for 1 minute and 30 seconds 25 times; 1 < / RTI > at 68 < RTI ID = 0.0 > The obtained PCR product was introduced into Saccharomyces cerevisiae via in vivo recombination into a strain of Y2805Δgal80 (Mat a pep4 :: HIS3 gal1 :: Tc190, prb1 can1 his3-200 ura3-52), and each transformant (Fig. 16).

자일로스를 탄소원으로 사용하는 고체 배지의 pH를 5 이하로 낮출 경우에 야생형 자일로스 이소머라제를 분비하는 균주는 성장하기 어렵기 때문에 이러한 특성을 이용하여 자일로스 이소머라제의 최적 pH가 감소한 변이 균주를 선별하고자 하였다. When the pH of the solid medium using xylose as a carbon source is lowered to 5 or less, it is difficult to grow wild-type xylose isomerase-secreting strains. Therefore, a mutation in which the optimum pH of xylose isomerase is decreased To select strains.

형질전환체들은 YNB + 2% xylose + 0.1% glucose + 0.5% casamino acid (pH5.0)를 함유한 배지에서 4일간 배양 후 성장 속도가 빠른 콜로니를 1차 선별하였다. 선별된 균주를 대상으로 자일로스 소모량을 확인하기 위하여 1% glucose + 2 % xylose + 0.5 mM MnCl2 + 20 mM MgCl2 함유한 배지의 pH를 5.0으로 조절하여 60시간 배양 후 HLPC로 소모한 자일로스를 정량분석 하였다. 도 17에서 보듯이, 대조구인 2805Δgal80/YGaT3-xylA6H로부터 발현된 자일로스 이소머라제 보다도 우수한 활성을 나타내는 3개의 형절전환체 (12, 28, 76 번)를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체 중에서도 76번 변이주의 경우 배양 60시간 동안 공급해준 20g/L의 xylose를 모두 소모하였으며 10g/L xylose를 소모한 대조구에 비해 xylose 소모량이 2배 증가한 것으로 확인되었다. The transformants were firstly cultured for 4 days in a medium containing YNB + 2% xylose + 0.1% glucose + 0.5% casamino acid (pH 5.0) To determine the amount of xylose consumed in selected strains, the pH of the medium containing 1% glucose + 2% xylose + 0.5 mM MnCl2 + 20 mM MgCl2 was adjusted to 5.0, and cultured for 60 hours. Then, xylose consumed with HLPC was quantified Respectively. As shown in Fig. 17, three transformants (12, 28, 76) exhibiting better activity than the xylose isomerase expressed from the control, 2805Δgal80 / YGaT3-xylA6H, were selected. Of the selected transformants, the mutant strain No. 76 consumed 20 g / L of xylose which was supplied for 60 hours of cultivation, and the amount of xylose consumed was doubled as compared with the case of 10 g / L xylose consumed.

자일로스 이용능이 증진된 12번과 76번 2개의 균주로부터 벡터를 회수 하여 염기서열을 분석한 결과, 12번 변이주는 156번째 아스파라진(N)이 세린(S)으로 바뀌었으며(N156S, 서열번호 54)) 76번 변이주는 252번째 아미노산인 이소루이신 (I)이 메티오닌 (M)으로 치환된 변이가 (I252M, 서열번호 55) 확인되었다. The vector was recovered from two strains No. 12 and No. 76 in which the use of xylose was enhanced and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, in the mutant 12, the 156th asparagine (N) was changed to serine (S) (N156S, 54) Mutant 76 was confirmed to have a mutation (I252M, SEQ ID NO: 55) in which isoleucine (I), which is the 252nd amino acid, was substituted with methionine (M).

