KR20160115645A - 아토피 및 알러지 질환에서의 ctcf 유전자의 용도 - Google Patents

아토피 및 알러지 질환에서의 ctcf 유전자의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아토피 및 알러지 질환에서의 CTCF의 발현 패턴에 따른 알러지 질환 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단법을 이용하는 경우, 알러지 질환 진단의 정확도가 증가하므로 효과적인 알러지 관련 질환 진단에 큰 활용이 기대된다. 또한, 낙아웃된 마우스를 통해 알러지 질환에 유효성분을 효과적으로 스크리닝 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

아토피 및 알러지 질환에서의 CTCF 유전자의 용도{A ROLE OF CTCF GENE IN ATOPIC AND ALLERGIC DISEASE}
본 발명은 아토피 및 알러지 질환에서의 CCCTC-결합인자(CTCF)의 용도에 관한 것이다.
알러지(Allergy)란 이물질 즉, 항원(Allergen)에 대한 특이하고 변형된 반응을 나타내는 생화학적 현상이며, 이 때 방출된 물질이 증상을 일으키게 되면 알러젠(Allergen)이라 하고 그 결과 생긴 질환을 알러지 질환이라고 한다. 알러지의 발생 원인은 항원항체반응의 결과로 나타나는 생체의 병적 과정이며, 알러지 질환 중 하나인 아토피 피부염은 유전인자와 환경인자가 관여하여 발명하는 면역성질환이다. 아토피 피부염은 만성적으로 건조하며 소양감이 심하고 반복적으로 재발되며 각종 자극에 의해 쉽게 피부염이 유발된다. 많은 경우에는 1-2주 간격으로 반복적으로 악화되며 적절한 관리를 하지 않으면 삼출을 동반한 홍반성 발진의 아급성병변, 가죽과 같이 두꺼워진 태선화의 만성병변으로 진행된다. 아토피피부염의 병리학적(조직검사 소견) 검사상 각각의 소견은 병변의 단계에 따라 다르지만 대체로 만성이 되면 표피가 두꺼워지고 여러 가지 면역반응에 관여하는 세포의 침윤이 관찰된다. 특히 면역 반응을 담당하는 랑게르한스세포(LC)가 증가되어 있으며 비정상적으로 증가된 항원제시 능력을 가진다.
면역 반응에 있어서, 수지상세포(DC) 또한 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있다. 따라서, 수지상세포의 분화를 촉진하여 성숙시킴으로써 강력한 면역 반응을 일으키는 무독성의 면역조절제의 개발과 그 물질의 작용기전을 명확히 이해하는 것은 수지상세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다(WO2012050269 A1). 또한 최근 연구에 따르면 알러지 및 아토피가 CTCF의 결합하는 부위에 연관이 있다고 개시되어 있다(Rosenwasser et al., Allergy Asthma Immunol Res. 2010 October; 2(4):215-227). 이에 따라, 아토피 및 알러지와 같은 피부 질환에서의 CTCF의 용도의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 알러지 질환에서의 CTCF의 용도로서 알러지 질환 진단에 관한 정보를 제공하는 것을 목적으로 하고, 진단 키트를 제공하는데 목적이 있으며, 알러지 질환 모델용 형질전환체를 제공하며, 알러지 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법을 제공하는데 목적이 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 "랑게르한스세포"란, 주로 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재하는 세포인 수지상세포 중에서 특히, 피부에 있는 세포를 랑게르한스세포라 부른다. 상기 세포는 포유동물의 면역계의 일부를 이루는 면역 세포이며, 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 그것들은 또한 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있다. 일단 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작되게 한다. 수지상세포는 흔치 않고 분리하기 어렵기 때문에 서로 다른 유형과 서브셋의 수지상세포의 정확한 생성과 발달 및 그 상호관계에 대해서는 대략적으로만 알려졌다. 수지상세포는 신체의 다른 세포들과 끊임없는 소통을 한다. 이러한 소통은 세포 표면 단백질의 상호작용에 근거한 직접적인 세포 대 세포 접촉의 형태를 취할 수 있다. 림프구성 수지상세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류머티스성 관절염, 알러지성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 된다. 상기와 같이 수지상세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "CCCTC-결합인자"란, 11개의 아연 핑거(zinc finger)를 포함하는 서열-특이적인 DNA 결합 단백질로 CTCF라고 한다. CTCF는 조절 단백질로 잘 알려져 있으며, 척추동물에서 인슐레이터(insulator)에 결합하는 전사 조절제로 조절 유전자 발현 조절에 대해 인헨서-블로킹(enhancer-blocking) 활성이나 프로모터와 인헨서의 상호작용을 매개하는 활성을 가진다. 정제된 CTCF는 SDS PAGE로 정의된 대략 130-160kD의 분자량을 가지며, 높은 GC 뉴클레오티드 함량을 가지는 DNA 지역에 우선적으로 결합한다.
