KR20160072590A - Method for preparing recombinant melanin - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 물리화학적 특성이 조절된 재조합 멜라닌의 제조방법 및 이에 따라 제조된 재조합 멜라닌에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing recombinant melanin with controlled physicochemical properties and a recombinant melanin produced thereby.
멜라닌(melanin)은 피부, 털, 눈 등 생명체들의 다양한 부위에 존재하는 생물학적 고분자성 색소 물질로, 거의 모든 생명체에 존재한다. 멜라닌은 흑갈색의 유멜라닌(Eumelanin)과 황적색의 페오멜라닌(pheomelanin)으로 분류된다. 유멜라닌은 3,4-디하이드로시-L-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, L-DOPA) 또는 2-(3,4-디하이드로시페닐)에틸아민[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamine, dopamine]으로부터 파생된 것이고, 페오멜라닌은 시스테인(cysteine), 글루타치온(glutathione) 등의 머캅토기(-SH) 함유 물질 존재 하에서 L-DOPA 또는 도파민(dopamine)으로부터 파생된 것이다.Melanin is a biologically polymeric pigment substance present in various parts of living things such as skin, hair, and eyes, and exists in almost all life forms. Melanin is classified as dark brown eumelanin and yellow red pheomelanin. Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) or 2- (3,4-dihydroxyphenyl) ethylamine [2- (3, 4-dihydroxyphenyl) ethylamine, dopamine], and peromelanin is derived from L-DOPA or dopamine in the presence of a mercapto group (-SH) containing substance such as cysteine or glutathione.
유멜라닌은 포유류에서 우세하게 존재하는 형태의 멜라닌으로서, 카테콜아민(catecholamine)의 산화로 유발된 o-퀴논(o-quinones)의 아민기(amine group) 부분의 분자 내 첨가(intramolecular addition)에 의해 형성된 인돌 유닛(indole units)을 포함하는 불균일한 구조의 생체 고분자로 알려져 있다. 또한 일부 곰팡이류가 사용하는 DHN (dihydroxynaphthalene) 물질 기반의 멜라닌 합성 기작 역시 알려져 있다. 멜라닌은 구조의 복잡성과 불용해성으로 인해 정확한 구조가 밝혀져 있지 않으나 다양한 형태의 올리고머가 초분자적 결합에 의해 뭉친 형태로 판단되고 있다.Eumelanin is a predominant form of melanin in mammals, formed by the intramolecular addition of the amine group portion of o-quinones induced by the oxidation of catecholamine And is known as a biomolecule having a nonuniform structure including indole units. Also known is the melanin synthesis mechanism based on the dihydroxynaphthalene (DHN) material used by some fungi. Melanin is not known precisely due to the complexity and insolubility of the structure, but it is judged that various types of oligomers aggregate by supramolecular bonding.
생체 내 색소인 멜라닌의 양에 의해 피부색이 결정되고 멜라닌의 양이 많을수록 피부가 검어지므로, 멜라닌의 합성을 억제하여 피부 화이트닝 효과를 꾀하거나, 기미, 잡티를 억제하고자 하는 피부 미용학적 연구가 오랫동안 진행되어 왔다. 또한, 흑색종과 같은 질병을 진단 또는 치료하기 위하여 멜라닌이 이용되기도 한다. The skin color is determined by the amount of melanin in the body and the skin becomes darker as the amount of melanin is increased. Therefore, a skin cosmetic study for suppressing the synthesis of melanin to suppress whitening and dullness, Has come. Melanin is also used to diagnose or treat diseases such as melanoma.
현재까지 알려진 멜라닌의 생물학적 기능으로는 넓은 영역의 전자기 복사(electromagnetic radiation)를 흡수하는 광보호(photoprotection) 기능을 포함하여, 감광(photosensitization, 광감작), 금속 배위(metal ion chelation), 항생 작용(antibiotic), 체온 조절(thermoregulation), 자유 라디칼 억제(free radical quenching) 등과 같이 그 기능이 다양하다. 이러한 멜라닌은 광전지(photovoltaic cell), 감지장치(sensor), 광전자와 에너지 저장장치(optoelectric and energy storage), 광활성/광보호 물질(photoactive and photoprotective materials), 항산화 물질, 생물 의학(biomedical), 화장품 등 다양한 응용 분야에서 이용되고 있다.The biological functions of melanin known so far include photosensitization, metal ion chelation, antibiotic action, including photoprotection that absorbs a wide range of electromagnetic radiation antibiotic, thermoregulation, free radical quenching, and the like. These melanins are used in photovoltaic cells, sensors, optoelectronic and energy storage, photoactive and photoprotective materials, antioxidants, biomedicals, cosmetics, etc. It is used in various applications.
