KR20160061945A - Immortalized cell lines producing factors improving atopic dermatitis, wrinkle and whitening, and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an immortalized cell line having atopic dermatitis improvement, wrinkle improvement and whitening activity, and use thereof.
최근 도시인들의 생활환경이 변화함에 따라 집안의 카펫에 서식하는 진드기, 습도 저하로 인한 먼지, 주변국의 사막화 및 공업화에 의해 날아오는 황사 및 미세먼지, 애완동물의 털, 꽃가루, 새로운 과일 및 음식, 식품첨가물 등 면역 과민반응(hypersensitivity)을 유발하는 다양한 알레르겐(allergen)에 노출될 기회가 점차 커지고 있다. Recent changes in the living environment of urban people have led to the development of mites that live on the carpets of homes, dust caused by humidity reduction, dust and fine dusts brought about by desertification and industrialization of neighboring countries, pet hair, pollen, There is a growing opportunity to be exposed to various allergens that cause hypersensitivity, such as additives.
아토피(atopy)는 최근 들어, 유병률이 급격히 증가함에 따라 그 위험성이 크게 부각되고 있는 과민증(hypersensitivity)의 일종으로, 면역학적 관점에서는 면역글로불린E(immunoglobulin E, Ig E)와 알레르겐(allergen)의 면역반응에 의한 주요증상을 동반하는 유전경향이 강한 알레르기성 질환군으로 정의된다. 특히, 아토피의 대표적 증상인 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 전 인구의 0.5%-1%, 어린이의 5-10%가 심각한 증상을 호소하고 있지만, 유전적인 요인과 면역계 결핍에 관련 있는 것으로 추정될 뿐 아직 정확한 원인은 밝혀진 바 없고, 환경 및 식생활 개선을 통해 다소 완화되는 것으로 기대될 뿐 근본적인 치료방법이 전무한 실정이다.Atopy is a type of hypersensitivity that has recently become increasingly prevalent as its prevalence increases rapidly. In terms of immunology, immunoglobulin E (Ig E) and allergen immunity Is defined as a group of allergic diseases with a strong genetic tendency with major symptoms due to the reaction. In particular, atopic dermatitis, a representative symptom of atopy, accounts for 0.5 to 1% of the total population and 5 to 10% of the children have serious symptoms, but it is presumed to be related to genetic factors and immune system deficiency The exact cause of the disease has yet to be clarified, and it is expected that it will be alleviated somewhat through the improvement of environment and diet, but there is no fundamental treatment method.
아토피 피부염은 유아와 소아에서 가장 흔한 염증성 피부질환으로 극심한 가려움증을 비롯한 피부건조증, 발진, 진물, 부스럼딱지, 비늘 같은 껍질이 있는 피부(인비늘) 등을 수반하며, 이로 인한 정서적 불안, 스트레스, 긴장, 좌절, 분노의 감정과 함께 기타 알레르기 질환인 두드러기, 금속 알레르기, 천식이나 알레르기성 비염 등을 동반하는 경우가 빈번하다. 또한 최근에는 성인에서도 아토피 피부염이 증가하고 있으며, 성인에서 아토피 피부염의 위험 인자로 얼굴과 목에 병변이 있는 경우나 동물, 꽃가루, 니켈 알레르기가 있는 경우 등이 제시되고 있다. Atopic dermatitis is the most common inflammatory skin disease in infants and children. It is accompanied by severe itching, skin dryness, rashes, dirt, scabs, scaly skin (rabbits), and the resulting emotional distress, stress, Frustration and anger, as well as other allergic diseases such as urticaria, metal allergy, asthma and allergic rhinitis. Recently, atopic dermatitis has been increasing in adults, and it has been suggested that adults, at risk for atopic dermatitis, have facial and neck lesions, animals, pollen and nickel allergy.
현재 아토피 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 항생제, 비스테로이드제를 비롯한 기타 진정제와 신경안정제 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 지속적으로 적용하기가 곤란하다.Currently, therapeutic agents used for the treatment of atopic dermatitis include topical steroids, immunosuppressants, antihistamines, antibiotics, non-steroids and other sedatives and nerve stabilizers. However, various side effects due to the use of these drugs have been reported However, since it is not a fundamental treatment for atopic dermatitis, it is difficult to apply them continuously.
한편, 최근 줄기세포가 세포대체, 뇌보호 및 면역조절 기전을 통해 비가역적 뇌손상을 개선시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)을 혈관 내로 주사했을 때 말초 면역계를 조절함으로써 자가면역병(autoimmune disease)인 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS) 모델에서 동물의 임상증상을 완화시키는 것으로 보고되었다. 또한 뇌실 내로 주사한 신경줄기세포는 뇌세포를 보호하고 손상된 세포를 대체함으로써 중주이상을 개선시켜 주는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 줄기세포가 면역조절 기능을 통해 자가면역병 및 과민반응을 개선해 줌을 시사한다. 아토피 피부염은 대표적인 제1형 과민반응이므로 Th1과 Th2 cells이 관여하는 피부과민반응을 예방하고 치료해 줄 수 있을 것으로 기대된다.Meanwhile, stem cells have recently been shown to improve irreversible brain damage through cell replacement, brain protection, and immune regulation. For example, neuronal stem cells (NSCs) are injected into the blood vessels to modulate the peripheral immune system, thereby alleviating the clinical symptoms of animals in multiple sclerosis (MS) models, an autoimmune disease . In addition, neural stem cells injected into the ventricles were shown to protect the brain cells and replace the damaged cells to improve the middle ear condition. These results suggest that stem cells can improve autoimmune disease and hypersensitivity through immunoregulation. Because atopic dermatitis is a
난치성 질환의 치료효능에 더하여, 줄기세포나 그 배양액은 항산화 및 창상치유 효능을 가지고 있는 것으로 알려졌다. 특히 지방간엽줄기세포는 콜라겐 생성을 촉진시키고 분해를 억제하여 피부주름을 개선해 줌은 물론, 최근에는 피부미백 효능이 알려져 피부미용을 위한 새로운 소재로 관심을 모으고 있다.In addition to the therapeutic efficacy of intractable diseases, stem cells and their cultures are known to have antioxidant and wound healing properties. In particular, lipid mesenchymal stem cells promote collagen production and inhibit degradation, thereby improving skin wrinkles. Recently, skin whitening effect has been known, and attention has been focused on new materials for skin care.
이에, 본 발명자들은 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ADSC), 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC) 배양액이 비만세포(mast cells) 및 아토피 피부염 모델동물에서 히스타민 분비와 피부 염증을 완화시키고, 콜라겐 분해효소인 MMP-1과 티로시나아제(tyrosinase)를 억제함으로써 피부 주름개선 및 미백 효능을 나타낸다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors have found that adipose-derived stem cells (ADSC), immortalized neural stem cells (CBNU-NSC), immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cells (CBNU-NSC.olig2) and immortalized amniotic stem cells -AFSC) culture alleviates histamine secretion and skin inflammation in mast cells and atopic dermatitis model animals, and inhibits collagen degrading enzymes MMP-1 and tyrosinase, thereby improving skin wrinkles and whitening efficacy The present invention has been completed.
따라서 본 발명의 목적은 지방줄기세포(ADSC), 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2) 또는 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC) 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름개선 또는 미백용 조성물을 제공하는데 있다.Therefore, the object of the present invention is to provide a culture medium containing adipogenic stem cell (ADSC), immortalized neural stem cell (CBNU-NSC), immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cell (CBNU-NSC.olig2) or immortalized amniotic stem cell (CBNU- A composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening, which is contained as an active ingredient.
또한 본 발명의 다른 목적은 반복적으로 줄기세포를 채취할 필요가 없도록 하는 불멸화 줄기세포주의 제조방법을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for producing an immortalized stem cell line which does not need to repeatedly collect stem cells.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터(v-myc-encoding retroviral vector)로 처리하여 얻은 충북대학교 불멸화 신경줄기세포주(Chungbuk National University-neural stem cells, CBNU-NSC) 또는 양수줄기세포주(Chungbuk National University-amniotic fluid stem cells, CBNU-AFSC)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides Chungbuk National University-neural stem cells obtained by treating neural stem cells or amniotic stem cells with a v-myc-encoding retroviral vector. cells, CBNU-NSC) or amniotic fluid stem cells (CBNU-AFSC).