본 발명의 일 구체예에서 "알러지 질환"이란, 부종, 과민증(anaphylazis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, "형질전환체"란, DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 대상체를 의미한다. 예를 들면 마우스, 랫트, 토끼, 돼지 등과 같은 포유류인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 예에 의해 형질전환이 가능한 동물의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 알러지 질환의 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명에 있어서, 알러지 질환 진단은 CTCF의 DNA, mRNA 또는 단백질로 이루어지는 군에서 1종 이상의 존재를 확인하고, CTCF를 코딩하는 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 감소되는 것을 측정하는 방법으로 이루어질 수 있다.
또한 본 발명에서의 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커"란, 대상 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 정상 세포에 비하여 대상 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 질병 진단 마커는 정상 대상 조직의 세포에 비하여, 알러지 질환에서 특이적으로 낮은 수준의 발현을 보이는 CTCF 유전자의 mRNA 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.
상기 "mRNA 발현 수준 측정”이란, 질병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 질병 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 대상 세포에서 발현이 감소하는 CTCF 유전자의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다. CTCF의 폴리뉴클레오타이드 서열을 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서의 "프라이머" 란, 짧은 자유 3말단 수산화기(Free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(Template)와 염기쌍(Base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 CTCF 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 질병을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또한 본 발명에서의“단백질 발현수준 측정”이란, 질병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 질병 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 효소면역측정법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(Protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 대상 세포에서 발현이 감소하는 마커인 CTCF 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것일 수 있다. CTCF 유전자로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 당업자는 상기 단백질에 특이적인 항체를 디자인할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, "항체"란, 상기에서 설명한 바와 같으며, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 CTCF 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고, 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다. 또한 본 발명에서의 항체는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 질병 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "진단 키트"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 진단 키트는 알러지 질환의 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명의 키트에는 알러지 질환 여부를 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 선택적으로 펩타이드를 인지하는 항체 또는 알러지 질환 감염시 특이적으로 발현이 감소되는 특정 펩타이드를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF의 DNA 또는 mRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 정상 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF의 DNA 또는 mRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 목적하는 피검체와 정상 피검체의 CTCF mRNA의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고, 목적하는 피검체의 CTCF mRNA의 발현 수준이 정상 피검체보다 낮을 경우, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 CTCF DNA 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 상기 구체예에서, 상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료 내 인터페론 감마의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 알러지 질환은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 정상 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 목적하는 피검체와 정상 피검체의 CTCF의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고, 목적하는 피검체의 CTCF의 발현 수준이 정상 피검체보다 낮을 경우, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 CTCF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 상기 구체예에서, 상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 면역형광법, 유세포 분석 방법, 마이크로어레이 또는 이동성분석 방법을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료 내 인터페론 감마의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 구체예에서 상기 알러지 질환은 부종, 과민증, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는방법을 제공하며, 상기 구체예에서, 상기 알러지 질환은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, CTCF DNA 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하거나; CTCF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 알러지 질환의 진단 키트를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 알러지 질환은 부종, 과민증, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지 중 하나인 것을 특징으로 하는 알러지 질환의 진단 키트를 제공하고, 상기 구체예에서, 상기 알러지 질환은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인 것을 특징으로 하는 알러지 질환의 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, CTCF의 유전자가 결실된 인간을 제외한 포유류 또는 세포인 알러지 질환 모델용 형질전환체를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 인간을 제외한 포유류는 마우스 또는 랫트인 것을 특징으로 하는 알러지 질환 모델용 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, CTCF의 유전자가 결실된 인간을 제외한 포유류 또는 세포인 알러지 질환 모델용 형질전환체에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; 상기 유전자 또는 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계 및 상기 CTCF 유전자 또는 단백질의 발현량 또는 활성이 상향조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 알러지 질환의 예방 또는 치료용 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 알러지 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 아토피 및 알러지 질환에서의 CTCF 발현 정도의 확인을 목적으로 하며, CTCF 유전자의 결핍을 통하여 알러지 관련 질환에 대하여 신속하고 보다 정확한 질병진단을 할 수 있을 것으로 예상되며, 효과적인 알러지 관련 질환 진단 및 스크리닝 방법에 큰 활용이 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수지상세포 특이적인 CTCF 낙아웃 마우스에서 수지상세포의 수가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 랑게르한스세포 특이적인 CTCF 낙아웃 마우스에서 표피의 랑게르한스세포수가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CTCF 결핍 랑게르한스세포의 수 감소는 랑게르한스세포 자가분열 능력의 감소와 관련이 있음을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 CTCF 결핍 랑게르한스세포는 생체 내에서 림프절로 이동하는 것에 문제가 발생하였음을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 CTCF 결핍 랑게르한스세포의 세포이주 저하는 세포부착 물질 증가 및 케모카인 수용체 7의 감소와 관련이 있음을 나타낸 것이다.