위에서 기술한 바와 같이 멜라닌은 천연에 존재하는 물질이므로, 멜라닌이 존재하는 생체 물질(머리털, 피부, 혹은 오징어 먹물 등)로부터 추출하여 얻을 수 있다. 그러나, 멜라닌의 생물학적 합성법은 대량생산이 어렵고 비용이 많이 들며, 이종 단백질이 포함되어 멜라닌만을 순수하게 분리하는데 어려움이 있다.As described above, melanin is a naturally occurring substance and can be obtained by extracting melanin from a biomaterial (hair, skin, squid ink, or the like) in which melanin exists. However, the biological synthesis method of melanin is difficult and costly to mass-produce, and it contains heterogeneous proteins, making it difficult to purely separate melanin.
이에 따라, 멜라닌을 화학적 합성방법으로 제조하는 방법이 개발되었고, 멜라닌의 화학적 합성방법으로는 멜라닌의 전구체 물질들을 이용하여 산화 고분자화를 유도하는 방법이 있다. 예를 들어 도파민 또는 L-DOPA 또는 DHN 물질과 함께 산화제를 처리함으로써 대량의 멜라닌을 합성할 수 있다. Accordingly, a method of producing melanin by a chemical synthesis method has been developed, and as a chemical synthesis method of melanin, there is a method of inducing oxidative polymerization by using precursor materials of melanin. A large amount of melanin can be synthesized, for example, by treating oxidants with dopamine or L-DOPA or DHN materials.
화학적 합성방법으로 제조된 멜라닌은 대량 생산에 용이하나, 불규칙한 형상을 가진 물질로서, 천연 멜라닌에 비하여 물리화학적 활성이 떨어지는 문제점이 있다 (Y.J.Kim et al., Biologically derived melanin electrodes in aqueous sodium-ion storage devices, PNAS, 2013, Dec, 24, 20312-7).Melanin, which is produced by a chemical synthesis method, is easy to mass-produce, but has irregular shape and has a problem in that its physicochemical activity is lower than that of natural melanin (YJKim et al., Biologically derived melanin electrodes in aqueous sodium-ion storage devices, PNAS, 2013, Dec, 24, 20312-7).
따라서, 합성된 멜라닌의 물리화학적 특성을 효과적으로 변화시킬 수 있는 방법이 필요하다. 그러나, 현재까지 멜라닌의 물리화학적 특성을 효과적으로 조절하는 기술에 대하여 보고된 바 없다.
Therefore, there is a need for a method that can effectively change the physicochemical properties of synthesized melanin. However, no technology has been reported to effectively control the physicochemical properties of melanin to date.
본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 멜라닌의 물리화학적 특성을 인위적으로 조절할 수 있는 재조합 멜라닌의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조된 재조합 멜라닌을 제공하는 것이다.
Disclosure of the Invention The object of the present invention is to provide a method for producing recombinant melanin which can artificially control the physicochemical properties of melanin and the recombinant melanin produced by the method.
본 발명은 멜라닌의 구성성분을 분해하여 1종 이상의 올리고머로 분리하는 단계; 및 The present invention relates to a process for the production of melanin, which comprises the steps of decomposing constituents of melanin and separating them into one or more oligomers; And
상기 1 종 이상의 올리고머를 선택하여 교반 및 건조하는 것을 포함하는 재조합 멜라닌의 제조방법을 제공한다.
Selecting one or more oligomers, stirring and drying the mixture.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의하여 제조된, 물리화학적 특성이 조절된 재조합 멜라닌을 제공한다.
The present invention also provides a recombinant melanin produced by the above production method and having controlled physicochemical properties.
본 발명에 따르면, 항산화력, 전하 저장력, 전기 전도도, 항균력, 접착력 또는 코팅력 등의 물리화학적 특성이 조절된 재조합 멜라닌을 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 대량으로 합성된 합성 멜라닌의 물리화학적 특성을 간단한 방법으로 효과적으로 조절할 수 있다. 제조된 물리화학적 특성이 조절된 재조합 멜라닌은 기존의 합성 멜라닌보다 우수한 물리화학적 특성을 나타내어, 다양한 산업 분야에서 활용될 수 있다.
According to the present invention, recombinant melanin having controlled physicochemical properties such as antioxidant ability, charge storage capacity, electric conductivity, antibacterial activity, adhesive force or coating power can be produced. According to the present invention, the physicochemical properties of a large amount of synthesized melanin can be effectively controlled by a simple method. Recombinant melanin with controlled physicochemical properties exhibits superior physicochemical properties than conventional synthetic melanin and can be used in various industrial fields.
도 1은 재조합 멜라닌의 제조방법을 보여주는 모식도이다.1 is a schematic diagram showing a method for producing recombinant melanin.
