KR20160092331A - A bioprobe for the detection of influenza A virus subtype H1N1 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1을 검출할 수 있는 바이오프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 핵산을 증폭하기 위한 전처리를 요구하지 않아 신속하고 편리한 검출이 가능하고, 아형 H1N1만을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오프로브에 관한 것이다. The present invention relates to a bioprobe capable of detecting the influenza A virus subtype H1N1, more specifically, it does not require a pretreatment for amplifying a nucleic acid, so that rapid and convenient detection is possible and only the subtype H1N1 can be specifically detected The present invention relates to a bio-probe.
인플루엔자(influenza, 독감)는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 의해 사람 및 동물(조류, 돼지, 개, 말 등)의 호흡기를 통해 전파되는 호흡기성 질병이다. 사람 인플루엔자(Human influenza)의 경우 매년 전 세계 10-20% 인구에서 발생하며, 전염성이 높아 매년 세계적 규모로 유행하는 경향이 있다. 인플루엔자의 증상은 고열, 두통, 근육통, 인후의 염증, 통증, 기침 등의 호흡기질환을 수반하며 심한 경우 노약자, 만성질환보유자 등의 사망을 유발할 수 있다. Influenza (influenza) is a respiratory disease that spreads through the respiratory system of people and animals (birds, pigs, dogs, horses, etc.) by the influenza virus. Human influenza occurs every year in the 10-20% of the world, and is highly contagious and tends to spread worldwide on an annual basis. Symptoms of influenza include high fever, headache, muscle aches, inflammation of the throat, pain, cough and other respiratory diseases. Severe cases can lead to deaths of elderly people and chronic disease holders.
인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 바이러스 중에서 가장 전염성이 강하고 독력이 강하다. 숙주가 조류, 포유류 등 매우 다양하며, 종간 전염 역시 발생할 수 있어 많은 아형 및 변이주가 존재한다. 그 중 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1은 돼지에서 유래한 인플루엔자 바이러스가 변이를 일으켜 발생한 것으로서 신종플루의 원인균이다. 2009년 신종플루가 대유행했을 때 전세계적으로 18500여명의 사망자가 발생하였으며, 전염병에 대한 공포로 국가 간 교역이 감소하고 경제가 위축되고 휴교령이 내려지는 등 유무형의 막대한 손실이 발생하였다.Influenza A virus is the most infectious and potent influenza virus among influenza viruses. Hosts are very diverse, including birds and mammals, and there are many subtypes and mutants that can develop interspecies transmission. Among them, influenza A virus subtype H1N1 is caused by mutation of influenza virus derived from pigs and is a causative organ of swine flu. When the H1N1 flu arose in 2009, there were about 18,500 deaths worldwide. Fear of communicable diseases caused massive losses, including trade between countries, economic recession, and school holidays.
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다. It is an object of the present invention to provide a bioprobe capable of specifically detecting influenza A virus subtype H1N1.
이에, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 펩타이드; 상기 펩타이드의 일 말단에 결합된, ??칭 소재가 태그된 서열번호 2로 기재되는 올리고뉴클레오타이드; 상기 펩타이드의 다른 말단에 결합된, 형광 소재가 태그된 서열번호 3으로 기재되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1 검출용 바이오프로브를 제공한다.Accordingly, the present invention relates to a peptide represented by SEQ ID NO: 1; An oligonucleotide represented by SEQ. ID. NO. 2 tagged with an epitope tag bound to one end of the peptide; The present invention provides a bioprobe for detecting influenza A virus subtype H1N1, which comprises an oligonucleotide represented by SEQ. ID. NO. 3 tagged with a fluorescent material, which is bonded to the other end of the peptide.