도 6(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 CTCF 결핍 랑게르한스세포의 항상성 유지가 결핍될 경우 접촉피부염 유도에 의한 귀두께가 CTCF 낙아웃 마우스에서 현저히 증가되었고 더 오래 지속됨을 나타낸 것이다.
도 6(b)는 접촉피부염 항원 도포 후 림프절에서 항원 특이적으로 인터페론 감마를 분비하는 CD8 항원 양성 T 세포 분획이 증가함을 나타낸 것이다.
도 6(c)는 접촉피부염 항원 도포 후 림프절에서 항원 특이적인 인터페론 감마 분비가 증가함을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: CTCF 낙아웃 마우스의 제조 및 확인
실시예 1-1: CTCF 낙아웃 마우스의 제조
목적 CCCTC-결합 인자의 대립유전자를 가지는 마우스, Ctcf tm1a(EUCOMM)Wtsi 를 유럽연합의 EUCOMM(European Conditional Mouse Mutagenesis Consortium)으로부터 구매하였고, Ctcf tm1a(EUCOMM)Wtsi 마우스를 치킨 β-액틴-래빗 β-글로빈 하이브리드 프로모터와 휴먼 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)-IE 인헨서에서 유래된 리컴비네이즈(recombinase) FLP의 개량된 형태(enhanced form)의 트랜스진(transgene)을 발현하는 ACT-FLPe C57BL/6 마우스(잭슨 실험실, 바 하버, 메인, 미국)와 번식시켜 lacZ-네오마이신(neomycin)-저항 카세트(cassette)의 결실(deletion)과 loxP-flanked Ctcf 유전자(Ctcf fl /+ )를 가진 마우스를 생성하였다. Ctcf fl /+ 마우스의 이종교배를 통해 Ctcf fl /fl 마우스를 생성하였다. 올리고뉴클레오티드에 의한 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 마우스의 유전자형을 조사하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다: 전방향 프라이머 5’-AACTCCCTGGTTCCACTCCT-3’ 및 역방향 프라이머 5’-GACCCTAGTGCTGTTTCGGC-3’; 야생형 생성물, 420bp; Ctcf fl 생성물, 539bp. Ctcf fl/f l 마우스 및 CD11c-Cre BAC 형질전환 마우스를 교배하여 수지상세포-특이적 Ctcf 결핍(CD11c-cKO) 마우스를 생성하였다. Ctcf fl /fl 마우스와 휴먼 랑게린-Cre BAC 형질전환 마우스(NCI 마우스 저장소에서 얻음)를 교배하여 랑게르한스세포-특이적 Ctcf 결핍(huLang-cKO) 마우스를 생성하였다. Ctcf fl /fl 마우스와 Cre 마우스를 교배한 후, 조건(conditional) Ctcf 대립유전자의 결실 효율을 올리고뉴클레오티드에 의한 게놈 DNA PCR를 이용하여 확정하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다: 전방향 프라이머 5’-AACTCCCTGGTTCCACTCCT-3’ 및 역방향 프라이머 5’-TGGAGACCCAGATTCAAATG-3’; Ctcf fl 생성물, 1226bp; Ctcf Δ 생성물, 435bp. CD45.1 코제닉 마우스 및 OVA323 -339 특이적T 세포 수용체를 발현하는 OT-II 형질전환 마우스를 잭슨 실험실에서 구매하였다. CD45.1 및 OT-II 마우스의 이종 교배를 통해 CD45.1+OT-II 마우스를 얻었다. 연세대학교 의과대학의 특정 병원균 부재(specific pathogen free) 시설에서 사육한 6 내지 12주의 나이 범위 내의 마우스를 모든 실험에 사용하였다. 본 실험에서 나이 및 성별이 일치하는 Ctcf fl /fl 리터메이트(littermate) 마우스를 야생형(WT) 대조 마우스로 사용하였다. 모든 동물 실험은 연세대학교 의과대학의 동물관리위원회에 의해 승인을 받았다. 수지상세포 특이적인 CTCF 낙아웃 마우스에서 전반적인 수지상세포의 수가 감소하였으며 특히 피부 랑게르한스세포의 수가 가장 많이 감소한 결과를 도 1에 기재하였다.