실시예 16 : 자일로스 이소머라제 변이주의 최적 pH 확인Example 16: Optimal pH determination of xylose isomerase mutant

상기 실시예에서 선별된 자일로스 이소머라제 변이주 중 자일로스 이용능이 더 우수한 변이주(Y2805Δgal80/YGaT3-XylA-766H)로부터 자일로스 이소머라제를 대량 생산하고자 5L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다(도 18). 실시예 6에 제시한 조건과 동일하게 수행되었으며 이후 순수한 자일로스 이소머라제를 얻기 위해 발효 농축액을 his-tag 칼럼을 이용하여 정제 후 단일 밴드의 순수한 자일로스 이소머라제를 확보하였다(도 19). 정제한 효소를 대상으로 최적 pH 확인을 위해 50 mM 시트레이트(citrate) 완충액(pH 3.0~5.0), 말레이트(maleate) 완충액(pH 6.0 ~ 7.0), 트리스(Tris) 완충액(pH 8.0 ~ 9.0), 글리신-수산화나트륨(Glycine-NaOH, pH 10)를 사용하여 각 pH 완충액에서 상대적인 활성을 조사하였다. 그 결과 도 20 에 나타난 바와 같이 대조구의 경우 pH7.0에서 질룰로스 전환효율이 가장 좋았으나 변이주의 경우 pH 5.0에서 최대 활성을 확인했으며 pH가 높아질수록 질룰로스 전환효율이 감소하는것으로 확인되었다. 따라서 대조구보다 최적 pH가 낮은 변이체임이 확인되었으며 이러한 차이로 인하여 xylose 배지에서 배양할 경우 xylose 이용능이 증가하였음을 알 수 있었다.In order to mass-produce xylose isomerase from the mutant strain (Y2805Δgal80 / YGaT3-XylA-766H), which is superior in the ability of using xylose among the xylose isomerase mutants selected in the above examples, fed-batch culture was carried out in a 5L fermenter 18). The same procedure as described in Example 6 was followed. Afterwards, to obtain pure xylose isomerase, a single band of pure xylose isomerase was obtained after purification of the fermentation concentrate using a his-tag column (Fig. 19) . (PH 3.0 to 5.0), maleate buffer (pH 6.0 to 7.0) and Tris buffer (pH 8.0 to 9.0) were added to the purified enzyme, , And glycine-sodium hydroxide (Glycine-NaOH, pH 10) were used to investigate the relative activity in each pH buffer. As a result, as shown in FIG. 20, the conversion efficiency of nitrilulose was the best at pH 7.0 in the control, but the maximum activity was observed at pH 5.0 in the case of the mutant strain, and the nitrilulose conversion efficiency was decreased as the pH was increased. Therefore, it was confirmed that the mutant with the optimal pH was lower than that of the control. Therefore, it was found that xylose activity increased when cultured in xylose medium.

상기 결과를 종합하면, 피로마이세스 종 유래의 자일로스 이소머라제를 효과적으로 분비 발현시키는 효모 균주를 제작하기 위하여, 코돈 최적화와 단백질 융합인자와의 조합을 확인한 결과, 단백질 융합인자 TFP 3 및 14 등과 피로마이세스 종 유래 자일로스 이소머라제를 융합할 경우 자일로스 이소머라제를 고효율로 분비하는 효모 균주로 제작할 수 있음을 확인하였다. As a result, the combination of codon optimization and protein fusion factor was confirmed to produce a yeast strain that effectively secretes and expresses xylose isomerase derived from pyromyosized species. As a result, protein fusion factors TFP 3 and 14, It was confirmed that when fused with xylose isomerase derived from pyromyesis species, it can be produced as a yeast strain which secretes xylose isomerase with high efficiency.

또한, 상기 제작한 효모 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 자일로스로부터 질룰로스를 생산하는 방법, 및 상기 배지에 마그네슘 이온, 망간 이온, 또는 바륨 이온을 포함하는 경우 자일로스 이용능이 증가함을 확인하였다. 또한 본 발명에서 제작된 자일로스 이소머라제 변이체는 야생형 효소에 비하여 내산성이 개선되어서 일반적인 효모 발효배지 조건인 pH5 내지 pH6 범위에서 자일로스 이용에 최적화됨을 확인하였다.Also, there is a method for producing gylulose from xylose, which comprises culturing the yeast strain produced in a medium, and an ability to use xylose when the medium contains magnesium ion, manganese ion, or barium ion Respectively. In addition, the xylose isomerase mutant prepared in the present invention has improved acid resistance as compared with the wild type enzyme, and thus it is confirmed that it is optimized for the use of xylose in the range of pH 5 to pH 6, which is a general yeast fermentation medium.

