KR20160041597A - Composition for suppressing metastasis of brain tumor comprising 3-hydroxy-3',4'-dimethoxyflavone - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 뇌종양 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inhibiting brain tumor metastasis.
뇌암은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생 되는 원발성 뇌암과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌암을 통칭하는 것이다. 이와 같은 뇌암은 다른 장기에서 발생하는 암과 구분되는 점이 많다. 우선 폐, 위, 유방 등에 생기는 암은 장기별로 한 두 종류에 국한되고, 그 성질이 동일하거나 유사한 편이다. 그러나 뇌에는 다형성아교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등 다양한 암이 발생한다.Brain cancer refers to brain cancer, secondary brain cancer that has spread from cancer of the brain and other parts of the body, such as brain cancer that occurs in the brain surrounding the brain. Such brain cancer is often distinguished from cancer that occurs in other organs. First, the cancers that occur in the lungs, stomach, and breasts are limited to one or two kinds of organs, and their properties are the same or similar. However, the brain has a variety of cancers such as glioblastoma multiforme, malignant glioma, lymph node, bladder, metastatic tumor.
한편, 다형성아교모세포종(Glioblastoma multiforme; GBM)은 중추신경계의 아교세포(glial cell)와 그 전구세포에서 기원하는 악성 암종으로 뇌의 피질측두엽 내 대뇌반구의 피질하 백질(white matter)에 가장 흔히 발생한다. GBM은 아교세포 유래 암종 중 등급(Grade) IV에 해당하며 세포수가 많고, 세포분열이 왕성하며, 혈관증식과 괴사를 동반한다(비특허문헌 1 참조). 더불어 이동 및 확산의 높은 잠재력을 가지고 있어 높은 침투력을 가진다. Glioblastoma multiforme (GBM) is a malignant carcinoma originating from the glial cell of the central nervous system and its progenitor cells. It is most commonly found in the white matter of the cerebral hemisphere in the cortical temporal lobe of the brain. do. GBM corresponds to Grade IV of glial cell-derived carcinoma and has a large number of cells, cell division is vigorous, accompanied by angiogenesis and necrosis (see Non-Patent Document 1). In addition, it has high penetration power because it has high potential of migration and diffusion.
또한 GBM은 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, 외과적인 치료로 완전히 제거하는 것은 거의 불가능하다.In addition, since GBM has no clear boundary between brain cells and tumor cells, it is almost impossible to completely remove it with surgical treatment.
때문에 GBM에 대해 외과적 수술로 병변 제거 후 방사선요법과 화학요법을 병행하는 표준 치료법이 시행되고 있으나 침윤적인 성장 패턴으로 인해 평균 생존율이 14.6개월에 불과하며(비특허문헌 2 참조), 재발률도 매우 높아 6개월 무진행 생존율(progression-free survival, PFS)이 15~21%, 평균 생존율 25주로 예후가 극히 불량하다(비특허문헌 3 참조).Therefore, standard therapy for radiation therapy and chemotherapy in combination with surgical resection for GBM is performed, but the median survival rate is only 14.6 months due to the invasive growth pattern (see non-patent document 2) Progression-free survival (PFS) of 15-21% and average survival rate of 25 weeks are extremely poor prognosis (see Non-Patent Document 3).
상기 화학 약물에는 경구용 항암제인 테모달이 유일하게 사용되고 있다. 그러나 환자에게 투여한 경우, 초기에는 어느 정도 약물에 반응을 보이지만 약물에 대한 내성이 빠르게 나타나는 문제가 있다.Tumodal, an oral anticancer agent, is the only drug used for the above-mentioned chemical drugs. However, when the drug is administered to a patient, the drug responds to the drug to some extent at an early stage but has a problem that the drug resistance is rapidly exhibited.
따라서 GBM의 전이와 침윤을 억제할 수 있는 치료제에 대한 연구와 개발이 요구된다.Therefore, research and development of therapeutic agents capable of inhibiting the metastasis and invasion of GBM are required.