또한 본 발명은 상기 바이오프로브에서 서열번호 2로 기재되는 올리고뉴클레오타이드와 서열번호 3으로 기재되는 올리고뉴클레오타이드가 어닐링(annealing)되어 형광 신호가 억제된 바이오프로브를 제공한다.The present invention also provides a bioprobe in which fluorescence signals are suppressed by annealing an oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 in the above-mentioned bioprobe.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1로 기재되는 펩타이드는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 헤마글루티닌, 즉 H1에 특이적으로 결합한다. 따라서 다른 바이러스에는 결합하지 않으며, 인플루엔자 A 바이러스 중에서도 다른 아형에는 결합하지 않아서, 아형 H1N1만을 검출할 수 있다.In the present invention, the peptide represented by SEQ ID NO: 1 specifically binds to hemagglutinin of influenza A virus subtype H1N1, i.e., H1. Therefore, it does not bind to other viruses and does not bind to other subtypes among influenza A viruses, so that only subtype H1N1 can be detected.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 ??칭 소재는 바람직하게는 BHQ2, 상기 형광 소재는 cy3가 될 수 있다. 다른 예로서, 본 발명에 사용될 수 있는 ??칭 소재의 예로는 Dabcyl, BHQ-1, QYS-7, BHQ-2, BHQ-3가 있으며, 형광 소재의 예로는 Cascade Blue, Pacific Blue, Oregon Green, Bodipy FL-X, Fluorescein, 5,6 FAM, Oregon green, TET, Bodipy R6-X, JOE, HEX, Cy3, Rhodamine REd-X, TAMRA, Cy3.5, ROX, Texas Red-X, Bodipy TR-X, Light Cycler, Bodipy 630/650-X, Cy5, Cy5.5가 있다. 그러나 ??칭 소재와 형광 소재의 종류는 이에 제한되지 않으며, ??칭 소재에 의하여 형광 소재가 소광될 수 있는 소재이면 본 발명에 적용될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the inventive material may preferably be BHQ2, and the fluorescent material may be cy3. Examples of fluorescent materials that can be used in the present invention include Dabcyl, BHQ-1, QYS-7, BHQ-2 and BHQ-3. Examples of fluorescent materials include Cascade Blue, Pacific Blue, Oregon Green , Bodipy FL-X, Fluorescein, 5,6 FAM, Oregon green, TET, Bodipy R6-X, JOE, HEX, Cy3, Rhodamine REd-X, TAMRA, Cy3.5, ROX, Texas Red- X, Light Cycler, Bodipy 630/650-X, Cy5, and Cy5.5. However, the type of the fluorescent material and the fluorescent material are not limited thereto, and the fluorescent material may be applied to the present invention if the fluorescent material can be extinguished by the fluorescent material.
본 발명에 있어서, 상기 바이오프로브는 서열번호 1로 기재되는 펩타이드, ??칭 소재가 태그된 서열번호 2로 기재되는 올리고뉴클레오타이드, 및 형광 소재가 태그된 서열번호 3으로 기재되는 올리고뉴클레오타이드가 4:4:2의 중량비로 포함된 것일 수 있다. 그러나 각 구성의 중량비는 이에 제한되지 않으며, ??칭 소재에 의하여 형광 소재가 소광될 수 있는 중량비라면 본 발명에 적용될 수 있다. In the present invention, the above-mentioned bioprobe comprises a peptide represented by SEQ ID NO: 1, an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 tagged with a targeting material, and an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 3 tagged with a fluorescent material, 4: 2. ≪ / RTI > However, the weight ratio of each constitution is not limited thereto, and can be applied to the present invention if the weight ratio is such that the fluorescent material can be extinguished by the working material.
본 발명은 a) 상기 어닐링된 바이오프로브와 시료를 접촉하는 단계;The present invention provides a method for producing a biodegradable bio-probe comprising: a) contacting the sample with the annealed bioprobe;
b) 상기 바이오프로브로부터 발생하는 형광 강도를 측정하는 단계; 및b) measuring the fluorescence intensity generated from the bioprobe; And
c) 상기 측정된 형광 강도가 시료와 접촉하기 전보다 증가한 경우 시료 내 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 검출 방법을 제공한다.and c) confirming the presence of the influenza A virus subtype H1N1 in the sample when the measured fluorescence intensity is higher than before the contact with the sample.
상기 방법에 있어서 상기 a) 단계는 실온에서 수행될 수 있다. 그러나 상기 바이오프로브가 변성되지 않는 한 수행 온도는 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 단계는 5분 내지 1시간, 바람직하게는 10분 내지 30분, 보다 바람직하게는 10분 동안 수행될 수 있다. 그러나 접촉 시간은 이에 제한되지 않는다. In the above method, the step a) may be carried out at room temperature. However, the working temperature is not limited thereto unless the bioprobe is denatured. Further, the above step may be carried out for 5 minutes to 1 hour, preferably 10 minutes to 30 minutes, more preferably 10 minutes. However, the contact time is not limited thereto.