본 발명자들은 멜라닌의 물리화학적 특성을 조절할 수 있는 방법을 연구한 결과, 멜라닌의 구성 성분을 인위적으로 분리한 후, 1 종 이상의 특정 성분만을 선택하여 재조합하는 경우, 본래의 특성과는 확연히 다른 물리화학적 특성이 나타날 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have studied a method of controlling the physicochemical properties of melanin. As a result, it has been found that when melanin components are artificially separated and then only one or more specific components are selected for recombination, the physicochemical properties And the present invention has been completed.
따라서, 본 발명은 멜라닌의 구성성분을 분해하여 1종 이상의 올리고머로 분리하는 단계; 및 상기 1 종 이상의 올리고머를 선택하여 교반 및 건조하는 것을 포함하는 재조합 멜라닌의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 멜라닌은 물리화학적 특성이 조절된 것을 특징으로 한다.Accordingly, the present invention relates to a process for preparing melanin comprising the steps of decomposing constituents of melanin into one or more oligomers; And a method for producing recombinant melanin comprising selecting one or more oligomers, stirring and drying. The recombinant melanin of the present invention is characterized by controlled physicochemical properties.
본 발명의 재조합 멜라닌의 제조방법의 모식도를 도 1에 나타내었다. 멜라닌(melanin)은 구조적으로 다양한 저분자 올리고머들이 물리적 결합에 의하여 초분자(supramolecule)성으로 뭉쳐있는 형태를 가지므로, 초분자로 결합되어 있는 멜라닌을 저분자 올리고머로 분리한 후, 특정 올리고머를 선별하여 재조합함으로써 물리화학적 특성이 효과적으로 조절된 재조합 멜라닌을 제조할 수 있다.A schematic diagram of a method for producing recombinant melanin of the present invention is shown in Fig. Since melanin is structurally composed of various low molecular oligomers combined with supramolecule by physical bonding, melanin bound to supramolecules is separated into small molecular oligomers, and then specific oligomers are selected and recombined. It is possible to produce recombinant melanin with effectively controlled chemical properties.
멜라닌을 구성하고 있는 다양한 저분자 올리고머들은 구조가 매우 복잡하고 다양하며, 본 발명의 올리고머는 멜라닌을 구성하고 있는 다양한 올리고머들을 모두 포함하는 것으로 이해된다. 올리고머는 그 구조의 다양성 때문에 특정 구조만으로 규정하기는 어려우나, 올리고머는 예를 들어, 방향족 화합물 또는 황을 함유하고 있는 것일 수 있다.The various low molecular weight oligomers constituting melanin are very complicated and varied in structure, and the oligomer of the present invention is understood to include all the various oligomers constituting melanin. Oligomers may be difficult to define solely by a specific structure because of the variety of structures thereof, but oligomers may contain, for example, aromatic compounds or sulfur.
방향족 화합물은 일환 또는 다환 방향족 기를 포함하고 있는 화합물을 의미한다. 방향족 기의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 페닐, 나프틸 및 안트릴 등을 포함한다. An aromatic compound means a compound containing a monocyclic or polycyclic aromatic group. Examples of aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, anthryl, and the like.
한 구체예에서, 올리고머는 물리적 결합에 의하여 서로 뭉쳐져 멜라닌을 구성하고 있을 수 있다.In one embodiment, the oligomers may be bound together by physical bonding to form melanin.
한 구체예에서, 재조합의 대상이 되는 멜라닌은 천연 멜라닌 또는 합성 멜라닌일 수 있다. 예를 들어, 합성 멜라닌은 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 또는 DOPA 유사체 또는 DHN 으로 이루어질 수 있다.In one embodiment, the melanin to be recombined can be native melanin or synthetic melanin. For example, synthetic melanin may be composed of DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) or a DOPA analog or DHN.
천연의 멜라닌은 티로시나제(tyrosinase)에 의하여 티로신으로부터 DOPA를 거쳐 합성된다. 구체적인 천연의 멜라닌 합성 과정은 잘 알려져 있다. 멜라닌을 대량으로 제조하기 위한 대안으로 합성 멜라닌이 개발되었으며, 합성 멜라닌은 천연의 멜라닌 합성 과정을 이용하여, 일반적으로 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine), DOPA 유사체, DHN(Dihydroxynaphthalene), 시스테인(cysteine) 및 글루타치온(glutathione)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 산화제로 처리하여 제조할 수 있다. 인공적인 합성에 사용되는 산화제는, 예를 들어, 과망산칼륨(potassium permanganate, KMnO4), 과요오드산 칼륨(potassium periodate, KIO4), 과요오드산 나트륨(sodium periodate, NaIO4) 및 산화효소 등이 포함된다.Natural melanin is synthesized from tyrosine by DOPA by tyrosinase. The specific natural melanin synthesis process is well known. Synthetic melanin has been developed as an alternative to the large-scale production of melanin. Synthetic melanin is generally synthesized using a natural melanin synthesis process, usually DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine), DOPA analogue, DHN (Dihydroxynaphthalene) cysteine, and glutathione with an oxidizing agent. Oxidants used in artificial synthesis include, for example, potassium permanganate (KMnO4), potassium periodate (KIO4), sodium periodate (NaIO4) and oxidase do.