상기의 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 3-하이드록시-3',4'-디메톡시플라본(3-hydroxy-3',4'-dimethoxyflavone, HDMF) 화합물을 함유하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 목적이 있다. In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting brain tumor metastasis comprising 3-hydroxy-3 ', 4'-dimethoxyflavone (HDMF) And the like.
또한 본 발명은 3-하이드록시-3',4'-디메톡시플라본(3-hydroxy-3',4'-dimethoxyflavone, HDMF) 화합물을 함유하는 뇌종양 전이 예방용 건강식품을 제공하는 데에 또 다른 목적이 있다. The present invention also provides a health food for the prevention of brain tumor metastasis, which contains 3-hydroxy-3 ', 4'-dimethoxyflavone (HDMF) There is a purpose.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting brain tumor metastasis, which comprises a compound represented by formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
상기 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물은 다형성교모세포종의 전이를 억제한다.The pharmaceutical composition for inhibiting brain tumor metastasis inhibits metastasis of a polymorphic glioblastoma.
상기 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물은 B 세포 림포마-w(B cell lymphoma-w, Bcl-w)에 의해 유도된 뇌종양 세포의 이동 및 침윤을 억제한다.The pharmaceutical composition for inhibiting brain tumor metastasis inhibits the migration and infiltration of brain tumor cells induced by B cell lymphoma-w (Bcl-w).
상기 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물은 RNA 결합 단백질인 무사시(Musashi), SRY(성 결정 영역 Y)-박스 2(SRY (sex determining region Y)-box 2, Sox-2)그리고 c-Myc로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 종양줄기세포 마커단백질의 발현을 억제한다.The pharmaceutical composition for inhibiting brain tumor metastasis comprises a combination of RNA binding proteins Musashi, SRY (sex determining region Y) -box 2 (Sox-2, Sox-2) and c-Myc Lt; RTI ID = 0.0 > of stem cell < / RTI >
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 뇌종양 전이 예방용 건강식품을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a health food for the prevention of brain tumor metastasis comprising the compound represented by formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명의 HDMF는 Bcl-w에 의해 유도된 뇌종양의 전이 및 침윤을 감소시키며 종양줄기세포 마커단백질의 발현을 감소시키므로, 본 발명에 따른 조성물은 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물 및 뇌종양 전이 예방용 건강식품으로 유용하게 활용될 수 있다. Since the HDMF of the present invention reduces the metastasis and invasion of brain tumors induced by Bcl-w and reduces the expression of tumor stem cell marker proteins, the composition according to the present invention is useful as a pharmaceutical composition for inhibiting brain tumor metastasis, As shown in FIG.
도 1 중 a 내지 b는 B 세포 림포마-w(B cell lymphoma-w, Bcl-w)를 과다 발현시킨 인간 교모세포종 세포주(Human glioblastoma cell line)인 U251 세포에 HDMF를 처리하였을 때 전이를 확인한 결과이며, 도 c 내지 d는 Bcl-w를 과다 발현시킨 U251 세포에 HDMF를 처리하였을 때 침윤을 확인한 결과이다.
도 2는 Bcl-w를 과다 발현시킨 U251 세포에 HDMF를 처리하였을 때 신경 세포구의 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 Bcl-w를 과다 발현시킨 U251 세포에 HDMF를 처리하였을 때 종양줄기세포 마커단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.1 (a) and (b) show transfection of U251 cells, a human glioblastoma cell line, which overexpresses B cell lymphoma-w (Bcl-w) And Figs. C to d show the results of confirming the infiltration of U251 cells overexpressing Bcl-w upon treatment with HDMF.
FIG. 2 shows the result of confirming the change of neuronal cell morphology when HDMF was treated on U251 cells overexpressing Bcl-w.
