KR20160115522A - Producing method of rheumatoid arthritis animal model, AbartaRA, via transplanting rheumatoid arthritis synovium - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 류마티스 관절염 동물모델의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활막 조직을 이식하고, 이후 말초혈액 단핵구 및 활막 세포를 추가적으로 주입하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 동물모델의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing an animal model of rheumatoid arthritis, and more particularly, to a method for producing an animal model of rheumatoid arthritis, which comprises transplanting synovial tissue isolated from a patient suffering from rheumatoid arthritis and then additionally injecting peripheral blood mononuclear cells and synovial cells And a manufacturing method thereof.
자가면역성 류마티스 관절염은 비정상적인 면역 반응에 따른 염증 전달 물질의 증가로 인한 활막의 염증과 신생혈관 형성, 관절 연골 및 뼈 손상을 특징으로 하는 질환으로, 그 유병률은 현재 약 1% 정도로 알려져 있다. 이는 유전적인 요인, 감염 등 환경적 요인에 의해 면역 체계의 이상을 초래하는 면역 매개성 질환으로 발병원인이 아직 밝혀지지 않은 질환이다.
Autoimmune rheumatoid arthritis is a disease characterized by synovial inflammation and neovascularization, arthritic cartilage and bone damage due to an increase in inflammatory mediators due to abnormal immune responses. Its prevalence is now known to be about 1%. It is an immune - mediated disease that causes an immune system abnormality due to environmental factors such as genetic factors and infection.
이러한 자가면역성 류마티스 관절염의 병인을 밝히기 위해 많은 연구자들이 일련의 관절파괴 과정에 관여하는 세포에 대한 실험을 수행하고 있다. 그러나 관절은 단순히 뼈와 뼈 사이의 빈 공간이 아니고 활막, 연골, 뼈, 혈액 등의 여러 부분이 유기적으로 연결되어 구성되며, 사이토카인과 같은 여러 가지 면역 반응을 유도할 수 있는 분자들과 세포들 간의 상호작용을 통해 서로 미묘하게 영향을 미치는 하나의 복잡한 장기와 같은 구조물이기 때문에, 관절염의 치료를 위해서는 고려해야 할 변수가 많고 따라서 그 치료가 어렵다. 이렇듯 자가면역성 류마티스 관절염 내의 병인 염증반응은 복합 병리 질환이므로 다각적인 측면에서의 치료적 접근이 절실히 요구된다.
To elucidate the pathogenesis of such autoimmune rheumatoid arthritis, many researchers are conducting experiments on cells involved in a series of joint destruction processes. However, joints are not merely empty spaces between bones and bones but are composed of organically connected parts such as synovial membrane, cartilage, bone, and blood, and molecules and cells capable of inducing various immune responses such as cytokines Because of the complexity of organ structures that subtly affect each other through interactions, there are many variables to consider for treatment of arthritis and are therefore difficult to treat. The inflammatory reaction, a disease in autoimmune rheumatoid arthritis, is a complex pathologic disease, so a therapeutic approach in multiple aspects is urgently required.
또한 관절의 장애뿐만 아니라 골다공증, 전신 장기침범 (폐, 피부, 눈)을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상적인 생활을 불가능하게 하여 사회적으로 환자를 고립시키는 역할을 하기도 한다. 부적절한 면역작용의 산물인 이 질환은 장기간 진단과 치료가 어려운 난치병이어서 심각한 사회적, 경제적 문제를 일으키는 요인이 되고 있다. 이러한 상황에서 복잡한 병리 현상에 기반하여 근본적인 병인을 조절할 수 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
In addition to joint disorders, osteoporosis, systemic organ involvement (lungs, skin, eyes), accompanied by a tremendous loss of quality of life, making normal life impossible and socially responsible for the isolation of patients. This disease, which is a product of inappropriate immune function, is an incurable disease that is difficult to diagnose and treat for a long time, which causes serious social and economic problems. In this situation, studies should be conducted to control the underlying pathogenesis based on complex pathology.
한편, 류마티스 관절염의 치료제 개발을 위한 동물모델로서 지금까지 대부분의 연구기관에서는 마우스 모델을 일반적으로 사용하여 왔다. 이러한 류마티스 관절염의 실험모델은 2형 콜라겐을 마우스에 접종하여 관절염을 유도시킴으로써 관절염 연구에 사용되고 있는데, 이 모델은 임상적으로나 조직학적으로 사람의 류마티스 관절염과 매우 유사한 것으로 알려져 있다(Stuart et al,1982). 따라서 2형 콜라겐으로 유도된 관절염 모델은 만성 관절염의 병인과 기전을 이해하고, 여러 가지 새로운 치료 약물개발을 위해 마우스에 직접 처리하여 반응을 관찰하고 치료효과를 연구하는데 널리 사용되고 있다.
On the other hand, as an animal model for developing a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, mouse models have been generally used in most research institutions to date. This experimental model of rheumatoid arthritis is known to be clinically and histologically similar to human rheumatoid arthritis (Stuart et al, 1982), which is used in arthritis studies by inducing arthritis by inoculating mice with type 2 collagen ). Therefore, the arthritis model induced by type 2 collagen is widely used to understand the pathogenesis and mechanism of chronic arthritis and to study the effects of treatment with mice directly on the development of various new therapeutic drugs.