또한, 본 발명은 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화 유도하여 얻은 충북대학교 불멸화 희돌기교전구세포주(Chungbuk National University-neural stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cells, CBNU-NSC.olig2)를 제공한다.The present invention also relates to a cell line derived from a neural stem cell-derived oligodendrocyte (Chungbuk National University) obtained by treating a neural stem cell with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector progenitor cells, CBNU-NSC.olig2).
또한, 본 발명은 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름개선 또는 미백용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a stem of a plant selected from the group consisting of an immortalized neural stem cell line (CBNU-NSC), an immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cell line (CBNU-NSC.olig2) and an immortal amniotic stem cell line (CBNU-AFSC) A composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening comprising a cell culture liquid as an active ingredient.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 불멸화 신경줄기세포 또는 상기 불멸화 양수줄기세포는 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터로 불멸화시킨 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the immortalized neural stem cells or the immortalized amniotic stem cells may be immortalized with neural stem cells or amniotic stem cells as v-myc encoding retrovirus vectors.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주는 상기 불멸화 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도한 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the immortalized neural stem cell-derived progenitor precursor cell line may be obtained by treating the immortalized neural stem cells with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector .
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 다음과 같은 특성을 나타내는 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the culture liquid may exhibit the following characteristics.
1) 세포에 직접 작용하여 아토피 원인물질 분비 차단;1) blocks the secretion of atopic origin by acting directly on cells;
2) 비만세포 탈과립 유도제(degranulator)인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크 반응 억제;2) inhibition of acute systemic shock response induced by Compound 48/80, a mast cell degranulation agent (degranulator);
3) 히스타민으로 유도된 가려움증 완화;3) relieving the itch induced by histamine;
4) lgE 생성 감소, 비만세포(mast cells) 침윤 억제, 히스타민 유리 억제, IL-4 감소.4) decreased IgE production, suppression of mast cells infiltration, inhibition of histamine release, and decreased IL-4.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 콜라겐 분해효소 활성을 억제하는 특성을 나타내는 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the culture medium may exhibit a property of inhibiting collagenase activity.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 티로시나아제 활성을 억제하는 특성 및 멜라닌 생성을 억제하는 특성을 나타내는 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the culture medium may exhibit a characteristic of inhibiting tyrosinase activity and a characteristic of inhibiting melanin production.
본 발명에 따르면 신경줄기세포와 양수줄기세포에 v-myc 종양유전자(oncogene)를 도입하여 불멸화 세포주(immortalized cell lines)를 확립하고, 신경줄기세포를 희돌기교전구세포로 분화유도하여 재차 줄기세포를 채취하지 않고 끊임없이 계대배양하면서 동일한 성분을 함유한 배양액을 얻을 수 있다는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 배양액은 아토피 원인물질 분비 차단, 비만세포 탈과립 유도제인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크 반응 억제, 히스타민으로 유도된 가려움증 완화, lgE 생성 감소, 비만세포(mast cells) 침윤 억제, 히스타민 유리 억제, IL-4 감소 활성을 나타내어 아토피 피부염 개선 효과를 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 배양액은 콜라겐 분해효소 활성을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내고, 티로시나아제 활성을 억제하고, 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 나타낸다.According to the present invention, immortalized cell lines are established by introducing a v-myc oncogene into neural stem cells and amniotic stem cells, inducing the differentiation of neural stem cells into progenitor precursor cells, And the culture solution containing the same components can be obtained while continuously passing through the culture. In addition, the immortalized stem cell culture solution according to the present invention can inhibit atopy-induced substance secretion, inhibit acute systemic shock induced by Compound 48/80 inducing mast cell degranulation, mitigate histamine-induced itching, decrease IgE production, cells) infiltration inhibition, histamine-free inhibition, and IL-4-decreasing activity, thereby improving atopic dermatitis. In addition, the culture medium of the immortal stem cell according to the present invention suppresses collagenase activity, exhibits a wrinkle-reducing effect, inhibits tyrosinase activity, and suppresses melanin production, thereby exhibiting a whitening effect.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 줄기세포 불멸화 및 분화유도 과정을 나타낸 그림이다. (A) 줄기세포 불멸화를 위한 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터. (B) 불멸화 줄기세포의 정상적인 인간 염색체 분석 핵형. (C) 불멸화 신경줄기세포(CVNU-NSC)가 줄기세포임을 확인해 주는 네스틴(nestin) 및 CD133 양성 면역염색상. (D) 불멸화 신경줄기세포로부터 분화된 CBNU-NSC.olig2가 희돌기교전구세포임을 확인해 주는 O4 및 CNPase 양성 면역염색상.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 히스타민으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 방어효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 히스타민으로 유도된 피부 출혈반응(Evan’s blue 누출)에 대한 줄기세포 배양액의 방어효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 피부염 완화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 혈청 IgE 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 혈청 histamine 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 혈청 IL-4 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 MMP-1 활성도에 대한 줄기세포 배양액의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 티로시나아제 활성도에 대한 줄기세포 배양액의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 세포(melanocytes)에서의 멜라닌 생산에 대한 줄기세포 배양액의 억제효과를 나타낸 그래프이다.FIG. 1 is a diagram illustrating a stem cell immortalization and differentiation induction process according to an embodiment of the present invention. (A) v-myc encoding retroviral vector for stem cell immortalization. (B) Normal human chromosome analysis karyotype of immortalized stem cells. (C) Nestin and CD133 positive immunohistochemical stain confirming that immortalized neural stem cells (CVNU-NSC) are stem cells. (D) O4 and CNPase-positive immunohistochemical staining to confirm that CBNU-NSC.olig2 differentiated from immortalized neural stem cells is a progenitor precursor cell.
FIG. 2 is a graph showing a protective effect of histamine-induced itching according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing a protective effect of a stem cell culture solution against histamine-induced skin bleeding reaction (Evan's blue leakage) according to an embodiment of the present invention.
4 is a graph showing the dermatitis relieving effect of a stem cell culture solution in a chronic atopic dermatitis model induced by OVA / alum + OVA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the serum IgE inhibitory effect of a stem cell culture solution in a chronic atopic dermatitis model induced by OVA / alum + OVA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing serum histamine inhibitory effect of a stem cell culture solution in a chronic atopic dermatitis model induced by OVA / alum + OVA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the serum IL-4 inhibitory effect of a stem cell culture solution in a chronic atopic dermatitis model induced by OVA / alum + OVA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing an inhibitory effect of a stem cell culture liquid on MMP-1 activity according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a graph showing an inhibitory effect of a stem cell culture solution on tyrosinase activity according to an embodiment of the present invention.
10 is a graph showing an inhibitory effect of a stem cell culture liquid on melanin production in melanocytes according to an embodiment of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In the following description, detailed description of known techniques well known to those skilled in the art may be omitted. In the following description of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear. Also, terminologies used herein are terms used to properly represent preferred embodiments of the present invention, which may vary depending on the user, intent of the operator, or custom in the field to which the present invention belongs.
따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Therefore, the definitions of these terms should be based on the contents throughout this specification. Throughout the specification, when an element is referred to as "comprising ", it means that it can include other elements as well, without excluding other elements unless specifically stated otherwise.
본 발명은 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주, 불멸화 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물을 제공한다.The present invention relates to an immortalized cell line having atopic dermatitis improvement, wrinkle improvement and whitening activity, and a method for producing the same, and more particularly to an immortalized cell line having atopic dermatitis improvement, wrinkle improvement and whitening activity, A composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening.
따라서, 본 발명은 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터)로 처리하여 얻은 불멸화 신경줄기세포주 또는 양수줄기세포주를 제공한다.Accordingly, the present invention provides an immortalized neural stem cell line or amniotic stem cell line obtained by treating neural stem cells or amniotic stem cells with a v-myc encoding retrovirus vector).
또한, 본 발명은 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 희돌기교전구세포주를 제공한다.The present invention also provides an immortalized progenitor cell line obtained by treating neural stem cells with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector to induce differentiation.
