KR20160110643A - Sensor for detecting botulinum neurotoxin and a detection method using the FRET - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 독성 펩타이드 물질인 보툴리늄 독소(botulinum neurotoxin)을 검출하기 위한 신규 센서 및 이를 이용한 보툴리늄 독소 검출 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel sensor for detecting a toxic peptide substance, botulinum neurotoxin, and a method for detecting botulinum toxin using the same.
보툴리늄 독소는 현재까지 알려진 독성 물질 중 가장 강력한 독성을 가진 물질이다. 이는 일반적으로 상한 음식이나, 부패한 동 식물에서 발견되는데, 사람에 대한 취사량은 매우 극소량이다.(호흡기로의 흡입: ~0.9 ㎍, 구강으로의 흡입: ~70 ㎍) 독성이 강력하며, 대량생산이 용이한 점으로 인해, 이는 바이오테러에 사용 가능한 생화학 무기로 활용이 가능한 물질이다. 독소는 기작하는 거동에 따라 A~G 까지 7가지 종류의 타입이 있다. 이 중 본 발명에 타겟으로 사용되는 독소는 E 타입 독소이다. 구조적으로 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어져있는데, 신경 전달 리셉터와 결합하는 heavy chain과 신경 전달 단백질을 가수분해를 통해 절단하는 light chain으로 구성된다. Botulinum toxin is the most toxic substance known to date. It is usually found in high-end food or in decayed copper plants, and the amount of food consumed by humans is very small (inhalation to the respiratory tract: ~ 0.9 ㎍, inhalation to the oral cavity: ~ 70 ㎍) Because of its ease, it is a biochemical weapon that can be used for bioterrorism. There are seven types of toxins, A to G, depending on the mechanism. Among them, the toxin used as a target of the present invention is an E type toxin. Structurally, it consists of two polypeptide chains, a heavy chain that binds to the neurotransmitter receptor and a light chain that cleaves the neurotransmitter protein through hydrolysis.
그러나 현재까지 인정되고 있는 검출법은 동물실험을 통한 검출법으로 높은 선택성과, 고 검출능을 가지는 장점이 있으나, 측정 시간이 수 일이 걸리며, 실험에 사용하는 동물 관리를 위한 설비가 갖춰야 하기 때문에 많은 비용이 요구된다. 그리하여 실제 현장에서 활용할 센서로 개발하기 위해서는 짧은 검출 시간과 높은 검출능 그리고 저렴한 센싱 방법이 필요하다.
However, the currently accepted detection method has advantages of high selectivity and high detection ability by animal experiment, but it takes a few days to measure and it is necessary to provide equipment for animal care used in experiments, . Therefore, in order to develop a sensor to be used in a real field, a short detection time, a high detection capability, and an inexpensive sensing method are required.
이에, 본 발명자들은 보툴리늄 독소를 검출하는 방법을 연구하는 중, 맹독 물질인 보툴리늄 독소를 안전하게 실험하기 위해서 세포막의 리셉터와 결합하는 H 사슬(heavy chain)을 제거하여 약독화를 시켰고, 대신 보툴리늄 독소의 proteolysis를 통한 촉매 특성을 나타내는 L 사슬(light chain)을 검출 물질로 하는 센서가 기존의 센서보다 선택성 및 안전성이 뛰어난 것을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.
Therefore, in order to test botulinum toxin, which is a poisonous substance, during the study of a method for detecting botulinum toxin, the present inventors attenuated the heavy chain that binds to the receptor of the cell membrane, It has been confirmed that a sensor using a light chain as a detection substance exhibiting excellent catalytic properties through proteolysis is superior in selectivity and safety to those of existing sensors, and thus the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드의 N 말단에는 산화 그래핀이 결합되고 상기 펩타이드의 C 말단에는 염료가 결합된 보툴리늄 독소 검출용 센서를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a sensor for detecting botulinum toxin, wherein the grafted oxide is bound to the N-terminal of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the dye is bonded to the C-terminal of the peptide.
본 발명의 다른 목적은 보툴리늄 독소 검출용 센서의 제조방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a method for producing a sensor for detecting botulinum toxin.
본 발명의 또 다른 목적은 보툴리늄 독소를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a method for detecting a botulinum toxin.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드의 N 말단에는 산화 그래핀이 결합되고 상기 펩타이드의 C 말단에는 염료가 결합된 보툴리늄 독소 검출용 센서를 제공한다.