또한, 류마티스 관절염의 자가면역 모델로 2형 콜라겐으로 관절염을 유도한 마우스를 이용하여 많은 연구들이 수행되고 있는데, 주로 사용되는 마우스 종으로는 DBA/1(H-2q)가 있다. DBA/1(H-2q)는 관절염을 유도할 수 있는 마우스 종으로서, 몇몇 사이토카인 유전자 변형 마우스를 제외하고는 유일하게 관절염을 유발시킬 수 있는 종으로 알려져 있다.
In addition, a number of studies have been carried out using mice that induced arthritis with type 2 collagen as an autoimmune model of rheumatoid arthritis. DBA / 1 (H-2q) is the most commonly used mouse species. DBA / 1 (H-2q) is a mouse species capable of inducing arthritis, and is known to be the only species capable of inducing arthritis, except for some cytokine transgenic mice.
그러나 류마티스 관절염과 관련 있는 주요 사이토카인 유전자 변형 마우스들의 대부분은 그 백그라운드(background)를 c57BL6 종으로 하고 있으나, 종래의 연구에 따르면 c57BL6 마우스에 2형 콜라겐으로 관절염을 유도시 관절염 평가 지수는 3점을 넘지 못했고 발병율(incidence)도 평균적으로 50% 정도에 그쳐 그 성공률이 미미하다. 따라서 관절염을 연구하기 위한 새로운 동물모델이 필요한 실정이다.
However, most of the major cytokine transgenic mice associated with rheumatoid arthritis have a background of c57BL6, but according to conventional studies, arthritis evaluation index is 3 points when inducing arthritis with c57BL6 mouse type 2 collagen And incidence is 50% on average, and the success rate is insignificant. Therefore, a new animal model is needed to study arthritis.
한편, 통상적으로, 맞춤의학(tailored medicine)이란 맞춤의료(order-made medicine) 또는 환자 맞춤형 의학(personalized medicine)이라고도 하며, 환자 개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 치료법을 결정하여 치료하는 방법을 의미한다. 유전정보를 기반으로 한 맞춤의학을 구현하기 위하여는, 유전체 진단용 바이오마커, 다양한 유전체 검사 방법, 상기 바이오마커를 이용하여 도출되거나 또는 상기 검사방법으로 얻어진 유전체 정보를 분석/통합할 수 있는 의료정보학적 분석법, 상기 분석법에 의해 분석된 결과를 적용할 수 있는 표적화 치료기술 등을 상호보완적으로 선행개발하여야 한다. 즉, 환자에게 적합한 치료법을 선별할 수 있는 기술 개발이 필요할 뿐만 아니라, 상기 선별된 치료법을 검증할 수 있는 기술이 개발되어야만 한다.
On the other hand, tailored medicine is also referred to as custom-made medicine or personalized medicine, and the individual's constitution or environment is individually examined to determine suitable treatment methods It means how to treat. In order to implement customized medicine based on genetic information, a biomarker for dielectrics diagnosis, a variety of genome inspection methods, a medical information system which can be obtained by using the biomarker or analyzed / integrated with genome information obtained by the above- Analysis method, targeting treatment technique to apply the result analyzed by the above analysis method, and the like should be complementarily developed. That is, it is not only necessary to develop a technique for selecting a suitable treatment method for a patient, but also a technique for verifying the selected treatment method must be developed.
맞춤의학을 실현하기 위한 방법으로 환자에게 적합한 약물을 스크리닝하거나 치료방법을 선별하는 방법을 개발할 필요가 있는데, 특히 상기와 같은 류마티스 관절염 등의 면역질환에 있어서는 개인마다 각 약물에 대해 나타내는 면역반응이 상이하여, 개인에 생체 특성을 재현하는 in vivo 환경을 조성할 수 있는 전임상 연구를 위한 동물모델의 개발이 필요하다.
In order to realize customized medicine, it is necessary to develop a method of screening a drug suitable for a patient or selecting a therapeutic method. Especially, in immunological diseases such as rheumatoid arthritis as described above, , It is necessary to develop an animal model for preclinical studies that can create an in vivo environment that reproduces biological characteristics in an individual.
이에 본 발명자들은 개인별 생체 특성에 따라 치료 효과는 뛰어나고 부작용이 적은 류마티스 관절염의 치료제를 스크리닝하거나 치료방법을 개발하기 위한 동물모델에 대해 연구를 진행하던 중, 환자의 활막조직을 이식하고, 이후 환자의 말초혈액 단핵구(PBMC)와 활막세포를 추가적으로 주입함으로써 효과적인 류마티스 관절염 동물모델을 제조할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the inventors of the present invention conducted research on an animal model for screening a therapeutic agent for rheumatoid arthritis which has excellent therapeutic effects according to individual biological characteristics, and develops a therapeutic method, while transplanting synovial tissue of a patient, The present invention has been completed to produce an effective rheumatoid arthritis animal model by additionally injecting peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and synovial cells.
본 발명의 목적은 류마티스 관절염에 효과적인 새로운 치료제 및 치료방법을 개발하기 위한 신규한 동물모델 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a novel animal model and a method for preparing the same for developing new therapeutic agents and therapeutic methods effective for rheumatoid arthritis.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활막 조직을 마우스에 이식하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for preparing an animal model of rheumatoid arthritis, comprising the step of transplanting a synovial tissue isolated from a rheumatoid arthritis patient into a mouse.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활막 조직은 그 부피가 0.1㎤ 내지 2㎤일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the volume of the synovial tissue may be 0.1 cm 3 to 2 cm 3.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활막 조직은 마트리겔(Matrigel)로 코팅하여 이식하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the synovial tissue may be coated with Matrigel and implanted.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활막 조직은 마우스 둔부의 상부 2~4 cm 지점을 1~2cm 개복하고, 상기 개복한 지점으로부터 2~4 cm 상부에 확보된 피하 공간에 이식하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the synovial tissue may be one to two centimeters of the upper 2 to 4 centimeter of the hind paw and transplanted to the subcutaneous space secured at 2 to 4 centimeters above the epiphysis .
