KR20160077852A - Method for manufacturing high purity free form-astaxanthin - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 고순도 유리형 아스타잔틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a process for preparing high purity, free-form astaxanthin.
카로티노이드(carotenoid)류는 동식물의 조직·기관, 해초류, 미생물의 균체를 포함해 자연계에 광범위하게 분포하는 색소이다. 카로티노이드류는 식품 또는 음료의 착색제로서의 식품첨가물의 분야 등에 목적으로 그 용도가 확대되고 있다. 카로티노이드류 중 하나로 잔토필(xanthophyll)류가 포함되는데, 아스타잔틴(astaxanthin), 칸타잔틴(canthaxanthin), 제아잔틴(zeaxanthin) 등은 산소 원자를 포함한 잔토필(xanthophylls)에 속하며 우수한 항산화 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. Carotenoids are widely distributed in nature, including microbial cells, tissues and organs of plants and animals, seaweeds, and microorganisms. Carotenoids have been used for the purpose of food additives as a coloring agent for food or beverage. One of the carotenoids includes xanthophylls such as astaxanthin, canthaxanthin and zeaxanthin, which belong to xanthophylls including oxygen atoms and have excellent antioxidative effects. .
특히, 아스타잔틴은 비타민 E의 100~1,000배, 베타카로틴의 약 40배의 강력한 항산화 작용을 하며, 항동맥경화 작용, 항당뇨 작용, 면역 활력 작용, 항스트레스 작용 등이 보고되고 있다. 그러나 현재 아스타잔틴은 다양항 생리활성에도 불구하고 산업적으로 응용이 미비한 실정이다. 이러한 이유 중 하나는 아스타잔틴의 구조에 있다. 화학 합성법에 의해 공업적으로도 생산되고 있으나, 안전성이 불안한 점에서 천연물에서 유래한 것이 요구되고 있다. 아스타잔틴은 새우, 크릴새우, 게 등의 갑각류, 연어, 참돔 등의 어류, 녹조 헤마토코쿠스(haematococcus)등의 해조류, 적색 효모 파피아(phaffia)등의 효모류 등 특히 해양에 광범위하게 분포한다. In particular, astaxanthin has a strong antioxidant activity of 100 to 1,000 times that of vitamin E and about 40 times that of beta carotene, and has been reported to have anti-arteriosclerosis, anti-diabetic effect, immunostimulatory action, and anti-stress action. However, at present, astaxanthin is not industrially applied despite various antimicrobial activities. One of these reasons is in the structure of astaxanthin. Although it is produced industrially by a chemical synthesis method, it is required to be derived from a natural product in view of safety instability. Astaxanthin is widely distributed in marine, especially shrimp, crab shrimp, crustaceans such as crabs, fishes such as salmon, red sea bream, seaweeds such as green algae haematococcus , and yeast such as red yeast phaffia do.
특히, 헤마토코쿠스 플루비알리스(haematococcus pluvialis)에서 많은 양의 아스타잔틴을 수득할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 천연 유래의 유리형 아스타잔틴을 공급하는 방법으로서 가장 유리한 방법으로 알려져 있다. 그러나 녹조류 헤마토코쿠스 플루비알리스에서 아스타잔틴을 추출할 경우, 에스터형 아스타잔틴을 얻을 수 있으나 해조류의 특성상 두꺼운 세포벽으로 인해 협잡물이 다량 존재하며 에스터형 아스타잔틴 이외에 여러 색소들과 함께 이루어져 있어, 헤마토코쿠스 플루비알리스로부터 수득하는 아스타잔틴은 순도가 현저하게 낮다는 단점이 있었다.In particular, hematococcus pluvialis ( haematococcus Pluvialis is known to be capable of obtaining a large amount of astaxanthin, and thus is known as the most advantageous method as a method of supplying glass-derived astaxanthin from natural sources. However, when extracting astaxanthin from green alga Hematococcus pluvialis, ester-type astaxanthin can be obtained, but due to the nature of seaweed, there are large amounts of contaminants due to thick cell walls, and in addition to ester-type astaxanthin, And the astaxanthin obtained from Hematococus pluvialis had a disadvantage that purity was remarkably low.