FIG. 3 shows the results of confirming the expression of tumor stem cell marker protein when U250 cells overexpressing Bcl-w were treated with HDMF.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 발명자들은 뇌종양의 전이 억제에 효과적인 조성물을 찾던 중, 플라본 유도체인 3-하이드록시-3',4'-디메톡시플라본(3-hydroxy-3',4'-dimethoxyflavone, HDMF)이 B 세포 림포마-w(B cell lymphoma-w, Bcl-w)에 의해 유도된 종양세포의 전이(metastasis)와 침윤(invasion)을 억제하고, 종양줄기세포의 마커단백질인 Musashi, Sox-2 및 c-myc의 발현을 억제하므로 뇌종양의 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다는 점을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.The present inventors searched for a composition effective for inhibiting the metastasis of brain tumors, and found that the flavone derivatives 3-hydroxy-3 ', 4'-dimethoxyflavone (HDMF) It inhibits the metastasis and invasion of tumor cells induced by B cell lymphoma-w (B cell-w) and inhibits invasion of tumor cells such as Musashi, Sox-2 and c -myc, and thus can be useful for inhibiting the metastasis of brain tumors. Thus, the present invention has been completed.
상기 HDMF는 하기 화학식 1로 표시되며 3-하이드록시-3',4'-디메톡시플라본(3-hydroxy-3',4'-dimethoxyflavone)이라 명명되고 Mw 298.2981의 중량평균분자량을 갖는다. HDMF는 벤젠 고리와 피란 고리로 구성된 축합 고리를 모핵으로 하는 케톤에 페닐 곁사슬이 있는 화합물로 주로 식물계에 존재한다. 현재까지 3000여종 이상으로 알려져 있는 식물 플라본 유도체들은 항염증, 항알러지, 항암활성 등 많은 생물학적 활성을 가지고 있다.The HDMF is represented by the following Formula 1 and is named 3-hydroxy-3 ', 4'-dimethoxyflavone and has a weight average molecular weight of Mw 298.2981. HDMF is a compound having a ketone and a phenyl side chain having a condensed ring composed of a benzene ring and a pyran ring, and is mainly present in the plant. Plant flavone derivatives, known to more than 3,000 species to date, have many biological activities such as anti-inflammatory, anti-allergic and anti-cancer activities.
[화학식 1][Chemical Formula 1]
상기 HDMF은 뇌종양 중 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)의 전이를 억제할 수 있다.The HDMF can inhibit metastasis of glioblastoma multiforme (GBM) in brain tumors.
또한 본 발명의 HDMF는 B 세포 림포마-w(B cell lymphoma-w, Bcl-w)에 의해 유도된 종양 세포의 전이(metastasis)와 침윤(invasion)을 억제하므로, 다형성교모세포종의 전이를 억제할 수 있다.In addition, the HDMF of the present invention suppresses the metastasis and invasion of tumor cells induced by B cell lymphoma-w (Bcl-w), thereby inhibiting the metastasis of the polymorphic glioblastoma can do.
또한, 본 발명의 HDMF는 Musashi, Sox-2 그리고 c-myc로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 종양줄기세포 마커단백질의 발현을 억제할 수 있다. In addition, the HDMF of the present invention can inhibit the expression of one or more tumor stem cell marker proteins selected from the group consisting of Musashi, Sox-2 and c-myc.
일 실시예에 따르면, 과발현된 Bcl-w에 의해 유도된 악성 뇌종양 세포종인 U251 세포의 증가된 전이 및 침윤이 HDMF를 처리한 후 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다.
According to one embodiment, increased transduction and invasion of U251 cells, a malignant brain tumor cell line induced by overexpressed Bcl-w, was significantly reduced after treatment with HDMF.
본 발명은 HDMF를 포함하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting brain metastasis comprising HDMF.
상기 약학 조성물의 적용대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 가축, 인간 등을 포함한 포유동물일 수 있다. The subject of application of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but preferably it can be a mammal including a livestock, a human, and the like.