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활막 조직을 마우스에 이식한 뒤, 상기 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초혈액 단핵구 및 활막 세포를 추가로 주입하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the method may further include injecting peripheral blood mononuclear cells and synovial cells isolated from the patient with rheumatoid arthritis after transplanting synovial tissue isolated from a patient suffering from rheumatoid arthritis into a mouse.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말초혈액 단핵구는 마우스의 꼬리정맥에 주사하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the peripheral blood mononuclear cells may be injected into the tail vein of a mouse.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활막 세포는 마우스의 복강에 주입하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the synovial cells may be injected into the abdominal cavity of a mouse.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말초혈액 단핵구 및 활막세포는 각각의 세포수의 비가 5:3~5:4의 비가 되도록 주입하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the peripheral blood mononuclear cells and synovial cells may be injected such that the ratio of the number of cells to the number of cells is 5: 3 to 5: 4.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말초혈액 단핵구는 0.5~5×106개의 세포를 주입하고, 활막세포는 4~20×105개의 세포를 주입하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the peripheral blood mononuclear cells may be injected with 0.5 to 5 × 10 6 cells, and the synovial cells with 4 to 20 × 10 5 cells.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말초혈액 단핵구 및 활막세포의 주입은 상기 활막 조직을 마우스에 이식하고 6~8일 경과 후 주입하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the peripheral blood mononuclear cells and synovial cells may be injected after transplantation of the synovial tissue into the mouse and lapse of 6 to 8 days.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 류마티스 관절염 마우스 동물모델을 제공한다.
The present invention also provides an animal model of rheumatoid arthritis mouse produced by the above method.
본 발명은 환자의 활막 조직을 이식한 동물모델로, 본 발명에 따른 동물모델은 제조하면 환자 맞춤형 동물모델의 제공이 가능하고, 한편, 환자의 활막 조직 이식 후 말초혈액 단핵구 및 활막 세포를 추가적으로 주입함으로써 류마티스 관절염 동물모델을 더욱 효과적으로 제조할 수 있어 류마티스 관절염 치료제 및 치료방법 개발에 크게 기여할 것으로 기대된다.
The present invention relates to an animal model transplanted with a synovial tissue of a patient, and it is possible to provide a patient-customized animal model when the animal model according to the present invention is manufactured, and further, peripheral blood mononuclear cells and synovial cells after the synovial tissue transplantation Thereby making it possible to more effectively manufacture an animal model of rheumatoid arthritis, thereby greatly contributing to the development of rheumatoid arthritis treatment and treatment methods.
도 1은 인간 류마티스 관절염 전임상을 위한 동물모델 제작 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 활막 조직 이식을 위한 마우스 절개면을 도식화한 것이다.
도 3은 마우스에 이식한 인간 류마티스 관절염 환자의 활막조직이 생착되고 혈관이 형성됨을 확인한 결과이다.
도 4는 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직과 PBMC, 활막 세포를 이식한 마우스에서 인간 혈관 세포를 면역형광염색법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 5는 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직을 단독 이식하거나, 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직 이식 후 PBMC와 활막 세포를 순차적으로 주입한 경우 마우스 혈액에서 인간 T 세포 발현 양상을 비교한 유세포 분석 결과이다.
도 6은 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직을 단독 이식하거나, 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직 이식 후 PBMC와 활막 세포를 순차적으로 주입한 경우 마우스 비장에서 인간 T 세포 발현 양상을 비교한 유세포 분석 결과이다.
도 7은 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직과 PBMC, 활막 세포를 이식한 마우스에서 인간 CD4 양성 T 세포를 면역형광염색법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 8은 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직과 PBMC, 활막 세포를 이식한 마우스에서 활막조직을 면역조직화학법으로 염색하여 마우스 대식세포를 관찰한 결과이다. Figure 1 is a schematic representation of an animal modeling process for pre-clinical human rheumatoid arthritis.
Figure 2 is a schematic of a mouse incision surface for synovial tissue transplantation.
FIG. 3 is a result of confirming that synovial tissues of human rheumatoid arthritis patients transplanted into mice are engrafted and blood vessels are formed.
FIG. 4 shows the results of immunoblotting staining of human vascular cells in synovial tissues of human rheumatoid arthritis patients and mice transplanted with PBMC and synovial cells.
FIG. 5 shows results of flow cytometry comparing the expression patterns of human T cells in mouse blood when the synovial tissues of human rheumatoid arthritis patients were transplanted alone, or PBMC and synovial cells were sequentially injected after synovial tissue transplantation in human rheumatoid arthritis patients.
FIG. 6 shows results of flow cytometry comparing the expression patterns of human T cells in mouse spleen when the synovial tissues of human rheumatoid arthritis patients were transplanted alone, or PBMC and synovial cells were sequentially injected after synovial tissue transplantation in human rheumatoid arthritis patients.
FIG. 7 shows the results of immunofluorescence staining of human CD4-positive T cells in mice transplanted with synovial tissue and PBMC and synovial cells in human rheumatoid arthritis patients.