In order to solve the above object, the present invention provides a sensor for detecting botulinum toxin, wherein graphene oxide is bound to the N-terminal of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a dye is bound to the C-terminal of the peptide.
상기 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드와 산화 그래핀은 공유 결합하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the graphene oxide are preferably covalently bonded, but are not limited thereto.
상기 산화 그래핀은 상기 도너(donor)로부터 전달된 에너지를 흡수하여 소강시키는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The oxidized graphene is preferably absorbed and absorbed by the donor, but is not limited thereto.
상기 서열번호 1로 이루어진 펩타이드는 서열번호 2로 이루어진 아미노산을 갖는 스페이서(spacer)와 서열번호 3으로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The peptide consisting of SEQ ID NO: 1 is preferably composed of a spacer having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
상기 스페이서(spacer)는 산화 그래핀과 결합하며, 상기 스페이서는 나선형 구조를 가지는 아미노산 서열로 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 보툴리늄 독소와 원활하게 결합하는 구조를 제공한다.The spacer is bonded to the graphene oxide, and the spacer is an amino acid sequence having a spiral structure. The spacer provides a structure in which the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 binds smoothly with the botulinum toxin.
상기 보툴리늄 독소는 서열번호 3으로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드의 15번째 알지닌(R)과 16번째 이소루신(I)는 보툴리늄 독소와 결합하여 가수분해 반응을 일으켜 단백질 분해 반응이 일어난다. 상기 단백질 분해 반응을 통하여 형광공명에너지 전이가 일어난다.
In the botulinum toxin, the 15th amino acid (R) and the 16th isoleucine (I) of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 bind to the botulinum toxin and cause a hydrolysis reaction to cause a proteolytic reaction. Fluorescence resonance energy transfer occurs through the proteolytic reaction.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 산화 그래핀을 합성하기 위한 그래파이트의 산화하는 단계:1) oxidizing the graphite to synthesize the oxidized graphene;
2) 산화 그래핀의 카르복실화하는 단계;2) carboxylation of the oxidized graphene;
3) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride, EDC) 결합 반응을 통해서 산화 그래핀에 형성된 카르복실 그룹을 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드 N 말단에 결합하는 단계; 및 3) The carboxyl group formed on the oxidized graphene through the coupling reaction of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Lt; RTI ID = 0.0 > 1 < / RTI >; And
4) 염료를 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드 C 말단에 결합하고 미 반응물을 제거하기 위하여 세척하는 단계를 포함하는 보툴리늄 독소 검출용 센서의 제조방법을 제공한다. 4) coupling the dye to the C-terminal of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and washing to remove unreacted material.
상기 단계 3) 및 단계 4)의 결합은 공유 결합인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
The combination of step 3) and step 4) is preferably a covalent bond, but is not limited thereto.
아울러, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조한 보툴리늄 독소 검출용 센서를 보툴리늄 독소를 포함하는 시료와 반응시켜 형광 신호 변화 측정하는 단계를 포함하는 보툴리늄 독소를 검출하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for detecting a botulinum toxin, comprising the step of measuring a change in fluorescence signal by reacting a sensor for detecting a botulinum toxin produced by the above method with a sample containing a botulinum toxin.
본 발명의 합성 및 측정은 1) 다양한 작용기를 가지는 산화 그래핀을 합성하기 위한 그래파이트의 산화단계, 2) 좀 더 많은 작용기를 형성하기 위한 산화 그래핀의 카르복실레이션 단계; 3) EDC coupling 반응을 통해서 산화 그래핀에 형성된 카르복실 그룹과 펩타이드의 결합 단계; 4) 최종 반응 후 미 반응물 제거를 위한 워싱 단계; 5) 보툴리늄 독소가 존재하는 반응물에서 센서의 형광 신호 변화 측정 단계;를 포함한다.
The synthesis and measurement of the present invention can be carried out by the following steps: 1) oxidation of graphite to synthesize oxidized graphene having various functional groups; 2) carboxylation of oxidized graphene to form more functional groups; 3) a step of binding a carboxyl group and a peptide formed on the graphene oxide through an EDC coupling reaction; 4) a washing step for removing unreacted material after the final reaction; 5) measuring the fluorescence signal change of the sensor in the reactant in which the botulinum toxin is present.