실시예 1-2: 휴먼 단핵구-유래 랑게르한스세포(MDLC)의 생성
연세대학교 IRB-승인받은 프로토콜 하에 정상 지원자(n=15; 나이 범위: 25-40세)에서 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 얻었다. PBMC를 Ficoll-Paque PLUS(지이 헬스케어, 피스카타웨이, 뉴저지, 미국)의 구배원심분리법으로 분리하였고, CD14+ 단핵구를 안티-휴먼 CD14 마이크로비드(밀테닉 비오텍, 베르기쉬 글라드바흐, 독일)로 정제하였다. 유세포 분석기를 통해 세포의 순도를 확인하였다(>92%). 휴먼 MDLC를 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 즉, 1x106개의 단핵구를 24-웰 조직 배양 플레이트(SPL, 서울, 한국)에 배치하고 10%의 열불활성 우태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum, FBS)(HyClone), 50μM 2-멜캅토에탄올, 2mM L-글루타민, 1mM 비필수아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 100단위/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토라이신으로 충진된 RPMI 1640(HyClone)으로 구성된 완전 RPMI 배지에서 배양하였다. MDLC 분화 시, 100ng/㎖ rhGM-CSF, 20ng/㎖ rhIL-4(크레아젠, 서울, 한국) 및 10ng/㎖ TGF-β1(페프로텍, 록키 힐, 뉴저지, 미국)를 사용하였다. 6일째 MDLC를 수확하였고 1㎍/㎖의 리포폴리사카리드(LPS)(인비보겐, 샌 디애고, 캘리포니아, 미국)로 추가로 2일 동안 자극(stimulate)시켰다.
면역형광법을 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 최적 절단 온도(사쿠라, 도쿄, 일본)에 보관한 얼려진 귀 샘플로부터의 조직 조각(Tissue section)(6μm 두께)을 저온 유지 장치(cryostat)로 준비하였다. 피부 조각을 얼음처럼 차가운 아세톤에서 고정하였고 10%의 고트 세럼에 차단시켰다. 항체 염색 후, 이미지를 LSM 700 공초점 현미경(짜이스)으로 생성하였고 ZEN 소프트웨어(짜이스)로 분석하였다. TUNEL 분석을 세포자멸사 평가 키트(In Situ Cell Death Detection Kit)를 사용하여, 제조사의 지침서(로슈 디아그노스틱스)에 따라 수행하였다. 랑게르한스세포 특이적인 CTCF 낙아웃 마우스에서 표피의 랑게르한스 세포수가 감소된 결과를 도 2에 기재하였다.
실시예 1-3: 바이러스 및 Vpx -함유 바이러스-유사 입자( Vpx - VLP ) 생성
단핵구 및 HIV-1-유래 렌티바이러스(lentiviruse)를 가진 DC의 현저히 낮은 형질도입 효율에 기인하여, 렌티바이러스에 감염이 된 MDLC를 도와주는 Vpx-VLP의 동시형질도입(co-transduction)을 이용하였다. Jianrong Lu 박사(플로리다대학교 의과대학)로부터 pGIPz 및 pGIPz-shCTCF 렌티바이러스 백터를 얻었다. pSIV3+ 플라스미드를 안광석 박사(서울대학교)로부터 제공받았다. MDLC로의 렌티바이러스 감염 및 유전자 형질도입을 다음과 같이 수행하였다. 즉, 폴리에틸렌이민(폴리사이언스, 워링턴, 펜실베니아, 미국)을 이용하여 HEK-293 세포를 psPAX2 및 pMD2.G(애드진, 케임브리지, 메사추세츠, 미국)와의 동시형질감염(co-transfection)하여 렌티바이러스를 생성하였다. 8㎍/㎖의 폴리브랜(시그마, 세인트루이스, 미주리, 미국)존재 하에서 단핵구 배양의 처음 2일 동안 렌티바이러스 감염을 수행하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)-양성 형질도입된 MDLC를 형광활성 생물세포 분류(FACS) 및 추가의 분석에 사용하였다.
실시예 1-4: 조직 준비 및 유세포 분석
표피 및 진피의 단세포 현탁액에서, 절단한 귀를 2.5mg/㎖의 디스파아제 II(로슈 디아그노스틱스, 게엠베하, 만하임, 독일)에 30분 동안 37℃에 두었다. 분리된 표피 및 진피 시트를 1mg/㎖ 콜라게나아제 IV(워딩턴, 미국)에 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 몇몇의 실험에서, 마우스 귀를 아세톤/올리브유(4:1)에 용해된 20㎕의 1% 옥사졸론(Sigma)으로 처리하고, 24시간 후, 상기 피부를 준비하고 검사하였다. 피부-배액림프절(skin-draining lymph nodes, SDLN) 및 비장에서의 전체 세포를 1mg/㎖의 콜라게나아제 IV에서 1시간 동안 37℃로 배양하였다. 현탁액 세포를 항체와 염색시키고 FACSVerse 유세포 분석기(BD 바이오사이언스, 산호세, 캘리포니아, 미국)로 분석하였다.