본 발명은 상기 바이오프로브 또는 상기 어닐링된 바이오프로브를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 키트는 사용 지침(instruction) 및 기타 검출에 필요한 도구 또는 장비를 더 포함할 수 있다. The present invention provides a kit for detecting influenza A virus subtype H1N1 comprising the bioprobe or the annealed bioprobe. The kit may further comprise tools or equipment necessary for use instructions and other detection.
본 발명은 바이러스 증폭을 위한 별도의 전처리를 요구하지 않고 실온에서도 수행할 수 있어 신속하고 간편한 검출이 가능하다. 또한 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1만을 선택적으로 검출할 수 있다. The present invention can be carried out at room temperature without requiring a separate pretreatment for amplification of the virus, thereby enabling quick and easy detection. In addition, only the influenza A virus subtype H1N1 can be selectively detected.
도 1은 본 발명의 바이오프로브의 제조과정을 나타낸 도이다.
도 2의 좌측 도는 본 발명의 바이오프로브가 제조되고(1단계), 어닐링시 FRET 현상을 이용하여 형광 신호를 억제하며(2단계), 타겟 바이러스 표면 단백질과 결합했을 때 형광 신호가 발생하는(3단계) 과정의 모식도이다. 도 2의 우측 도는 본 발명의 바이오프로브가 어닐링시 형광 신호가 효과적으로 억제되며, 인플루엔자 A 바이러스 H1N1에 특이적으로 높은 형광 감도가 나타남을 보여주는 그래프이다.
도 3은 ??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드의 양을 변화시켜 바이오프로브를 제조하였을 때 어닐링 전후 형광 신호를 나타낸 도이다.
도 4는 ??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드의 양을 각각 다양한 농도로 사용하여 바이오프로브를 제조하였을 때 어닐링 전후 형광 신호를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 바이오프로브를 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H3N2, H3N2, H5N2, H6N5, 또는 코로나바이러스와 반응시켰을 경우 형광 신호를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 바이오프로브와 바이러스의 반응 시간을 변화시켰을 때 형광 신호를 나타낸 도이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a view showing a process of manufacturing a bioprobe according to the present invention;
2 shows the fluorescence signal suppressed by the FRET phenomenon at the annealing step (step 2), the fluorescence signal is generated when the fluorescence signal is combined with the target virus surface protein (step 3) Step process. 2 is a graph showing that the fluorescence signal is effectively suppressed at the time of annealing of the bioprobe of the present invention and fluorescence sensitivity specifically exhibited to the influenza A virus H1N1.
FIG. 3 is a graph showing a fluorescence signal before and after annealing when a bioprobe is prepared by varying the amount of oligonucleotide tagged with BHQ2.
FIG. 4 is a graph showing fluorescence signals before and after annealing when a bioprobe was prepared using various amounts of oligonucleotide tagged with BHQ2.
FIG. 5 is a graph showing a fluorescence signal when the bioprobes of the present invention are reacted with influenza A virus subtypes H1N1, H3N2, H3N2, H5N2, H6N5, or coronavirus.
6 is a graph showing a fluorescence signal when the reaction time of the bioprobes and viruses of the present invention is changed.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
실시예 1. 바이오프로브 제조Example 1. Preparation of a bioprobe
1-1. 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 표면의 H1 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 준비1-1. Preparation of a peptide specifically binding to H1 protein on the surface of influenza A virus subtype H1N1
인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 표면의 H1 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드(서열번호 1: ARLSPTMVHPNGAQP)를 ㈜ 펩트론으로부터 구입하여 준비하였다. 상기 펩타이드를 0.56 mM 처리했을 때 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H5N2, H6N5 각각의 표면의 HA 단백질에 대한 친화도(affinity)를 SPR(Surface Plasmon Resonance) 방법으로 검출하였다. 친화도의 단위는 RU(Response Unit)로 나타내었고, 하기 표에서 확인할 수 있다. A peptide (SEQ ID NO: 1: ARLSPTMVHPNGAQP) specifically binding to the H1 protein on the surface of influenza A virus subtype H1N1 was purchased from Peptron. When the peptide was treated at 0.56 mM, the affinity of HA protein on the surface of influenza A virus subtypes H1N1, H5N2 and H6N5 was detected by SPR (Surface Plasmon Resonance) method. The unit of affinity is represented by RU (Response Unit) and can be seen in the following table.