멜라닌을 분해하여 1 종 이상의 올리고머로 분리하는 방법은 당업계에서 알려진 통상의 분해 및 분리방법을 제한 없이 이용할 수 있다. 이하에서 기술하는 특정 분해 또는 분리방법은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대하여 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The method of decomposing melanin and separating it into one or more oligomers can be carried out by any conventional method of decomposition and separation known in the art without limitation. The specific decomposition or separation method described below is only intended to facilitate understanding of the present invention and is not intended to limit the present invention to the specific disclosure form. It is to be understood that the scope of the present invention includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the scope and spirit of the present invention.
한 구체예에서, 멜라닌의 분해는 멜라닌을 용해하는 단계를 포함한다. 초분자성으로 뭉쳐있는 형태의 멜라닌을 저분자의 올리고머 형태로 만들기 위해서는, 멜라닌을 용해하는 과정이 필요하다. In one embodiment, degradation of melanin comprises dissolving melanin. In order to make supramolecular melanin into a low molecular oligomer form, it is necessary to dissolve melanin.
한 구체예에서, 멜라닌의 용해는 멜라닌을 pH 10 이상인 수용액 또는 이온성 액체(ionic liquid)를 포함하는 수용액으로 처리함으로써 수행될 수 있다. In one embodiment, the dissolution of melanin can be performed by treating the melanin with an aqueous solution comprising an aqueous solution or ionic liquid having a pH of 10 or higher.
멜라닌은 염기성 용액에 잘 용해되기 때문에, pH 10 이상의 수용액에서 멜라닌을 용해할 수 있다. 멜라닌을 용해하기 위한 염기성 용액은 pH 10 이상이기만 하면 종류에 제한 없이 이용 가능하다. pH 10 이상의 수용액은 직접 제조하거나, 또는 구입하여 사용할 수 있다. Since melanin is well soluble in a basic solution, melanin can be dissolved in an aqueous solution having a pH of 10 or more. The basic solution for dissolving melanin can be used without limitation as long as it is at least pH 10. An aqueous solution having a pH of 10 or more can be directly produced or purchased.
이온성 액체(ionic liquid)는 액체 상태의 염을 의미하는 것으로, 융점이 낮고, 증기압이 거의 없으며, 독성이 없고, 높은 열 안정성을 나타내어, 용매로 다양한 분야에서 이용되고 있다. 이온성 액체는 적절한 양이온 및 음이온을 선택하여 제조할 수 있고, 이온성 액체의 종류에는 양이온으로서 디알킬이미다졸륨, 알킬피리디늄, 4급 암모늄 또는 4급 포스포늄, 음이온으로서 NO3 -, BF4 -, PF6 -, AlCl4 -, Al2Cl7 -, 트리플루오로메탄설포네이트(Trifluoromethanesulfonate), 트리플루오로메탄설포닐아미드(Trifluoromethanesulfonylamide), 또는 CH3CH(OH)CO2 -를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.BACKGROUND ART An ionic liquid means a salt in a liquid state and has a low melting point, little vapor pressure, no toxicity, high heat stability, and is used in various fields as a solvent. The ionic liquid can be prepared by selecting appropriate cations and anions. The ionic liquid includes dialkylimidazolium, alkylpyridinium, quaternary ammonium or quaternary phosphonium as a cation, NO 3 - , BF 4 - , PF 6 - , AlCl 4 - , Al 2 Cl 7 - , Trifluoromethanesulfonate, Trifluoromethanesulfonylamide, or CH 3 CH (OH) CO 2 - But is not limited thereto.
한 구체예에서, 이온성 액체를 포함하는 수용액은 물 중량 대비 1 w/v% 내지 50 w/v%, 5 w/v% 내지 40 w/v%, 5 w/v% 내지 35 w/v%, 또는 10 w/v% 내지 30 w/v%의 이온성 액체를 포함할 수 있다. 상기 범위에서, 멜라닌을 완전히 용해시켜 멜라닌을 구성하는 올리고머로 효과적으로 분리할 수 있다.In one embodiment, the aqueous solution comprising the ionic liquid comprises 1 w / v% to 50 w / v%, 5 w / v% to 40 w / v%, 5 w / v% to 35 w / v, %, Or from 10 w / v% to 30 w / v% of the ionic liquid. Within this range, the melanin can be completely dissolved and effectively separated into oligomers constituting melanin.