실시예 1-5: 항체
형광체-접합 안티-마우스 CD11b, CD11c, CD40, CD44, CD45, CD45.1, CD69, CD80, CD86, CD103, CD115(콜로니-자극인자-1 수용체, CSF-1R), CD135, CD207(랑게린), 아넥신 V, C-C 케모카인 수용체 7(CCR7), E-카데린, 표피세포부착분자(EpCAM), F4/80, Foxp3, I-Ab(MHC II), 인터페론(IFN)-γ, Ki-67, Siglec-H 및 신호조절단백질알파(Sirpα) 모노클로날 항체(mAbs)를 이바이오사이언스(샌 디에고, 캘리포니아, 미국)에서 얻었고, 안티-마우스 CD4 및 CD8α 항체를 BD 바이오사이언스로부터 얻었다. 비오틴-접합 안티-마우스 CD3, CD19, NK1.1, Ter119 및 B220 mAbs를 골수 내 계통-양성 개체군(lineage-positive population)을 변별(discriminating)하여 pre-cDCs(이바이오사이언스)를 분석하는데 사용하였다. 안티-마우스 CTCF(압캠, 케임브리지, 메사추세츠, 미국) 및 형질전환 성장인자-베타 수용체 II(TGF-βRII; R&D 시스템, 미니애폴리스, 미네소타, 미국) 항체 또한 본 발명에 사용되었다. 세포가 함유된 조직 현탁액을 바이올렛색 형광 live/dead 염색(몰레큘러 프로브스, 유진, 오레곤, 미국)으로 30분 동안 얼음에서 배양하고 기재된 항체로 FACS 버퍼(1%의 소혈청 알부민을 포함하는 포스페이트-버퍼 살린)를 사용하여 적절한 희석 하에서 염색시켰다. IFN-γ 및 랑게린의 세포 내 검출 시, 세포를 BD 사이토픽스/사이토펌(BD Cytofix/Cytoperm)(BD 바이오사이언스)로 고정 및 투과화(permeabilized)시키고 30분 동안 얼음에 펌/세척(Perm/Wash) 버퍼(BD 바이오사이언스)에 희석시킨 항체와 함께 배양하였다. Foxp3 및 Ki-67의 세포 내 검출을 Foxp3/전사인자 염색 키트(이바이오사이언스)를 사용하여 수행하였다. 휴먼 MDLC 염색 시, 형광체-접합 안티-휴먼 CCR7, CD11c, CD14, CD80(BD 바이오사이언스), CD86, 및 E-카드헤린(이바이오사이언스) mAbs를 사용하였다. 모든 유세포 분석기 데이터를 FlowJo 소프트웨어(트리스타, 애슐랜드, 오레곤, 미국)로 분석하였다.
실시예 1-6: 홀마운트 (Whole-mount) 표피 시트 염색
분리된 표피 시트를 차가운 아세톤으로 15분 동안 실온에서 고정하였다. 표피 시트를 정제된 안티-마우스 I-Ab mAb(클론 M5/114, 바이오레전드, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국)와 배양하였고, 신호를 Alexa 488-접합 고트 안티-랫트 IgG(인비트로겐, 칼즈배드, 캘리포니아, 미국)로 증폭시켰다. 염색 후, 시트를 봉입제(mounting medium)(벡터 실험실, 벌링게임, 캘리포니아, 미국)로 유리슬라이드에 고정시켰다. 이미지를 LSM 700 공초점 현미경(짜이스, 오버코헨, 독일)으로 이미지를 얻었고 ZEN 소프트웨어(짜이스)로 분석하였다.
실시예 1-7: 전자현미경검사
침적고정(immersion-fixation)시, 마우스 귀 조직을 3% 포름알데히드(파라포름알데히드로부터 새롭게 준비) 및 1% 글루타르알데히드(진공 증류)의 혼합물을 0.1M의 카코딜레이트(cacodylate) 버퍼(pH 7.2)에서 15분 동안 37℃로 고정시켰다. 그 후, 상온에서 4시간 동안 침적고정 후 상기 조직을 얇은 조각으로 슬라이스 하였다. 고정을 중단하기 위해서, 버퍼 내 50mM NH4Cl 내의 조직 슬라이스에 1시간 동안 자유 알데히드 그룹을 함침하여 차단하였다. 그 다음에, 상기 조직 슬라이스를 증류수 내 1% 오스뮴 테트록사이드로 1시간 동안 후고정 한 후, 1% 아세트산우라닐 수용액으로 1시간 동안 일괄염색(en bloc staining)하였다. 연속된 에탄올 단계의 탈수 후, 표준 프로토콜에 따라 Epon-Araldite(Fluka)로 임베딩(embedding)하였다. 아주 얇은 80nm 조각을 아세트산우라닐 및 시트르산납으로 염색된 구리 슬롯 그리드(copper slot grid)에 준비하였고 히타치 H-7650 전자현미경(히타치, 도쿄, 일본)으로 80kV에서 관찰하였다. 전자현미경사진을 11-메가픽셀 CCD XR611-M 디지털 카메라(어드벤스드 마이크로스코피 테크닉, 우번, 메사추세츠, 미국)로 촬영하였다.
