KR20160080449A - Methods for establishing high expression cell line - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은, IRES 및 단백질 불안정화 서열이 연결된 항생제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 포함하는, 고발현 세포주 확립용 발현벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 발현벡터, 이를 이용한 형질전환세포, 고발현 세포주 확립방법, 및 목적 단백질의 고생산 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an expression vector for establishing a high expression cell line, which comprises an antibiotic selectable marker gene expression cassette to which IRES and a protein destabilizing sequence are linked. More particularly, the present invention relates to the above expression vector, And a method for high-yielding a protein of interest.
현재 FDA의 승인을 얻어 시판되는 재조합 의약품들의 대부분이 동물세포 배양 방법을 사용하여 생산되고 있으며, 특히 고부가 가치의 당 단백질 대부분이 동물세포배양 방법으로 생산되기 때문에 고생산성의 재조합 세포주의 연구 개발은 산업계의 집중적인 투자를 받으며 빠르게 성장하고 있는 산업 기술 분야이다. 따라서, 포유류 세포에서 원하는 목적 단백질(Protein of Interest, POI)을 높은 수준으로 발현하는 안정한 발현 세포주를 확립하는 일은, 최근 각광받는 항체 약물 등 생물제제(biologics)의 생산성과 직결되는 일이기 때문에 생물공학적, 산업적으로 매우 중요하다. Most recombinant drugs marketed under FDA approval are produced using animal cell culture methods. Especially, since most of high-value-added glycoproteins are produced by animal cell culture methods, research and development of recombinant high- Is a rapidly growing industrial technology area that is receiving intensive investment by Therefore, establishing a stable expression cell line that expresses a high level of a desired protein (Interestingly, POI) in mammalian cells is directly related to the productivity of biologics such as antibody drugs, , Which is very important in industry.
종래 이러한 고발현 유도방법으로는, promoter, enhancer, insulator 등을 개량하여 전사효율을 높힘으로써 mRNA를 대량 생성시키는 방법과, 생성된 mRNA의 안정성을 높이는 방법에 초점이 맞춰져 있다. 그러나, 이러한 방법을 이용하더라도, 결국 높은 수준의 발현을 유지하는 클론을 선별하는 일은 고발현 유도와는 또 다른 문제이다.Conventionally, such high expression induction methods have focused on a method of mass-producing mRNA by improving transcription efficiency by improving promoter, enhancer, insulator and the like, and a method of enhancing the stability of the produced mRNA. However, even using this method, screening for clones that maintain high levels of expression is eventually a different problem from high expression induction.
한편, 안정한 발현 세포주를 확립하기 위하여는, 목적 단백질을 발현하는 플라스미드의 transfection 및 항생제 등을 이용한 선택(antibiotic selection) 과정을 요하므로, 형질전환된 세포들 중에서 높은 수준의 발현을 유지하는 clone을 찾아내는 지리하고도 소모적인 작업을 필요로 한다. 이때, 일반적으로 많이 사용하는 플라스미드는, POI를 발현하는 발현카세트(expression cassette)와, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제나 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제와 같이, 항생제 처리시 생존하게 하는 선택 마커(selection marker) 단백질의 발현카세트를 별도로 가진다.On the other hand, in order to establish a stable expression cell line, transfection of a plasmid expressing a target protein and antibiotic selection using antibiotics are required, so that a clone which maintains a high level of expression among the transformed cells is found It requires geographical and consuming work. Herein, commonly used plasmids include an expression cassette expressing POI and a selection marker protein such as neomycin phosphotransferase and puromycin acetyltransferase which survive the treatment with antibiotics. Lt; / RTI > cassette.
이러한 플라스미드를 진핵세포에 트랜스펙션하여 항생제 선택과정을 거치면 안정한 발현 세포주를 얻을 수 있는데, 이를 위해서는 원형 상태의 플라스미드의 임의의 부위에서 절단이 일어나 선형 상태가 되고, 이것이 숙주세포의 염색체에 삽입(integration)되는 과정이 필요하다. 그러나, 만약 상기 절단부위가 POI 발현카세트 내부일 경우에는, 목적 단백질의 발현 없이 선택마커 단백질의 발현에 의해 항생제 선택에서 살아남게 되는 문제가 있다. 즉, 항생제 선택에 의해 살아남았으나 POI를 발현하지 않는 위양성 세포가 발생하는 문제가 있는데, 이러한 문제는 POI를 코딩하는 유전자가 길수록 가능성이 높은 바, POI 발현 카세트 내부가 절단될 확률이 높아지기 때문이다. 또한, POI 발현 카세트에 가장 널리 사용하는 프로모터인 CMV promoter는 시간이 지나면서 진핵세포에서 그 활성이 감소하게 되는데, 이 또한 항생제 선택을 오래 할수록 위양성 세포의 발생이 증가하는 원인요소가 된다.Transfection of these plasmids into eukaryotic cells and selection of antibiotics leads to stable expression of the cell line. In this case, the plasmid is cleaved at any site of the circular plasmid and becomes linear, which is inserted into the chromosome of the host cell integration process. However, if the cleavage site is inside the POI expression cassette, there is a problem that selection of an antibiotic is survived by expression of a selectable marker protein without expression of a target protein. In other words, there is a problem that a false-positive cell that does not express POI is survived by the selection of antibiotics. Such a problem is more likely to occur when the gene encoding POI is longer, and the probability of cleavage of the inside of the POI expression cassette is increased. In addition, the CMV promoter, which is the most widely used promoter for POI expression cassette, decreases its activity in eukaryotic cells over time, and this is also a cause of the increase in the incidence of false-positive cells with longer antibiotic selection.