[표 1][Table 1]
상기 표에서 서열번호 1의 펩타이드가 H1N1 바이러스에 특이적으로 높은 친화도를 나타냄을 알 수 있다. In the above table, it can be seen that the peptide of SEQ ID NO: 1 has a high affinity specifically for the H1N1 virus.
1-2. 바이오프로브 제조1-2. Manufacture of bio-probes
상기 펩타이드의 한쪽 말단은 Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride)으로, 다른 한쪽 말단은 NH2로 보호되어 있다. NH2 쪽 말단에 ??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2: TTTTTGGGGG)를 Sulfo-SMCC를 크로스 링커(cross linker)로 하여 결합시켰다. 그리고 다른 쪽 말단에서 Fmoc을 제거한 후, 형광 소재(cy3)가 태그된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3: CCCCCAAAA)를 Sulfo-SMCC를 크로스 링커로 하여 결합하여 바이오프로브를 제조하였다.One end of the peptide is protected with Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride) and the other end is protected with NH 2 . The oligonucleotide (SEQ ID NO: 2: TTTTTGGGGG) tagged with the BHQ2 substance at the NH 2 -terminal end was bound with Sulfo-SMCC as a cross linker. After removing Fmoc from the other end, oligonucleotide (SEQ ID NO: 3: CCCCCAAAA) tagged with a fluorescent material (cy3) was bound using Sulfo-SMCC as a cross linker to prepare a bioprobe.
상기 제조과정을 도 1에 나타내었다. The manufacturing process is shown in Fig.
1-3. 어닐링을 통한 바이오프로브의 형광 신호 억제1-3. Suppression of fluorescence signal of bio-probe by annealing
합성된 바이오프로브가 비특이적 형광 신호를 발생시키는 것을 억제하기 위하여 어닐링(annealing)을 수행하였다. 즉, 상기 바이오프로브를 95 ℃의 온도에서 2-5분간 둔 후, 서서히 상온으로 온도를 낮춤으로써 상기 바이오프로브의 서열번호 2 및 3 간의 수소결합을 유도하여 바이오프로브가 헤어핀 구조가 되도록 하였다.The synthesized bioprobes were annealed to inhibit the generation of nonspecific fluorescence signals. That is, the bioprobe was allowed to stand at 95 ° C. for 2 to 5 minutes, and the temperature was gradually lowered to room temperature to induce hydrogen bonding between SEQ ID NOS: 2 and 3 of the bioprobe to make the bioprobe a hairpin structure.
헤어핀 구조를 이룬 바이오프로브는 양 말단에 존재하는 형광 소재와 ??칭 소재간의 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 현상에 의하여 형광 신호가 억제되었다. The fluorescence signal was suppressed by the fluorescence resonance energy transfer (FRET) phenomenon between the fluorescent material existing at both ends and the fluorescent material.
바이오프로브가 제조되고(1단계), 어닐링시 FRET 현상을 이용하여 형광 신호를 억제하며(2단계), 타겟 바이러스 표면 단백질과 결합했을 때 형광 신호가 발생하는(3단계) 과정의 모식도를 도 2의 좌측 도에 나타내었다. A schematic diagram of a process in which a fluorescence signal is generated when a bio-probe is prepared (Step 1), annealing is performed using a FRET phenomenon to suppress fluorescence signal (Step 2) As shown in Fig.
1-4. 형광 소재와 ??칭 소재의 비율에 따른 형광 신호 억제 정도 확인1-4. Determination of fluorescence signal suppression according to the ratio of fluorescent material and fluorescent material
본 발명의 바이오프로브에서 형광 소재와 ??칭 소재의 비율을 결정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. The following experiment was conducted to determine the ratio of the fluorescent material to the fluorescent material in the bio-probe of the present invention.