이러한 단점을 극복하기 위해, 조(crude) 잔토필을 물 존재하에서 리파아제와 작용시켜 협잡물 중 하나인 중성 지질을 분해되도록 하고 그 리파아제 효소 처리액을 유수(油水) 분리하여 분취한 오일층으로부터 유리 지방산을 증류로 아스타잔틴과 분리시켜 농축 정제하는 방법(일본 공개 특허 제2002-218994호)이 개발되었으나, 본 방법에 따르면 리파아제와의 효소반응에 소요되는 시간이 길고, 오일층에는 아스타잔틴 외에 다른 색소들이 다량 포함되어 있어 오일층으로부터 고순도 아스타잔틴을 수득하기 위해서는 분리정제 과정이 필수적이므로 생산경제성이 떨어진다는 단점이 있었으며, 최종적으로 수득할 수 있는 아스타잔틴의 최대 함량이 28.33%에 불과하다는 단점이 있었다. 또한, 초임계 유체 추출법을 이용하여 아스타잔틴을 얻는 방법(일본 공개 특허 제2004-041147호)이 있으나, 초임계 유체 추출을 위해 10시간 이상이 소요될 뿐만 아니라 초임계 추출에도 불구하고 아스타잔틴을 60 질량% 이하로 수득하는데 불과해 생산경제성이 매우 낮았다. 또한, 파라코쿠스 세균(E-396주) 배양물을 80℃ 이상의 온도 조건에 물과 에탄올 혼합용매로 추출처리하는 방법(대한민국 등록 특허 제10-1154907호)이 있으나, 이러한 처리공정과 특정 세균을 이용하여도 아스타잔틴의 순도가 0.5 내지 60% 이하에 불과하다. 또한, 대한민국 등록 특허 제10-0431359호는 파피아 로도지마 돌연변이 균주에서 아스타잔틴을 수득하는 방법에 관한 것으로, 분리된 총 색소 중 80% 이상의 함량으로 아스타잔틴을 얻을 수 있다고 하나, 균주를 사멸시키는 단계를 거쳐 생존한 균주를 다시 재배양하여 성장이 빠르고 윤기가 있고 붉은색이 짙은 균주들을 선별하는 단계를 수회 반복해야 하는바, 이러한 선별 단계는 과학적인 factor를 가지고 제조공정상의 밸리데이션을 한 방법이 아니며 산업에 적용 시 생산자의 주관적 판단에 따라 선별 여부가 결정된다는 점에서 재현성이 떨어질 뿐만 아니라, 이러한 단계를 통해 획득한 분리 균주를 다시 배지에서 4~6일 동안 배양하는 등 생산 경쟁성이 낮다는 단점이 있다.
In order to overcome this disadvantage, the crude zotapyl is reacted with lipase in the presence of water to cause the neutral lipid, which is one of the contaminants, to be decomposed, and the lipase enzyme-treated liquid is separated from the oil layer by separating the oil- (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-218994) was developed by separating it from astaxanthin by distillation (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-218994). However, according to this method, the time required for the enzymatic reaction with lipase is long, and besides astaxanthin Since a large amount of other pigments are contained, separation and purification processes are indispensable for obtaining high-purity astaxanthin from the oil layer, resulting in a disadvantage in that the production economical efficiency is low and the maximum amount of astaxanthin finally obtained is only 28.33% There was a drawback. In addition, there is a method of obtaining astaxanthin using supercritical fluid extraction (Japanese Laid-Open Patent Application No. 2004-041147), but it takes more than 10 hours for supercritical fluid extraction, To 60% by mass or less, resulting in a very low production cost. In addition, there is a method of extracting a culture of Paracoccus bacterium (E-396 strain) with a mixed solvent of water and ethanol at a temperature of 80 ° C or higher (Korean Patent Registration No. 10-1154907). However, The purity of astaxanthin is only 0.5 to 60% or less. Korean Patent No. 10-0431359 relates to a method for obtaining astaxanthin in a mutant strain of Papiarodojima, wherein astaxanthin can be obtained in an amount of 80% or more of the total pigment isolated, The surviving strains were then re-cultured, and a step of selecting the strains which were fast growing, lustrous and red-colored was repeated several times. This sorting step was carried out with a scientific factor and validation of the manufacturer's normal In addition, not only the reproducibility is deteriorated because the selection is made according to the subjective judgment of the producer when applied to the industry, and the production of the competitive strain such as culturing the separated strain obtained in this step again for 4 to 6 days in the medium There is a drawback that it is low.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 간편하고 짧은 시간에 높은 재현성을 가지면서 아스타잔틴의 손실율을 최소화한 천연 유래의 고순도 유리형 아스타잔틴을 수득하는 방법을 제공하는데 있다.