종래, 이러한 문제들을 해결하기 위해, 내부리보좀유입점(Internal Ribosomal Entry Site, IRES)을 사용하여 하나의 mRNA에서 POI와 선택마커 단백질을 모두 발현하게 하는 기술이 개발되었다. 진핵세포에서 mRNA의 번역은 일반적으로 캡(cap)구조 의존적이지만, 캡구조 비의존성 번역을 하는 경우 리보솜이 mRNA 사슬 내부에 존재하고 있는 특정 영역(구조)에 직접 결합하여 번역을 시작하는 경우가 있어 이것을 내부인식(개시)기구라 하고, 내부개시기구에서 리보솜이 직접 결합하는 mRNA상의 부위에 해당하는 IRES는 mRNA에서 CAP-비의존성 번역을 시작할 수 있도록 하는 RNA의 2차구조를 의미한다. 즉, mRNA의 특정 서열이 2차구조를 형성하여 IRES를 만들면 진핵세포의 리보좀이 IRES에 결합하여 CAP 단백질이 없어도 번역을 시작할 수 있다.Conventionally, to solve these problems, a technique has been developed in which an internal ribosomal entry site (IRES) is used to express both a POI and a selectable marker protein in one mRNA. The translation of mRNA in eukaryotic cells is generally cap structure dependent. However, in the case of cap structure non-dependent translation, the ribosome directly binds to a specific region (structure) existing in the mRNA chain and starts translation This is known as the internal recognition (initiation) mechanism, and IRES, which corresponds to the region on the mRNA that the ribosome directly binds in the internal initiation mechanism, means the secondary structure of the RNA which enables CAP-independent translation in the mRNA to start. That is, when a specific sequence of mRNA forms a secondary structure to form an IRES, a ribosome of a eukaryotic cell binds to IRES and can start translation without CAP protein.
따라서, IRES를 이용하면 하나의 mRNA에서 두개의 ORF의 발현이 가능하다. 즉, 진핵세포의 유전자는 monocistronic하여 하나의 mRNA에서 한개의 단백질이 만들어지는 반면 바이러스나 박테리아는 polycistronic한데, 진핵세포에서 bicistronic하게 발현이 유도될 수 있도록 첫번째 ORF와 두번째 ORF 사이에 IRES 서열을 삽입하여 bicistronic expression vector 형태로 이용할 수 있다. 특히, 이러한 방법은, POI와 선택마커 단백질을 동시에 발현시켜야 하는 경우 유용한데, 두번째 위치하는 선택마커 단백질이 발현되려면 첫번째 위치하는 POI가 먼저 전사되어야 하므로, 목적 단백질과 선택마커 단백질의 발현을 동질화할 수 있기 때문이다. 상기 bicistronic expression vector에서 첫번째 POI ORF는 cap-의존성 번역을 하게되고, 두번째 선택마커 ORF는 IRES-의존성 번역을 하게 된다.Therefore, the use of IRES allows the expression of two ORFs in one mRNA. In other words, eukaryotic genes are monocistronic and one protein is produced in one mRNA, while viruses and bacteria are polycistronic. In order to induce bicistronic expression in eukaryotic cells, an IRES sequence is inserted between the first ORF and the second ORF It can be used as a bicistronic expression vector. In particular, such a method is useful when the POI and the selectable marker protein must be expressed simultaneously. In order to express the selectable marker protein located at the second position, the first positioned POI must be transcribed first, so that the expression of the desired protein and the selectable marker protein is homologous It is because. In the bicistronic expression vector, the first POI ORF is subjected to cap-dependent translation and the second selection marker ORF is subjected to IRES-dependent translation.
따라서, IRES를 사용하면 위양성 세포의 생성이 근원적으로 차단되는 장점이 있지만, 이러한 장점에도 불구하고 실제 단백질 발현수율이 높은 세포주를 만들기 위해 IRES 기술이 잘 사용되지는 않는데, 목적 단백질의 발현수율이 보장되지 않기 때문이다. 그 원인으로는, 도 1의 모식도에서 알 수 있듯이, 상대적으로 적은 수의 mRNA로부터 발현된 선택마커 단백질의 발현양이 항생제 선택에서 살아남기에 충분하기 때문이다. 즉, 높은 발현율을 보이는 세포와 낮은 발현율을 보이는 세포 모두 항생제 선택시 살아남게 되므로, 이들 세포중 고발현 수율을 보이는 세포주를 선별하기란 쉽지 않다는 문제가 있다. 더욱이, 세포배양을 지속적으로 하게 되면, 프로모터의 활성이 감소하게 되어도 계속 살아남을 수 있으므로 오랜 배양 후에는 대부분의 세포가 낮은 발현을 보이게 된다.Therefore, despite the advantages of using IRES, production of false-positive cells is fundamentally blocked. Despite these advantages, IRES technology is not well used to produce cell lines with high protein expression yield. It is not. The reason for this is that as shown in the schematic diagram of Fig. 1, the expression amount of the selectable marker protein expressed from a relatively small number of mRNAs is sufficient to survive antibiotic selection. That is, since cells exhibiting a high expression rate and cells exhibiting a low expression rate survive the selection of antibiotics, there is a problem in that it is not easy to select a cell line exhibiting a high expression yield among these cells. Moreover, if the cell culture is continuously maintained, even if the activity of the promoter is decreased, it can survive, and therefore, most of the cells show low expression after long incubation.
따라서, IRES를 활용하여 위양성 세포의 발생을 차단하면서 높을 발현을 보이는 세포만 살아남게 하기 위해서는 선택마커 단백질의 발현을 감소시키는 기술이 필요하다. 이를 통해, 상대적으로 더 많은 양의 mRNA가 있어야 비로서 항생제 선택에서 살아남을 수 있는 양의 선택마커 단백질 발현이 가능하게 되므로, 높은 단백질 발현을 보이는 세포만 살아남게 되어 고발현 세포주의 선별이 가능할 것이다(도 2 참조). 또한, 장기간 배양에 의해 프로모터의 활성이 감소된 세포는, 선택마커 단백질의 양이 충분치 못해 살아남지 못하고, 높은 발현을 보이는 세포만 지속적으로 살아남게 될 것이다.Therefore, in order to survive only high-expression cells while preventing the production of false-positive cells by utilizing IRES, there is a need for a technique for reducing the expression of selectable marker proteins. This allows the expression of positive selection marker proteins that survive antibiotic selection rather than requiring relatively higher amounts of mRNA, thus allowing only those cells that exhibit high protein expression to survive, thus allowing selection of highly expressing cell lines (See Fig. 2). In addition, cells whose promoter activity is decreased by long-term culture will not survive because the amount of the selectable marker protein is not sufficient, and only cells showing high expression will survive continuously.