FIG. 8 shows the result of immunohistochemical staining of synovial tissues in mice transplanted with synovial tissue, PBMC, and synovial cells of human rheumatoid arthritis patients and observing mouse macrophages.
본 발명은 류마티스 관절염을 연구하기 위한 동물모델을 연구하던 중, 마우스에 활막 조직을 이식하고 이후 말초혈액 단핵구 및 활막 세포를 추가로 주입하는 경우 환자 맞춤형 류마티스 관절염 동물모델이 효과적으로 제작될 수 있다는 사실을 최초로 확인함으로써 완성된 것이다.
The present invention is based on the finding that, in studying animal models for studying rheumatoid arthritis, a patient-tailored rheumatoid arthritis animal model can be effectively produced when synovial tissue is transplanted into mice and further infused with peripheral blood mononuclear cells and synovial cells It was completed by the first confirmation.
따라서, 본 발명은 신규한 류마티스 관절염 마우스 동물모델 및 이의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있으며, 본 발명에서 제공하는 상기 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법은, 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활막 조직을 마우스에 이식하는 단계를 포함할 수 있다.
Therefore, the present invention provides a novel animal model of rheumatoid arthritis mouse and a method for producing the same, and the method of the present invention for producing an animal model of rheumatoid arthritis mouse, To the patient.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 활막 조직은 류마티스 관절염 환자로부터 분리되는데, 분리된 활막 조직은 PBS로 세척하고 10% DMEM 배지로 옮긴 후 지방 조직을 떼어내고 0.1㎤ 내지 2㎤의 부피가 되도록, 바람직하게는 0.5㎤ 부피가 되도록 잘라 90% FBS와 10% DMSO 혼합 용액에 담가 동물모델에 이식하기 전까지 -70℃에서 보관할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the synovial tissue is isolated from a patient suffering from rheumatoid arthritis. The separated synovial tissue is washed with PBS, transferred to a 10% DMEM medium, and then the adipose tissue is removed and the volume is adjusted to 0.1 cm & Preferably 0.5 cm 3, and stored at -70 ° C until immersed in a 90% FBS and 10% DMSO mixed solution and transferred to an animal model.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 -70℃에 보관된 활막 조직을 동물모델에 이식하기 위하여 37℃ 온탕 배양기에 담가 녹이고, 녹은 조직을 10% DMEM에 배지에 넣어 세척한 후, 인간 Vascular endothelial growth factor(VEGF)가 함유된 마트리겔(matrigel)로 감싼 후, 상온에 두어 상기 조직을 마트리겔로 코팅할 수 있다. 이 경우, 마트리겔은 분리된 조직 당 100~1000㎕를 이용하여 코팅하고, 바람직하게는 500㎕를 이용하여 코팅하며, 이 때 함유하는 인간 VEGF는0.1~500ng/ml일 수 있고, 바람직하게는 10ng/ml 일 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the synovial tissue stored at -70 ° C was immersed in a 37 ° C warm bath incubator for transplantation into an animal model, and the melted tissue was washed in 10% DMEM medium, and then the human vascular endothelial growth (VEGF), and then the tissue is coated with matrigel at room temperature. In this case, the matrigel is coated using 100 to 1000 쨉 l per separated tissue, preferably 500 쨉 l, and the human VEGF contained therein may be 0.1 to 500 ng / ml, 10 ng / ml.
본 발명의 일실시예에서는 NSG 마우스를 이소플루레인(isofluane)을 이용하여 호흡마취시키며, 마우스의 오른쪽 둔부 위쪽을 제모하고, 제모된 마우스의 오른쪽 둔부 2~4cm 지점, 바람직하게는 3cm 지점을 가위로 1~2cm, 바람직하게는 1.5cm 절개하고, 절개된 부분으로 가위를 넣어 개복부위 위로 2~4cm, 바람직하게 3cm 위를 가위로 벌려가며 피하공간을 확보할 수 있다. 이 경우 피막이 찢어지지 않도록 유의하여야 한다. 이후 절개한 부분 끝을 포셉으로 잡고, 준비된 조직을 멸균된 약수저로 떠서 상기 피하공간에 넣어주고, 나일론 봉합사를 이용하여 절개한 부위를 10회 내외 봉합할 수 있다. 이후 봉합 부위를 포비돈과 같은 소독액을 이용하여 소독하고, 적외선 등을 쬐어 마우스가 의식을 찾도록 한 후, 마우스를 케이지에 넣고 적정량의 사료를 넣어 준 후 사육실에서 사육할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, an NSG mouse is anesthetized with isofluane, epilating the upper right part of the mouse, scissoring the 2 to 4 cm, preferably 3 cm, And a scissor is inserted into the incised portion to open a space of 2 to 4 cm, preferably 3 cm above the incised portion, with scissors to secure the subcutaneous space. In this case, care should be taken not to tear the film. The end of the incision can then be held with a forceps, the prepared tissue can be plunged into a sterile syringe and placed in the subcutaneous space, and the incision site can be sutured 10 times using a nylon suture. Then, the suture area is disinfected with a disinfectant such as povidone, and the infant is irradiated to look for the consciousness of the mouse. Then, the mouse can be put into a cage and fed with an appropriate amount of feed, and then raised in the breeding room.