상기 약학 조성물은 인간 등을 포함한 포유동물에게 섭취하게 함으로써 뇌종양 전이를 예방할 수 있고, 이미 발생한 뇌종양의 전이를 억제할 수 있다.The pharmaceutical composition can be administered to mammals including humans to prevent brain tumor metastasis and inhibit metastasis of a brain tumor that has already occurred.
본 발명의 HDMF는, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 99중량%로 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.The HDMF of the present invention may contain 0.1 to 99% by weight based on the total weight of the composition, and the scope of the present invention is not limited thereto.
본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA).The pharmaceutical compositions according to the present invention may comprise suitable carriers, excipients or diluents conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions and may be prepared in any of the formulations conventionally produced in the art (see, for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition; Mack Publishing Company, Easton PA).
본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories and sterilized injection solutions according to a conventional method . In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose sucrose), lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included .
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 일례로, 경구, 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등을 선택할 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like in a variety of routes. All modes of administration may be expected, for example, oral, dermal or intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrasternal injection.
또한, 본 발명의 조성물은 뇌종양 전이 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법 등과 병용하여 사용할 수 있다.
In addition, the composition of the present invention can be used alone or in combination with surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and a method of using a biological response modifier for inhibiting brain tumor metastasis.
본 발명은 HDMF를 포함하는 뇌종양 전이 예방용 건강식품을 제공한다.The present invention provides a health food for preventing brain metastasis comprising HDMF.
상기 식품 조성물의 적용대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 가축, 인간 등을 포함한 포유동물일 수 있다. The subject to which the food composition is applied is not particularly limited, but may preferably be a mammal including a livestock, a human, and the like.
상기 HDMF를 첨가할 수 있는 식품으로는, 일례로 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.Examples of foods to which HDMF can be added include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complexes, and health functional foods.
식품 또는 음료 중의 상기 HDMF의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.01 내지 50g의 비율로 가할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.The amount of HDMF in the food or beverage may be 0.01 to 50% by weight of the total food, and the health beverage composition may be added in an amount of 0.01 to 50 g based on 100 ml, but the scope of the present invention is not limited thereto .
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 HDMF를 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
The health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to the other ingredients other than those containing HDMF and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients such as ordinary beverages. In addition to the above-mentioned composition, the composition of the present invention can be used as a flavoring agent such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and aggravating agents (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, Salts, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated beverages and the like.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the following examples illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
<< 실시예Example 1> 뇌종양 세포주 및 1> brain tumor cell line and HDMFHDMF 의 준비Preparation of
1. 뇌종양 세포주 준비1. Brain tumor cell line preparation
인간 교모세포종 세포주(Human glioblastoma cell line)인 U251 세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 구입하였다. U251세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, Sigma, FBS), 0.1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin(PAA laboratories GmbH, Pasching, Austria))이 첨가된 이글의 최소필수배지(Minimum Essential medium Eagle(Cellgromediatech, Inc., Manassas, VA, USA))로 배양하였다. The human glioblastoma cell line U251 cell line was purchased from Korean Cell Line Bank (KCLB). U251 cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator with 10% fetal bovine serum (Sigma, FBS), 0.1% penicillin-streptomycin (PAA laboratories GmbH, Pasching, Austria) (Minimum Essential Medium Eagle (Cellgromediatech, Inc., Manassas, VA, USA)).
또한 뇌종양 세포의 전이와 침윤성을 높이기 위하여, 리포펙타민 2000(Lipofectamin 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA))과 pcDNA3, Bcl-w를 각각 혼합하고 30분간 상온에 둔 후 U251 세포가 배양된 배지에 첨가하는, 일시적인 형질주입(transient transfection)방법을 통해 대조군인 pcDNA3 벡터(vector) 또는 Bcl-w 과발현체를 U251 세포에 주입하였다.
In order to enhance the metastasis and invasiveness of brain tumor cells, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), PcDNA3 and Bcl-w were mixed and incubated for 30 minutes at room temperature. U251 cells were added to the cultured medium The control pcDNA3 vector or Bcl-w overexpressed cells were injected into U251 cells through a transient transfection method.