구체적으로, 1-2의 바이오프로브 제조시, 형광 소재(cy3)가 태그된 올리고뉴클레오타이드의 양을 100 pmol로 고정하고, ??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드의 양을 변화시켜가면서(각각 100, 150, 200, 250, 300 pmol) 바이오프로브를 제조하였다. Specifically, the amount of the oligonucleotide tagged with the fluorescent material (cy3) was fixed at 100 pmol and the amount of the oligonucleotide tagged with the BHQ2 was changed 100, 150, 200, 250 and 300 pmol, respectively).
각 바이오프로브를 1-3과 마찬가지로 어닐링하여, 어닐링 전 및 후의 형광 신호를 비교하였다.Each of the bio-probes was annealed in the same manner as 1-3, and the fluorescence signals before and after annealing were compared.
결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 시험된 ??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드의 양과 관계없이 형광 신호가 효과적으로 억제됨을 알 수 있다.The results are shown in FIG. It can be seen that the fluorescence signal is effectively suppressed irrespective of the amount of the oligonucleotide tagged in the test substance (BHQ2) tested in FIG.
1-5. 어닐링 전후의 형광신호 비교1-5. Comparison of fluorescence signals before and after annealing
??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드를 다양한 농도로 사용하여 1-2의 방법으로 제조한 바이오프로브를 1-3의 방법으로 어닐링한 경우, 어닐링 전후의 형광 신호를 비교하였다.Fluorescence signals before and after annealing were compared when the bioprobes prepared by methods 1-2 were annealed using oligonucleotides tagged with BHQ2 at varying concentrations 1-3.
결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 ??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드가 모든 농도에서 어닐링 후 형광 신호가 모두 효과적으로 억제되며, 4 nmol 사용되었을 때 형광 신호가 가장 효과적으로 억제됨을 알 수 있다. The results are shown in Fig. In FIG. 4, it can be seen that the fluorescence signal is most effectively suppressed when the oligonucleotide tagged with BHQ2 is effectively suppressed after annealing at all concentrations and when 4 nmol is used.
실시예 2. 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 검출Example 2. Detection of influenza A virus subtype H1N1
??칭 소재(BHQ2)가 태그된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 2)를 4 nmol, 형광 소재(cy3)가 태그된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3)를 2 nmol, 및 서열번호 1의 펩타이드를 4 nmol 사용하여 실시예 1-2의 방법대로 바이오프로브를 제조하고 1-3의 방법대로 어닐링한 후, 상온에 바로 꺼내어 2 내지 3시간 두었다. 그 후 바이러스 역가 1*104의 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, 인플루엔자 A 바이러스 아형 H3N2, H3N2, H5N2, H6N5, 또는 코로나바이러스(Corona virus) 각각에 상기 어닐링된 바이오프로브를 100 μL의 양으로 처리하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 서열번호 1의 펩타이드 대신 scrambled control(서열번호 4: CDDYYYGFGCNKFCRPR)을 사용한 것 외에 다른 모든 것을 동일하게 하여 컨트롤 프로브(control probe)을 준비하였고, 동일한 방법으로 각 바이러스와 반응시켰다.4 nmol of the oligonucleotide tagged with the BHQ2 (SEQ ID NO: 2), 2 nmol of the oligonucleotide tagged with the fluorescent material (cy3) (SEQ ID NO: 3) and 4 nmol of the peptide of SEQ ID NO: 1 The bioprobe was prepared according to the method of Example 1-2, annealed according to the methods 1-3, taken out at room temperature for 2 to 3 hours. Then, the above-described annealed bioprobe was treated with 100 μL of influenza A virus subtype H1N1, influenza A virus subtype H3N2, H3N2, H5N2, H6N5, or Corona virus with a virus titer of 1 × 10 4 , For 10 minutes. A control probe was prepared in the same manner except that the peptide of SEQ ID NO: 1 was replaced with a scrambled control (SEQ ID NO: 4: CDDYYYGFGCNKFCRPR), and reacted with each virus in the same manner.