실시예 2: CTCF 유전자의 기능 확인
실시예 2-1: 통가죽 절편체 배양(Whole-skin explant culture)
각 마우스의 귀를 잘라 등쪽(dorsal) 및 배쪽(ventral) 반으로 분해하였다. 나누어진 두 피부 모두 완전 RPMI 배양 배지가 함유된 12-웰 플레이트에서 배양하였다. 3일 후, 상등액을 4개의 피부 절편체로부터 풀링(pool)하였고 유세포 분석기로 분석하였다. 표피 시트를 배양된 절편체에서 준비하였고 그 후에 홀마운트 표피 시트 염색으로 평가하였다.
실시예 2-2: In vivo 브로모데옥시우리딘 ( BrdU ) 표지 및 분석
각각의 마우스에 매일 7일 동안 1mg의 BrdU(Sigma)를 복강내 주입하였다. 마지막 주입 하루 후, 분리된 LC를 제조사의 지침서(BD Pharmingen)에 따라 BrdU 플로우 키트를 이용하여 염색하였다. CTCF가 결핍된 랑게르한스세포의 수 감소가 랑게르한스세포 자가분열 능력의 감소와 관련이 있는 것으로 나타났다(도3).
실시예 2-3: 플루오르세인 이소티오시아네이트( FITC )-유도 피부 DC 이동성 분석(Fluorescein isothiocyanate -induced cutaneous DC migration assay)
마우스의 복부를 면도하고, 아세톤/디부틸프탈레이트(1:1) 내 200㎕의 0.5% FITC(시그마) 용액을 면도된 영역에 도포하였다. 배액의 액와(draining axillary) 및 서혜(inguinal) LN을 수확하였고, 지정된 시점에서 세포를 유세포 분석기를 통하여 분석하였다. CTCF가 결핍된 랑게르한스세포의 생체 내 림프절 이동에 관하여 도 4에 나타내었다.
실시예 2-4: 화학주성 이동성 분석 방법( Chemotaxis migration assay)
전체 1x105개의 LPS-자극된 GFP+ MDLC를 완전 RPMI 배지 내 트랜스웰 윗부분에 배치하였고, 재조합 휴먼 C-C 케모카인 리간드 19(CCL19)(페프로텍)의 지시된 함량을 포함하거나 포함하지 않은 채 아래 챔버(bottom chamber)에 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이동 세포의 수를 유세기 분석기를 이용하여 1분 동안의 고정 시간에서 계수하였다. 화학주석 인덱스(chemotaxis index)를 CCL19 로 이동하는 세포의 수를 음성 대조 배지 내 이동 세포의 수로 나눈 비율로 계산하였다. 마이크로어레이를 다음과 같이 수행하였다. 표피의 랑게르한스세포를 유세포 분석기 코어에 FACSAria II 세포 분리기(BD 바이오사이언스)로 에배슨의생명연구센터(연세대학교 의료원)에서 분류하였다. 분류된 LC를 즉각적으로 500㎕ TRIzol(인비트로겐)에 수집하고, 총 RNA를 이소프로파놀 침강시험(isopropanol precipitation method)을 이용하여 추출하였다. 분리된 RNA를 WT 발현 키트(엠비온, 오스틴, 텍사스, 미국)에 의해 선형으로 증폭시켰고 WT 터미널 레이블링 키트(Terminal Labeling Kit)(엠비온)로 표지하였다. 표지된 cRNA를 아피메트릭스 마우스 유전자칩(Affymetrix Mouse GeneChip) 2.0 ST 어레이(아피메트릭스, 산타 클라라, 캘리포니아, 미국)에 혼성화시켰다. 얻은 발현 데이터를 R 소프트웨어(www.R-project.org)로 분석하였다. 품질관리를 바이오컨턱터 프로젝트(www.bioconductor.org)의 상이한 R 패키지를 이용하여 완료하였다. 마이크로어레이의 유의도 분석(Significance Analysis of Microarray)(SAM)을 이용하여 WT 및 CTCF-결핍 LC 간에 유의하고 상이하게 발현되는 유전자를 결정하였다(FDR; q<5%). 발현이 1.5배 이상 상이한 확장된 유전자군에서의 DAVID 기능적 주석 도구(http://david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 유전자 온톨로지 생물적 작용(Gene Ontology biological process)의 기능적 주석(functional annotation)을 수행하였다. 마이크로어레이 실험 결과를 도 5에 기재하였다.