이와 같이, 선택마커 단백질의 발현을 감소시키기 위해서는, mRNA 수준에서 불안정화시키는 방법과 단백질 수준에서 불안정화시키는 방법이 있다. 그러나, mRNA를 불안정화시키는 방법을 이용할 경우, 선택마커 단백질의 발현을 감소시키기 위해서는 POI의 발현도 같이 감소하게 되는 문제가 있기 때문에, 단백질 수준에서 불안정화시키는 방법이 더욱 유용할 것이다. 단백질 수준의 불안정화 방법에는, 카복시말단에 mouse ODC 단백질의 PEST 도메인 등을 붙이는 방법이 주로 사용되나 이 정도로는 충분치 않아, 더 강력한 불안정화 방법이 필요한 실정이다.Thus, in order to decrease the expression of the selectable marker protein, there are a method of destabilizing at the mRNA level and a method of destabilizing at the protein level. However, when the method of destabilizing mRNA is used, there is a problem that the expression of POI is also decreased in order to decrease the expression of the selectable marker protein, so that the method of destabilizing at the protein level will be more useful. To destabilize the protein level, the method of attaching the PEST domain of the mouse ODC protein to the carboxy terminal is mainly used, but this is not enough and a stronger destabilization method is needed.
따라서, 본 발명은, 단백질 불안정화 서열이 연결된 항생제 선택 마커 유전자 발현 카세트와 IRES 유전자를 포함하는, 고발현 세포주 확립용 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an expression vector for establishing a highly expressing cell line, which comprises an antibiotic selectable marker gene expression cassette to which a protein destabilizing sequence is linked and an IRES gene.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 이용한 형질전환세포, 고발현 세포주 확립방법, 단백질 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a transformed cell, a method of establishing a highly expressing cell line, and a method of producing a protein using the expression vector.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 목적 단백질(POI)을 암호화하는 유전자 발현 카세트; 내부리보좀유입점(Internal Ribosomal Entry Site, IRES)을 암호화하는 유전자; 및 단백질 불안정화 서열이 연결된 항생제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 포함하는, 고발현 세포주 확립용 발현벡터를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a gene expression cassette encoding a target protein (POI); A gene encoding an internal ribosomal entry site (IRES); And an antibiotic selectable marker gene expression cassette to which the protein destabilizing sequence is linked.
또한, 본 발명은, 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 얻어진 형질전환세포를 제공한다.The present invention also provides a transformed cell obtained by transforming a host cell with the above expression vector.
또한, 본 발명은, 상기 형질전환세포를 항생제로 선택하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 고발현 세포주 확립방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for establishing a highly expressing cell line of a target protein, comprising the step of selecting the transformed cell as an antibiotic.
또한, 본 발명은, 상기 방법으로 확립된 고발현 세포주를 배양한 후 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 목적 단백질 고생산방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a high-molecular-weight target protein, which comprises culturing a high-expression cell line established by the above method and then purifying the protein.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단백질 불안정화 서열은 유비퀴틴(ubiquitin) G76V 변이체 서열일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the protein destabilizing sequence may be a ubiquitin G76V mutant sequence.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 항생제 선택 마커는 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. In another embodiment of the present invention, the antibiotic selectable marker may be selected from the group consisting of puromycin acetyltransferase, neomycin phosphotransferase, and hygromycin phosphotransferase.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 목적 단백질(POI)은 항체, 호르몬, 백신 및 형광단백질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. In another embodiment of the present invention, the target protein (POI) may be selected from the group consisting of an antibody, a hormone, a vaccine and a fluorescent protein.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 IRES는 상기 POI 발현 카세트와 항생제 선택 마커 발현 카세트 사이에 위치할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the IRES can be located between the POI expression cassette and the antibiotic selectable marker expression cassette.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 숙주세포는 동물세포일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the host cell may be an animal cell.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 동물세포는 HEK293(Human Embryonic Kidney Cell), CHO(Chinese Hamster Ovary Cell) 및 Vero(Monkey Kidney Cell)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. In another embodiment of the present invention, the animal cells may be selected from the group consisting of Human Embryonic Kidney Cell (HEK293), Chinese Hamster Ovary Cell (CHO) and Monkey Kidney Cell (Vero).
본 발명에 따르면, 위양성 세포의 발생을 차단하면서 고발현 세포주만을 신속 용이하게 선별할 수 있으므로, 효율적인 재조합 단백질의 생산이 가능하다. 따라서, 세포배양기술을 통해 생산되는 치료용 항체 단백질, 호르몬, 백신, 바이오시밀러 등의 약물을 대량 생산하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다.According to the present invention, it is possible to quickly and easily select only the high-expression cell line while preventing the production of false-positive cells, thereby enabling efficient production of recombinant protein. Therefore, it may be useful for mass production of therapeutic antibody proteins, hormones, vaccines, biosimilars and the like produced through cell culture technology.
도 1은, IRES 유전자와 항생제 선택마커 유전자를 포함하는 일반적인 발현벡터에 대하여 항생제 선택을 실시한 결과를 나타내는 모식도이다.
도 2는, IRES 유전자와 단백질 불안정화 서열이 연결된 항생제 선택마커 유전자를 포함하는 본 발명의 발현벡터에 대하여 항생제 선택을 실시한 결과를 나타내는 모식도이다.
도 3은, 일반적인 발현벡터(pLVX-EYIP)와 본 발명의 발현벡터(pLVX-EYIdP)의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 4는, 일반적인 발현벡터(pLVX-EYIP) 또는 본 발명의 발현벡터(pLVX-EYIdP)를 함유하는 렌티바이러스로 숙주세포를 형질도입하여, 상기 각 발현벡터가 숙주세포 게놈 내에 안정하게 integration되었음을 보여주는 그래프이다.
도 5는, 일반적인 발현벡터(pLVX-EYIP)와 본 발명의 발현벡터(pLVX-EYIdP) 각각을 숙주세포(HEK293A)에 형질전환시키고 다른 농도(2ug/ml, 10ug/ml)의 항생제(puromycine)로 선택한 후, 본 발명의 발현벡터에 의해 형광단백질(YFP)이 고발현되었는지 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 6은, 일반적인 발현벡터(pLVX-EYIP)와 본 발명의 발현벡터(pLVX-EYIdP) 각각을 숙주세포(HEK293A)에 형질전환시키고 다른 농도(2ug/ml, 10ug/ml)의 항생제(puromycine)로 선택한 후, 본 발명의 발현벡터에 의해 형광단백질(YFP)이 고발현되는 안정한 세포주가 확립되었는지 형광현미경으로 형광세기를 확인한 결과이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing results of antibiotic selection for a common expression vector containing an IRES gene and an antibiotic selectable marker gene. FIG.