본 발명의 일실시예에서는 환자의 혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구 및 활막 세포를 추가로 주입할 수 있는데, 상기 말초혈액 단핵구 및 활막세포는 각각의 세포수의 비가 5:3~5:4의 비가 되도록 주입할 수 있고, 상기 말초혈액 단핵구는 0.5~5×106개의 세포를 주입하고, 활막세포는 4~20×105개의 세포를 주입할 수 있으며, 바람직하게는 상기 말초혈액 단핵구는 1×106개의 세포를 주입하고, 활막세포는 8×105개의 세포를 주입할 수 있다. 이 경우, 상기 말초혈액 단핵구는 꼬리 정맥에 주사하고, 활막세포는 복강 주입하는 것이 바람직하다. 상기 말초혈액 단핵구 및 활막세포의 주입은 상기 활막 조직을 마우스에 이식하고 6~8일 경과 후 주입하는 것이 바람직하다.
In one embodiment of the present invention, peripheral blood mononuclear cells and synovial cells isolated from blood of a patient can be further injected. The peripheral blood mononuclear cells and synovial cells are cultured in a ratio of 5: 3 to 5: 4 The peripheral blood mononuclear cells may be injected with 0.5 to 5 × 10 6 cells and the synovial cells with 4 to 20 × 10 5 cells. Preferably, the peripheral blood mononuclear cells are injected with 1 × 10 6 cells can be injected, and synovial cells can be injected 8 8 5 cells. In this case, it is preferable that the peripheral blood mononuclear cells are injected into the tail vein and the synovial cells are injected into the abdominal cavity. The injection of peripheral blood mononuclear cells and synovial cells is preferably performed after 6 to 8 days after transplanting the synovial tissues into a mouse.
상기와 같이 조직 이식된 류마티스 관절염 동물모델은 조직 이식 후 주 3회 행동 및 상태를 관찰하였으며, 조직 이식 후 30일이 경과한 후 안락사시켜 활막조직의 생착 및 혈관형성을 관찰하였고, 마우스 동물모델의 혈액 및 비장에서 인간 혈관세포 및 인간 T 세포의 발현을 확인하였고, 이식된 인간의 활막 조직에서 마우스 대식세포의 침윤을 확인함으로써 성공적인 환자 맞춤형 류마티스 관절염 동물모델이 제작된 것을 알 수 있었다.
The animal models of rheumatoid arthritis as described above were observed three times a week and three times a week after the transplantation. After 30 days from the transplantation, euthyroidism was observed to observe the engraftment and vascularization of the synovial tissues. The expression of human vascular cells and human T cells in blood and spleen was confirmed and a successful patient-tailored rheumatoid arthritis animal model was produced by confirming the invasion of mouse macrophages in transplanted human synovial tissue.
한편, 본 발명자들은 환자의 활막 조직을 단독으로 이식하는 것에 비하여 활막 조직 이식 후 환자의 말초혈액 단핵구와 활막세포를 추가로 주입하는 경우 환자 맞춤형 류마티스 관절염 동물모델이 더 성공적으로 제작되었음을 알 수 있었다.
On the other hand, the present inventors have found that a patient-tailored rheumatoid arthritis animal model has been produced more successfully when the patient's peripheral blood mononuclear cells and synovial cells are further injected after synovial tissue transplantation, compared with transplanting the synovial tissue alone.
본 발명의 용어 "환자 맞춤형 동물모델"이란, "아바타 마우스"라고도 하며, 환자 유래 세포 또는 조직을 면역 결핍 동물에 정위적으로 이종이식하여 제작된 환자 맞춤형 동물모델(xenograft animal model)을 의미하는데, 환자에서 해당 질환과 형태학적 환경이 동일 또는 유사하고, 유전학적 환경이 동일 또는 유사하며, 상기 해당 질환의 마커 단백질의 발현특성이 동일하여, 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 그대로 반영한 조건을 제공할 수 있다.
The term " patient-customized animal model ", also referred to herein as an "avatar mouse ", refers to a xenograft animal model produced by stereotactic xenotransplantation of a patient-derived cell or tissue into an immunodeficient animal, A condition in which the disease and the morphological environment of the patient are the same or similar, the genetic environment is the same or similar, the expression characteristics of the marker protein of the disease are the same, and the genetic, physiological and environmental characteristics Can be provided.
본 발명의 용어 "면역 결핍 동물"이란, 암이 발병될 수 있도록 면역시스템을 구성하는 일부 구성요소를 유전자 수준에서 인위적으로 손상시켜서 정상적인 면역시스템이 구현되지 않도록 조작하여 제조된 동물모델을 의미한다. 상기 면역결핍 동물로는 신경계가 형성된 동물을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 면역결핍 포유동물을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 면역결핍되도록 조작된 마우스, 랫트, 햄스터, 기니어피그 등의 면역결핍 설치류가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 누드 마우스, NSG(NOD scid gamma) 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/SCID Il2rg-/-) 마우스 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
The term "immunodeficient animal " of the present invention means an animal model prepared by artificially damaging some components constituting the immune system at the genetic level so that the cancer can be developed, so that a normal immune system is not implemented. The immunodeficient animal may be an animal in which a nervous system has been formed. Preferably, an immunodeficient mammal may be used. More preferably, the immunodeficient animal is an immunodeficient rodent such as a mouse, rat, hamster, guinea pig, (NOD scid gamma) mouse, a non-obese diabetic mouse, a severe combined immunodeficiency (SCID) mouse, a NOD-SCID mouse, a NOG (NOD / SCID Il2rg- / -) mouse, and the like, but it is not particularly limited thereto.