줄기세포는 계대배양 과정에서 노화되고 증식이 느려져 지속적으로 균일하고 우수한 배양액을 얻으려면 고통과 윤리적인 문제가 따르는 반복적인 채취가 요구된다. 따라서 본 발명에서는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백효능을 나타내는 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 및 불멸화 양수줄기세포가 일차배양(primary culture) 또는 계대배양(passage) 과정에서 증식능이 떨어지고 배양액 내 유효성분 함량이 감소하는 문제점을 극복하고 우수한 배양액을 안정적으로 확보하기 위해서, 신경줄기세포와 양수줄기세포에 v-myc 종양유전자(oncogene)를 도입하고, 신경줄기세포를 희돌기교전구세포로 분화유도하여 불멸화 세포주(immortalized cell lines)를 확립하였으며, 보다 구체적으로 CBNU-NSC, CBNU-NSC.olig2 및 CBNU-AFSC 세포주를 확립하였다. 이러한 불멸화 세포주는 재차 줄기세포를 채취하지 않고 끊임없이 계대배양하면서 동일한 성분을 함유한 배양액을 얻을 수 있다는 장점이 있어 기능성 신소재로 그 응용성이 크다.Stem cells are aging in the process of subculture, slowed proliferation, and repeatedly harvesting with pain and ethical problems is required to obtain a consistently uniform and excellent culture medium. Therefore, in the present invention, immortalized neural stem cells, immortalized neural stem cell-derived mesenchymal stem cells and immortalized amniotic stem cells exhibiting atopic dermatitis improvement, wrinkle improvement and whitening efficacy are capable of proliferating in primary culture or passaging In order to overcome the problem of decreasing the effective ingredient content in the culture medium and to secure a stable culture medium, a v-myc oncogene is introduced into neural stem cells and amniotic stem cells, and neural stem cells are introduced into the progenitor precursor cells Immortalized cell lines were established to induce differentiation, and more specifically CBNU-NSC, CBNU-NSC.olig2 and CBNU-AFSC cell lines were established. Such an immortalized cell line is advantageous as a functional new material because it has an advantage that a culture solution containing the same ingredients can be obtained while continuously culturing the stem cells without taking stem cells again.
본 발명에서는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백에 효과적인 소재를 탐색하기 위해 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ADSC), 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포주(CBNU-AFSC) 등 다양한 줄기세포 배양액의 효능을 비교하였으며, 일예로 비만세포(mast cells) 및 아토피 피부염 모델동물에서 히스타민 분비와 피부 염증을 완화시켜 주는지를 평가하였다. 또한, 콜라겐 분해효소인 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)과 티로시나아제(tyrosinase)를 억제함으로써 피부 주름 개선 및 미백 효능을 나타내는지를 이미 그 효능이 알려진 지방줄기세포와 비교 평가하였다.In the present invention, in order to search for effective materials for improving atopic dermatitis, improving wrinkles and whitening, adipose-derived stem cells (ADSC), immortalized neural stem cell line (CBNU-NSC), immortal neural stem cell- (CBNU-NSC.olig2) and immortalized amniotic fluid stem cell line (CBNU-AFSC). For example, mast cells and atopic dermatitis model animals alleviate histamine secretion and skin inflammation. . In addition, the compounds showing matrix wrinkle reduction and whitening efficacy by inhibiting collagenase, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and tyrosinase, were compared with lipid stem cells whose effects were already known.
그 결과, 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 및 불멸화 양수줄기세포의 우수한 효능을 확인하였다.As a result, excellent efficacy of immortalized neural stem cells, immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cells and immortalized amniotic stem cells was confirmed.
이에, 본 발명은 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a method for producing a stem (s) selected from the group consisting of an immortalized neural stem cell line (CBNU-NSC), an immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cell line (CBNU-NSC.olig2) and an immortal amniotic stem cell line A composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening comprising a cell culture liquid as an active ingredient.
본 발명에서 상기 불멸화 신경줄기세포 또는 상기 불멸화 양수줄기세포는 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터로 불멸화시킨 것일 수 있다.In the present invention, the immortalized neural stem cells or the immortalized amniotic stem cells may be immortalized with neural stem cells or amniotic stem cells as v-myc encoding retrovirus vectors.
또한, 상기 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포는 상기 불멸화 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도한 것일 수 있다.In addition, the immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cells may be derived from the immortalized neural stem cells by treating with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector.
아토피 피부염을 유발하는 데에는 여러세포들(T lymphocytes, Langerhans cells, eosinophils, keratinocytes)과 인자(cytokines과 immunoglobulins, 특히 IgE)들이 관여하는 것으로 알려져 있다. It is known that many cells (T lymphocytes, Langerhans cells, eosinophils, keratinocytes) and factors (cytokines and immunoglobulins, especially IgE) are involved in causing atopic dermatitis.
초기단계에서 아토피 과민반응 유발 알레르겐(allergen)은 IL-4와 같은 사이토카인을 분비하는 Th2 타입의 T세포를 유도한다. 이어 IgE를 포함하는 항체를 생산하는 B 세포와 반응한다. 알레르겐이 비만세포(mast cells) 표면의 Fcε 수용체I에 cross-link되어 있는 IgE와 반응하면 비만세포로부터 히스타민이 유리되어 즉각적인 과민반응, 즉 아나필락시스 쇼크반응(anaphylaxis)이 유발된다. 아토피 피부염에서 Th2 타입의 T세포가 IL-4를 다량으로 생산하고, 이는 플라즈마 세포(plasma cells)로 하여금 IgE 생산을 촉진시킨다. 그러므로 가장 효과적인 항알러지 및 항아토피 후보물질로는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제함은 물론, 초기 Th2 타입의 T세포와 후기 Th1 타입의 T세포를 포함한 Th 세포의 활성화를 차단하는 것이 필요하다.At the early stage, allergen-induced allergens induce Th2-type T cells that secrete cytokines such as IL-4. And then reacts with B cells producing antibodies comprising IgE. When allergens react with IgE cross-linked to Fcε receptor I on the surface of mast cells, histamine is liberated from mast cells and an immediate hypersensitivity reaction (anaphylaxis shock) is induced. In atopic dermatitis, Th2-type T cells produce a large amount of IL-4, which causes plasma cells to stimulate IgE production. Therefore, the most effective anti-allergic and anti-atopy candidates are not only inhibiting histamine release from mast cells, but also blocking the activation of Th cells, including early Th2 type T cells and late Th1 type T cells.
본 발명의 일 실시예에서는 인간에서 실제적으로 문제가 되고 있는 만성 아토피 피부염 동물모델을 이용하여 줄기세포 배양액의 개선효능을 평가하였다. OVA/alum + OVA로 유도되는 아토피 피부염에 모델에서 OVA 감작군에서는 다양한 피부 염증 및 비후와 더불어 비만세포 침윤이 유도되었으며, 혈청 분석결과 총 IgE 수준의 유의한 상승이 관찰되어 후보물질 탐색을 위한 만성 아토피 적합모델로 확인되었다.In one embodiment of the present invention, the improvement effect of the stem cell culture fluid was evaluated using an animal model of chronic atopic dermatitis, which is actually a problem in humans. In the model of OVA / alum + OVA induced atopic dermatitis, mast cell infiltration was induced with various skin inflammation and hypertrophy in the OVA sensitization group, and a significant increase in total IgE level was observed by serum analysis, It was confirmed as an atopy fit model.
또한, 본 발명에서는 줄기세포 배양액의 확실한 아토피 피부염 개선효능을 검증하기 위해 배양액 원액과 더불어 10배 농축액을 제조함으로써 임상적용 가능성을 확인하였다. 또한, 작용기전을 규명하기 위해 비만세포의 이탈과립(degranulation)으로부터의 전신성 쇼크반응, 국소성 가려움증 및 출혈반응, 피부염증 및 매개물질에 대해 분석하였다.In addition, in the present invention, the possibility of clinical application is confirmed by preparing a 10-fold concentrate together with a stock solution of a culture medium in order to verify a certain effect of the stem cell culture fluid for relieving atopic dermatitis. To elucidate the mechanisms of action, systemic shock reactions, focal itching and hemorrhagic reactions, skin inflammation and mediators from mast cell degranulation were analyzed.