Accordingly, a problem to be solved by the present invention is to provide a method for obtaining a high purity free-form glassy astaxanthin having a high reproducibility in a short time and minimizing loss of astaxanthin.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 저순도 유리형 아스타잔틴 함유 시료로부터 고순도 유리형 아스타잔틴을 제조하는 방법을 제공한다. In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method for producing high purity glassy astaxanthin from a low purity free astaxanthin-containing sample using column chromatography.
보다 구체적으로, 본 발명은 S1) 저순도 유리형 아스타잔틴 함유 시료를 실리카 겔에 로드(load)하는 단계; 및 S2) 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합물을 전개시키는 단계를 포함하는, 고순도 유리형 아스타잔틴 제조방법을 제공한다. More particularly, the present invention relates to a method for the preparation of a microcapsule comprising the steps of: S1) loading a low purity free-form astaxanthin-containing sample into silica gel; And S2) developing a mixture of hexane, ethyl acetate or a mixture thereof.
본 발명에 따르면, 일반적인 컬럼 크로마토그래피를 1회 수행하는 간단하고 저비용의 공정만으로도 유리형 아스타잔틴을 고순도로 제조할 수 있으므로 경제적으로 유용하게 사용할 수 있는 방법이다.
According to the present invention, since free astaxanthin can be produced with high purity only by a simple and low-cost process in which general column chromatography is performed once, it is economically useful.
'아스타잔틴'은 베타-카로틴의 양쪽의 벤젠고리에 하이드록실기와 케톤기가 부가되어 있는 3,3'-디히드록시-β-카로틴-4,4'-디온(3,3'-dihydroxy-β-carotene-4,4'-dione)을 말하며, 에스터형 아스타잔틴 또는 비-에스터형 아스타잔틴으로 나눠질 수 있다. 천연 유래의 아스타잔틴은 주로 에스터형 아스타잔틴이나, 비-에스터형 아스타잔틴도 연어에서 생성되는 것으로 보고되는 등 그 존재가 확인된 바 있다(Higuera-Ciapara et al. 2006 등). 아스타잔틴의 식이 형태가 에스터형인지 혹은 비-에스터형인지와 무관하게, 인간 혈액에서 발견되는 아스타잔틴은 모두 비-에스터형 아스타잔틴인 것으로 알려져 있다(Okada et al. 2008; Osterlie et al. 2000; Coral-Hinostroza et al. 2004). 에스터형 아스타잔틴은 인간에게서 낮은 생물학적 이용도(bioavailability)를 나타내며(Coral-Hinostroza et al. 2004), 따라서 혈액으로 흡수되기 디에스터화(de-esterify)되어야 하고, 이를 위해 소화기관에서 가수분해되어야 한다. 이에, 인간에게 공급되는 아스타잔틴은 비-에스터형(유리형) 아스타잔틴인 것이 바람직하다.
'Astaxanthin' is a mixture of 3,3'-dihydroxy-β-carotene-4,4'-dione (3,3'-dihydroxy) with a hydroxyl group and a ketone group added to both benzene rings of β- -β-carotene-4,4'-dione), and can be divided into ester-type astaxanthin or non-ester-type astaxanthin. Astaxanthin from natural sources has been identified mainly in the form of ester-type astaxanthin, and non-ester-type astaxanthin in salmon (Higuera-Ciapara et al. 2006). Regardless of whether the dietary form of astaxanthin is ester or non-ester, all of the astaxanthin found in human blood is known to be non-ester-like astaxanthin (Okada et al. 2008; Osterlie et 2000; Coral-Hinostroza et al., 2004). The ester-type astaxanthin exhibits low bioavailability in humans (Coral-Hinostroza et al. 2004), and therefore must be de-esterified to be absorbed into the blood and hydrolyzed in the digestive tract . Thus, it is preferable that astaxanthin supplied to humans is non-ester (free) astaxanthin.
본 발명의 명세서에 있어서, 용어 '유리형 아스타잔틴(astaxanthin)'은 비-에스터형 아스타잔틴을 의미하고, 용어 '아스타잔틴(astaxanthin)'은 유리형 아스타잔틴 및 에스터형 아스타잔틴을 모두 총괄하여 지칭하며, 상기 에스터형 아스타잔틴에는 예컨대 아스타잔틴 모노에스터, 아스타잔틴 디에스터 등이 포함된다.