멜라닌을 분해하여 저분자의 올리고머 상태로 만든 멜라닌을 크로마토그래피를 수행하여 1 종 이상의 올리고머를 물리화학적 특성에 따라 분리할 수 있다. 액체 크로마토그래피가 사용될 수 있으며 순상 (Normal phase), 역상 (Reverse phase), 이온 교환 (Ion-exchange), 또는 크기 배제 (Size-exclusion) 방식들이 활용될 수 있다. 크로마토그래피법에 의한 물질의 분리 기법은 잘 알려져 있는 기술이다. 크로마토그래피는 이동상과 고정상에 대한 혼합 성분 각각의 인력차이를 이용하여 복잡한 혼합물을 구성하고 있는 매우 유사한 성분들을 분리할 수 있기 때문에, 크로마토그래피를 이용하여 멜라닌을 구성하는 올리고머를 그 구조적 특성에 따라 분리할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 실시예에서는, 합성된 멜라닌을 4급 암모늄 계열의 유기물이 10% w/w 함유된 용액에 완전히 용해한 후 0.45 ? 실린지 필터로 거른 후 C18 역상 컬럼과 이동상으로 4급 암모? 계열의 유기물이 10% (w/w)가 함유된 용액과 아세토니트릴의 특정 비율을 사용하여 구성 올리고머로 분리하였다.One or more oligomers can be separated according to their physicochemical properties by performing chromatography on melanin, which degrades melanin to a low molecular weight oligomer state. Liquid chromatography can be used, and normal phase, reverse phase, ion-exchange, or size-exclusion methods can be utilized. Chromatographic separation of materials is a well known technique. Chromatography separates the very similar components that make up a complex mixture using the difference in attraction of each of the mixed components to the mobile phase and the stationary phase, so that the oligomers constituting melanin are separated by their structural characteristics can do. In the following examples, the melanin synthesized is completely dissolved in a solution containing 10% w / w of a quaternary ammonium-based organic material, After filtration with a syringe filter, C18 reversed phase column and mobile phase were used. Were separated into constituent oligomers using a specific proportion of acetonitrile and a solution containing 10% (w / w) of organics of the series.
멜라닌의 물리화학적 특성을 조절하기 위해 분리된 올리고머 조합에서 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 선택된 올리고머들은 필요에 따라 교반 내지는 건조 과정을 추가적으로 시행할 수 있으며 이를 통해 선택된 올리고머 사이의 초분자적 결합을 효과적으로 유도하여 그래뉼 형성을 가능하게 한다. 건조 과정을 통하여 용매가 제거되면 선택된 올리고머들이 물리적 결합에 의하여 서로 뭉치게 되어 멜라닌 입자를 형성하게 된다. 즉, 멜라닌을 이루는 구성 성분을 분해하여 올리고머로 분리한 후 특정 성분만으로 재조합 하는 과정을 통해 새로운 형태의 멜라닌 그래뉼을 만들 수 있고 이를 통해 물리화학적 특성을 효과적으로 조절할 수 있다. 이러한 재조합 방식에 의하여, 보다 바람직하게는 기존 합성 멜라닌보다 산업적 응용 가능성이 높은 멜라닌 그래뉼 제조를 가능하게 한다.In order to control the physicochemical properties of melanin, one or more of the separated oligomer combinations may be selected and used. The selected oligomers can be additionally stirred or dried according to need, thereby effectively inducing supramolecular bonding between the selected oligomers to enable granule formation. When the solvent is removed through the drying process, the selected oligomers are aggregated together by physical bonding to form melanin particles. In other words, the melanin constituent is decomposed and separated into oligomers, and the melanin granules are recombined with only the specific ingredients. Thus, a new type of melanin granules can be produced, thereby effectively controlling the physicochemical properties. By such a recombinant method, it is possible to manufacture melanin granules having higher industrial applicability than conventional synthetic melanin, more preferably.
한 구체예에서, 멜라닌의 물리화학적 특성은 항산화력, 전하 저장력, 전기 전도도, 항균력, 접착력 및 코팅 능력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.In one embodiment, the physicochemical properties of melanin may be one or more selected from the group consisting of antioxidant power, charge storage capacity, electrical conductivity, antimicrobial activity, adhesion and coating ability.
물리화학적 특성에 따라 분리된 올리고머 중에서 원하는 부분만을 선택하여 교반 및 건조함으로써, 우수한 특성을 가지는 멜라닌을 재조합할 수 있다. 이렇게 제조된 재조합 멜라닌은 우수한 물리화학적 특성에 기반하여, 다양한 산업 분야에서 활용될 수 있다.Melanin having excellent properties can be recombined by selecting only a desired portion of the separated oligomers according to their physicochemical properties and stirring and drying them. The recombinant melanin thus produced can be utilized in various industrial fields based on excellent physicochemical properties.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 따라 제조된 재조합 멜라닌을 제공한다.