2. 3-2. 3- 하이드록시Hydroxy -3',4'--3 ', 4'- 디메톡시플라본Dimethoxy flavone 준비 Ready
3-하이드록시-3',4'-디메톡시플라본(3-hydroxy-3',4'-dimethoxyflavone, HDMF)은 마이크로소스(MicroSource), 디스커버리 시스템(Discovery Systems)으로부터 구입하였다. HDMF는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해하여 10mM의 저장 농도로 분주하여 -20℃에 보관하였다. 그리고 본 발명의 실험에 사용된 U251 세포에 최종 농도 10μM로 처리하였다.
3-hydroxy-3 ', 4'-dimethoxyflavone (HDMF) was purchased from MicroSource, Discovery Systems. HDMF was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and stored at -20 ° C at a storage concentration of 10 mM. Then, the U251 cells used in the experiment of the present invention were treated with a final concentration of 10 μM.
<< 실시예Example 2> 2> HDMF가HDMF 뇌종양 세포의 이동 및 침윤에 미치는 영향 Influence of brain tumor cell migration and invasion
1. 암세포 전이 분석1. Cancer cell metastasis analysis
HDMF의 뇌종양 세포 전이 억제의 효과를 분석하기 위해 암세포 이동 측정법(wound healing assay)을 이용하였다. 먼저, 배양 접시(culture dish)바닥에 단일 층으로 붙어있는(Confluent monolayer) 세포를 팁을 사용하여 긁은 후 37℃에서 16 내지 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 인산완충식염수(Phosphate buffer saline, PBS)로 두 번 씻어준 후 3:1 비율의 메탄올과 아세트산으로 30분간 고정시켜 준 다음, 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)이 첨가된 10% 에탄올로 30분간 염색하였다. 5군데의 긁힌 영역(200x500 μm2)을 현미경을 사용하여 이동한 세포 수를 세어주고 그 결과를 평균 차이 검정 방법(t-test)을 사용하여 통계 분석하였다.A wound healing assay was used to analyze the effect of HDMF on brain tumor cell metastasis inhibition. First, Confluent monolayer cells on the bottom of culture dishes were scratched with a tip and incubated at 37 ° C for 16-24 hours. The cultured cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS), and then fixed with methanol and acetic acid in a ratio of 3: 1 for 30 minutes. Then, 10% ethanol with 1% crystal violet For 30 minutes. The number of cells migrated using a microscope in five scraped areas (200 x 500 μm 2 ) was counted and the results were statistically analyzed using an average difference test (t-test).
그 결과 도 1 중 a 내지 b와 같이, Bcl-w에 의하여 뇌종양 세포의 전이가 증가되었지만 HDMF를 처리한 경우, 대조군인 DMSO를 처리한 경우보다 전이된 세포의 수가 현저히 적다는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figs. 1 (a) and (b), the expression of brain tumor cells was increased by Bcl-w but the number of metastasized cells was significantly lower in HDMF treatment than in control DMSO treatment.
2. 2. 트렌스웰Transwell 침윤 분석 Infiltration analysis
HDMF의 뇌종양 세포 침윤 억제의 효과를 분석하기 위해 트랜스웰 침윤 분석법(transwell invasion assay)을 이용하였다. 먼저, 메트리젤이 코팅된 폴리카보네이트 필터(polycarbonate filter)의 상부에 2×105의 세포를 배양하고 하부에는 0.1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 성장인자가 없는 배지 1ml을 채워 주었다. 그런 후 37℃의 온도에서 20 내지 24시간 동안 배양하고 디프 퀵 키트(Diff-Quick kit)를 사용하여 세포 고정과 염색을 진행하고 현미경을 사용하여 세포를 센 후 t-test를 사용하여 통계 분석하였다.Transwell invasion assays were used to analyze the effect of HDMF on brain tumor invasion inhibition. First, 2x10 < 5 > cells were cultured on top of a polycarbonate filter coated with a metrizel, and 1 ml of growth medium-free medium supplemented with 0.1% bovine serum albumin (BSA) I filled it. Then, the cells were cultured at 37 ° C for 20 to 24 hours, and cell fixation and staining were performed using a Diff-Quick kit. The cells were counted using a microscope and then analyzed using a t-test .