FIG. 2 is a schematic diagram showing the results of performing an antibiotic selection on an expression vector of the present invention including an antibiotic selectable marker gene to which an IRES gene and a protein destabilizing sequence are linked. FIG.
3 is a schematic diagram showing the structure of a general expression vector (pLVX-EYIP) and an expression vector (pLVX-EYIdP) of the present invention.
Figure 4 shows the results of transfection of host cells with lentiviruses containing the general expression vector (pLVX-EYIP) or the expression vector of the invention (pLVX-EYIdP), showing that each of the expression vectors was stably integrated into the host cell genome Graph.
FIG. 5 shows the results obtained by transforming each of the common expression vector (pLVX-EYIP) and the expression vector of the present invention (pLVX-EYIdP) into a host cell (HEK293A) and using different concentrations (2 ug / ml, 10 ug / ml) of puromycine , And then confirmed by Western blotting whether or not the fluorescent protein (YFP) was highly expressed by the expression vector of the present invention.
FIG. 6 shows the results obtained by transforming each of the common expression vector (pLVX-EYIP) and the expression vector of the present invention (pLVX-EYIdP) into host cells (HEK293A) with different concentrations (2 ug / ml, 10 ug / ml) of puromycine , And then the fluorescence intensity was confirmed by fluorescence microscopy to confirm whether a stable cell line in which a fluorescent protein (YFP) was highly expressed by the expression vector of the present invention was established.
본 발명은, 목적 단백질(POI)을 암호화하는 유전자 발현 카세트; 내부리보좀유입점(Internal Ribosomal Entry Site, IRES)을 암호화하는 유전자; 및 단백질 불안정화 서열이 연결된 항생제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 포함하는, 고발현 세포주 확립용 발현벡터를 제공한다.The present invention relates to a gene expression cassette encoding a target protein (POI); A gene encoding an internal ribosomal entry site (IRES); And an antibiotic selectable marker gene expression cassette to which the protein destabilizing sequence is linked.
본 발명에서는, 항생제(Puromycin) 저항성을 부여하는 단백질(예를 들면, puromycin acetyl transferase, PAC)의 아미노 말단에 ubiquitin-fusion degradation(UFD)을 일으키게 하는 Ubiquitin G76V(UbG76V)를 도입함으로써, 상기 단백질을 불안정화시킬 수 있는 발현벡터(예; pLVX-EYIdP)를 고안하였다. 이때, Ubiquitin G76V은, 야생형 유비퀴틴의 76번째 아미노산인 glycine을 valine으로 치환시킨 변이체로서, ubiquitin hydrolase 분해에 저항성을 갖는 형태이다.In the present invention, by introducing Ubiquitin G76V (Ub G76V ) which causes ubiquitin-fusion degradation (UFD) at the amino terminus of a protein that confers resistance to puromycin (for example, puromycin acetyl transferase (For example, pLVX-EYIdP), which can destabilize the cell line. At this time, Ubiquitin G76V is a variant in which glycine, the 76th amino acid of wild type ubiquitin, is substituted with valine, and is resistant to degradation of ubiquitin hydrolase.
또한, 본 발명에서는, 상기 발현벡터를 함유하는 렌티바이러스를 제작하여 숙주세포(HEK293)에 도입한 후 항생제 선택을 진행하고, 단백질 발현 및 형광세기를 확인한 결과, 대조군(pLVX-EYIP)에 비하여 목적 단백질(POI)의 발현량 및 형광세기가 3배 이상 증가함을 알 수 있었다. In addition, in the present invention, a lentivirus containing the above expression vector was prepared and introduced into a host cell (HEK293). Antibiotic selection proceeded, and protein expression and fluorescence intensity were checked. As a result, compared with the control (pLVX-EYIP) The expression level of protein (POI) and the fluorescence intensity were increased more than three times.
이러한 결과는, 본 발명의 발현벡터에 의해 목적 단백질(POI)이 고발현되는 안정한 세포주만을 선별할 수 있음을 의미하는 것이다. 즉, 본 발명에 의해, 세포 선별의 공정 및 시간을 대폭 단축할 수 있고, 고발현을 나타내는 세포의 비율이 상승함으로써 단시간에 효율적으로 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포를 확립할 수 있다.These results indicate that only stable cell lines highly expressing the target protein (POI) can be selected by the expression vector of the present invention. That is, according to the present invention, the process and time for cell sorting can be greatly shortened, and the ratio of cells exhibiting high expression can be increased, and cells capable of expressing the target protein gene at a high level in a short time can be established.
본 발명에 있어서, "발현 벡터"란 유전자 공학에 이용되는 벡터로서, 플라스미드 벡터가 바람직하나 이에 한정되지 않고, 예를 들면 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 및 다른 비플라스미드 벡터도 이용될 수 있다.In the present invention, "expression vector" is a vector used in gene engineering and is preferably a plasmid vector, but is not limited thereto. For example, virus vector, cosmid vector, bacterial artificial chromosome (BAC), yeast artificial chromosome (YAC ) And other non-plasmid vectors may also be used.
본 발명에 있어서, "선택 마커 유전자(selection marker gene)"란 목적 단백질의 유전자와 연결되어 발현 벡터에 삽입된 마커 유전자로서, 목적 유전자가 정상적으로 발현되는 세포를 선별 확인할 수 있게 한다. 이때, 선택 마커 단백질로는, 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "selection marker gene" is a marker gene inserted into an expression vector linked to a gene of a target protein, thereby enabling to identify cells in which a target gene is normally expressed. Examples of the selectable marker protein include, but are not limited to, puromycin acetyltransferase, neomycin phosphotransferase, hygromycin phosphotransferase, and the like.
본 발명에 있어서, "발현 카세트"란 프로모터에서부터 유전자 코드 서열, 터미네이터 서열까지의 유전자 발현의 단위를 의미하는 것으로, 인트론, 스페이서, 번역 증강 영역 등을 포함하는 경우도 있다. In the present invention, "expression cassette" means a unit of gene expression from a promoter to a gene coding sequence and a terminator sequence, and may include an intron, a spacer, a translation enhancing region, and the like.