분석한 결과들을 종합해 보면, 본 발명에 따른 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포, 불멸화 양수줄기세포 배양액 농축액은 첫째, 세포에 직접 작용하여 아토피 원인물질 분비를 차단하는 것으로 나타났고, 둘째, 비만세포의 탈과립 유도제인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크반응을 억제함으로써 체내에서도 급성 과민반응을 완화시켜 주는 것으로 확인되었으며, 셋째, 히스타민으로 유도된 가려움증을 완화시켜 주는 것으로 확인되어 임상에서 가장 고통스러운 증상을 효과적으로 해결해 줄 수 있는 가능성을 제시하였고, 넷째, 만성 아토피 피부염 모델에서 IgE 생성을 감소시키고, 비만세포의 침윤을 억제하고, 히스타민 유리를 억제함은 물론 IL-4를 감소시킴으로써 피부염증을 완화시키는 것으로 나타났다.According to the results of the analysis, immortal amniotic stem cells, immortalized neural stem cell-derived progenitor precursor cells, and immortalized amniotic stem cell culture solution concentrate according to the present invention firstly act directly on cells and block the secretion of atopic origin substances Second, it was confirmed that the compound suppresses the acute systemic shock induced by the compound 48/80 induced by the degranulation inducing agent of mast cells, and the third, it alleviates the histamine-induced itching. In the present study, we investigated the effects of IL-4 and IL-4 on the development of atopic dermatitis. To reduce skin inflammation.
따라서 본 발명에 따른 상기 불멸화 줄기세포 배양액은 일련의 제1형 과민반응 유발 전 과정에서 단계별 억제효과를 발휘함으로써 새로운 아토피 피부염 개선 후보물질로서의 가능성이 충분한 것으로 확인되었다.Therefore, the immortalized stem cell culture according to the present invention exhibits a step-by-step inhibitory effect during a series of the induction of the type I hypersensitivity reaction, and thus it has been confirmed that there is a high possibility as a candidate for ameliorating a new atopic dermatitis.
한편, 나이가 들고 자외선과 같은 유해환경에 노출될 기회가 많아짐에 따라 피부 주름과 착색 및 기미/주근깨가 증가하고 있어 피부 미용개념에 있어 주름 개선 및 미백에 대한 관심이 고조되고 있다. 많은 항산화 천연물을 활용한 주름 개선 및 미백용 소재가 개발되고 있지만, 최근 줄기세포 배양액의 피부염 및 주름 개선과 미백 효능이 주목을 받고 있다. 특히 줄기세포에 의한 피부재생 효과가 배양액 내 성장/영양인자(growth/trophic factors)에 의한 것으로, 이들 성분이 자기 피부 기저층의 줄기세포를 활성화하여 세포성장주기를 빠르게 함으로써 근원적으로 젊은 피부로 되돌려 줄 수 있다는 의학적 가설에 따라 기대감이 높다.On the other hand, as the chance of exposure to harmful environment such as old age and ultraviolet rays increases, wrinkles, coloring, and stain / freckles increase, and thus interest in the improvement of wrinkles and whitening in the concept of skin beauty is increasing. Although many wrinkle-improving and whitening materials have been developed using many antioxidant natural materials, improvement of dermatitis and wrinkles and whitening efficacy of stem cell culture fluids are attracting attention. In particular, skin regeneration by stem cells is caused by growth / trophic factors in the culture medium, and these components activate the stem cells of the basal layer of the skin and speed up the cell growth cycle, There is a high expectation based on the medical hypothesis.
본 발명에서는 다양한 줄기세포 배양액을 피부 콜라겐(collagen)을 분해하여 주름 형성에 직접 관여하는 MMP-1에 적용한 결과, 기존에 피부 주름개선용으로 사용되어 온 지방줄기세포 배양액에 비해 본 발명에 따른 불멸화 신경줄기세포 배양액이 더 높은 억제효과를 나타냈으며, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 배양액은 불멸화 신경줄기세포 배양액 보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 특히, 불멸화 양수줄기세포 배양액은 가장 강력하게 MMP-1을 억제하여 주름 개선에 유용하게 이용될 수 있다.In the present invention, various stem cell cultures were applied to MMP-1 directly involved in the formation of wrinkles by decomposing collagen of skin. As a result, compared with the adipose stem cell culture fluid used for improving skin wrinkles, Neuronal stem cell cultures showed a higher inhibitory effect and the culture media of immortalized neural stem cells derived from neural stem cells were more effective than the culture of immortalized neural stem cells. In particular, the immortalized amniotic fluid culture medium of stem cells can be most effectively used to suppress wrinkles by inhibiting MMP-1 most strongly.
MMP-1 억제효과에 더하여 티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌(melanin)을 합성하여 피부를 검게 만드는 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 억제에 있어서도 기존에 미백효능이 알려진 지방줄기세포에 비해 본 발명에 따른 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 및 불멸화 양수줄기세포가 더 우수한 억제효과를 보여 주었으며, 더 나아가 멜라닌세포(melanocytes)에 직접 적용했을 때에도 불멸화 양수줄기세포 > 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포의 순으로 멜라닌 생산을 탁월하게 억제하였다. 따라서 본 발명의 불멸화 양수줄기세포 배양액은 주름 개선은 물론, 미백에 있어서도 우수한 효과를 나타낸다.In addition to the inhibitory effect of MMP-1, tyrosinase, which is an enzyme that melts melanin from tyrosine to make skin darker, Immortalized neural stem cells, immortalized neural stem cells, and immortalized amniotic stem cells showed more excellent inhibitory effect. Furthermore, when applied directly to melanocytes, immortalized amniotic stem cells> immortalized neural stem cells The progenitor cells and the immortalized neural stem cells in the order of melanin production. Therefore, the immortalized amniotic fluid culture medium of the present invention exhibits an excellent effect not only in wrinkle improvement but also in whitening.
한편, 본 발명의 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.Meanwhile, the composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening of the present invention may be a cosmetic composition.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 또는 불멸화 양수줄기세포의 배양액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.The components contained in the cosmetic composition of the present invention include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the culture of immortalized neural stem cells as an active ingredient, a culture medium of an immortalized neural stem cell-derived proliferative precursor cell or an immortalized amniotic stem cell, Stabilizers, solubilizers, vitamins, customary adjuvants such as pigments and perfumes, and carriers. In addition, the cosmetic composition may further include a skin absorption promoting substance to improve its effect.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림,클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention can be prepared into any of the formulations conventionally produced in the art and can be used as a solution, a suspension, an emulsion, a paste, a gel, a cream, a lotion, a powder, a soap, , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of a soft lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray or a powder. When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형In the case where the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. Especially, in the case of a spray, a mixture of chlorofluorohydrocarbons, propane / Propane or dimethyl ether. When the formulation of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters. The formulation of the present invention
이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.In the case of this suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose, aluminum Metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used. When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, or ethoxylated glycerol fatty acid esters.
또한, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.In addition, the composition of the present invention can be manufactured from a pharmaceutical composition.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.When the composition of the present invention is manufactured from a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내, 경막하, 뇌 내 또는 뇌실 내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans in various routes such as oral or parenteral, and can be administered orally, rectally, intravenously, muscularly, subcutaneously, Intraperitoneal, intracerebral, or intracerebral injection. Preferably, it is applied by transdermal administration during parenteral administration, more preferably by topical application by application.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1-100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in an amount of 0.1-100 mg / kg on an adult basis, once or several times a day, in the case of an oral formulation, It is preferable to apply 1 to 5 times a day in an amount of 1.0 to 3.0 ml per day and continue for 1 month or longer. However, the dosage is not intended to limit the scope of the present invention.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in any form suitable for pharmaceutical preparations including oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, external preparations such as ointments and creams, suppositories and sterile injectable solutions, , Dispersants, or stabilizers.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 일 실시예를 제공한다. 다만, 하기의 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 아래의 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. It should be understood, however, that the following examples are for the purpose of promoting understanding of the present invention, but the present invention is not limited by the following examples.