In the present specification, the term 'free astaxanthin' refers to non-ester type astaxanthin, and the term 'astaxanthin' refers to glass type astaxanthin and ester type astaxanthin, Tin are all collectively referred to as the ester type astaxanthin, and the ester type astaxanthin includes, for example, astaxanthin monoester, astaxanthin diester and the like.
이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by steps.
본 발명에 있어서, '저순도 유리형 아스타잔틴 함유 시료'는 유리형 아스타잔틴을 저순도로 함유하고 있어 이로부터 고순도 유리형 아스타잔틴을 제조하고자 하는 대상 시료라면 제한되지 않고 이용될 수 있으며, 시료에는 유리형 아스타잔틴 외에 협잡물이 포함될 수 있고, 상기 협잡물은 시료의 종류, 시료 준비 방법, 시료 준비 시기(계절) 등에 따라 그 성분의 종류, 함량, 배합비 등에 차이가 있을 수 있으며, 시료에 함유된 성분 중 유리형 아스타잔틴 외에는 모두 협잡물로 보며, 예컨대 에스터형 아스타잔틴도 협잡물에 해당되는 것으로 본다. In the present invention, the "low purity free astaxanthin-containing sample" contains low-purity free astaxanthin, so that any sample to be prepared from the high purity free astaxanthin can be used without limitation The samples may contain contaminants in addition to the glassy astaxanthin. The types of contaminants may vary depending on the kind of the sample, the method of preparing the sample, the timing of preparing the sample (season), the content thereof, Among the components contained in the sample, all of the components other than the glassy astaxanthin are regarded as impurities. For example, ester astaxanthin is considered to be a contaminant.
시료 내 유리형 아스타잔틴은 저순도로 포함되어 있으며, 상기 용어 '저순도'는 실리카 겔에 로드(load)하기 직전(즉, 추가의 처리 단계를 포함하지 않음)의 시료 내 유리형 아스타잔틴의 순도를 기준으로 하며, 바람직하게 0.0001% 이상, 0.001% 이상, 0.01% 이상, 0.1% 이상, 1% 이상 내지 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 10% 이하일 수 있고, 더욱 바람직하게 1% 이상 10% 이하, 가장 바람직하게 1% 이상 6% 이하일 수 있다. The glassy astaxanthin in the sample is of low purity and the term "low purity" refers to the glassy astaxanthin in the sample just prior to loading into the silica gel (ie, without additional processing steps) , Preferably not less than 0.0001%, not less than 0.001%, not less than 0.01%, not less than 0.1%, not less than 1% to not more than 30%, not more than 25%, not more than 20%, not more than 10% , More preferably 1% or more and 10% or less, and most preferably 1% or more and 6% or less.
대상 시료는 화학적 합성물일 수 있으나 바람직하게 천연물에서 유래된 시료이다. 상기 천연물에는 유리형 아스타잔틴을 수득할 수 있는 천연물이라면 제한되지 않고 포함될 수 있으며, 천연물 유래의 유리형 아스타잔틴은 천연물에서 생성 또는 분리된 산물이 유리형 아스타잔틴인 것에 한하지 않고 천연물에서 생성 또는 분리된 산물은 유리형 아스타잔틴 외의 물질이라 해도 추가 공정을 통해 유리형 아스타잔틴으로 전환된다면 천연물 유래의 유리형 아스타잔틴에 포함될 수 있다. 예컨대, 천연물에서 분리 또는 생성된 에스터형 아스타잔틴을 시료 준비 전처리 과정을 통해 유리형 아스타잔틴으로 전환시켜 시료로 준비할 수 있다. 상기 전처리 과정에는 에스터형 아스타잔틴을 유리형 아스타잔틴으로 전환시키기 위한 당업계 공지된 다양한 방법이 적용될 수 있고, 예컨대 생물학적 검화(saponication) (예. 에스터라제 처리 등) 또는 화학적 검화(saponication) (예. 강염기 처리)등이 적용될 수 있다. 천연물의 종류에는 예컨대 미세조류, 효모, 박테리아 및 곰팡이 등이 포함되며, 바람직하게 녹조류, 더욱 바람직하게 헤마토코쿠스 속, 더더욱 바람직하게, 헤마토코쿠스 플루비알리스, 헤마토코쿠스 라쿠스트리스, 헤마토코쿠스 카펜시스, 헤마토코쿠스 드로에바켄시스, 헤마토코쿠스 짐바비엔시스, 또는 이들의 2이상의 혼합물이 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 헤마토코쿠스 플루비알리스이다. 천연물에서의 아스타잔틴 합성율을 높이기 위해, 다양한 스트레스를 통해 아스타잔틴 합성을 활성화시키는 방법 등이 이용될 수 있고, 예컨대, 영양소 고갈, 강광, 활성산소, 고온, 건조 등의 스트레스를 단독 또는 조합하여 부가하는 방법이 이용될 수 있다. 상기 천연물의 태양에는 예컨대 천연물의 파쇄된 세포벽 분획, 생체, 사체, 건조체, 이의 배양물 또는 배양액, 또는 이의 추출물 등이 포함될 수 있다. 천연물 유래 시료는 당업계 공지된 방법으로 제작할 수 있으며, 또는 상업적으로 입수할 수도 있다. 보다 구체적으로, 헤마토코쿠스 속으로부터 시료를 제작하기 위해, 헤마토코쿠스 속 추출물을 준비할 수 있으며, 당업계 공지된 다양한 추출방법에 따라 추출조건(추출온도, 추출시간 등)을 조절할 수 있으나, 바람직하게 용매추출법을 이용할 수 있다. 용매추출을 위해, 당업계 공지된 다양한 용매를 이용할 수 있으나, 예컨대 유기용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 상기 유기용매에는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, tert-부탄올, 2-부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 에틸아세티이트, 이소부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 에틸포르메이트, n-프로필 아세테이트, 이소-프로필 아세테이트, 디클로로에탄, 메틸-에틸 케톤 및 이의 혼합물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 헤마토코쿠스 플루비알리스 건조체 대비 0.05 ~ 0.5 L/g의 아세톤을 첨가하고 실온에서 1 ~ 3 시간 동안 추출하고, 선택적으로 여과 및 감압농축하여, 헤마토코쿠스 플루비알리스 추출물을 준비할 수 있다. '실온'은 약 10 ~ 35 ℃의 온도를 의미한다. 