본 발명은 기존 센서의 단점을 개선하기 위한 것으로서, 산화 그래핀을 기반으로 형광공명에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfe, FRET) 센서를 새롭게 합성하고, 타겟 물질인 보톨리늄 독소를 기존의 센서들에 비하여 신속하고 빠른 측정장치를 제공한다.The present invention is to improve the disadvantages of conventional sensors. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) sensors based on oxidized graphene are newly synthesized, and the target substance, botulinum toxin, And provides a fast measurement device.
또한, 대량 생산이 용이하고 제조공정이 간단하면서도 고효율, 고정밀의 보툴리늄 감지가 가능한 측정센서를 개시한다.Also disclosed is a measurement sensor capable of high-efficiency, high-precision botulinum sensing, which is easy to mass-produce and simple to manufacture.
본 발명의 일 특징에 따른 보툴리늄 독소 검출용 센서는, 특정 에너지 파장에서 여기하여 에너지를 전달하는 도너(donor) 부분 (5-FAM); 도너(donor)로부터 전달된 에너지를 흡수하여 소광시키는 억셉터(acceptor) 부분(산화 그래핀); 타겟물질인 보툴리늄 독소와 결합을 통해 단백질 분해 반응을 하며, 동시에 도너(donor)와 억셉터(acceptor)를 결합하는 서열번호 1의 아미노산을 갖는 펩타이드 부분;를 포함한다. A sensor for detecting botulinum toxin according to one aspect of the present invention comprises: a donor portion (5-FAM) that transmits energy at a specific energy wavelength; An acceptor portion (graphene oxide) that absorbs and extinguishes the energy transferred from the donor; A peptide portion having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 which undergoes a proteolytic reaction through binding with a botulinum toxin as a target substance and at the same time binds a donor and an acceptor.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 독소 센서는, 비표면적을 높고, 소광 효율이 높은 나노구조체 역할을 하는 산화 그래핀 시트를 이용하여 높은 센싱 감도가 증가합니다. 여기서 사용하는 산화그래핀 시트는 그래파이트 파우더를 modified hummers method를 통해서 많은 작용기를 가지는 산화 그래핀을 합성한다. FRET 센서에서 소광 역할을 하는 것은 산화 그래핀 시트에 한정하지 않고, 그래핀, 탄소나노튜브, 탄소나노튜브 필름 등 다양한 탄소 구조체를 활용할 수 있다. The toxin sensor according to another aspect of the present invention has a high sensing sensitivity by using an oxidized graphene sheet serving as a nano structure having a high specific surface area and a high extinction efficiency. The oxidized graphene sheets used here synthesize graphene oxide graphene with many functional groups through the modified hummers method. It is possible to utilize various carbon structures such as graphene, carbon nanotube, and carbon nanotube film, as well as oxidized graphene sheet, which serves as a quenching light for the FRET sensor.
본 발명의 또 다른 특징에는 보툴리늄 독소와 기작하는 펩타이드를 산화 그래핀에 공유결합으로 수식하여 제작한다. 이를 통하여 다른 외부 자극에 대해서 보다 높은 선택성, 안정성을 가지는 센서의 제작이 가능하다.
Another feature of the present invention is that the botulinum toxin and the acting peptide are modified by covalent bonding to the oxidized graphene. This makes it possible to manufacture sensors with higher selectivity and stability for other external stimuli.
기존의 산화 그래핀에 물리적으로 흡착시킨 FRET 센서는 외부의 자극에 큰 노이즈 신호가 나타나지만, 본 발명의 보툴리늄 독소 검출용 센서의 경우 공유결합을 통해서 합성한 센서로서 신속하고 정확하게 보툴리늄 독소의 감지가 가능하므로 보툴리늄 독소를 검출하는데 유용하게 이용할 수 있다.
The FRET sensor physically adsorbed to the existing oxidized graphene shows a large noise signal to the external stimulus. However, in the case of the sensor for detecting the botulinum toxin of the present invention, the sensor synthesized through the covalent bond can detect the botulinum toxin rapidly and accurately. Therefore, it can be usefully used for detecting botulinum toxin.
도 1은 보툴리늄 독소(Botulinum toxin type E)를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에서 타겟 물질과 상호작용을 통해 단백질 분해를 일으키는 펩타이드 사슬의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 산화 그래핀이 형성되는 과정을 보여주는 개념도이다.
도 4는 본 발명의 산화 그래핀의 작용기가 카르복실화되는 과정을 보여주는 개념도이다.