<< 실시예Example 1> 1>
줄기세포 채취, Stem cell harvesting, 불멸화immortalization 및 분화유도 And induction of differentiation
지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ADMSC)는 53세의 정상인 여성으로부터 복부 지방흡입술을 통해, 신경줄기세포(NSC)는 임신 15주에 유산된 태아의 뇌로부터, 양수줄기세포(AFSC)는 임신 말기 정상적인 임산부로부터 각각의 기관윤리위원회(IRB) 심의를 거쳐 환자 및 보호자의 동의서를 받아 채취하였다.Adipose-derived stem cells (ADMSC) are derived from abdominal fat aspiration from a normal 53-year-old woman, from neural stem cells (NSCs) from fetal brain aborted at 15 weeks of gestation, They were taken from the normal pregnant women after their respective institutional ethics committee (IRB) deliberations and consent was obtained from the patients and their guardians.
신경줄기세포와 양수줄기세포의 특성을 유지함으로써 안정적으로 동일한 배양액을 얻기 위하여, v-myc-encoding retroviral vector를 사용하여 불멸화한 신경줄기세포주(CBNU-NSC)와 불멸화한 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)를 확립하였다. 즉, pLSN.v-myc-encoding retroviral vector를 사용하여 PA317 amphotropic packaging cell line을 감염시키고, 성공적으로 감염된 retroviral particles을 가진 PA317 producer cell line, 즉 PASK1.2를 얻었다. 이러한 PASK1.2를 이용하여 줄기세포를 불멸화하고 puromycin 저항성 클론을 선별하여 확장시켰다.(CBNU-NSC) and immortalized amniotic stem cell line (CBNU-AFSC) using v-myc-encoding retroviral vector in order to stably obtain the same culture medium by maintaining the characteristics of neural stem cells and amniotic stem cells. Respectively. In other words, PA317 amphotropic packaging cell line was infected with the pLSN.v-myc-encoding retroviral vector and the PA317 producer cell line, PASK1.2, with successfully infected retroviral particles was obtained. Using PASK1.2, stem cells were immortalized and puromycin resistant clones were selected and expanded.
한편, 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC)를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 얻은 불멸화 신경줄기세포주 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2)를 확립하였다. 즉, pLHCX.Olig2-encoding retroviral vector를 사용하여 PA317 amphotropic packaging cell line을 감염시켰다. 이 packaging cells의 상등액을 신경줄기세포(CBNU-NSC)에 접종하고 puromycin 저항성 클론을 선별하여 확장시켰다.(CBNU-NSC.olig2) derived from the immortalized neural stem cell line obtained by treating the immortalized neural stem cell line (CBNU-NSC) with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector Respectively. In other words, the pLHCX.Olig2-encoding retroviral vector was used to infect the PA317 amphotropic packaging cell line. The supernatants of these packaging cells were inoculated into neural stem cells (CBNU-NSC) and puromycin resistant clones were selected and expanded.
확립된 세포주에 대해 네스틴(nestin), CD133, O4, CNPase 등에 대한 면역염색으로 줄기세포와 희돌기교전구세포임을 확인하였다(도 1 참조).The established cell lines were confirmed to be stem cells and progenitor precursor cells by immunostaining for nestin, CD133, O4, CNPase and the like (see FIG. 1).
또한, 상기 본 발명에서 제조한 불멸화 줄기세포주들은 2014년 7월 25일자로 KCTC 기관에 각각 기탁하여 균주 기탁번호를 부여받았는데, 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC)는 기탁번호 KCTC12635BP로 부여받았고, 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)는 기탁번호 KCTC12634BP로 부여받았으며, 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2)는 기탁번호 KCTC12636BP로 부여받았다.In addition, the immortalized stem cell lines prepared in the present invention were deposited with KCTC institutions on July 25, 2014, respectively. The immortalized stem cell lines (CBNU-NSC) were assigned with deposit number KCTC12635BP, The stem cell line (CBNU-AFSC) was deposited with the accession number KCTC12634BP. The stem cell line (CBNU-AFSC) was treated with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector to induce differentiation, and the immortalized cell line CBNU- NSC.olig2) was assigned accession number KCTC12636BP.
<< 실시예Example 2> 2>
실험동물Experimental animal
암컷 ICR 마우스(6주령, 25-30 g)를 코아텍(경기도 평택)으로부터 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물을 마우스용 케이지에 5마리씩 수용하고, 동물실험실의 환경을 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간(07:00-19:00), 조도 150-300 lux로 조절하였다. 실험동물용 pellet형 고형사료인 Purina Rat Chow를 바이오피아(경기도 군포)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.Female ICR mice (6 weeks old, 25-30 g) were supplied from Koatech (Pyeongtaek, Gyeonggi Province) and used for about 1 week after laboratory purification. Animals were housed in a mouse cage in an amount of 5 animals per animal, and the environment of the animal laboratory was maintained at a temperature of 23 ± 2 ° C, a relative humidity of 55 ± 10%, a ventilation frequency of 12 times / hour, a lighting cycle of 12 hours (07:00 to 19:00) The illumination was adjusted to 150-300 lux. Purina Rat Chow, a pellet-type solid feed for laboratory animals, was supplied and received from Biopia (Gyeonggi Province Gunpo), and sterile purified water was freely ingested. This study was carried out in accordance with the Standard Operation Procedures (SOP) of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Chungbuk National University.
<< 실시예Example 3> 3>
아토피 피부염 개선효능 시험평가(1)Atopic dermatitis improvement efficacy test evaluation (1)
<3-1> β-≪ 3-1 > 헥소사미니다제Hexosamidine 분비 억제효과 Secretion inhibitory effect
과립의 지표인 β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)를 분석하여 비만세포(mast cells) 분비를 측정하였다. 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 48-웰 플레이트(2.5×105 cells/well)에 분주하고, 12시간 동안 1 μg/mL IgE를 처리한 후 HEPES 버퍼로 4회 세척하였다. 배양세포에 시험물질인 줄기세포 배양액(원액 또는 10배 농축액 1%)을 가하고, 이어서 0.1% BSA 함유 세포외버퍼(extracellular buffer)에 희석한 DNP-BSA (400 ng/mL)로 처리한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 50 μL의 상층액에 200 μL의 1 mM p-니트로페닐 N-아세틸-베타-D-글루코사민(p-nitrophenyl N-acetyl-βbeta-D-glucosamine)을 가하고 37℃에서 3시간 반응시켰다. 500 μL의 0.05 M 소듐 카보네이트 버퍼(sodium carbonate buffer)를 가하여 효소반응을 정지시키고, 405 nm에서 흡광도로 β-헥소사미니다제의 분비량을 측정하였다.Mast cell secretion was measured by analyzing β-hexosaminidase, an indicator of granules. RBL-2H3 cells were divided into 48-well plates (2.5 × 10 5 cells / well), treated with 1 μg / mL IgE for 12 hours and then washed four times with HEPES buffer. The cells were treated with DNP-BSA (400 ng / mL) diluted in a 0.1% BSA-containing extracellular buffer, and then incubated for 1 hour at 37 ° C. Lt; 0 > C for 1 hour. Then, 200 μL of 1 mM p-nitrophenyl N-acetyl-βbeta-D-glucosamine was added to 50 μL of the supernatant, followed by reaction at 37 ° C. for 3 hours. 500 μL of 0.05 M sodium carbonate buffer was added to stop the enzyme reaction, and the secretion amount of β-hexosaminidase was measured at 405 nm with absorbance.
그 결과, 하기 표 1을 참조하면, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 IgE로 감작시켰을 때 분비되는 β-헥소사미니다제에 대해 이에 비해 지방줄기세포(ADSC) 배양액을 1%의 농도로 처리했을 때는 약 8%, 10배 농축액을 처리했을 때는 약 19%의 약한 억제효과를 보여 주었다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC) 배양액을 1%의 농도로 처리했을 때는 약 10%, 10배 농축했을 때는 약 23%의 억제효과를 보여 주었다. 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2) 배양액은 원액으로는 약 21%, 농축액으로는 약 42%의 억제효과가 나타나 불멸화 신경줄기세포와 비교하여 더 우수한 억제효과를 나타내었다. 특히, 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC)는 원액과 농축액에서 각각 34%와 55.5%의 억제효과를 나타내 가장 우수한 것으로 확인되었다.As a result, as shown in the following Table 1, compared to β-hexosaminidase secreted when RBL-2H3 cells were sensitized with IgE, adipocyte stem cell (ADSC) culture medium was treated at a concentration of 1% And about 19% when treated with a 10-fold concentrated solution. Compared with the CBNU-NSC culture, the inhibitory effect was about 10% at 1% concentration and about 23% at 10-fold concentration. The culture media of CBNU-NSC.olig2 derived from the immortalized neural stem cells showed about 21% inhibitory effect on the undiluted solution and about 42% on the concentrate, showing a more excellent inhibitory effect than the immortalized neural stem cells. In particular, immortalized amniotic fluid cells (CBNU-AFSC) showed the most excellent inhibitory effect of 34% and 55.5% in the undiluted solution and concentrate, respectively.