헤마토코쿠스 플루비알리스 추출물에 존재하는 에스터형 아스타잔틴을 유리형 아스타잔틴으로 전환시키기 위해, 헤마토코쿠스 플루비알리스 추출물에 콜레스테롤 에스터라제를 첨가하여 30 ~ 40 ℃에서 0.5 ~ 1.5 시간 동안 반응시킨 후, 선택적으로 추출, 여과 및 농축하였다. The subject sample may be a chemical compound, but is preferably a sample derived from a natural product. The natural product may include, without limitation, any natural product capable of obtaining free astaxanthin. The free astaxanthin derived from natural products is not limited to glass astaxanthin, Can be incorporated into free astaxanthin from natural products if they are converted to free astatanthin by an additional process, even if they are substances other than glassy astaxanthin. For example, the ester-type astaxanthin isolated or produced from a natural product can be converted into free astatanthin through a sample preparation process and prepared as a sample. Various methods known in the art for converting ester astaxanthin into free astaxanthin can be applied to the pretreatment process, for example, biological saponification (e.g., esterase treatment) or chemical saponification ) (Eg strong base treatment) can be applied. Examples of the natural product include microalgae, yeast, bacteria, fungi and the like, and preferably green algae, more preferably hematococzus, still more preferably hematococzus fluvialis, , Hematococzukensis, hematococcus drooeobensis, hematococzum gibbbensis, or a mixture of two or more thereof, and most preferably hematococzus pluvialis. A method of activating astaxanthin synthesis through various stresses in order to increase the synthesis rate of astaxanthin in a natural product can be used. For example, stress such as nutrient depletion, strong light, active oxygen, high temperature, A method in which the addition is performed can be used. Examples of the natural product include a crushed cell wall fraction of a natural product, a living body, a carcass, a dried body, a culture or a culture thereof, or an extract thereof. Natural-product-derived samples can be produced by methods known in the art, or can be obtained commercially. More specifically, in order to prepare a sample from the genus Hematococcus, the genus Haematococcus extract can be prepared, and the extraction conditions (extraction temperature, extraction time, etc.) can be adjusted according to various extraction methods known in the art However, a solvent extraction method can be preferably used. For solvent extraction, various solvents known in the art can be used, but they can be extracted using, for example, an organic solvent, and the organic solvent includes methanol, ethanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, propyl acetate, isopropylacetate, dichloroethane, methyl acetate, isobutyl acetate, n-butyl acetate, ethyl formate, n-propyl acetate, iso-propyl acetate, dichloroethane, methyl - ethyl ketone, and mixtures thereof, and the like. According to a specific embodiment of the present invention, acetone in an amount of 0.05 to 0.5 L / g is added to the hematocookus pluvialis dried body, and the mixture is extracted at room temperature for 1 to 3 hours, selectively filtered and concentrated under reduced pressure, Cuspfluvialis extract can be prepared. "Room temperature" means a temperature of about 10 to 35 ° C. In order to convert the ester type astaxanthin present in the hematocoxin pluvialis extract into the free astatanthin, the cholesterol esterase is added to the hematococzual pluvialis extract, After reacting for 1.5 hours, it was selectively extracted, filtered and concentrated.