따라서 일반적으로 자일로스 활용능력 향상에 필요한것으로 알려진 xylose transporter, xylulokinase등을 도입하고 오단당인산대사경로(pentose phosphate pathway)가 강화된 균주에 본 발명에서 제작된 자일로스 이소머라제 분비발현 벡터를 발현시키면 자일로스로부터 에탄올 발효능을 개선할 수 있다.Therefore, a xylose transporter, xylulokinase or the like known to be required for improving xylose utilization ability is generally introduced and a xylose isomerase secretion expression vector produced in the present invention is expressed in a strain having enhanced pentose phosphate pathway Can improve the efficacy of ethanol from xylose.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Methods of utilizing xylose as a carbon source using secretory expression of xylose isomerase <130> KPA150228KR-P1 <150> KR10-2015-0057224 <151> 2015-04-23 <160> 55 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1314 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized xylA derived from Piromyces sp. <400> 1 atggcaaagg aatattttcc acagattcag aagattaaat ttgaaggtaa ggattcaaag 60 aatccattag cttttcacta ctatgatgct gaaaaagaag tgatgggtaa aaaaatgaag 120 gattggttac gtttcgcaat ggcttggtgg catacactgt gcgcagaagg tgcagaccag 180 tttggggggg gtacaaaatc tttcccttgg aatgaaggaa cagatgcaat tgagatagcc 240 aaacaaaaag ttgatgctgg tttcgaaatc atgcaaaaac ttggtatacc atactattgt 300 ttccacgatg ttgatcttgt ttcagaagga aactctattg aagaatatga atcgaatctt 360 aaggctgtag ttgcttatct aaaagaaaag caaaaagaaa ccggtattaa gcttttatgg 420 agtactgcta atgtcttcgg tcacaaacgt tatatgaatg gggcatctac taaccctgac 480 tttgatgtcg tagcccgtgc tattgttcaa attaagaacg cgatagatgc 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attaagaacg cgatagatgc cggtattgaa 540 cttggtgctg aaaattacgt attttggggt ggtcgtgaag gttacatgtc tttattaaac 600 actgaccaaa agcgtgagaa agaacatatg gcgactatgt tgaccatggc gcgtgactac 660 gctcgttcca aaggatttaa gggaactttt ttgattgaac caaagccgat ggaacctaca 720 aaacatcagt atgatgttga tactgaaacg gctataggtt tccttaaagc acataatcta 780 gataaggact tcaaagtaaa tattgaagtt aatcacgcta cattagctgg acatactttt 840 gt; ggtgactatc aaaacggctg ggatactgat cagtttccca ttgaccaata cgaattagtc 960 caagcttgga tggagatcat ccgtggtggt ggtttcgtta caggtggtac caattttgat 1020 gccaaaacgc gtcgtaattc aactgacttg gaagacatca tcatagcaca tgtttctgga 1080 atggatgcta tggctcgtgc tcttgaaaac gctgccaaat tactccaaga aagtccatat 1140 accaagatga aaaaggagag atacgcatcc tttgatagtg gtataggaaa ggactttgaa 1200 gatggtaaac ttacgctgga acaagtttac gagtatggta aaaaaaatgg tgaaccaaag 1260 caaacttctg gtaaacaaga actatatgaa gcgatcgtgg ccatgtatca ataa 1314 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xylase PCR forward primer <400> 2 ctcgccttag 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Asp Ala Lys Thr Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu Asp             340 345 350 Ile Ile Ile Ala His Val Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala Leu         355 360 365 Glu Asn Ala Ala Lys Leu Leu Gln Glu Ser Pro Tyr Thr Lys Met Lys     370 375 380 Lys Glu Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe Glu 385 