도 5는 산화 그래핀과 독소에 기작하는 펩타이드 사슬을 EDC coupling 반응을 통한 합성 개략도이다.
도 6은 도 2와 도 3에서 설명한 방법으로 만든 산화 그래핀과 카르복실화 된 산화 그래핀의 모습을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명 센서가 보툴리늄 독소와 기작하여 타겟 물질인 보툴리늄 독소의 유무에 따른 단백질 분해를 통한 센서의 형광 신호를 나타내는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 8은 본 발명의 보툴리늄 독소 검출용 센서의 각각의 독소 농도에서 반응시간에 따른 검출 신호를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 보툴리늄 독소 농도에 따른 형광 신호 크기 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 독소 농도에 따른 형광 신호 크기 차이값을 plot한 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing a botulinum toxin type E. FIG.
FIG. 2 is a diagram showing an amino acid sequence of a peptide chain causing proteolysis through interaction with a target substance in the present invention. FIG.
3 is a conceptual view showing a process of forming the graphene oxide of the present invention.
FIG. 4 is a conceptual diagram showing a process in which the functional group of the oxidized graphene of the present invention is carboxylated.
FIG. 5 is a schematic diagram of synthesis through the EDC coupling reaction of oxidative graphene and peptide chains acting on toxins.
6 is a view showing the state of the oxidized graphene and the carboxylated graphene oxide formed by the method described in FIG. 2 and FIG.
FIG. 7 is a schematic view showing a process in which the sensor of the present invention displays a fluorescence signal of a sensor through a protein decomposition with or without a botulinum toxin as a target material, which is mechanically activated with a botulinum toxin.
FIG. 8 is a graph showing detection signals according to reaction times at the respective toxin concentrations of the sensor for detecting botulinum toxin of the present invention. FIG.
FIG. 9 is a graph showing a change in fluorescence signal magnitude according to the concentration of botulinum toxin according to an embodiment of the present invention.
10 is a graph plotting fluorescence signal magnitude differences according to toxin concentration according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서는 독소와의 기작을 통한 단백질 분해 반응을 통한 FRET 시스템의 형광신호 변화를 감지하는 원리이다.
In the present invention, it is a principle to detect a change in fluorescence signal of the FRET system through a proteolytic reaction with a toxin.
<< 실시예Example 1> 1> 펩타이드Peptides 리간드Ligand 구조체 Structure
본 발명의 펩타이드 리간드 구조체는 크게 두 가지 구조를 가지고 있다. 먼저 독소와 결합하여 단백질 분해가 되는 서열번호 3으로 이루어진 아미노산을 갖는 리간드(DMGNEIDTQNRQIDRIMEKAD, Asp-Asp)와 산화 그래핀과 결합하는 스페이서(spacer) ([G][L][Aib][A][A][G][G])로 이루어져 있다. 리간드 부분은 세포의 신경전달 기작을 하는 SNARE 단백질 중 하나인 SNAP-25 펩타이드에서 가져온 것으로 21mer의 아미노산으로 이루어져 있다. 보툴리늄 독소는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열 중에서 RI 위치를 가수분해를 일으킨다. 그리고 가수 분해 위치 이외의 아미노산은 독소와 결합에 관여하는 펩타이드에 해당한다. 나머지 spacer 펩타이드 부분은 산화 그래핀과 결합하는 역할을 하는데, 본 발명의 spacer 펩타이드는 잘 휘지 않는 나선 구조를 가지는 아미노산 서열로 펩타이드 리간드와 독소가 원활하게 결합하는 구조를 제공한다. 본 발명에서 검출물질로 선택한 독소는 보툴리늄 독소이다. 이 펩타이드 사슬의 N-말단기는 산화 그래핀의 카르복실 그룹과 결합하는 부분이며, C-말단기는 형광 염료가 결합되어 FRET 시스템의 donor 부분과 연결된다. 이러한 구조로 이루어진 보툴리늄 독소와 기작하여 단백질 분해를 일으키는 펩타이드 리간드 구조체를 도 2에 나타내었다.