본 발명에 있어서, 준비된 시료를 실리카 겔에 로드(load)하고(S1 단계), 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합물을 전개시킨다(S2 단계). In the present invention, the prepared sample is loaded on silica gel (step S1), and hexane, ethyl acetate or a mixture thereof is developed (step S2).
준비된 시료의 100 - 150 배의 중량의 실리카 겔이 충진된 컬럼에 시료를 처리한 후, 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합물을 전개시켜, 협잡물을 제거하고 유리형 아스타잔틴만을 분리분획한다. The sample is treated with a column packed with silica gel of 100-150 times the weight of the prepared sample, and then hexane, ethyl acetate or a mixture thereof is developed to remove impurities and to separate only free astaxanthin.
바람직하게, 헥산을 1차 전개시키고, 헥산 및 에틸아세티이드의 혼합물을 2차 전개시키며, 보다 바람직하게 상기 헥산 및 에틸아세테이트 혼합물의 혼합비는 84:26 - 70:30 (v/v%), 84:26 - 75:25 (v/v%), 82:18 - 78:22 (v/v%). 가장 바람직하게 80:20 (v/v%)일 수 있다. Preferably, the hexane is first developed and the mixture of hexane and ethyl acetide is developed secondarily, more preferably the mixture ratio of hexane and ethyl acetate mixture is 84:26 to 70:30 (v / v%), 84:26 - 75:25 (v / v%), 82:18 - 78:22 (v / v%). Most preferably 80:20 (v / v%).
상기 용매 전개하여 얻은 분리분획물을 선택적으로 여과, 농축하는 정제 단계를 거칠 수 있다. The separated fraction obtained by solvent development can be subjected to a purification step of selectively filtering and concentrating the separated fraction.
본 발명에 따라 제조된 유리형 아스타잔틴의 순도는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 더욱 바람직하게 74% 이상일 수 있다.
The purity of the glassy astaxanthin prepared according to the present invention may be at least 50%, at least 60%, at least 70%, more preferably at least 74%.
본 발명에 따르면, 간편하고 짧은 시간에 높은 재현성을 가지면서 아스타잔틴의 손실율을 최소화한 천연 유래의 고순도 유리형 아스타잔틴을 수득할 수 있다.
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to obtain high-purity, free-flowing glassy astaxanthin having a high reproducibility in a short time and minimizing loss of astaxanthin.
도 1은 비교예 1(좌측), 실시예 1(중앙) 및 실시예 2(우측)의 박층크로마토그래피 결과를 도시한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 실시예 1의 액체크로마토그래피 결과를 도시한 것이고, 도 2c는 실시예 2의 액체크로마토그래피 결과를 도시한 것이다. 1 shows results of thin layer chromatography of Comparative Example 1 (left), Example 1 (center) and Example 2 (right).
Figs. 2A and 2B show the results of liquid chromatography of Example 1, and Fig. 2C show the results of liquid chromatography of Example 2. Fig.
본 발명의 상세한 발명은 이하에 주어지는 실시예에서 기술되며, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되므로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The following detailed description of the invention is set forth in the following examples, which are provided to illustrate the invention and are not to be construed as limiting the scope of the invention.