390 395 400 Asp Gly Lys Leu Thr Leu Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Lys Lys Asn                 405 410 415 Gly Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Leu Tyr Glu Ala Ile             420 425 430 Val Ala Met Tyr Gln         435 <210> 55 <211> 437 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XylA76 <400> 55 Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Gln Ile Gln Lys Ile Lys Phe Glu Gly   1 5 10 15 Lys Asp Ser Lys Asn Pro Leu Ala Phe His Tyr Tyr Asp Ala Glu Lys              20 25 30 Glu Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Arg Phe Ala Met Ala          35 40 45 Trp Trp His Thr Leu Cys Ala Glu Gly Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gly      50 55 60 Thr Lys Ser Phe Pro Trp Asn Glu Gly Thr Asp Ala Ile Glu Ile Ala  65 70 75 80 Lys Gln Lys Val Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Gln Lys Leu Gly Ile                  85 90 95 Pro Tyr Tyr Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Ser Glu Gly Asn Ser             100 105 110 Ile Glu Glu Tyr Glu Ser Asn Leu Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Lys         115 120 125 Glu Lys Gln Lys Glu Thr Gly Ile Lys Leu Leu Trp Ser Thr Ala Asn     130 135 140 Val Phe Gly His Lys Arg Tyr Met Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro Asp 145 150 155 160 Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ala Ile Asp                 165 170 175 Ala Gly Ile Glu Leu Gly Ala Glu Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg             180 185 190 Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys Glu         195 200 205 His Met Ala Thr Met Leu Thr Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ser Lys     210 215 220 Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro Thr 225 230 235 240 Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Ala Met Gly Phe Leu Lys                 245 250 255 Ala His Asn Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn His             260 265 270 Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala Val         275 280 285 Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Tyr Gln     290 295 300 Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Gln Tyr Glu Leu Val 305 310 315 320 Gln Ala Trp Met Glu Ile Ile Arg Gly Gly Gly Phe Val Thr Gly Gly                 325 330 335 Thr Asn Phe Asp Ala Lys Thr Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu Asp             340 345 350 Ile Ile Ile Ala His Val Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala Leu         355 360 365 Glu Asn Ala Ala Lys Leu Leu Gln Glu Ser Pro Tyr Thr Lys Met Lys     370 375 380 Lys Glu Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe Glu 385 390 395 400 Asp Gly Lys Leu Thr Leu Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Lys Lys Asn                 405 410 415 Gly Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Leu Tyr Glu Ala Ile             420 425 430 Val Ala Met Tyr Gln         435