본 발명의 용어 "이종이식"이란, 종이 다른 동물의 간, 심장, 신장 등 기관, 장기, 조직, 세포 등을 이식하는 방법을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 이종이식은 환자로부터 분리된 활막 조직 또는 활막 세포를 면역 결핍 동물에 이식하는 방법으로 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
The term " xenotransplantation " of the present invention means a method of transplanting organs, organs, tissues, cells, etc., such as liver, heart, and kidney of another animal. For the purpose of the present invention, the xenotransplantation may be understood as a method of transplanting synovial tissue or synovial cells isolated from a patient into an immunodeficient animal, but is not particularly limited thereto.
본 발명의 용어 "맞춤의학(tailored medicine)"이란 맞춤의료(order-made medicine) 또는 환자 맞춤형 의학(personalized medicine)이라고도 하며, 환자개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 치료법을 결정하는 방법 또는 치료하는 방법을 의미한다.
The term "tailored medicine" of the present invention is also referred to as an order-made medicine or a personalized medicine, and the constitution or the environment of a patient is individually examined to determine a suitable treatment method Or a method of treatment.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
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실시예Example
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류마티스Rheumatism
관절염 arthritis
전임상Preclinical
동물모델 제작 방법 How to make an animal model
1. 활막 조직 준비1. Synovial tissue preparation
류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활막조직을 PBS로 세척한 후, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지로 옮기고, 활막 조직에서 지방을 제거한다. 지방이 제거된 활막 조직을 가로 및 세로를 각 1cm 크기로 자른 후, 자른 조직을 90% FBS와 10% DMSO 용액에 담근 후 -70℃에 보관한다.The synovial tissue isolated from patients with rheumatoid arthritis is washed with PBS, transferred to DMEM medium containing 10% FBS, and fat is removed from the synovial tissue. After cutting fat-removed synovial tissue to 1 cm in length and width, the cut tissue is immersed in 90% FBS and 10% DMSO solution, and stored at -70 ° C.
2. 조직 이식 준비2. Prepare a tissue implant
-70℃에 보관한 활막 조직을 37℃ 온탕 배양기(water bath)에 담가 녹이고, 이를 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 넣고 세척한다. 마트리겔(Matrigel) 500㎕에 인간 VEGF를 10ng/ml이 되도록 첨가하고, 상기 준비된 활막 조직을 상기 마트리겔로 감싼 후, 마트리겔을 굳힌다.
The synovial tissues stored at -70 ° C are immersed in a 37 ° C hot water bath and dissolved in DMEM medium containing 10% FBS. Human VEGF was added to Matrigel (500 쨉 l) at a concentration of 10 ng / ml, the prepared synovial tissue was wrapped with the matrigel, and Matrigel was hardened.
3. 활막 조직 이식3. Synovial tissue transplantation
NSG 마우스를 이소플루레인(isoflurane)을 이용하여 호흡마취시키고, 마우스의 오른쪽 둔부의 상부를 제모한다. 제모한 마우스 오른쪽 둔부에 소독용 알코올을 뿌린 뒤 상부 2~3cm 지점을 가위로 1~1.5cm 가량 자르고, 자른 부분으로 가위를 넣어 개복부위 상부 3cm 위에 가위를 벌려가며 피막이 찢어지지 않게 하며 피하 공간을 확보한다(도 1 참조). 절개한 부분 끝을 포셉으로 잡고, 상기 마트리겔로 감싸 굳힌 조직을 멸균된 약수저로 떠서 상기 확보된 피하 공간에 넣어주고, 나일론 봉합사를 이용하여 절개한 부위를 약 10회 봉합한다. 봉합 후 포비돈으로 수술 부위를 소독하고, 적외선 등을 쬐어 마우스가 의식을 찾는 것을 확인한 후 사육실에서 사육한다.
An NSG mouse is anesthetized with respiration using isoflurane, and the upper part of the right hindquarter of the mouse is epilated. After spraying the sterilized alcohol on the right buttocks of the depilated mouse, cut the upper 2 ~ 3cm points by 1 ~ 1.5cm with the scissors and put the scissors in the cut part to open the scissors on the upper 3cm of the upper part to prevent tearing of the capsule. (See Fig. 1). The end of the incised portion is held with a forceps, and the tissue wrapped with the matrigel is drained with a sterilized spoon and put in the secured subcutaneous space, and the incision site is sutured about 10 times using a nylon suture. After the suture, sterilize the surgical site with povidone, apply infrared light, etc., and check that the mouse finds consciousness and then raise it in the breeding room.
4. 4. 활막세포Synovial cell 주입 Injection
활막 조직 이식 후 7일이 지난 뒤, 류마티스 관절염 환자의 혈액에서 분리한 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell) 1×106 개 세포를 100㎕의 PBS에 부유시켜 마우스의 꼬리 정맥에 주입하고, 동시에 류마티스 관절염 환자의 활막세포 8×105 개를 100㎕의 PBS에 부유시켜 마우스에 복강 투여한다.
Seven days after synovial tissue transplantation, 1 × 10 6 PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) cells isolated from the blood of patients with rheumatoid arthritis were suspended in 100 μl of PBS, injected into the tail vein of the mouse, and rheumatoid arthritis 8 × 10 5 synovial cells of the patient are suspended in 100 μl of PBS and administered intraperitoneally to mice.
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실험예Experimental Example
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1. One. 류마티스Rheumatism 관절염 동물모델에서의 활막 조직의 생착 및 혈관형성 확인 Identification of synovial tissue engraftment and angiogenesis in arthritic animal models
상기 실시예를 통해 제작된 NSG 마우스는 활막 조직을 이식한 후 30일 뒤 안락사시키고, 이식부위를 절개하여 활막 조직의 생착 및 혈관 형성 여부를 확인해 보았다. 그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 이식한 활막 조직이 마우스에 제대로 생착되었으며, 새로운 혈관이 형성되어 있음을 육안으로 확인할 수 있었다.