(ADSC)Adipose stem cell
(ADSC)
(CBNU-NSC)Immortalized neural stem cells
(CBNU-NSC)
(CBNU-NSC.olig2)Immortalization
(CBNU-NSC.olig2)
(CBNU-AFSC)Immortalized amniotic stem cells
(CBNU-AFSC)
<3-2> Compound 48/80 유도 전신성 <3-2> Compound 48/80 Induced Systemic 아나필락시스반응Anaphylactic reaction 억제효능 Inhibitory efficacy
RBL-2H3 세포에서의 탈과립(degranulation) 억제효과에 근거하여 동물에서의 전신성 아나필락시스 쇼크반응 억제효능을 평가하고자 하였다.Based on the inhibitory effect of degranulation on RBL-2H3 cells, the effect of inhibiting the systemic anaphylactic shock reaction in animals was evaluated.
이를 위해, 마우스에 시험물질인 줄기세포 배양액(원액 또는 10배 농축액 0.1 mL/mouse)을 복강 내로 주사하고, 30분 후 비만세포 탈과립 유도제인 Compound 48/80 (8 mg/kg)를 복강 내로 주사하였다. 1시간 동안 전신적인 아나필락시스 반응에 따른 동물의 사망률을 기록하였다.To this end, the mouse was injected into the abdominal cavity with the stem cell culture solution (raw solution or 10-fold concentrated solution, 0.1 mL / mouse) and the compound 48/80 (8 mg / kg) as a mast cell degranulation inducing agent was injected intraperitoneally Respectively. The mortality rate of the animals according to the systemic anaphylactic reaction for 1 hour was recorded.
그 결과, 하기 표 2를 참조하면, 비만세포 탈과립 유도제로 알려진 Compound 48/80를 8 mg/kg의 용량으로 복강 내로 투여했을 때 모든 동물이 쇼크로 사망하였는데, 원액의 지방줄기세포 배양액은 효과가 없었으나, 농축액을 0.1 mL/mouse의 용량으로 사전에 투여했을 때는 50%만이 사망하였다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포 배양 원액을 투여했을 때는 사망률이 66.7%로 감소하였으며, 10배 농축액을 투여했을 때는 33.3%로 더욱 줄어들었다. 불멸화 희돌기교전구세포 배양액은 더 효과가 좋아서, 원액과 농축액 투여 후 사망률이 각각 50%와 16.7%로 감소하였다. 한편, 불멸화 양수줄기세포는 원액 투여시 50%로 사망률을 낮추었으며, 특히 농축액 투여시에는 모든 동물이 생존하여 가장 우수한 것으로 나타났다.As a result, referring to the following Table 2, when Compound 48/80, which is known as a mast cell degranulation inducer, was administered intraperitoneally at a dose of 8 mg / kg, all animals died from shock, and the adipocyte stem cell culture solution was effective However, only 50% of the concentrate died when pre-dosed at a dose of 0.1 mL / mouse. In contrast, the mortality rate decreased to 66.7% when the undiluted neural stem cell culture broth was administered, and to 33.3% when the 10-fold concentrated solution was administered. The immortalized progenitor cell culture medium was more effective, and mortality after administration of concentrate and concentrate decreased to 50% and 16.7%, respectively. On the other hand, immortalized amniotic fluid cells showed a mortality rate of 50% in the case of the undiluted solution.
(mL/mouse)Dose
(mL / mouse)
(ADSC)Adipose stem cell
(ADSC)
(CBNU-NSC)Immortalized neural stem cells
(CBNU-NSC)
(CBNU-NSC.olig2)Immortalization
(CBNU-NSC.olig2)
(CBNU-AFSC)Immortalized amniotic stem cells
(CBNU-AFSC)
<3-3> 히스타민 유도 가려움증 및 피부출혈 억제효능<3-3> Effect of inhibiting histamine-induced itching and skin bleeding
히스타민으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 완화효과를 평가하기 위하여, 마우스의 등 부위를 제모하고, 50 μL 줄기세포 배양액(10배 농축액)과 동량(50 μL)의 히스타민(histamine dihydrochloride; 0.5 μg/site) 혼합액을 피내로 주사하였다. 이어 0.25 mL의 Evan’s blue 용액(0.5%)을 혈관 내로 주사하였다. 30분 동안 가려움증으로 인해 뒷발로 긁는 횟수(scratching behavior)를 측정하였다. 또한, 가려움증 측정 후 피부를 절제하여 Evan’s blue를 포름아마이드로 추출하여 혈관 누출량을 측정하였다.To evaluate the mitigating effect of histamine-induced itching on the stem cell culture solution, the back part of the mouse was epilated, and 50 μL histamine dihydrochloride (0.5 μg) was added to 50 μL of the stem cell culture solution (10 times concentrated) / site) mixed solution was injected intradermally. Then 0.25 mL of Evan's blue solution (0.5%) was injected intravascularly. Scratching behavior was measured for 30 minutes due to itching. After the itching was measured, the skin was excised and Evan's blue was extracted with formaldehyde to measure the blood vessel leakage.
그 결과, 도 2를 참조하면, 히스타민(0.5 μg/site)을 마우스의 피내로 주사했을 때 30분간 평균 85회의 긁는 횟수를 나타냈다. 이러한 가려움증에 대해 지방줄기세포(ADSC) 배양 농축액(50 μL)을 혼합 투여했을 때는 긁는 횟수가 70회로 유의하게(17.6%) 줄어들었다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포 배양액은 61회로, 불멸화 희돌기교전구세포 배양액은 48회로 탁월하게 감소시키는 것으로 나타났다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양 농축액은 39회로 감소시켜 가장 우수한 것으로 나타났다.As a result, referring to FIG. 2, when the histamine (0.5 μg / site) was injected intradermally into the mouse, the average number of scratches was 85 times for 30 minutes. When mixed with 50 μL of adipocyte stem cell (ADSC) culture concentrate for this itching, the number of scratches decreased by 70% (17.6%) significantly. In contrast, the immortalized neural stem cell culture showed an excellent reduction of 61 times, and the immortalized progenitor cell preculture cell culture showed a remarkable reduction of 48 times. In particular, immortalized amniotic fluid stem cell culture concentrate showed the best result in 39 cycles.
또한, 도 3을 참조하면, 히스타민으로 가려움증이 유발된 마우스 피부에서의 피부 출혈반응을 Evan’s blue 누출량으로 정량한 결과, 히스타민만을 투여했을 때는 2.70 μg/site의 Evan’s blue가 누출되었는데, 지방줄기세포 배양 농축액을 혼합 투여했을 때는 누출량이 2.30 μg/site로 14.8% 감소한 것을 확인하였다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포 배양액과 희돌기교전구세포 배양액은 각각 1.67 μg/site와 1.33 μg/site로 유의하게 감소시켰다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양액 투여시에는 1.13 μg/site로 탁월하게 감소하여 가장 우수한 것으로 나타났다.In addition, referring to FIG. 3, Evan's blue leakage of histamine-induced skin irritation in mouse skin induced by Evan's blue leakage revealed that Evan's blue of 2.70 μg / site was leaked when histamine alone was administered, When the concentrate was mixed, it was confirmed that the leakage amount decreased by 14.8% at 2.30 μg / site. In contrast, the culture media of immortalized neural stem cells and proliferating progenitor cells were significantly reduced to 1.67 μg / site and 1.33 μg / site, respectively. In particular, when administered to the immortalized amniotic fluid culture medium, it showed an excellent reduction of 1.13 μg / site.