본 발명에 있어서, 선택 마커 유전자 발현 카세트에 있어서의 "프로모터"는 동물 세포, 특히 포유류 세포에서 발현 가능한 프로모터이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 인간이나 마우스의 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터, 인간 헤르페스 단순 바이러스의 티미딘 키나제 유전자(HSV-tk) 프로모터 등의 바이러스에서 유래하는 것이거나; 또는 마우스 포스포글리세레이트-키나제1(phosphoglycerate-kinase1) 유전자(PGK) 프로모터 등의 비바이러스성 세포 유전자에서 유래하는 것이거나; 또는 유래가 상이한 프로모터의 혼성을 들 수 있다. In the present invention, the "promoter" in the selection marker gene expression cassette is not particularly limited as long as it is a promoter capable of being expressed in animal cells, particularly mammalian cells. However, human or mouse cytomegalovirus (CMV) promoter, monkey virus 40 SV40) promoter, the thymidine kinase gene (HSV-tk) promoter of human herpes simplex virus, or the like; Or a non-viral cell gene such as a phosphoglycerate-kinase 1 gene (PGK) promoter; Or the hybridization of different promoters derived from each other.
본 발명에 있어서, "항생제"란 단백질 합성 저해계 물질로서, 퓨로마이신(Puromycin), 네오마이신(Neomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 블라스티사이딘(Blasticidin), 게네티신(Geneticin)(G418), 제오신(Zeocin) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term "antibiotic" refers to a protein synthesis inhibitory substance selected from the group consisting of puromycin, neomycin, hygromycin, blasticidin, geneticin ( G418), Zeocin, and the like.
본 발명에 있어서, "IRES(Internal Ribosomal Entry Site)"란 리보솜이 직접 결합하는 mRNA상의 부위를 말하며, mRNA에서 CAP-비의존성 번역을 시작할 수 있도록 하는 RNA의 2차구조를 의미한다. 진핵세포에서 bicistronic하게 발현이 유도될 수 있도록, 첫번째 ORF와 두번째 ORF 사이에 IRES 서열을 삽입하여 bicistronic expression vector 형태로 이용할 수 있다. In the present invention, "IRES (Internal Ribosomal Entry Site) " refers to a region on an mRNA to which a ribosome directly binds, and refers to a secondary structure of RNA that enables CAP-independent translation in mRNA. In order to induce bicistronic expression in eukaryotic cells, an IRES sequence may be inserted between the first ORF and the second ORF and used as a bicistronic expression vector.
본 발명에 있어서, "목적 단백질(POI)"은 항체, 호르몬, 백신, 형광단백질 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "target protein (POI)" includes, but is not limited to, an antibody, a hormone, a vaccine, and a fluorescent protein.
본 발명에 있어서, 목적 단백질(POI) 발현 카세트, IRES 및 선택마커 발현 카세트의 배치 순서는, 목적 단백질(POI)의 발현이 가능한 한 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 목적 단백질(POI) 발현 카세트, IRES 및 선택마커 발현 카세트 순서로 상류로부터 하류로 향하여 배치한다. 이들 3개의 요소는 서로 직접 연결되어 있을 필요는 없고, 원하는 바에 따라 인트론, 스페이서, 번역 증강 영역 등을 사이에 가질 수도 있다.In the present invention, the arrangement order of the target protein (POI) expression cassette, the IRES and the selection marker expression cassette is not particularly limited as far as the expression of the target protein (POI) is possible, And the selection marker expression cassette in the order from the upstream side to the downstream side. These three elements need not be directly connected to each other, but may have an intron, a spacer, a translation enhancement region, etc., as desired.
또한, 본 발명은, 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 얻어진 형질전환세포를 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a transformed cell obtained by transforming a host cell with the above expression vector.
본 발명에 있어서, "숙주세포"는 재조합 단백질의 생산에 일반적으로 이용되는 사람 세포(HEK293, PER.C6, HKB11, HT1080 F2N 등) 외에도, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 원숭이 신장세포(Vero), 마우스 미엘로마 세포(NSO), 마우스 골수종 세포(SP2/0), 베이비 햄스터 키드니 세포(BHK-21) 등의 포유류 유래의 세포를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않고 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 개, 소, 말, 양, 원숭이, 돼지 등의 동물 유래의 세포 등을 넓게 도입 대상으로 할 수 있다. 또한, 대장균 등의 세균 세포나 효모, 곤충 세포 등을 이용한 단백질 생산 시스템에도 응용할 수 있다.In the present invention, "host cell" includes Chinese hamster ovary cells (CHO), monkey kidney cells (Vero), as well as human cells (HEK293, PER.C6, HKB11, HT1080 F2N, etc.) commonly used for the production of recombinant proteins. , Mouse mammalian cells (NSO), mouse myeloma cells (SP2 / 0), and baby hamster kidney cells (BHK-21), but the present invention is not limited thereto. , Mammals, rabbits, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, pigs, and the like. It can also be applied to a protein production system using bacterial cells such as Escherichia coli, yeast, insect cells and the like.
본 발명에 있어서, 숙주세포의 "형질전환 방법"은 제한이 없으며, 예를 들면 바이러스 감염법(tranduction), 리포펙션법, 인산칼슘법, 전기천공법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션 등을 이용할 수 있다.In the present invention, the "transformation method" of the host cell is not limited, and for example, a virus infection method, a lipofection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a DEAE dextran method, .
또한, 본 발명은, 상기 형질전환 세포를 항생제로 선택하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 고발현 세포주 확립방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for establishing a highly expressing cell line of a target protein, comprising the step of selecting the transformed cell as an antibiotic.
본 발명에 있어서, 항생제 선택에 사용하는 항생제 농도는 일반적으로 사용되는 농도의 범위에서 고발현 세포의 농축이 가능하지만, 조금 높은 농도가 바람직하다. 최적인 농도는 숙주세포나 이용하는 배지의 종류에 따라 따르며, 이들 농도의 설정 방법은 당업자에게는 공지이고, 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, HEK293 세포를 배양하고 퓨로마이신 내성 유전자 발현 카세트를 이용한 경우의 퓨로마이신의 농도로서는 2μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 10μg/ml 이상이다.In the present invention, the concentration of antibiotics used for antibiotic selection can be increased in the range of generally used concentration, but a higher concentration is preferable. The optimum concentration depends on the type of the host cell or the medium to be used, and the method for setting these concentrations is well known to those skilled in the art and can be appropriately set. For example, when the HEK293 cells are cultured and the puromycin-resistant gene expression cassette is used, the concentration of puromycin is 2 μg / ml or more, more preferably 5 μg / ml or more, and even more preferably 10 μg / ml or more.