그 후 530 nm의 파장으로 여기(excitation)시켜 형광 신호 변화를 측정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 본 발명의 바이오프로브(도면상에서 'Beacon'으로 표시)는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1과 반응시켰을 때 높은 형광 강도를 나타내었으나, 같은 인플루엔자 A 바이러스 중에서도 아형 H3N2, H5N2, H6N5와 반응시켰을 때는 매우 낮은 형광 강도를 나타내었으며, 코로나 바이러스와 반응시켰을 때는 형광 신호가 억제된 상태가 유지되었다. 한편 컨트롤 프로브(도면상에서 'Control Beacon'으로 표시)는 반응시킨 바이러스 3종 모두에 대하여 형광 강도가 낮게 나타났다. Thereafter, the fluorescence signal change was measured by excitation with a wavelength of 530 nm. The results are shown in Fig. In FIG. 5, the bioprobes of the present invention (denoted by "Beacon" in the drawing) showed high fluorescence intensity when reacted with Influenza A virus subtype H1N1. However, among the influenza A viruses, when they were reacted with subtypes H3N2, H5N2 and H6N5 The fluorescence intensity was maintained at the low level when reacted with coronavirus. On the other hand, the control probes (labeled 'Control Beacon' in the drawings) showed low fluorescence intensity for all three viruses reacted.
실시예 3. 바이러스와의 반응 시간에 따른 검출능 확인Example 3 Confirmation of Detection Ability According to Reaction Time with Virus
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 본 발명의 바이오프로브를 제조하여 어닐링한 후, 다른 모든 조건 및 방법은 실시예 2와 동일하게 하되 바이오프로브와 각 바이러스의 반응 시간을 10분, 20분, 30분으로 각각 변화시켜 가면서 이에 따른 검출능을 확인하였다. After the bioprobe of the present invention was prepared and annealed in the same manner as in Example 2, all other conditions and methods were the same as in Example 2 except that the reaction time of the bioprobe and each virus was 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes Respectively, and the detection ability thereof was confirmed.
결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 본 발명의 바이오프로브가 신속하게 (30분 이내) 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1에 대하여 높은 형광 강도를 나타내었고, 특히 10분간 반응시킨 경우에도 높은 형광 강도가 나타남을 확인하였다. The results are shown in Fig. In FIG. 6, the bioprobe of the present invention exhibited a high fluorescence intensity rapidly (within 30 minutes) against influenza A virus subtype H1N1, and it was confirmed that even when 10 minutes of reaction was performed, a high fluorescence intensity appeared.
Claims (8)
b) 상기 바이오프로브로부터 발생하는 형광 강도를 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 형광 강도가 시료와 접촉하기 이전보다 증가한 경우 시료 내 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 검출 방법.a) contacting the sample with the bioprobe of claim 2;
b) measuring the fluorescence intensity generated from the bioprobe; And
c) detecting the presence of the influenza A virus subtype H1N1 in the sample when the measured fluorescence intensity is greater than before contact with the sample.
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|---|---|---|---|
| KR1020150012824A KR101706324B1 (en) | 2015-01-27 | 2015-01-27 | A bioprobe for the detection of influenza A virus subtype H1N1 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220039426A (en) * | 2020-09-22 | 2022-03-29 | 중앙대학교 산학협력단 | Peptide specifically binding to H1N1 subtype of influenza A virus and uses thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007105565A1 (en) * | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Keio University | Peptide for inhibition of influenza infection, inhibitor of influenza infection, liposome, and prophylactic/therapeutic agent for influenza |
| CN102286639A (en) * | 2011-08-05 | 2011-12-21 | 江苏硕世生物科技有限公司 | Type A H1N1/influenza A virus nucleic acid dual fluorescent polymerase chain reaction (PCR) detection kit |
-
2015
- 2015-01-27 KR KR1020150012824A patent/KR101706324B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2007105565A1 (en) * | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Keio University | Peptide for inhibition of influenza infection, inhibitor of influenza infection, liposome, and prophylactic/therapeutic agent for influenza |
| CN102286639A (en) * | 2011-08-05 | 2011-12-21 | 江苏硕世生物科技有限公司 | Type A H1N1/influenza A virus nucleic acid dual fluorescent polymerase chain reaction (PCR) detection kit |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220039426A (en) * | 2020-09-22 | 2022-03-29 | 중앙대학교 산학협력단 | Peptide specifically binding to H1N1 subtype of influenza A virus and uses thereof |
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