The present invention also provides a recombinant melanin produced according to the above production method.
이하에서, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Preparation Examples and Experimental Examples. The following Preparation Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following Production Examples and Experimental Examples.
[[ 제조예Manufacturing example 1] 멜라닌의 제조 1] Manufacture of melanin
2,7-디하이드록시나프탈렌(2,7-dihydroxynaphthalene; 2,7-DHN) (Sigma)을 10 ppm 농도로 20% ethanol이 함유된 수용액에 완전히 용해한 후 산화 고분자화 반응을 유도하기 위해 CuCl (I) (Sigma)을 1 ppm 농도로 처리한 후 38도에서 약 10시간 동안 반응하였다. 반응을 마친 후 13,000 rpm으로 반응물을 원심분리한 후, 상층액을 버렸다. 그 후 증류수를 이용해 5번 같은 원심분리 방법을 이용하여 세척한 후 동결건조를 통해 합성 멜라닌을 얻었다.
After dissolving 2,7-dihydroxynaphthalene (2,7-DHN) (Sigma) in an aqueous solution containing 20% ethanol at a concentration of 10 ppm, CuCl I) (Sigma) was treated at a concentration of 1 ppm and reacted at 38 ° C for about 10 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was centrifuged at 13,000 rpm, and the supernatant was discarded. After that, it was washed with distilled water using the same centrifugation method as No. 5, followed by lyophilization to obtain synthetic melanin.
[[ 제조예Manufacturing example 2] 재조합 멜라닌의 제조 2] Production of recombinant melanin
제조예 1에서 제작된 멜라닌 5 ppm 을 1-에틸-3-메틸이미다졸리움 아세테이트가 10% w/w로 함유된 수용액으로 용해하고, 0.45 μm 사이즈의 실린지 필터로 처리한 후 HPLC (Agilent G1315A, Agilent, Waldbronn, Germany) 를 수행하였다. HPLC 이동상은 1-에틸-3-메틸이미다졸리움 아세테이트가 10% w/w 함유된 물과 아세토니트릴(Acetonitrile)을 8:2의 비율로 사용하였으며 속도는 1 ml/min으로 하였다. 분리를 위한 컬럼은 ZORBAX SB C-18 컬럼을 이용하였다. 크로마토그램 분석 결과 분리 가능한 총 4개의 피크가 검출되었으며 머무름 시간은 각각 4.5, 8.8, 11.5, 20.3 min으로 검출되었다. 각 피크를 분리하고 동결건조를 통해 농축한 후 증류수와 아세토니트릴이 8:2로 희석한 이동상을 같은 조건으로 다시 HPLC를 하여 피크 분리 후 잔류하는 이온성 액체를 완전히 제거하였다. 이온성 액체가 제거된 분리 샘플을 동결건조 하여 4종류의 고체 가루의 멜라닌 구성 성분을 얻었다. 재조합 멜라닌은 아래 제조예 2-1, 2-2, 2-3에 맞게 분리 샘플을 섞은 후 에탄올 10% w/w가 함유된 증류수 10 mL에 희석하였다. 최종적으로 초음파 처리를 30분 한 후, 30rpm으로 교반하면서 진공 오븐에서 80℃로 건조하여, 재조합된 멜라닌을 얻었다.
5 ppm of the melanin prepared in Preparation Example 1 was dissolved in an aqueous solution containing 10% w / w of 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate, treated with a syringe filter having a size of 0.45 μm and then subjected to HPLC (Agilent G1315A , Agilent, Waldbronn, Germany). The HPLC mobile phase used water and acetonitrile in a ratio of 8: 2 with 1% w / w of 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate and a rate of 1 ml / min. The column for separation was a ZORBAX SB C-18 column. Chromatogram analysis showed that four peaks were detected and retention times were 4.5, 8.8, 11.5 and 20.3 min, respectively. Each peak was separated and concentrated by lyophilization. The mobile phase diluted with distilled water and acetonitrile (8: 2) was again subjected to HPLC under the same conditions to completely remove the remaining ionic liquid after peak separation. The separated samples from which the ionic liquid had been removed were lyophilized to obtain four kinds of melanin components of solid powder. Recombinant melanin was prepared by mixing the separated samples according to Production Examples 2-1, 2-2 and 2-3 below, and then diluted with 10 mL of distilled water containing 10% w / w ethanol. Finally, after 30 minutes of ultrasonic treatment, the mixture was dried at 80 캜 in a vacuum oven while stirring at 30 rpm to obtain recombinant melanin.
[제조예 2-1] 항산화력이 조절된 재조합 멜라닌의 제조[Production Example 2-1] Preparation of recombinant melanin with antioxidant power regulated
제조예 2에서 분리된 4.5, 11.5 min에 분리된 멜라닌 구성성분을 이용해 재조합 멜라닌을 제조하였다.