실시예 1Example 1
미파쇄 헤마토코쿠스 플루비알리스 동결건조물 50g을 아세톤 5L에 넣어 호모게나이져(Ultra-Turrax T25 basic, IKA-WERKE, Germany)를 사용하여 실온에서 2시간, 6500rpm에서 추출하여 여과한 후 감압농축시켰다. 이로써 미파쇄 헤마토코쿠스 플루비알리스 추출물 15g을 수득하였다. 50mM tris-buffer(PH 7.0) 5L를 제조한 후 콜레스테롤 에스터라제(Wako, 1,000 units, Japan)를 투입하여 4unit/mL 농도가 되도록 용해시켜 효소용액을 제조하였다. 미파쇄 헤마토코쿠스 플루비알리스 추출물 5g을 취하여 아세톤 5L로 용해시킨 후 제조된 효소용액과 37℃ 수욕상에서 45분간 반응시켰다. 혼합된 반응물에 황산나트륨 1kg, 석유에테르 3L를 넣어 1시간 동안 교반 후 2시간 정치 후 상층액을 취하였다. 취해진 상층액에 무수황산나트륨 1kg를 넣고 5분간 교반하여 여과한 후 여과액을 질소로 완전 농축한다. 이로써 저순도 유리형 아스타잔틴 농축물 4.5g을 수득하였다.50 g of freeze-dried Hematococcus pluvialis freeze-dried product was extracted with 5 L of acetone at 6500 rpm for 2 hours at room temperature using a homogenizer (Ultra-Turrax T25 basic, IKA-WERKE, Germany) . Thereby, 15 g of non-crushed Hematococcus pluvialis extract was obtained. 5 L of 50 mM tris-buffer (pH 7.0) was prepared, and cholesterol esterase (Wako, 1,000 units, Japan) was added thereto to dissolve the enzyme solution to a concentration of 4 units / mL. 5 g of unfractionated hematococzial pluvialis extract was dissolved in 5 L of acetone and reacted with the prepared enzyme solution for 45 minutes in a 37 ° C water bath. 1 kg of sodium sulfate and 3 liters of petroleum ether were added to the mixed reaction product, and the mixture was stirred for 1 hour and then allowed to stand for 2 hours, and the supernatant was taken. Add 1 kg of anhydrous sodium sulfate to the supernatant and stir for 5 minutes. After filtration, the filtrate is completely concentrated with nitrogen. 4.5 g of a low purity, free astaxanthin concentrate was obtained.
실시예 2 Example 2
실시예 1에서 얻은 농축물 2g을 중압액체크로마토그래피하였는바, 실리카겔 컬럼(RediSep® Rf 330g)에 헥산을 2시간 동안 전개시키고 헥산과 에틸아세테이트(95:5, 90:10, 85:15, 80:20 v/v% 순차적으로 각각 0.2시간동안)를 200mL/min로 전개시켰다. 헥산과 아세테이트의 혼합비 80:20 v/v%로 전개시킨 경우 Rf값은 약 0.1로 나타났고, 그 외의 혼합비 조건에서는 그 이하로 나타나 수치화하기 어려웠다. 분리분획한 후, 50℃에서 감압 농축하여 정제된 분말 36mg을 수득하였다.
Example 2g the concentrate obtained from the first medium pressure liquid chromatography hayeotneun bar, developed with hexane in a silica gel column (RediSep ® Rf 330g) for 2 hours and hexane and ethyl acetate (95: 5, 90:10, 85:15, 80 : 20 v / v% sequentially for 0.2 hour each) at 200 mL / min. The Rf value was about 0.1 when the mixture ratio of hexane and acetate was expanded to 80:20 v / v%. The separated fractions were concentrated under reduced pressure at 50 DEG C to obtain 36 mg of purified powder.
비교예 1Comparative Example 1
95%의 유리형 아스타잔틴을 가지는 표준품(Dr. Ehrenstorfer GmbH, Germany)을 구입하였다.
(Ehrenstorfer GmbH, Germany) with 95% free astaxanthin.
비교예 2Comparative Example 2
실시예 1에서 얻은 농축물 2g을 중압액체크로마토그래피하였는바, C18컬럼(RediSep® Rf 130g)에 100mL/min 유속으로 메탄올과 아세톤(3:1 v/v%) 0.5시간 동안 전개 시키고 아세톤 100%로 전개시켰다. 메탄올과 아세톤의 혼합비 3:1 v/v%로 전개시킨 경우 Rf값은 약 0.2로 나타났다. 분리분획한 후 50℃에서 감압농축하여 정제된 분말 1g을 수득하였다.