그 결과 도 1 중 c 내지 d와 같이, Bcl-w에 의하여 뇌종양 세포의 침윤이 증가되었지만 HDMF를 처리한 경우, 대조군인 DMSO를 처리한 경우보다 세포의 침윤이 확연히 적었으며 Bcl-w를 과발현시키지 않은 경우와 비슷한 결과를 보였다.
As a result, the infiltration of brain tumor cells by Bcl-w was increased as shown in c to d of FIG. 1, but the infiltration of Bcl-w was overexpressed when treated with HDMF, compared to the control DMSO The results were similar to those obtained without.
<< 실시예Example 3> 3> HDMFHDMF 가 뇌종양 Brain tumor 세포구Cell wall 형성에 미치는 영향 Influence on formation
1. 신경세포구형성능 분석1. Nerve cell spherical performance analysis
HDMF가 뇌종양 세포구 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 세포구 세포 배양 분석법(Sphere formation assay)를 이용하였다. 먼저, 세포구를 형성하는 세포들을 96웰 플레이트의 웰 당 1 내지 2개의 세포를 심어 배양하였다. 12시간 후 세포가 하나의 독립적인 세포로 존재하는지 확인하고 1일 내지 20일까지 배양하며 세포구 형성을 관찰하였다. 형성된 세포구를 10% FBS를 이용하여 배양 접시 바닥에 부착시키고 쿠마씨 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)을 사용하여 염색 후 지름 20μm 이상 크기의 세포구 수를 세어 그래프화 하였다.To determine the effect of HDMF on brain tumor cell formation, a sphere formation assay was used. First, cells forming cell spheres were seeded with 1 to 2 cells per well of a 96-well plate. After 12 hours, the cells were confirmed to be present as one independent cell, and cultured for 1 to 20 days, and cell formation was observed. The formed cell spheres were attached to the bottom of the culture dish using 10% FBS, and the cell counts of 20 μm or more in diameter were counted by grafting using Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250).
그 결과 도 2와 같이, Bcl-w에 의해 증가하던 세포구의 수가 HDMF에 의하여 감소됨을 확인하였다.
As a result, as shown in Fig. 2, it was confirmed that the number of cell spheres increased by Bcl-w was decreased by HDMF.
<< 실시예Example 4> 4> HDMF가HDMF 종양줄기세포 Tumor stem cells 마커단백질Marker protein 발현에 미치는 영향 Effect on expression
1. One. 신경세포구Nerve cell compartment 배양 culture
상기 <실시예 1>의 1에서 준비한 대조군인 pcDNA3 벡터(vector) 또는 Bcl-w 과발현체가 형질주입된 U251 세포를 1:50의 비율로 혼합한 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF)와 섬유아세포 증식인자(fibroblast growthfactor, bFGF) 20 ng/ml와 B27이 포함된 배지(Dulbeccos modified Eagles medium, DEME-F12)에서 배양하였다.
The <Example 1> controls the pcDNA3 vector (vector) or Bcl-w-overexpressing transfected body the epithelial cells to the injected mixture U251 cells at a ratio of 1:50 growth factor (Epidermal growth factor, EGF) prepared by the first of the fiber Were cultured in Dulbeccos modified Eagles medium (DEME-F12) containing 20 ng / ml of fibroblast growth factor (bFGF) and B27.