본 발명의 선별방법을 이용하면, 항생제 선택 후에도 생존하는 세포군(폴리클론)의 상태로 목적 단백질 생산량이 유의하게 상승하고 있어, 이들 세포군으로부터 세포를 단리하고 배양함으로써 용이하게 고발현을 나타내는 세포주(모노클론)를 취득할 수 있다. When the selection method of the present invention is used, the target protein production amount is significantly elevated in the state of the cell group (polyclone) that survives even after the selection of the antibiotic, and by isolating and culturing the cells from these cell groups, Clone) can be acquired.
본 발명에 있어서, 세포의 발현 수준은 리포터 유전자의 발현량에 의해 확인할 수 있으며, 예를 들면 YFP(Yellow Fluorescent Protein; 황색 형광 단백질), GFP(Green Fluorescent Protein; 녹색 형광 단백질), Luciferase 유전자 등의 형광 단백질 유전자를 포함하는 발현 카세트를 본 발명의 발현 벡터에 도입하고, 형광현미경 또는 FACS(fluorescence activated cell sorting; 형광 활성화 세포 분석기) 등의 유세포 분석기를 이용하여 형광 강도를 해석함으로써 확인할 수 있다. 또한, 리포터 유전자에 한하지 않고, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; 효소 결합 면역흡착 측정법), 효소 면역 측정법(EIA) 등을 이용함으로써 항체 등의 목적 단백질의 발현량을 분석할 수도 있다.
In the present invention, the expression level of a cell can be confirmed by the expression level of a reporter gene, and for example, the expression levels of YFP (Yellow Fluorescent Protein), GFP (Green Fluorescent Protein) and Luciferase gene It can be confirmed by introducing an expression cassette containing a fluorescent protein gene into the expression vector of the present invention and analyzing the fluorescence intensity using a flow cytometer such as a fluorescence microscope or a fluorescence activated cell sorting (FACS). In addition, the expression amount of a target protein such as an antibody can be analyzed by using an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) or an enzyme immunoassay (EIA) instead of the reporter gene.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1: 불안정화 1: destabilization 선택마커Selection marker 발현벡터 제작 Production of expression vector
목적 단백질을 높은 수준으로 발현하는 안정한 세포주 확립을 위한 첫 단계로, 불안정화 선택마커(destabilized selective marker)가 발현되는 발현벡터를 제조하였다. An expression vector expressing a destabilized selective marker was prepared as a first step for establishing a stable cell line expressing a high level of a target protein.
우선, EF1a 프로모터, IRES, 및 Puromycin acetyl transferase 유전자(Puro)를 함유하는 벡터 pLVX-EF1a-IRES-Puro(이하, "pLVX-EIP")((주)Clontech)를 구입하여, PAC(Puromycin acetyl transferase)의 아미노 말단에 UFD(ubiquitin-fusion degradation)를 일으키게 하는 ubiquitin G76V(이하 Ub76V)를 도입하여 "pLVX-EIdP"를 제작한 후, Transgene의 발현 정도를 형광으로 쉽게 비교하기 위하여 YFP(yellow fluorescent protein)를 pLVX-EIP와 pLVX-EIdP에 각각 도입하여 최종적으로 pLVX-EYIP와 pLVX-EYIdP를 얻었다.First, a vector pLVX-EF1a-IRES-Puro (hereinafter referred to as "pLVX-EIP") (Clontech) containing the EF1a promoter, IRES and the Puromycin acetyl transferase gene (Puro) ) ubiquitin of the causing the UFD (ubiquitin-fusion degradation) to the amino terminus G76V (hereinafter Ub 76V) the introduction to "pLVX-EIdP" after, YFP (yellow fluorescent to the expression level of Transgene to facilitate comparison to the fluorescence produced protein) was introduced into pLVX-EIP and pLVX-EIdP, respectively, and finally pLVX-EYIP and pLVX-EYIdP were obtained.
구체적인 방법은 하기와 같다.
The concrete method is as follows.
1-1. 1-1. pLVXpLVX -- EIdPEIdP 제작 making
pLVX-EIP((주)Clontech)를 주형으로 하고, 프라이머쌍으로서 5'-aga cga cct tcc atg cat acc gag tac aag ccc-3' 및 5'-ggg ctt gta ctc ggt atg cat gga agg tcg tct-3'를 사용하여 site-directed mutagenesis를 시행함으로써 pLVX-EIP의 PAC(Puromycin acetyl transferase) 아미노 말단에 NsiI restriction site를 도입하고, 이를 pLVX-EF1a-IREs-NsiI-Puro로 명명하였다. 5'-aga cga cct tcc atg cat acc gag tac aag ccc-3 'and 5'-ggg ctt gta ctc ggt atg cat gga agg tcg tcg-3' as a primer pair using pLVX-EIP (Clontech) 3 ', site-directed mutagenesis was performed to introduce the NsiI restriction site at the amino terminus of PAC (Puromycin acetyl transferase) of pLVX-EIP and named pLVX-EF1a-IREs-NsiI-Puro.
한편, UbG76V-Puro 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머쌍으로서 5'-tta tgc atg tgc aga ttt tcg tg-3' 및 5'-ttc tgc agc ac caca cct ctg-3'로 PCR 증폭을 시행한 후, NsiI/PstI으로 절단한 단편을 상기 pLVX-EF1a-IREs-NsiI-Puro의 NsiI 위치에 삽입하여 "pLVX-EIdP"을 얻었다.
On the other hand, PCR was amplified using 5'-tta tgc atg tgc aga ttt tcg tg-3 'and 5'-ttc tgc agc ac caca ctg-3' as a primer pair using the Ub G76V -Puro plasmid as a template , And a fragment digested with NsiI / PstI was inserted at the NsiI site of pLVX-EF1a-IREs-NsiI-Puro to obtain "pLVX-EIdP".