Example 1 concentrate 2g to medium pressure liquid chromatography hayeotneun bar, C18 column, obtained from methanol and acetone to 100mL / min flow rate on a (RediSep ® Rf 130g) (3 : 1 v / v%) developed and acetone 100% for 0.5 hours Respectively. When the mixture ratio of methanol and acetone was 3: 1 v / v%, the Rf value was about 0.2. The separated fractions were concentrated under reduced pressure at 50 ° C to obtain 1 g of purified powder.
실험예 1 : TLC 확인Experimental Example 1: TLC confirmation
상기 실시예 1, 실시예 2의 수득물과 비교예 1의 표준품을 각각 아세톤으로 녹여 동일한 농도인 1,000㎍/mL으로 제조하여 박층크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC)를 아래와 같은 조건으로 진행하였다. The obtained products of Examples 1 and 2 and the standard of Comparative Example 1 were each dissolved in acetone to give the same concentration of 1,000 μg / mL, and thin layer chromatography (TLC) was conducted under the following conditions.
- 흡착제 : 실리카겔(Silica gel) 60 F254, Merck, USA- Adsorbent: Silica gel 60 F 254 , Merck, USA
- 전개용매 : 헥산 : 에틸아세테이트 (3:1 v/v%)- developing solvent: hexane: ethyl acetate (3: 1 v / v%)
- 측정파장 : 366nm- Measured wavelength: 366 nm
상기 조건으로 진행한 결과를 도 1에 도시하였다. FIG. 1 shows the results obtained under the above conditions.
실시예 2에 따른 수득물은 순도에 방해가 되는 요소인 협잡물 및 여러 색소들이 분리되어 비교예 1의 표준품과 유사한 결과를 나타냈다.The results obtained in Example 2 were similar to those of Comparative Example 1 in that the impurities and various pigments, which are elements that interfere with purity, were separated.
실험예Experimental Example 2 : 순도 확인 2: Check purity
실험예 1에서 각각 동일한 농도로 제조된 용액을 가지고 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 아래와 같은 조건으로 진행하였다.High performance liquid chromatography (HPLC) was carried out under the following conditions with the solutions prepared in the same concentrations in Experimental Example 1, respectively.
- HPLC 기기 : Agilent 1260 Infinity - HPLC instrument: Agilent 1260 Infinity
- 이동상 : 메탄올 : 메틸삼차뷰틸에터 : 1%인산용액 (81:15:4 v/v%)- mobile phase: methanol: methyl tertiary butyl ether: 1% phosphoric acid solution (81: 15: 4 v / v%)
- 컬럼 : YMC carotenoid 4.6×250mm, S-5㎛- Column: YMC carotenoid 4.6 x 250 mm, S-5 m
- 유속 : 1.0mL/min- Flow rate: 1.0 mL / min
- 검출파장 : 474nm- Detection wavelength: 474 nm
- 주입량 : 20㎕- Injection amount: 20 μl
상기 조건으로 진행한 결과를 도 2에 도시하였다. The results of proceeding under the above conditions are shown in Fig.
실시예 2에 따른 수득물에서 유리형 아스타잔틴의 순도는 74.6%로 나타났다. 이에 반해, 실시예 1에 따른 수득물에서 유리형 아스타잔틴의 순도는 3.4%, 비교예 2에 따른 수득물에서 유리형 아스타잔틴의 순도는 4.5%로 나타났다.
The purity of free astaxanthin in the product according to Example 2 was found to be 74.6%. In contrast, the purity of free astaxanthin in the product according to Example 1 was 3.4%, and the purity of free astaxanthin in the product according to Comparative Example 2 was 4.5%.
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|---|---|---|---|---|
| CN106479662A (en) * | 2016-12-29 | 2017-03-08 | 山东师范大学 | A kind of extracting method of the Antarctic krill oils and fatss rich in astaxanthin and its ester |
Citations (2)
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-
2014
- 2014-12-24 KR KR1020140188274A patent/KR101701976B1/en active IP Right Grant
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| CN106479662B (en) * | 2016-12-29 | 2020-03-27 | 山东师范大学 | Extraction method of antarctic krill grease rich in astaxanthin and esters thereof |
Also Published As
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|---|---|
| KR101701976B1 (en) | 2017-02-03 |
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