The peptide ligand structure of the present invention has two structures. First, a ligand (DMGNEIDTQNRQID RI MEKAD, Asp-Asp) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 which is bound to a toxin by proteolysis and a spacer ([G] [L] [Aib] [A ] [A] [G] [G]). The ligand portion is derived from the SNAP-25 peptide, one of the SNARE proteins that undergo neurotransmission in the cell, and consists of 21-mer amino acids. The botulinum toxin causes hydrolysis of the RI position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. And amino acids other than the hydrolysis site correspond to peptides involved in binding to toxins. The remaining spacer peptide moiety plays a role of binding to the graphene oxide. The spacer peptide of the present invention has a structure in which the peptide ligand and the toxin are smoothly bonded to each other with an amino acid sequence having a sparse helical structure. The toxin selected as the detection substance in the present invention is a botulinum toxin. The N-terminal group of this peptide chain is a part of binding to the carboxyl group of the oxidized graphene, and the C-terminal group is connected to the donor part of the FRET system by binding the fluorescent dye. A tubulin toxin having such a structure and a peptide ligand structure that causes a mechanism of proteolysis are shown in Fig.
<< 실시예Example 2> 2> 펩타이드Peptides 리간드Ligand 구조체와 결합하는 산화 Oxidation in association with the structure 그래핀을Graffin 합성 synthesis
상기 실시예 1의 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드에 산화 그래핀을 합성하였다. Oxidized graphene was synthesized on the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in Example 1 above.
구체적으로, 그래파이트 파우더를 H2SO4에 분산시킨 뒤 KMnO4를 첨가하여 산화반응을 진행시킨다. 산화된 그래핀은 표면에 하이드록실, 에폭시 그룹이, 가장자리에 카르복실 그룹이 형성된다(도 3). 그런 다음, 산화 그래핀의 하이드록실, 에폭시 그룹을 카르복실화 반응을 통해서 펩타이드와 결합을 용이하게 더 많은 카르복실 그룹을 형성시킨다(도 4). 상기 반응에 의해 생성된 산화 그래핀 및 카르복실화된 산화그래핀을 도 5에 나타내었다. 카르복실화 반응이 완료된 산화 그래핀은 도 2에서 나타낸 서열번호 2로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드 사슬과 함께 분산시킨 다음, EDC coupling을 통해서 아마이드 결합을 형성시킨다(도 5). 반응이 모두 진행된 후, 미 반응물은 충분한 워싱 과정을 통해 제거하여 산화 그래핀 기반 FRET 센서를 수거하였고, 이것이 보툴리늄 독소 검출용 센서이다.
Specifically, after the graphite powder is dispersed in H 2 SO 4 , KMnO 4 is added to proceed the oxidation reaction. Oxidized graphene forms hydroxyl, epoxy groups on the surface and carboxyl groups on the edges (Fig. 3). Then hydroxyl and epoxy groups of the graphene oxide are easily carboxylated to form more carboxyl groups through carboxylation reaction with the peptide (Figure 4). The oxidized graphene and the carboxylated graphene oxide produced by the above reaction are shown in Fig. The carboxylated graphene graphene is dispersed together with the peptide chain having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 shown in FIG. 2, followed by EDC coupling to form an amide bond (FIG. 5). After all the reaction was completed, the unreacted material was removed through a sufficient washing process to collect the oxidized graphene-based FRET sensor, which is a sensor for detecting botulinum toxin.
<< 실시예Example 3> 3> 보툴리늄Botulinum 독소 검출용 센서의 독소 검출 분석 Toxin detection analysis of toxin detection sensor
상기 실시예 2에서 제작한 보툴리늄 독소 검출용 센서의 독소 검출에 걸리는 시간을 분석하기 위하여 보툴리늄 독소(LcE)의 단백질 분해 반응을 통한 염료의 형광 신호 변화를 측정하였고 그 개념도를 도 7에 나타내었다.In order to analyze the time taken for the toxin detection of the botulinum toxin detection sensor prepared in Example 2, the fluorescence signal change of the dye through the proteolytic reaction of the botulinum toxin (LcE) was measured, and a conceptual diagram thereof is shown in FIG.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 보툴리늄 독소 검출용 센서에 보툴리늄 독소를 0 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml 및 500 ng/ml의 농도별로 첨가하여 형광 신호 강도를 측정하였다. Specifically, the fluorescent signal intensity was measured by adding botulinum toxin to the botulinum toxin detection sensor prepared in Example 2 at concentrations of 0 ng / ml, 5 ng / ml, 50 ng / ml and 500 ng / ml.