NSG mice prepared by the above example were euthanized 30 days after transplantation of synovial tissue, and the graft site was excised to confirm the engraftment and vascularization of synovial tissue. As a result, as shown in FIG. 3, the transplanted synovial tissue was properly adhered to the mouse, and it was visually confirmed that a new blood vessel was formed.
2. 2. 류마티스Rheumatism 관절염 동물모델에서의 인간 Human in Arthritis Animal Model 혈관세포Vascular cell 확인 Confirm
인간 류마티스 관절염 동물모델이 제대로 제작되었는지 확인해 보고자, 상기 실시예를 통해 제작된 마우스를 활막 조직 이식 후 30일이 지난 뒤 안락사시키고, 면역형광염색법을 통하여 인간 혈관세포 생성을 관찰하였다.In order to confirm whether the animal model of human rheumatoid arthritis was properly manufactured, the mouse produced through the above example was euthanized 30 days after the synovial tissue transplantation, and human vascular cell formation was observed through immunofluorescence staining.
이를 위하여 이식 부위의 활막조직을 OCT compound에 넣고 만든 냉동 절편을 7μm 두께로 잘라 젤라틴으로 코팅된 슬라이드 글라스에 올려붙인 뒤, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)가 포함된 완충액으로 실온에서 고정하고, 인산완충액으로 세척한 다음 인산완충액으로 10배 희석된 정상염소의 혈청이 활막 조직의 비특이적 항체결합을 저해하도록 실온에서 1시간동안 처리하였다. 다음으로, 인간 혈관세포임을 나타내는 Anti-human CD31 (PECAM-1) Phycoerythrin (PE) 항체를 사용하여 4℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 실온에서 인산완충액으로 15분간 세척하여 잔여 항체를 제거한 다음 세포의 핵 형광염색제인 DAPI가 포함된 봉입제로 봉입하고 잠시 말린 뒤 공초점 현미경으로 관찰하였다. To this end, the frozen section of the synovial tissue at the graft site was placed in OCT compound, and the slice was cut into a 7 μm-thick sliced gelatin-coated slide glass, fixed at room temperature with 4% paraformaldehyde buffer, After washing with buffer, serum of normal chlorine diluted 10-fold with phosphate buffer was treated at room temperature for 1 hour to inhibit nonspecific antibody binding of synovial tissue. Next, the cells were reacted at 4 ° C for 15 hours with anti-human CD31 (PECAM-1) Phycoerythrin (PE) antibody, which indicates that the cells were human vascular cells. Then, the cells were washed with phosphate buffer solution for 15 minutes at room temperature to remove residual antibody And then incubated for a short period of time with a confocal microscope.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 활막 조직과 PBMC, 활막 세포를 이식한 마우스에서 인간 혈관세포가 확인되어, 인간의 활막 조직이 이식된 마우스 모델이 제대로 만들어졌음을 알 수 있었다.
As a result, as shown in Fig. 4, human vascular cells were confirmed in the mice transplanted with the synovial tissues of the present invention and the PBMCs and synovial cells, and it was found that a mouse model in which human synovial tissues were transplanted was well formed.
3. 3. 유세포Flow cell 분석을 통한 Through analysis 류마티스Rheumatism 관절염 동물 모델 확인 Arthritis animal model identification
본 발명자들은 초기 실험에서 NSG 마우스에 인간 류마티스 관절염 환자의 활막 조직을 이식함으로써 류마티스 관절염 동물모델을 제작할 수 있음을 확인하였으며, 류마티스 관절염 동물모델의 제작 효과를 증진시키기 위하여 다양한 실험을 진행하던 중, 류마티스 관절염 환자의 PBMC와 활막 세포를 주입하는 경우 류마티스 관절염 동물 모델의 제작 효과가 증진되는 것을 확인할 수 있었다.The present inventors confirmed that an animal model of rheumatoid arthritis can be produced by transplanting synovial tissue of human rheumatoid arthritis patients to NSG mice in the initial experiment and various experiments were carried out in order to improve the production effect of rheumatoid arthritis animal model. Injection of PBMC and synovial cells from patients with arthritis improved the efficacy of the animal models of rheumatoid arthritis.
이는 유세포분석을 통하여 확인할 수 있었는데, 상기 실시예에서 류마티스 관절염 환자의 활막조직만 이식한 마우스와 활막조직 이식 후 7일이 지난 뒤 류마티스 관절염 환자의 PBMC와 활막세포를 추가로 주입한 마우스로부터 혈액 또는 비장을 채취한 뒤, 인간 T 세포 표지자인 인간 CD4, CD45, CD8에 대한 항체와 30분 동안 반응시키고, 이후 인산완충용액으로 세척한 다음, 유세포분석기를 이용하여 유세포 분석하였다. It was confirmed by flow cytometry analysis that in the above example, the synovial tissues of the rheumatoid arthritis patients were transplanted into the blood or blood from the mice injected with synovial cells and PBMCs of
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 혈액과 비장에서 모두 인간 T 세포 표지자인 CD4, CD45, CD8 양성 세포가 활막조직만 이식한 마우스에 비해 활막조직 이식 후 7일이 지난 뒤 PBMC와 활막세포를 추가로 주입한 마우스에서 훨씬 많이 발현되어 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 5 and FIG. 6, the CD4, CD45, and CD8-positive cells, which are both human T cell markers in the blood and spleen, were transferred to
4. 4. 면역형광염색법을Immunofluorescent staining 통한 through 류마티스Rheumatism 관절염 동물 모델 확인 Arthritis animal model identification
한편, 본 발명자들은 상기 실시예를 통해 제작된 마우스를 활막 조직 이식 후 30일이 지난 뒤 안락사시키고, 상기 실험예 2에 기재된 방법과 같이 면역형광염색법을 통하여 CD4 양성 T 세포의 생성을 관찰하였다.Meanwhile, the inventors of the present invention euthanized after 30 days from synovial tissue transplantation and observed the production of CD4-positive T cells by immunofluorescence staining as described in Experimental Example 2.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 활막 조직과 PBMC, 활막 세포를 이식한 마우스에서 CD4 양성 T 세포가 확인되어, 인간의 활막 조직이 이식된 환자 맞춤형 동물 모델이 제대로 만들어졌음을 알 수 있었다.