실시예 2-5: 접촉 과민증 및 합텐 -특이적 T-세포 반응
2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB: 시그마)를 사용하여 CHS를 유도시켰다. 0일에 아세톤/올리브유(4:1) 내 25㎕의 0.5%(wt/vol) DNFB를 마우스의 면도된 복부에 도포시키므로 감작시키고, 5일에 오른쪽 귀에 20㎕의 0.3%(wt/vol) DNFB로 대항량(challenge)하였다. 대항량 전 및 후, 두께측정기를 사용하여 귀 두께를 측정하였다. 마우스를 25㎕의 0.5% DNFB로 감작시키고, 5일 후에 액와 및 사혜의 LN을 수확하였다. 전체 LN세포를 2.5μM 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE; 몰레큘러 프로브스)에 15분 동안 37℃에서 염색시키고 세척한 후 웰 당 1×106개의 LN 세포를 96-웰 플레이트에서 DNFB와 동일한 항원성인 수용성인 2,4-디니트로벤젠 술폰산(DNBS; Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA) 50㎍/㎖를 포함하거나 포함하지 않는 완전 RPMI 배지로 3일 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 GolgiStop(BD 바이오사이언스)의 존재 하에서 50ng/㎖의 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate)(PMA; 시그마) 및 500ng/㎖의 이오노마이신(시그마)으로 5시간 동안 37℃에서 재자극(re-stimulated)시킨 후, IFN-γ의 세포 내 염색을 수행하였다. IFN-γ의 분비를 사이토매트릭 비드 분석(Cytometric Bead Array)(BD 바이오사이언스)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 검사하였다. 접촉 피부염 항원 도포 후 림프절에서 CD8 항원 양성 T 세포 및 인터페론 감마를 도 6(b) 및 도 6(c)에 비교하였다.
실시예 2-6: 파두유 -유도 자극성 피부염
아세톤 내 20㎕의 1%(vol/vol) 파두유(시그마)를 귀 피부에 도포하고, 처리 전 및 후에 지정된 시점에서 귀 두께를 측정하였다. 접촉피부염 유도에 의한 귀두께의 비교를 도 6(a)에 나타내었다.
실시예 2-7: 에피큐테니우스 과민증( Epicutaneous sensitization) 및 T 세포 양자전이 (adoptive-transfer)
마우스의 등을 전기면도기로 면도하고 피부 1x1cm 크기를 셀로판 테이프(니찌방, 도쿄, 일본)로 네 번 이상 테이프 스트리핑(tape-stripping)하였다. 50㎕의 생리식염수 내 100㎍의 오브말부민(OVA)(시그마)을 핀 챔버(Finn Chamber)(스마트프랙티스)를 이용하여 도포하였다. T 세포 양자전이 시, 비드-접합 안티-CD4 mAb 및 자성 비드 분리(밀테니 비오텍)를 이용하여 CD4+ T 세포를 CD45.1+OT-II 마우스에서 분리하였고 10μM의 CFSE로 표지하였다. 4x106개의 표지 세포를 레트로-오비탈 경로를 통해 수용 마우스로 양자 전이시켰고, 24시간 후, 마우스를 OVA로 바르는 약품으로 인하여(epicutaneously) 감작시켰다. OVA 감작 72시간 이후, 상완(brachial) SDLN을 수확하였고 세포 현탁액을 CFSE의 감소(diminution)를 유세포 분석기로 분석하였다.
실시예 2-8: 바르는 약품으로 인해 감작된 피부( epicutaneously sensitized skin)의 임상적 및 조직학적 평가방법
염증 피부(inflamed skin)의 임상 점수를 다음과 같이 평가하였다. 즉, 피부 병변에서의 홍반, 부종, 궤식(erosion), 스케일링(scaling), 및 소양증(pruritus)의 증상에 대하여 각각 임상 범주에서 심각도의 총합을 계산하였고 점수로는, 0(없음), 1(가벼운), 2(적당한) 및 3(극심한)으로 점수화하였다. 피부 조직을 10%의 포르말린에 고정하였고 조직학적 평가방법을 위해 파라핀에 임베디드(embedded)하였다. 피부 조각(6μm 두께)을 준비하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 바르는 약품으로 인해 감작된 피부가 습진성 피부염(eczematous dermatitis)의 특징을 보일 때, 표피의 해면화(epidermal spongiosis)로 점수를 추가하였다. 사용된 점수 등급은 다음과 같다: 0, 반응 없음; 1, 최소 반응; 2, 경증 반응; 3, 적당한 반응; and 4, 현저한 반응.