1-2. 1-2. pLVXpLVX -- EYIPEYIP 와 Wow pLVXpLVX -- EYIdPEYIdP 제작 making
YFP(yellow fluorescent protein) 유전자를 포함하는 pcDNA3.1-hygro-YFP 벡터를 NheI 및 XbaI으로 절단하여 YFP 유전자 단편만을 분리하여, 상기 실시예 1-1에서 얻어진 pLVX-EIP 및 pLVX-EIdP의 XbaI restriction site에 각각 삽입한 후, 이들 플라스미드를 pLVX-EYIP와 pLVX-EYIdP라고 명명하였다(도 3 참조).
The pcDNA3.1-hygro-YFP vector containing the YFP (yellow fluorescent protein) gene was digested with NheI and XbaI to isolate only the YFP gene fragment. The XbaI restriction of pLVX-EIP and pLVX-EIdP obtained in Example 1-1 site, and these plasmids were named pLVX-EYIP and pLVX-EYIdP (see FIG. 3).
실시예Example 2: 2: LentivirusLentivirus 제작 making
실시예 1에서 제작된 pLVX-EYIP 또는 pLVX-EYIdP를 함유하는 2종류의 렌티바이러스를 제작하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. To prepare two kinds of lentiviruses containing pLVX-EYIP or pLVX-EYIdP prepared in Example 1, the following experiment was conducted.
우선, 숙주세로로서 HEK293T(Human Embryonic Kidney Cell 293T) 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 6웰 플레이트에 7x105세포/웰의 농도로 접종한 후 24시간 뒤에 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교체하였다. 이후, pLVX-EYIP 또는 pLVX-EYIdP와, packaging vector인 psPAX2(1.2ug) 및 pMD2G(0.4ug)을 4:3:1의 비율로 총 3ug이 되도록 HEK293T 세포에 밤새 트랜스펙션킨 후, 다음날 10% FBS와 항생제가 포함된 DMEM/F12 배지로 교체하고, 24시간 후 1차 바이러스 수확을 진행하였다. EYIP와 EYIdP 렌티바이러스가 포함된 배지를 1.5ml 튜브에 모아서 pellet down 후 200ul씩 분주하여 -80℃에 냉동 보관하였다. 플레이트의 웰에 새 배지를 교체하여 24시간 후 위와 같은 방법으로 2차 바이러스 수확을 진행하였다.
First, HEK293T (Human Embryonic Kidney Cell 293T) cells were inoculated in a DMEM medium containing 10% FBS at a concentration of 7 × 10 5 cells / well on a 6-well plate as a host length, and after 24 hours, DMEM medium . Then, pLVX-EYIP or pLVX-EYIdP and packaging vectors psPAX2 (1.2 ug) and pMD2G (0.4 ug) were transfected overnight in HEK293T cells at a ratio of 4: 3: The medium was replaced with DMEM / F12 medium containing FBS and antibiotics, and the first virus was harvested 24 hours later. The medium containing EYIP and EYIdP lentivirus was collected in a 1.5 ml tube, pelleted and dispensed in 200 ul each, and stored frozen at -80 ° C. After replacing the new medium with the wells of the plate, the secondary virus harvesting was carried out in the same manner as described above.
실시예Example 3: 3: LentivirusLentivirus TransductionTransduction
실시예 2에서 제조된 2종류(EYIP와 EYIdP)의 YFP 발현 렌티바이러스를 HEK293A(Human Embryonic Kidney Cell 293A) 세포주에 도입하기 위해, 다음의 실험을 수행하였다. In order to introduce the YFP-expressing lentivirus of the two kinds (EYIP and EYIdP) prepared in Example 2 into the HEK293A (Human Embryonic Kidney Cell 293A) cell line, the following experiment was conducted.
우선, HEK293A 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 24웰 플레이트에 1x104세포/웰의 농도로 접종하였다. 24시간 뒤에 EYIP와 EYIdP lentivirus 200ul에, 바이러스와 숙주세포의 결합력을 높혀 감염도(infectivity)를 증가시키기 위하여 polybrene을 8ug/ml 농도로 넣고 DMEM 배지 200ul와 잘 혼합하여 HEK293A에 감염시켰다. 바이러스 감염 15시간 후, 새로운 배지로 교체하고, 72시간 후 puromycin을 0, 2, 10ug/ml의 농도로 각각 처리하여 selection을 진행하였다. First, by using a DMEM medium containing 10% FBS for HEK293A cells were inoculated with 1x10 4 cells / well density in a 24 well plate. Twenty-four hours later, EYIP and EYIdP lentivirus 200ul were infected with HEK293A by mixing well with 200ul of DMEM medium at a concentration of 8 ug / ml of polybrene in order to increase the infectivity of viruses and host cells. After 15 hours of virus infection, the medium was replaced with fresh medium. After 72 hours, puromycin was treated at 0, 2, and 10 ug / ml, respectively.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 렌티바이러스에 의해 각 발현벡터가 숙주세포 게놈에 안정하게 integration되어, YFP가 안정하게 발현되는 selected HEK293A-LVX-EYIP 세포주(이하, 293A-LVX-EYIP-P0,2,10) 및 HEK293A-LVX-EYIdP 세포주(이하, 293A-LVX-EYIdP-P0,2,10)가 확립되었음을 확인하였다.
As a result, as shown in Fig. 4, the selected HEK293A-LVX-EYIP cell line (hereinafter referred to as 293A-LVX-EYIP-P0), in which each expression vector was stably integrated into the host cell genome by lentivirus and YFP was stably expressed , 2,10) and HEK293A-LVX-EYIdP cell lines (hereinafter, 293A-LVX-EYIdP-P0,2,10) were established.
실시예Example 4: 4: WesternWestern BlotBlot
실시예 3에서 제조된 2종류의 안정한 세포주에 대하여, YFP 발현량을 확인하기 위하여, 다음의 방법으로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다.Western blotting was carried out by the following method to confirm the expression amount of YFP on the two kinds of stable cell lines prepared in Example 3.