그 결과, 보툴리늄 독소가 없을 시(0 ng/ml)에는 형광염료와 산화그래핀 사이에서 형광공명에너지전이를 통해서 소광 상태를 유지하여 형광신호가 매우 낮은 상태로 나타났다. 보툴리늄 독소를 넣었을 때, 보툴리늄 독소와 펩타이드 간의 콤플렉스가 형성되고, 점차 형광 신호가 회복됨을 보이며, 1시간 이내에 단백질 분해반응이 진행되어 산화 그래핀에 결합되어 있는 형광 염료가 떨어져 나가는 정도를 측정하였다. As a result, in the absence of botulinum toxin (0 ng / ml) fluorescence resonance energy transition was maintained between the fluorescent dye and the oxidized graphene, resulting in a very low fluorescence signal. When the botulinum toxin was added, a complex between the botulinum toxin and the peptide was formed, and gradually the fluorescence signal was recovered. Within 1 hour, the proteolytic reaction proceeded to measure the degree of separation of the fluorescent dye bound to the oxidized graphene.
그 결과, 형광신호는 초기 30분 이내에 급격히 증가하는 것을 확인하였고, 이후 60분 이후는 더 이상 증가하지 않는 것으로 보아 보툴리늄 독소에 의한 단백질 분해 반응이 종결된 것으로 보인다. 또한 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml의 각 농도에서 동일한 거동을 확인하였으며, 이는 높은 재현성을 가지는 센서 시스템임을 확인하였다(도 8).
As a result, it was confirmed that the fluorescence signal rapidly increased within the first 30 minutes, and the protein decomposition reaction by the botulinum toxin appears to be terminated after 60 minutes since then. In addition, the same behavior was confirmed at each concentration of 5 ng / ml, 50 ng / ml, and 500 ng / ml, confirming that this is a highly reproducible sensor system (FIG.
<< 실시예Example 4> 다양한 농도의 4> 보툴리늄Botulinum 독소에 대한 센서의 형광 신호 분석 Fluorescence signal analysis of sensors for toxins
다양한 농도의 보툴리늄 독소에 대한 보툴리늄 독소 검출용 센서의 형광 신호 강도를 분석하였다.Fluorescent signal intensities of botulinum toxin detection sensors for various concentrations of botulinum toxin were analyzed.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 보툴리늄 독소 검출용 센서에 보툴리늄 독소를 0 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml의 농도별로 첨가하여 형광 신호 강도를 측정하였다. 보툴리늄 독소를 검출 용액에 농도별로 넣은 뒤, 한 시간동안 37℃에서 인큐베이션 한 후, 형광 회복을 측정하였다.Specifically, the botulinum toxin detection sensor prepared in Example 2 was infused at a concentration of 0 ng / ml, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ng / ml, 250 ng / ml, and 500 ng / ml, respectively. The botulinum toxin was added to the detection solution in concentrations, followed by incubation for one hour at 37 ° C and fluorescence recovery was measured.
그 결과, 보툴리늄 독소를 0 ng/ml의 농도에서부터 농도가 증가함에 따라 센서의 520nm 파장대의 형광 세기가 증가하는 것으로 보아 보톨리늄 독소의 단백질 분해거동에 따른 소광된 형광이 회복됨을 확인하였다. 일반적으로 형광공명에너지전이가 일어나는 거리는 donor와 acceptor 간의 거리 r에 대하여 r-6에 비례한다. 하지만 산화 그래핀의 경우 r-4에 비례하여 거리가 10nm에서도 충분히 센서로 응용 가능한 것을 확인하였다(도 9).
As a result, it was confirmed that fluorescence intensities of the 520 nm wavelength band of the sensor were increased as the concentration of botulinum toxin increased from the concentration of 0 ng / ml. Thus, it was confirmed that the extinction fluorescence was restored according to the protein decomposition behavior of the botulinum toxin. In general, the distance at which the fluorescence resonance energy transfer takes place is proportional to r -6 relative to the distance r between donor and acceptor. However, in the case of the graphene oxide, it was confirmed that the sensor can be sufficiently applied even at a distance of 10 nm in proportion to r -4 (FIG. 9).
<< 실시예Example 5> 다양한 농도의 5> Various concentrations of 보툴리늄Botulinum 독소에 대한 센서의 형광 세기 분석 Analysis of fluorescence intensity of sensor for toxin
상기 실시예 2에서 제작한 보툴리늄 독소 검출용 센서의 보툴리늄 독소의 농도에 따른 형광 세기 변화량을 분석하였다. The amount of fluorescent intensity change according to the concentration of botulinum toxin in the sensor for detecting botulinum toxin prepared in Example 2 was analyzed.