Recombinant melanin was prepared using the separated melanin components at 4.5 and 11.5 min isolated in Production Example 2.
[제조예 2-2] 항균력이 조절된 재조합 멜라닌의 제조[Production Example 2-2] Preparation of recombinant melanin with controlled antimicrobial activity
제조예 2에서 분리된 4.5, 8.8, 20.3 min에 분리된 멜라닌 구성성분을 이용해 재조합 멜라닌을 제조하였다.
Recombinant melanin was prepared using the separated melanin components at 4.5, 8.8, and 20.3 min, which were isolated in Production Example 2.
[제조예 2-3] 코팅력이 조절된 재조합 멜라닌의 제조[Production Example 2-3] Preparation of recombinant melanin with controlled coating power
제조예 2에서 분리된 4.5 min에 분리된 멜라닌 구성성분을 이용해 재조합 멜라닌을 제조하였다.
Recombinant melanin was prepared using a separated melanin component at 4.5 min, which was isolated in Production Example 2.
[[ 실험예Experimental Example 1] 재조합 멜라닌의 특성 분석 1] Characterization of recombinant melanin
[실험예 1-1] 재조합 멜라닌의 항산화력[Experimental Example 1-1] Antioxidant activity of recombinant melanin
산화 효소 락카아제 (Sigma)를 이용하여 ABTS(2,2-azino-bis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), Fluka)를 420 ㎚에서 강한 흡광을 띠는 ABTS 라디칼 물질로 바꾼 후, 처리된 락카아제 효소를 제거하기 위해 한외여과(ultrafiltration)를 수행하여 ABTS 라디칼 물질을 얻었다. ABTS 라디칼을 420 ㎚에서 흡광도가 1.0이 되도록 증류수로 희석하였다. 그리고 나서, 제조예 1 그리고 2-1 에서 얻은 멜라닌을 증류수에 1 ppm 농도로 분산시킨 용액 30 ? 을 각각 흡광도 1.0의 ABTS 라디칼 용액에 처리한 후 용액이 420 nm에서 무색화되는 정도를 UV-Visible spectrometer를 이용해 측정하였다. 측정 결과 제조예 1에서 만든 멜라닌은 무색화 정도가 50%인 반면 제조예 2-1을 통해 만든 재조합 멜라닌의 경우 86%가 측정되었다.
ABTS (2,2-azino-bis (3-ehtylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), Fluka) was converted to strong absorptive ABTS radical material at 420 nm using oxidase enzyme (Sigma) To remove the lactase enzyme, ultrafiltration was performed to obtain ABTS radical material. The ABTS radical was diluted with distilled water to an absorbance of 1.0 at 420 nm. Thereafter, the melanin obtained in Preparation Examples 1 and 2-1 was dispersed in distilled water at a concentration of 1 ppm. Was treated with an ABTS radical solution having an absorbance of 1.0, and the degree of coloration of the solution at 420 nm was measured using a UV-Visible spectrometer. As a result of measurement, melanin prepared in Preparation Example 1 was 50% colorless, whereas 86% of recombinant melanin prepared in Preparation Example 2-1 was measured.
[실험예 1-2] 재조합 멜라닌의 항균력[Experimental Example 1-2] Antibacterial activity of recombinant melanin
E. Coli XL1 Blue를 100 mL의 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1 mL의 대장균을 취하여 PBS 버퍼를 이용해 원심분리 및 세척을 3 회 수행하였다. 그리고 나서, 제조예 1 및 제조예 2-2 에서 얻은 멜라닌을 증류수에 1 ppm 농도로 분산시킨 용액 80 ? 을 세척된 대장균이 100배로 희석된 PBS 버퍼 1 mL에 투입한 후 3일간 실온에서 교반하였다. 교반 후 50 ㎕의 용액을 취하여 아가 배지에서 배양한 후 대장균의 증식 여부를 관찰하였다. 제조예 1에서 얻은 멜라닌의 경우 콜로니 형성 개수가 220개가 관찰되었으나 제조예 2-2에서 얻은 재조합 멜라닌을 이용한 경우 콜로니 형성 개수가 120개로 관찰되었다.
After E. coli XL1 Blue was cultured in 100 mL of LB medium for 12 hours, 1 mL of E. coli was collected and centrifuged and washed three times with PBS buffer. Then, the melanin obtained in Preparation Example 1 and Preparation Example 2-2 was dispersed in distilled water at a concentration of 1 ppm, and a solution of 80? Was added to 1 mL of PBS buffer diluted with 100 times of washed E. coli and then stirred at room temperature for 3 days. After stirring, 50 mu l of the solution was taken and cultured in agar medium, and then the growth of E. coli was observed. In the case of melanin obtained in Preparation Example 1, the number of colonies formed was 220, whereas in the case of using recombinant melanin obtained in Preparation Example 2-2, the number of colonies formed was 120.