Claims (20)

단백질 융합인자(Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드 및 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자일로스 이소머라제 분비 발현용 발현 카세트.
An expression cassette for secretion expression of xylose isomerase, comprising a polynucleotide encoding a protein fusion partner (TFP) and a polynucleotide encoding a xylose isomerase.
제1항에 있어서, 상기 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드 는 피로마이세스 종(Piromyces sp.)으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
2. An expression cassette according to claim 1, wherein the polynucleotide encoding the xylose isomerase is derived from Piromyces sp .
제1항에 있어서, 상기 자일로스 이소머라제를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
2. An expression cassette according to claim 1, wherein the polynucleotide encoding the xylose isomerase has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서, 상기 자일로스 이소머라제는 서열번호 54 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
The expression cassette of claim 1, wherein the xylose isomerase has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55.
제1항에 있어서, 상기 단백질 융합인자(TFP)는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 TFP 1, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 TFP 2, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 TFP 3, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 TFP 4, 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 TFP 5, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성된 TFP 6, 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된 TFP 7, 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 TFP 8, 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 TFP 9, 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성된 TFP 10, 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 TFP 11, 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성된 TFP 12, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 TFP 13, 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성된 TFP 14, 서열번호 20의 아미노산 서열로 구성된 TFP 15, 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성된 TFP 16, 서열번호 22의 아미노산 서열로 구성된 TFP 17, 서열번호 23의 아미노산 서열로 구성된 TFP 18, 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성된 TFP 19, 서열번호 25의 아미노산 서열로 구성된 TFP 20, 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성된 TFP 21, 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된 TFP 22, 서열번호 28의 아미노산 서열로 구성된 TFP 23, 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 구성된 TFP 24로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 발현 카세트.
The protein fusion factor (TFP) of claim 1, wherein the protein fusion factor (TFP) comprises TFP1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, TFP2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, TFP3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: TFP 5 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, TFP 6 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, TFP 4 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, TFP 9 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, TFP 10 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, TFP 11 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, TFP 12 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: TFP 14 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, TFP 15 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, T FP 16, TFP 17 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, TFP 18 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, TFP 19 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, TFP 20 composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, 27, TFP 23 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, TFP 23 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and TFP 24 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 , Expression cassette.
제5항에 있어서, 상기 단백질 융합인자(TFP)는 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 TFP 3, 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 TFP 8, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 TFP 13, 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성된 TFP 14, 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성된 TFP 19, 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 구성된 TFP 20으로 이루어진 군에서 선택되는, 발현 카세트.
The protein fusion factor (TFP) of claim 5, wherein the protein fusion factor (TFP) comprises TFP 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, TFP 8 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, TFP 13 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: TFP 19 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, TFP 19 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and TFP 20 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는, 발현 벡터.
7. An expression vector comprising the expression cassette of any one of claims 1 to 6.
제7항의 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된, 형질전환 미생물.
7. A transforming microorganism, wherein the expression vector of claim 7 is introduced into a host cell.
제8항에 있어서, 상기 발현 벡터는 서열번호 54 또는 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 자일로스 이소머라제를 분비하는 발현 카세트를 포함하는 것인, 형질전환 미생물.
9. The transformed microorganism of claim 8, wherein the expression vector comprises an expression cassette that secretes xylose isomerase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55.
제8항에 있어서, 상기 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인, 형질전환 미생물.
9. The transformed microorganism of claim 8, wherein the host cell is Saccharomyces cerevisiae .
제10항에 있어서, 상기 숙주 세포는 Y2805△gall80 균주인, 형질전환 미생물.
11. The transformed microorganism according to claim 10, wherein the host cell is a strain Y2805? Gall80.
제8항에 있어서, 상기 형질전환 미생물은 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 분비하여 자일로스(xylose)를 질룰로스(xylulose)로 전환하는 것인, 형질전환 미생물.
9. The transformed microorganism according to claim 8, wherein the transforming microorganism secretes xylose isomerase to convert xylose into xylulose.
제8항의 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 생산하는 방법.
9. A method for producing xylose isomerase, comprising culturing the transforming microorganism of claim 8.
제8항의 형질전환 미생물을 탄소원으로 자일로스를 포함하는 배지에 배양하는 단계를 포함하는, 질룰로스(xylulose)를 생산하는 방법.
A method for producing xylulose, comprising culturing the transformed microorganism of claim 8 in a culture medium containing xylose as a carbon source.
제14항에 있어서, 상기 배지는 2가 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생산 방법.
15. The method according to claim 14, wherein the medium comprises a divalent metal ion.
제15항에 있어서, 상기 2가 금속 이온이 마그네슘 이온(Mg2+), 망간 이온(Mn2+) 또는 바륨 이온인(Ba2+), 생산 방법.
The production method according to claim 15, wherein the divalent metal ion is magnesium ion (Mg 2+ ), manganese ion (Mn 2+ ) or barium ion (Ba 2+ ).
제16항에 있어서, 상기 2가 금속이온을 포함하는 배지는 5 내지 25 mM의 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하는 것인, 생산 방법.
17. The method of claim 16, wherein the production method is to culture medium containing the divalent metal ions include magnesium chloride (MgCl 2) from 5 to 25 mM.
제16항에 있어서, 상기 2가 금속이온을 포함하는 배지는 0.01 내지 5 mM의 염화망간(MnCl2)을 포함하는 것인, 생산 방법.
The production method according to claim 16, wherein the medium containing the divalent metal ion comprises 0.01 to 5 mM manganese chloride (MnCl 2 ).
제8항의 형질전환 미생물을 이용하여 바이오 매스 유래 복합당을 당화 및 발효하는 방법.
A method for saccharifying and fermenting a biomass-derived complex sugar using the transgenic microorganism of claim 8.
제19항에 있어서, 상기 바이오 매스 유래 복합당은 포도당 및 자일로스로 이루어진 것을 특징으로 하는, 당화 및 발효하는 방법.20. The method of saccharification and fermentation according to claim 19, wherein the biomass-derived complex sugar is composed of glucose and xylose.
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