<< 실시예Example 4> 4>
아토피 피부염 개선효능 시험평가(2)Atopic dermatitis improvement efficacy test evaluation (2)
<4-1> 만성 아토피 유발 및 시험물질 투여<4-1> Chronic atopic induction and test substance administration
마우스에 10 μg ovalbumin/4 mg aluminum hydroxide (OVA/alum in 200 μL saline)를 1주일 간격으로 총 3회(0, 7 및 14일) 복강 내로 투여함으로써 감작을 유도하였다. 마지막 감작 7일 후(21일) 100 μL 줄기세포 배양액(10배 농축액)과 동량(100 μL)의 OVA (100 μg)를 sterile gauze 패치 (1.5×1.5 cm)에 점적하여 제모한 마우스의 등에 적용하고 transparent dressing을 이용하여 고정하였다. 패치는 2일에 한 번씩 교체하였으며 총 14일(21-35일) 동안 유지하였다.Sensitization was induced by intraperitoneal administration of 10 μg ovalbumin / 4 mg aluminum hydroxide (OVA / alum in 200 μL saline) to the mice three times a week (0, 7 and 14 days) Application of 100 μL stem cell culture solution (10 times concentrated) and the same amount (100 μL) of OVA (100 μg) to a sterile gauze patch (1.5 × 1.5 cm) by epilating 7 days after the last sensitization (21 days) And fixed with transparent dressing. The patches were replaced every 2 days and were maintained for a total of 14 days (21-35 days).
<4-2> 피부병변의 평가≪ 4-2 > Evaluation of skin lesion
피부병변은 패치를 제거하고 24시간 후 다음의 지표에 따라 점수화하였다. 증상(symptoms): 1, 발적 및 출혈(erythema & hemorrhage); 2, 부종(edema); 3, 인설 및 미란(excoriation & erosion); 4, 건조(dryness). 정도(score): 0, 무증상(no sign); 1, 미약(mild); 2, 중등도(moderate); 3, 심함(severe). 각각의 증상에 대한 score의 합을 개체별 피부염 점수(dermatitis score)로 하였다. Skin lesions were scored according to the following index after 24 hours of patch removal. Symptoms: 1, erythema &hemorrhage; 2, edema; 3, excoriation &erosion; 4, dryness. Score: 0, no sign; 1, mild; 2, moderate; 3, severe. The sum of scores for each symptom was defined as a dermatitis score.
그 결과, 도 4를 참조하면, OVA/alum + OVA로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 다양한 정도의 홍반, 부종, 인설, 건조증상 등의 피부병변이 유발되어 그 정도를 dermatitis score로 평가한 결과 4.16점에 달하는 것으로 나타났다. 이에 비해 지방줄기세포와 불멸화 신경줄기세포 배양 농축액을 도포했을 때는 각각 3.15점과 3.02점으로 다소 완화되었지만 유의성이 인정되지 않았다. 이에 비해 희돌기교전구세포 배양액 도포시에는 2.36점으로 크게 완화되었으며, 불멸화 양수줄기세포 배양액은 1.62점으로 낮추어 탁월한 아토피 피부염 개선효과를 보여 주었다.As a result, referring to FIG. 4, in a chronic atopic dermatitis model induced by OVA / alum + OVA, various degrees of skin lesions such as erythema, edema, dryness, and dryness were induced and the degree of dermatitis score was evaluated as 4.16 . In contrast, when the adipocyte stem cell and the immortalized neural stem cell culture concentrate were applied, they were somewhat mitigated to 3.15 and 3.02, respectively, but the significance was not recognized. In contrast, when applied to the culture media of the proliferating progenitor cells, it was greatly eased to 2.36 points, and the amount of the culture medium of the immortalized amniotic fluid stem cells was reduced to 1.62 points, which showed an excellent effect of improving atopic dermatitis.
* <4-3> 조직병리학적 평가 * <4-3> Histopathological evaluation
부검시 피부 병변부위의 일부를 채취하여 Bouin's solution에 고정한 후 파라핀 절편을 만들어 헤마톡실린&에오신(hematoxylin & eosin)으로 염색하였다. 광학현미경을 이용하여 염증세포의 침윤정도를 평가하였다. 상피증식(epidermal hyperplasia)을 평가하기 위해 상피 두께를 이미지 분석 소프트웨어 프로그램(ImagePartner, Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 또한, 비만세포의 침윤정도를 평가하기 위해 조직절편을 산성의 톨루이딘 블루(toluidine blue, pH 4.0)로 염색하고, ×1,000 배율의 high-power fields (HPFs) 하에서 20개 시야의 비만세포를 계수하였다.During autopsy, a portion of the skin lesion was harvested, fixed in Bouin's solution, and paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin. The degree of infiltration of inflammatory cells was evaluated using an optical microscope. Epidermal thickness was measured using an image analysis software program (ImagePartner, Seoul, Korea) to evaluate epidermal hyperplasia. To evaluate the extent of mast cell infiltration, tissue sections were stained with acidic toluidine blue (pH 4.0), and 20 fields of mast cells were counted under high-power fields (HPFs) at × 1,000 magnification .
그 결과, 하기 표 3을 참조하면, OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부에서 OVA 첩포 부위에 상피증식과 함께 진피(dermis)의 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration)이 확인되었다. 특히 톨루이딘 블루로 염색했을 때 진피(dermis) 조직 내에 많은 수의 비만세포가 분포함으로써 면역 과민반응이 확인되었다. 이러한 알레르기 반응에 대해 지방줄기세포와 불멸화 신경줄기세포 배양 농축액의 도포는 다소의 완화효과를 나타냈으며, 특히 희돌기교전구세포 배양액은 유의한 개선효과를 보여 주었다. 특히 불멸화 양수줄기세포는 가장 탁월한 피부염증 및 비만세포 침윤 억제효능을 나타내었다.As a result, referring to Table 3, inflammatory cell infiltration of the dermis was confirmed with epithelial proliferation at the OVA patch site in chronic atopic skin induced by OVA / alum + OVA. In particular, immunostaining was confirmed by the distribution of a large number of mast cells in the dermis tissue when stained with toluidine blue. The application of adipocyte stem cell and immortalized neural stem cell culture concentrate to the allergic reaction showed some mitigating effect, and especially the culture media of the progenitor cells showed a significant improvement. In particular, the immortalized amniotic fluid stem cells showed the most excellent skin inflammation and mast cell infiltration inhibitory effect.
+ OVAOVA / alum
+ OVA
(μm, ×100)Epithelium thickness
(μm, × 100)
(ADSC)Adipose stem cell
(ADSC)
(CBNU-NSC)Immortalized neural stem cells
(CBNU-NSC)
(CBNU-NSC.olig2)Immortalization
(CBNU-NSC.olig2)
(CBNU-AFSC)Immortalized amniotic stem cells
(CBNU-AFSC)
<4-4> 혈청 total <4-4> Serum total IgEIgE , IL-4 및 histamine 농도 측정, IL-4 and histamine concentrations
부검 시 복대정맥으로부터 채혈한 혈액을 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 총 IgE는 마우스 IgE ELISA 키트(Immunology Consultant Laboratory, Inc., Newberg, USA)로, IL-4는 마우스 IL-4 ELISA 키트(Koma Biotechnology, Inc., Seoul, Korea)로, 그리고 히스타민 농도를 히스타민 ELISA 키트(Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Eichenhain, Germany)을 이용하여 분석하였다.Blood collected from the abdominal vein at the time of autopsy was centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to obtain serum. Total IgE in serum was measured by a mouse IgE ELISA kit (Immunology Consultant Laboratory, Inc., Newberg, USA), IL-4 by mouse IL-4 ELISA kit (Koma Biotechnology, Inc., Seoul, Korea) Histamine < / RTI > ELISA kit (Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Eichenhain, Germany).