As a result, as shown in Fig. 7, it was confirmed that CD4-positive T cells were confirmed in the mouse transplanted with the synovial tissues of the present invention and PBMC and synovial cells, and the patient-customized animal model transplanted with human synovial tissue I could.
5. 5. 면역조직화학법을Immunohistochemistry 이용한 Used 류마티스Rheumatism 관절염 동물 모델 확인 Arthritis animal model identification
본 발명자들은 상기 실시예를 통해 제작된 마우스를 활막 조직 이식 후 30일이 지난 뒤 안락사시키고, 활막 조직 절편을 취하여 면역조직화학법을 이용하여 마우스 대식세포를 관찰하였다.The inventors of the present invention euthanized after 30 days of synovial tissue transplantation and observed the mouse macrophages using immunohistochemistry.
즉, 안락사 시킨 마우스 동물 모델의 활막 조직을 10% 중성 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포맷하여 7 ㎛ 절편으로 세절하고, 세절한 절편을 H&E 염색법으로 염색하고 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. Namely, synovial tissues of euthanized mouse animal models were fixed in 10% neutral formalin, and then formatted in paraffin and cut into 7 ㎛ sections. Three sections were stained with H & E staining and observed with an optical microscope.
그 결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이, 이식한 인간 류마티스 관절염 활막 조직에 마우스의 혈관이 형성되었으며, 그 혈관을 통하여 마우스의 세포가 이식한 활막 조직으로 침윤되어 있어, 인간의 활막 조직이 이식된 환자 맞춤형 동물 모델이 제대로 만들어졌음을 알 수 있었다.
As a result, as shown in Fig. 8, blood vessels of mice were formed in the transplanted human rheumatoid arthritis synovial tissue, and the mouse cells were infiltrated into the synovial tissue transplanted through the blood vessels, We could see that the customized animal model was built properly.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
Claims (11)
상기 활막 조직은 0.1㎤ 내지 2㎤의 부피인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the synovial tissue has a volume of 0.1 cm 3 to 2 cm 3.
상기 활막 조직은 마트리겔(Matrigel)로 코팅하여 이식하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the synovial tissue is coated with Matrigel and transplanted. ≪ RTI ID = 0.0 > 21. < / RTI >
상기 활막 조직은 마우스 둔부의 상부 2~4 cm 지점을 1~2cm 개복하고, 상기 개복한 지점으로부터 2~4 cm 상부에 확보된 피하 공간에 이식하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the synovial tissue is transplanted into the subcutaneous space secured at an upper portion of 2 to 4 cm from the open point and 2 to 4 cm from the upper 2 to 4 cm of the mouse buttock. .
상기 방법은 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활막 조직을 마우스에 이식한 뒤, 상기 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 말초혈액 단핵구 및 활막 세포를 추가로 주입하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein said method comprises transplanting synovial tissue isolated from a patient suffering from rheumatoid arthritis into a mouse and then injecting further peripheral blood mononuclear cells and synovial cells separated from said rheumatoid arthritis patient.
상기 말초혈액 단핵구는 마우스의 꼬리정맥에 주사하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 동물모델의 제조방법.6. The method of claim 5,
Wherein said peripheral blood mononuclear cells are injected into the tail vein of a mouse.
상기 활막 세포는 마우스의 복강에 주입하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 동물모델의 제조방법.6. The method of claim 5,
Wherein the synovial cells are injected into the abdominal cavity of a mouse.
상기 말초혈액 단핵구 및 활막세포는 각각의 세포수의 비가 5:3~5:4의 비가 되도록 주입하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 동물모델의 제조방법.6. The method of claim 5,
Wherein said peripheral blood mononuclear cells and synovial cells are injected at a ratio of 5: 3 to 5: 4 for each cell number.
상기 말초혈액 단핵구는 0.5~5×106개의 세포를 주입하고, 활막세포는 4~20×105개의 세포를 주입하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 동물모델의 제조방법.6. The method of claim 5,
The peripheral blood mononuclear cells is 0.5 ~ 5 × 10 6 of the implanted cells, synovial cells is 4 ~ 20 × 10 5 cells of the method for producing an animal model of rheumatoid arthritis which comprises injecting.
상기 말초혈액 단핵구 및 활막세포의 주입은 상기 활막 조직을 마우스에 이식하고 6~8일 경과 후 주입하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.6. The method of claim 5,
Wherein the injected peripheral blood mononuclear cells and synovial cells are injected after 6 to 8 days after transplanting the synovial tissue into a mouse.
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