[실험예 1-3] 재조합 멜라닌의 코팅력[Experimental Example 1-3] Coating power of recombinant melanin
제조예 1 그리고 제조예 2-3에서 얻은 멜라닌을 증류수에 1 ppm 농도로 분산시킨 후 PET 필름을 담근 후 24시간 처리하였다. 처리 후 5 ppm AgNO3 용액으로 PET 필름 표면을 30분간 처리하여 표면의 색깔이 은이온 환원을 통해 변화하는지를 관찰하였다. 제조예 1에서 얻은 멜라닌에 비하여 제조예 2-3에서 얻은 재조합 멜라닌이 훨씬 더 짙은 색깔의 변화가 있는 것으로 보아 제조예 2-3에서 얻은 재조합 멜라닌이 훨씬 더 표면에 많이 달라붙은 것으로 추론할 수 있다.
The melanin obtained in Preparation Example 1 and Preparation Example 2-3 was dispersed in distilled water at a concentration of 1 ppm, and the PET film was immersed therein for 24 hours. After the treatment, the surface of the PET film was treated with 5 ppm AgNO 3 solution for 30 minutes to observe whether the color of the surface changed through silver ion reduction. It can be deduced that the recombinant melanin obtained in Production Example 2-3 has a much darker color change than the melanin obtained in Production Example 1 and that the recombinant melanin obtained in Production Example 2-3 is much more attached to the surface .
Claims (10)
상기 1 종 이상의 올리고머를 선택하여 교반 및 건조하는 것을 포함하는 재조합 멜라닌의 제조방법.
Decomposing the constituents of melanin into one or more oligomers; And
Selecting one or more oligomers, stirring and drying the mixture.
재조합 멜라닌은 물리화학적 특성이 조절된 것인 재조합 멜라닌의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the recombinant melanin is regulated in physicochemical properties.
멜라닌은 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine), DOPA 유사체, DHN(Dihydroxynaphthalene), 시스테인(cysteine) 및 글루타치온(glutathione)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 산화 고분자화하여 제조된 것인 재조합 멜라닌의 제조방법.
The method according to claim 1,
Melanin is a recombinant melanin produced by oxidizing at least one selected from the group consisting of DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine), DOPA analog, DHN (Dihydroxynaphthalene), cysteine and glutathione Gt;
올리고머는 물리적 결합에 의하여 서로 결합되어 멜라닌을 구성하고 있는 것인 재조합 멜라닌의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the oligomers are linked to each other by physical bonding to constitute melanin.
멜라닌의 분해는 멜라닌을 pH 10 이상인 수용액 또는 이온성 액체(ionic liquid)를 포함하는 수용액으로 처리하여 수행되는 것인 재조합 멜라닌의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the degradation of melanin is carried out by treating the melanin with an aqueous solution comprising an aqueous solution having a pH of 10 or more or an ionic liquid.
이온성 액체는 디알킬이미다졸륨, 알킬피리디늄, 4급 암모늄, 4급 포스포늄, NO3 -, BF4 -, PF6 -, AlCl4 -, Al2Cl7 -, 트리플루오로메탄설포네이트(Trifluoromethanesulfonate), 트리플루오로메탄설포닐아미드(Trifluoromethanesulfonylamide) 및 CH3CH(OH)CO2 - 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 재조합 멜라닌의 제조방법.
6. The method of claim 5,
Ionic liquid is a dialkyl imidazolium, alkyl pyridinium, quaternary ammonium, quaternary phosphonium, NO 3 -, BF 4 - , PF 6 -, AlCl 4 -, Al 2 Cl 7 -, trifluoromethane sulfonate Wherein the recombinant melanin is at least one selected from the group consisting of Trifluoromethanesulfonate, Trifluoromethanesulfonylamide and CH 3 CH (OH) CO 2 - ions.
이온성 액체는 물 중량 대비 1 w/w% 내지 50 w/w%로 포함되는 것인 재조합 멜라닌의 제조방법.
6. The method of claim 5,
Wherein the ionic liquid is contained in an amount of 1 w / w% to 50 w / w% based on the weight of water.
멜라닌의 분리는 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것인 재조합 멜라닌의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the separation of melanin comprises performing a chromatography.
물리화학적 특성은 항산화력, 전하 저장력, 전기 전도도, 항균력, 접착력 및 코팅 능력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 재조합 멜라닌의 제조방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the physicochemical properties of the recombinant melanin are at least one selected from the group consisting of antioxidant power, charge storage capacity, electrical conductivity, antibacterial activity, adhesive power and coating ability.
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- 2014-12-15 KR KR1020140180418A patent/KR101959464B1/en active IP Right Grant
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| KR101959464B1 (en) | 2019-03-18 |
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