2. 종양줄기세포 단백질 발현 분석2. Tumor stem cell protein expression analysis
HDMF가 종양줄기세포 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하였다. 상기 <실시예 4>의 1에서 준비한 U251 세포를 2일 내지 4일 후에 수확하고 방사선 면역 침전 분석 버퍼(radioimmune precipitation assay buffer, RIPA buffer)를 사용하여 용해하였다. 그런 후 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 이용해 상기 세포 용해물에서 단백질을 분리하여 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 멤브레인은 5% 탈지유가 첨가된 트윈 20을 함유한 트리스-완충 식염수(Tris-buffered saline containing Tween 20, TBST)로 한 시간 동안 블로킹(blocking)을 하였다. 그 후 각각의 종양줄기세포 마커단백질 항체를 멤브레인으로 이동된 단백질과 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 종양줄기세포 마커단백질 항체는 Mushshi(cell signaling technology), Sox-2(R&D Systems), c-Myc(Santa Cruz Biotechnology), β-액틴(Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 2시간이 지난 후 TBST로 반응하지 않은 항체를 제거하고 겨자무과산화수소(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 생쥐, 토끼 또는 염소에서 유래된 2차 항체(Bio-rad)를 반응시킨 다음 화학발광검출법(chemiluminescence(ECL) detection system)을 이용하여 종양줄기세포 단백질 발현을 관찰하였다.Western blot was used to determine the effect of HDMF on tumor stem cell protein expression. U251 cells prepared in 1 of Example 4 were harvested 2 to 4 days later and lysed using radioimmuno precipitation assay buffer (RIPA buffer). Proteins were then separated from the cell lysate using sodium dodecyl sulfate (SDS) - polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and transferred to a nitrocellulose membrane. The membranes were blocked for one hour with Tris-buffered saline containing Tween 20 (TBST) containing Tween 20 supplemented with 5% skim milk. Each tumor stem cell marker protein antibody was then reacted with the protein transferred to the membrane for 2 hours at room temperature. Tumor stem cell marker protein antibodies were Mushshi (cell signaling technology), Sox-2 (R & D Systems), c-Myc (Santa Cruz Biotechnology) and β-actin (Sigma-Aldrich). After 2 hours, the antibody that had not reacted with TBST was removed and reacted with a secondary antibody (Bio-rad) derived from mouse, rabbit or chlorine combined with horseradish peroxidase (HRP) Chemiluminescence (ECL) detection system) was used to observe tumor stem cell protein expression.
그 결과 도 3과 같이, Bcl-w에 의해 증가된 종양줄기세포 단백질의 발현이 HDMF를 처리하였을 시 현저히 감소한 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Fig. 3, it was confirmed that the expression of tumor stem cell protein increased by Bcl-w was significantly reduced when HDMF was treated.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that such detail is solved by the person skilled in the art without departing from the scope of the invention. will be. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (6)
[화학식 1]
[Chemical Formula 1]
상기 뇌종양은 다형성교모세포종인 것을 특징으로 하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the brain tumor is a polymorphic glioblastoma.
상기 조성물은 Bcl-w에 의해 유도된 뇌종양 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물.The method according to claim 1,
Wherein said composition inhibits the migration and infiltration of brain tumor cells induced by Bcl-w.
상기 조성물은 종양줄기세포 마커단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물.The method according to claim 1,
Wherein said composition reduces the expression of tumor stem cell marker protein.
상기 종양줄기세포 마커단백질은 무사시(Musashi), Sox-2 그리고 c-Myc로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 뇌종양 전이 억제용 약학 조성물.5. The method of claim 4,
Wherein the tumor stem cell marker protein is at least one selected from the group consisting of Musashi, Sox-2, and c-Myc.
[화학식 1]
A health food for the prevention of brain tumor metastasis containing the compound represented by formula (1).
[Chemical Formula 1]
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-
2014
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| 1. AJCC cancer staging handbook: from the AJCC cancer staging manual. 7th ed. 2010, New York: Springer. xix, 718 p |
| 2. N. Engl. J. Med. (2005) 3520:987 |
| 3. J. Clin. Oncol. (1999) 17:2572 |
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