실시예 2-9: OVA-특이적 항체에 대한 효소면역측정법(ELISA)
OVA-특이적 IgE/IgG1/IgG2a 레벨을 마우스 IgE/IgG1/IgG2a ELISA 키트(이바이오사이언스)를 이용하여 간접 ELISA으로 측정하였다. ELISA 플레이트를 OVA(500ng/웰)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 블로킹(blocking) 후, 각각의 웰에 50㎕의 20x 희석된 세럼을 첨가하였고 2시간 동안 배양하였다. 비오틴-접합 안티-마우스 IgE Abs 및 스트랩타아비딘-접합 호스라디시 페록시다아제(이바이오사이언스)를 이용하여 IgE 레벨을 결정하였다. 또한, 알칼라인 포스파타제-접합 안티-마우스 IgG1/IgG2a Abs(산타 크루즈 바이오테크놀러지, 산타 크루즈, 캘리포니아, 미국)를 OVA-항체 착물(complex)을 검출하는데 사용하였다. 450nm에서 광학밀도를 측정하였다.
실시예 2-10: 정량적 중합효소 연쇄반응
정제된 세포에서 전체 RNA를 하이브리드-R 토탈 RNA 키트(진올바이오테크놀러지, 서울, 한국)로 분리하였다. cDNA를 PrimeScript™ RT 마스터 믹스(다카라 바이오, 시가, 일본)를 사용하여 합성하였다. 정량적 중학효소 연쇄반응을 ABI StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국)으로 SYBR 그린(다카라 바이오)을 사용한 다양한 PCR 사이클 동안 이중가닥 DNA의 합성을 모니터링 함으로서 수행하였다. 각 표본에서, 복제 테스트 반응(duplicate test reaction)으로 목적 유전자의 발현을 분석하였고, 결과를 Gapdh mRNA로 정규화하였다.
실시예 2--11: 웨스턴 블랏
전체 지라세포(splenocyte)를 마그네틱 비드-접합 안티-CD11c mAb(밀테닉 비오텍)로 표지하고, 파라마그네틱 컬럼(밀테닉 비오텍)에서 2번의 양성선택에 의해 DC를 정제하였다. 세포를 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% 노닐 페녹시폴리에톡시에탄올, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 5% 글리세롤 및 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)(시그마)이 함유된 100㎕의 셀 라이시스 버퍼에서 용해하였다. 전체 세포 용해물(lysate)을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 분해하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인에 전이시켰다. 5% 탈지우유로 블로킹 시킨 후, 상기 멤브레인을 항체로 배양하고, 호스라디시 페록시다아제-접합 이차 항체로 배양하였다. 목적 단백질을 SuperSignal 웨스트 피코 화학발광 기판(West Pico Chemiluminescent Substrate)(피어스, 락포드, 일리노이, 미국)을 이용하여 시각화하였다.
통계
데이터를 독립표본 스튜던트 양방 t검정(unpaired Student’s two-tailed t-test)으로 분석하였고, Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., 샌 디애고, 캘리포니아, 미국)를 사용하였다. P값이 0.05 미만이면, 통계학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.

Claims (17)

  1. 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF의 DNA 또는 mRNA의 발현 수준을 확인하는 단계;
    정상 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF의 DNA 또는 mRNA의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    목적하는 피검체와 정상 피검체의 CTCF mRNA의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고, 목적하는 피검체의 CTCF mRNA의 발현 수준이 정상 피검체보다 낮을 경우, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 CTCF DNA 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료 내 인터페론 감마의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 부종, 과민증(anaphylazis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  6. 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;
    정상 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 CTCF 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    목적하는 피검체와 정상 피검체의 CTCF의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하고, 목적하는 피검체의 CTCF의 발현 수준이 정상 피검체보다 낮을 경우, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 CTCF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 알러지 질환과 관련이 있음을 알 수 있는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 면역형광법, 유세포 분석 방법, 마이크로어레이 또는 이동성분석 방법을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은 목적하는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료 내 인터페론 감마의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 부종, 과민증, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인 것을 특징으로 하는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  12. CTCF DNA 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하거나; CTCF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 알러지 질환의 진단 키트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 부종, 과민증, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤층 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지 중 하나인 것을 특징으로 하는 알러지 질환의 진단 키트.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 알러지 질환은 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염인 것을 특징으로 하는 알러지 질환의 진단 키트.
  15. CTCF의 유전자가 결실된 인간을 제외한 포유류 또는 세포인 알러지 질환 모델용 형질전환체.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유류는 마우스 또는 랫트인 것을 특징으로 하는 알러지 질환 모델용 형질전환체.
  17. 제 15항의 형질전환체에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    상기 유전자 또는 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계 및
    상기 CTCF 유전자 또는 단백질의 발현량 또는 활성이 상향조절(up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 알러지 질환의 예방 또는 치료용 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 알러지 질환의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법.
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