구체적으로, 보툴리늄 독소를 넣지 않은 기준 샘플 대비 독소에 의한 형광 회복량의 변화량을 위 실험과 같은 방법으로 측정하였다. 보툴리늄 독소를 검출용액에 농도별로 넣은 뒤, 한 시간 동안 37℃에서 인큐베이션 한 후, 형광 회복을 측정하였다.Specifically, the amount of change in fluorescence recovery by toxin versus a reference sample without botulinum toxin was measured in the same manner as in the above experiment. The botulinum toxin was added to the detection solution in concentrations, followed by incubation for one hour at 37 ° C and fluorescence recovery was measured.
그 결과, 독소 농도가 증가함에 따라 점차 형광 세기 변화량도 증가하다가 50 ng/ml 이상 되면 변화량이 줄어들었다. 그리고 독소 농도 0~16 ng/ml 구간에서는 독소 농도에 대해 변화량이 선형적 증가를 보이고, ΔF = 32.48*[LcE] (ng/ml) + 12.75의 선형 방정식을 따른다. 측정 한계값을 설정하기 위해 일반적으로 3S b/m (Sb: control 값의 표준편차, m 위 선형방정식의 기울기) 로 계산되며 2.0 ng/ml으로 결정되었다(도 10).As a result, the amount of fluorescence intensity gradually increased as the concentration of toxin increased, and the amount of change was decreased when the concentration was 50 ng / ml or more. In the range of
<110> Korea Research Institute of Standards and Science
<120> Sensor for detecting botulinum neurotoxin and a detection method
using the FRET
<130> P14R18D0095
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> GLAibAAGGDMGNEIDTQNRQIDRIMEKAD
<400> 1
Gly Leu Xaa Ala Ala Gly Gly Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln
1 5 10 15
Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp
20 25
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> GLAibAAGG
<400> 2
Gly Leu Xaa Ala Ala Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> DMGNEIDTQNRQIDRIMEKAD
<400> 3
Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile
1 5 10 15
Met Glu Lys Ala Asp
20
<110> Korea Research Institute of Standards and Science
<120> Sensor for detecting botulinum neurotoxin and a detection method
using the FRET
<130> P14R18D0095
<160> 3
<170> Kopatentin 2.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> GLAibAAGGDMGNEIDTQNRQIDRIMEKAD
<400> 1
Gly Leu Xaa Ala Ala Gly Gly Asp Met Gly Asn Glu Ile
Claims (11)
A sensor for detecting botulinum toxin, wherein graphene oxide is bound to the N-terminus of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a dye is bound to the C-terminus of the peptide.
2. The sensor for detecting botulinum toxin according to claim 1, wherein the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is covalently bonded to the oxidized graphene.
The sensor for detecting botulinum toxin according to claim 1, wherein the dye is a donor part for transferring energy.
2. The sensor for detecting botulinum toxin according to claim 1, wherein the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 is composed of a spacer having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
5. The sensor for detecting botulinum toxin according to claim 4, wherein the spacer is bonded to graphene oxide.
5. The sensor for detecting botulinum toxin according to claim 4, wherein the spacer has a spiral structure.
5. The sensor for detecting botulinum toxin according to claim 4, wherein the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 binds to a botulinum toxin.
The method according to claim 7, wherein the 15th amino acid (R) and the 16th isoleucine (I) of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are combined with a botulinum toxin to cause a hydrolysis reaction. For sensors.
2) 산화 그래핀의 카르복실화하는 단계;
3) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride, EDC) 결합 반응을 통해서 산화 그래핀에 형성된 카르복실 그룹을 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드 N 말단에 결합하는 단계; 및
4) 염료를 서열번호 1로 이루어진 아미노산을 갖는 펩타이드 C 말단에 결합하고 미 반응물을 제거하기 위하여 세척하는 단계를 포함하는 보툴리늄 독소 검출용 센서의 제조방법.
1) oxidizing the graphite to synthesize the oxidized graphene;
2) carboxylation of the oxidized graphene;
3) The carboxyl group formed on the oxidized graphene through the coupling reaction of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Lt; RTI ID = 0.0 > 1 < / RTI >; And
4) binding the dye to the C-terminal of the amino acid-containing peptide of SEQ ID NO: 1 and washing to remove unreacted material.
10. The method of claim 9, wherein the binding of step (3) and step (4) is a covalent bond.
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