그 결과, 도 5 내지 도 7을 참조하면, 만성 아토피 피부에서 OVA 감작 마우스의 혈청 총 IgE, 히스타민 및 IL-4 농도는 정상 대조군에 비하여 크게 증가하였다. 이러한 혈청 allergy 반응 지표는 줄기세포 배양 농축액 도포로 완화되었는데, 지표 간에 약간의 차이가 있긴 하지만 전반적으로 불멸화 양수줄기세포 ≥ 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포 ≥ 지방줄기세포의 순으로 우수한 것으로 확인되었다.As a result, referring to FIG. 5 to FIG. 7, serum total IgE, histamine and IL-4 concentrations of OVA-sensitized mice in chronic atopic skin were significantly increased compared to the normal control group. These serum allergy response indicators were alleviated by application of stem cell culture concentrate, although there was a slight difference between the indices but overall immortalization amniotic stem cell ≥ immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cell> immortalized neural stem cell ≥ adipocyte stem cell .
<< 실시예Example 5> 5>
피부 주름 개선효능 평가Evaluation of skin wrinkle improving efficacy
피부 주름 개선효능을 콜라겐을 분해하여 소멸시키는 콜라게나제(collagenase) 효소 중의 하나인 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)에 대한 억제효능으로 평가하였다. Bovine tendon collagen (25 mg)을 0.05 M tris(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) buffer에 녹인 후 37℃에서 15분간 정치시켰다. 이어 콜라겐 type-1과 시험물질인 줄기세포 배양액(10배 농축액 1%)을 첨가한 뒤 5시간 동안 추가로 반응시켰다. 반응액 0.2 mL를 취하여 1 mL의 A buffer [4% ninhydrin in Methyl Cellosolve (2-methoxyethanol) + 0.2 M sodium citrate with 0.71 mM stannous chloride, pH 0.5]에 첨가하였다. 20분간 끓인 뒤 n-프로판올을 첨가하고, 15분간 정치한 후 600 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.(MMP-1), one of the collagenase enzymes that break down and extinguish collagen in skin wrinkles. Bovine tendon collagen (25 mg) was dissolved in 0.05 M tris (hydroxymethyl) -methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) buffer and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes. The collagen type-1 and the stem cell culture solution (
그 결과, 도 8을 참조하면, 콜라겐은 분해하여 피부주름의 원인을 제공하는 MMP-1의 활성도를 지방줄기세포 배양 농축액은 73.6%로 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포와 희돌기교전구세포 배양액은 더 우수하여, 각각 61.2%와 56.6%로 억제하였다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양액은 MMP-1 활성도를 48.1%로 억제하여 가장 우수하였다. 따라서 피부주름 개선효과에 있어서 불멸화 양수줄기세포 > 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 우수한 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 8, the activity of MMP-1, which causes collagen degradation to cause skin wrinkles, was significantly inhibited by 73.6% of the fat stem cell culture concentrate. In contrast, the culture media of immortalized neural stem cells and proliferating progenitor cells were more excellent, which was 61.2% and 56.6%, respectively. In particular, the immortalized amniotic fluid culture stem cells showed the highest inhibition of MMP-1 activity to 48.1%. Therefore, in order to improve the wrinkles of skin, immortalized amniotic stem cells> immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cells> immortalized neural stem cells> adipose stem cells were found to be superior in order.
<< 실시예Example 6> 6>
피부 skin 미백효능Whitening efficacy 시험평가 Test evaluation
<6-1> <6-1> 티로시나제Tyrosinase 억제효능 Inhibitory efficacy
티로신으로부터 멜라닌을 생산하는 데에 관여하는 효소인 티로시나아제에 대한 줄기세포 배양액의 억제효능을 평가하였다. 시험관에 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS), 시험물질인 줄기세포 배양액(10배 농축액 1%) 및 mushroom tyrosinase (1,500-2,000 U/mL)를 순서대로 넣고, 이 용액에 1.5 mM 티로신 액을 넣은 후 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.The inhibitory effect of tyrosinase, an enzyme involved in the production of melanin from tyrosine, on stem cell culture fluids was evaluated. To the test tube, add 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS), the stem cell culture medium (10% concentrated 1%) and mushroom tyrosinase (1,500-2,000 U / mL) Followed by reaction at 37 占 폚 for 15 minutes. Enzyme activity was measured by absorbance at 490 nm using an ELISA reader.
*그 결과, 도 9를 참조하면, 티로신으로부터 멜라닌을 생산하는 데에 관여하는 티로시나아제의 활성도에 대해서도 지방줄기세포 배양 농축액은 73.5%로 유의하게 억제하였다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포와 희돌기교전구세포 배양액은 더 우수하여, 각각 58.7%와 49.2%로 억제하였다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양액은 tyrosinase 활성도를 39.6%로 억제하여 가장 탁월하였다.As a result, referring to FIG. 9, the activity of tyrosinase involved in the production of melanin from tyrosine was also significantly inhibited by 73.5% in fat stem cell culture concentrate. In contrast, the culture media of immortalized neural stem cells and proliferating progenitor cells were more excellent, suppressing them to 58.7% and 49.2%, respectively. In particular, the immortalized amniotic fluid stem cell culture showed the highest inhibition of tyrosinase activity to 39.6%.
<6-2> 세포 내 melanin 생산 억제효능<6-2> Effect of inhibiting melanin production in cells
Murine melanoma B16 F10 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에 1×105 cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 시험물질인 줄기세포 배양액(10배 농축액 1%)이 함유된 DMEM 배지로 교체한 후 72시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. Hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛을 확보하였다. 세포 펠렛을 60℃에서 건조한 후 10% dimetyl sulfoxide (DMSO)가 함유된 1 M NaOH 용액(100 μL)을 멜라닌을 용출시켰다. Microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포수당 멜라닌의 양을 구하였다.Murine melanoma B16 F10 cells were inoculated in a 6-well plate at a density of 1 × 10 5 cells / well in a DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS). Lt; / RTI > The medium was removed and replaced with DMEM medium containing the test substance, stem cell culture solution (10
그 결과, 도 10을 참조하면, melanocytes에서의 직접적인 멜라닌 생산에 대한 억제효능에 있어서도 지방줄기세포 배양 농축액이 61.2%로 억제한 데 비해, 불멸화 신경줄기세포, 희돌기교전구세포 및 양수줄기세포 배양 농축액은 각각 56.5%, 44.3% 및 31.6%로 억제하는 것으로 나타났다.As a result, referring to FIG. 10, the inhibitory effect on melanin production in melanocytes was also suppressed to 61.2% in the fat stem cell culture concentrate, compared with that in immature neural stem cells, proliferative progenitor cells and amniotic stem cell culture concentrate Respectively, to 56.5%, 44.3% and 31.6%, respectively.
따라서 피부 미백효과에 있어서도 불멸화 양수줄기세포 > 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 우수한 것으로 확인되었다.Therefore, it was confirmed that the skin whitening effect was also superior in the order of immortalized amniotic stem cells> immortalized neural stem cell derived progenitor precursor cells> immortalized neural stem cells> adipose stem cells.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
Claims (6)
상기 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포는 상기 불멸화 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도한 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.3. The method of claim 2,
The immortal neural stem cell-derived progenitor precursor cells are characterized in that the immortal neural stem cells are treated with an Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector to induce differentiation, thereby improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening / RTI >
상기 배양액은 다음과 같은 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물:
1) 세포에 직접 작용하여 아토피 원인물질 분비 차단;
2) 비만세포 탈과립 유도제인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크 반응 억제;
3) 히스타민으로 유도된 가려움증 완화; 및
4) lgE 생성 감소, 비만세포(mast cells) 침윤 억제, 히스타민 유리 억제, IL-4 감소.3. The method of claim 2,
A composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening, characterized in that the culture liquid has the following characteristics:
1) blocks the secretion of atopic origin by acting directly on cells;
2) inhibition of acute systemic shock induced by Compound 48/80, a mast cell degranulation inducer;
3) relieving the itch induced by histamine; And
4) decreased IgE production, suppression of mast cells infiltration, inhibition of histamine release, and decreased IL-4.
상기 배양액은 콜라겐 분해효소 활성을 억제하는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.3. The method of claim 2,
The composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening is characterized in that the culture liquid has a property of inhibiting collagenase activity.
상기 배양액은 티로시나아제 활성을 억제하는 특성 및 멜라닌 생성을 억제하는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.3. The method of claim 2,
The composition for improving atopic dermatitis, improving wrinkles or whitening of the present invention is characterized by exhibiting a property of inhibiting tyrosinase activity and inhibiting melanin production.
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