우선, 실시예 3에서 농도별로(0, 2, 10ug/ml) 항생제 선택된 293A-LVX-EYIP-P0,2,10 세포와 293A-LVX-EYIdP-P0,2,10 세포를, 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 6웰 플레이트에 5x105세포/웰의 농도로 접종하였다. 24시간 후 PBS-Triton lysis buffer 200ul를 세포에 처리하여 lysis시킨 후, 세포를 1.5ml 튜브에 모아 13,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상층액만 따로 모아 단백질 정량을 실시한 후 단백질 양이 20ug이 되도록 5× Sample buffer를 넣어서 샘플을 만들고 100℃에서 10분간 가열하여 단백질을 변성시켰다. First, in Example 3, 293A-LVX-EYIP-P0,2,10 cells and 293A-LVX-EYIdP-P0,2,10 cells selected with antibiotics (0, 2, 10 ug / Containing DMEM medium at a concentration of 5 x 10 cells / well in a 6-well plate. Twenty-four hours later, the cells were lysed by treating with 200 μl of PBS-Triton lysis buffer, and the cells were collected in a 1.5 ml tube and centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. After collecting the supernatant alone, The sample was prepared by adding 5 x sample buffer to 20 ug, and the protein was denatured by heating at 100 캜 for 10 minutes.
10% SDS-PAGE gel에 상기 샘플을 loading한 후 125V에서 1시간 이상 전기영동시킨 후, NC membrane을 이용하여 통상의 방법으로 transfer 및 blocking을 진행하였다. 1시간 후, 1차 항체인 항-YFP, 항-PuroR, 항-Actin 항체를 4℃에서 밤새 배양하고, 다음날 1× PBST 버퍼로 membrane을 3번 세척한 후 2차 항체를 결합시켰다. 이때, 2차 항체로서 YFP는 anti-rabbit, PuroR은 anti-rat, Actin은 anti-goat로 1:5000의 비율로 상온에서 1시간 처리하였다. 이후, 1× PBST 버퍼로 membrane을 3번 세척하고 ECL solution을 membrane에 처리한 후 현상하여, YFP, Ub-PuroR, PuroR, Actin의 밴드 양상을 확인하였다.After loading the sample on 10% SDS-PAGE gel, electrophoresis was carried out at 125 V for more than 1 hour, and transfer and blocking were carried out using an NC membrane by a conventional method. After 1 hour, the primary antibodies anti-YFP, anti-PuroR and anti-Actin antibodies were incubated overnight at 4 ° C, and the membrane was washed 3 times with 1 × PBST buffer the following day and then the secondary antibody was bound. At this time, YFP as a secondary antibody was treated with anti-rabbit, PuroR as anti-rat and Actin as anti-goat at a ratio of 1: 5000 at room temperature for 1 hour. After that, membrane was washed 3 times with 1 × PBST buffer, ECL solution was treated on the membrane, and developed, and band patterns of YFP, Ub-PuroR, PuroR and Actin were confirmed.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 항생제 저항 단백질을 불안정화시킨 본 발명의 발현벡터(EYIdP)로 형질전환된 세포의 경우에는, 실제 Ubiquitin G76V가 Puromycin acetyltransferase의 N-말단에 부가되어 전기영동상의 shift가 관찰되었다. 또한, 본 발명의 경우, 일반적인 발현벡터(EYIdP)에 비하여 형광단백질(YFP)의 발현량이 3배 이상 증가하였으며, 특히 항생제(puromycine)의 농도가 높을수록 발현량은 더욱 증가하였다.
As a result, as shown in FIG. 5, in the case of cells transformed with the expression vector (EYIdP) of the present invention destabilizing antibiotic resistance protein, Ubiquitin G76V was actually added to the N-terminal of Puromycin acetyltransferase, Was observed. In the present invention, the expression level of fluorescent protein (YFP) was increased more than 3 times as compared with a general expression vector (EYIdP). Especially, as the concentration of antibiotic (puromycine) was higher, the expression level was further increased.
실시예Example 5: 5: 형광세기Fluorescence intensity 측정 Measure
실시예 4를 통하여 본 발명의 발현벡터(pLVX-EYIdP)에 의해 형광단백질(YFP)의 발현량이 월등히 증가하였음을 확인하였으므로, 이에 비례하여 형광세기도 증가하였는지 더욱 확인하였다.In Example 4, it was confirmed that the expression level of fluorescent protein (YFP) was markedly increased by the expression vector (pLVX-EYIdP) of the present invention. Thus, it was confirmed that the fluorescence intensity also increased in proportion thereto.
우선, 실시예 3에서 농도별로(0, 2, 10ug/ml) 항생제 선택된 293A-LVX-EYIP-P0,2,10 세포와 293A-LVX-EYIdP-P0,2,10 세포를, 10% FBS를 포함한 DMEM 배지를 이용하여 6웰 플레이트에 2x105세포/웰의 농도로 접종한 후, 24시간 지나 형광 현미경을 이용하여 1000배에서 형광세기를 관찰하였다. First, in Example 3, 293A-LVX-EYIP-P0,2,10 cells and 293A-LVX-EYIdP-P0,2,10 cells selected with antibiotics (0, 2, 10 ug / after using the DMEM culture medium was inoculated with 2x10 5 cells / well in 6 well plates containing a concentration of, by using a fluorescence microscope over 24 hours to observe the fluorescence intensity at 1000 times.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 발현벡터(pLVX-EYIdP)로 형질전환된 세포의 경우 형광세기가 일반적인 발현벡터(pLVX-EYIP)에 비하여 현저히 증가하였으며, 특히 항생제(puromycine)의 농도가 높을수록 형광세기는 더욱 증가하였다. 이로써, 본 발명의 발현벡터에 의해 목적 단백질(POI)이 고발현되는 안정한 세포주가 확립되었음을 알 수 있다.
As a result, as shown in FIG. 6, the fluorescence intensity of the cells transformed with the expression vector of the present invention (pLVX-EYIdP) was significantly increased compared with that of the normal expression vector (pLVX-EYIP) The higher the concentration, the stronger the fluorescence intensity. Thus, it can be seen that a stable cell line in which the target protein (POI) is highly expressed is established by the expression vector of the present invention.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined in the appended claims. It will be understood that the invention may be varied and varied without departing from the scope of the invention.
Claims (10)
(i) 목적 단백질(POI)을 암호화하는 유전자 발현 카세트;
(ⅱ) 내부리보좀유입점(Internal Ribosomal Entry Site, IRES)을 암호화하는 유전자; 및
(ⅲ) 단백질 불안정화 서열이 연결된 항생제 선택 마커 유전자 발현 카세트.An expression vector for establishing a highly expressing cell line, comprising:
(i) a gene expression cassette encoding the target protein (POI);
(Ii) a gene encoding an internal ribosomal entry site (IRES); And
(Iii) an antibiotic selection marker gene expression cassette to which a protein destabilizing sequence is linked.
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