KR20160038953A

KR20160038953A - Respiratory syncytial virus universal vaccine

Info

Publication number: KR20160038953A
Application number: KR1020140130984A
Authority: KR
Inventors: 장준
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2016-04-08
Also published as: KR101695518B1

Abstract

The present invention relates to a fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) made of G protein core fragment (Gcf) protein having an RSV subtype A and B; a polynucleotide encoding the fusion protein; an expression vector comprising the polynucleotide; and a transformant other than a human being, including the expression vector; an RSV vaccine composition comprising the fusion protein as an active ingredient; a method for producing the vaccine composition; a method for increasing protective immunity against RSV, including a step of injecting the vaccine composition into an entity requiring immunity against RSV; and a method for preventing or treating respiratory tract infection caused by RSV, including a step of injecting the vaccine composition into the entity requiring immunity against RSV.

Description

[0002] Respiratory syncytial virus universal vaccine [0002]

본 발명은 호흡기 신시치아 바이러스(RSV) A 아형의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment) 및 호흡기 신시치아 B 아형의 Gcf 단백질의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물, 상기 백신 조성물을 제조 방법, 상기 백신 조성물을 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 보호 면역을 증가시키는 방법 및 상기 백신 조성물을 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스에 의한 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a fusion protein of a respiratory syncytial virus (RSV) A subtype Gcf protein (RSV G protein core fragment) and a respiratory syncytial B subtype Gcf protein, a polynucleotide encoding said fusion protein, a polynucleotide comprising said polynucleotide A transformant other than a human comprising the expression vector and the expression vector, a respiratory syncytial virus vaccine composition comprising the fusion protein as an active ingredient, a method for producing the vaccine composition, a method for producing the vaccine composition, A method of increasing the protective immunity against respiratory syncytial virus comprising administering to a subject in need of immunization a respiratory syncytial virus comprising a step of administering said vaccine composition to a subject in need of immunization against respiratory syncytial virus, Prevention of respiratory infections caused by tooth virus Relates to a method of treatment.

인간 호흡기 신시치아 바이러스(human RSV)는 뉴모바이러스 속(genus Pneumovirus) 및 파라믹소바이러스 과(family Paramyxoviridae)에 속하는 음성극성(negative-sense), 비분절화(non-segmented) RNA 바이러스이다. RSV는 유아 및 노인에게 심각한 상부 및 하부 기도에 대한 호흡기 질환의 중요한 원인이다. 이에 효과적인 RSV 백신을 개발하기 위하여 많은 노력이 있었으나, RSV 미접촉 유아 및 어린이에게 안전하고, 효과적이며, 허가된 RSV 백신은 아직까지 없다. 1960년대에는 FI-RSV(formalin-inactivated RSV)가 임상 연구되었으나, FI-RSV는 어린이들에게 심각한 질환을 야기하여, 두 명이 사망하고, FI-RSV를 접종한 개체의 약 80%가 병원에서 치료를 받았다. 지금까지 정제된 RSV F, G 및 M 단백질이 서브유닛 백신으로서 개발되었고, RSV G 당단백질이 RSV 바이러스 감염에 대한 중화 항체를 나타내어, 보호 항원 중 하나로서 알려져 왔다. 또한, RSV F 및 G 단백질은 수많은 임상 시험의 대상이 되어 왔다. 예를 들어, BBG2Na는 RSV A G 단백질의 중심 보존된 부분(G2Na)이 연쇄상구균 G 단백질의 알부민 결합 도메인(BB)의 C-말단에 융합된 형태의 재조합 융합 단백질로서, RSV 서브유닛 백신 후보자로서 폐 면역병리 유도 없이 보호 면역 반응을 유발할 수 있음이 알려져 있으나, 임상 3상에서 BB 요소에 의하여 타입 III 과민반응을 야기하는 것이 보고된 바 있다(Polack et al., The Pediatric infectious disease journal 23, S65-S73, 2004).
Human respiratory syncytial virus (RSV) is a negative-sense, non-segmented RNA virus belonging to the genus Pneumovirus and the family Paramyxoviridae . RSV is an important cause of respiratory illness in the upper and lower respiratory tract in infants and the elderly. There have been many efforts to develop an effective RSV vaccine, but there are still no safe, effective, and licensed RSV vaccines available for children and children who do not have RSV. In the 1960s, FI-RSV (formalin-inactivated RSV) was clinically studied, but FI-RSV caused serious illness in children, resulting in two deaths and about 80% of individuals who received FI-RSV were treated at the hospital received. So far purified RSV F, G and M proteins have been developed as subunit vaccines and RSV G glycoprotein has been known as one of the protective antigens, exhibiting neutralizing antibodies against RSV virus infection. In addition, RSV F and G proteins have been the subject of numerous clinical trials. For example, BBG2Na is a recombinant fusion protein in which the centrally conserved portion (G2Na) of the RSV AG protein is fused to the C-terminus of albumin binding domain (BB) of streptococcal G protein. As a candidate RSV subunit vaccine candidate, Although it is known that a protective immune response can be induced without inducing immunopathology, it has been reported that type III hypersensitivity is caused by the BB element in clinical trials (Polack et al., The Pediatric Infectious Disease Journal 23, S65-S73 , 2004).

RSV G 단백질의 비당화 부위는 지금까지 알려진 A 및 B 균주 간에 보존된 13개의 아미노산 펩타이드에 해당한다. G 단백질의 헤파린 결합 도메인은 일차 감염 동안 세포 표면에 위치한 글리코사미노글리칸(GAGs)과의 초기 상호작용에 중요한 역할을 담당하고, G 단백질의 CX3C 케모카인 모티프인 182-186 아미노산 부위는 CX3CR1과 상호작용하여 기능한다. RSV G 단백질 또는 펩타이드 면역화와 관련된 많은 연구들은 RSV G 단백질의 백신 접종이 백신에 의한 폐 호산구증(eosinophilia) 및 Th2-타입의 우세 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13 및 이오탁신) 생산과 관련되어 있다고 보고하고 있다. 여기서, RSV G 단백질에 매개되는 폐 호산구증은 RSV G 단백질의 184-193 아미노산 잔기를 포함하는 보조 T 세포 에피토프와 관련된 것으로 알려진 바 있다. 다만, RSV F(F51-66)의 CD4+ T 세포 에피포트 및 185 번 및 188번 아미노산 잔기의 알라닌 치환을 포함하는 mGcf의 융합 단백질인 Th-mGcf는 백신 매개 폐 호산구증 또는 심각한 체중 감소를 유발하지 않으면서도 높은 RSV G-특이적 항체 반응을 유도하며, 바이러스 제거 효과를 보이는 것으로 알려진 바 있다. 또한, 설하 투여 경로를 통하여 콜레라 톡신과 RSV B Gcf를 마우스에 백신화한 경우, RSV B 특이적 항체 반응을 나타내면서도 기도에 심각한 폐 호산구 유도를 야기하지 않은 것으로 알려진 바 있다. 이러한 이유로, RSV G 단백질은 지금까지도 유망한 백신 후보로서 여겨지고 있다.
The non-glycosylated site of the RSV G protein corresponds to the 13 amino acid peptides conserved between the known strains A and B. The heparin-binding domain of the G protein plays an important role in the initial interaction with the glycosaminoglycans (GAGs) located on the cell surface during the primary infection, and the 182-186 amino acid region of the G protein CX3C chemokine motif interacts with CX3CR1 Function. Many studies involving RSV G protein or peptide immunization have shown that vaccination of RSV G protein is associated with the eosinophilia and the Th2-type dominant cytokines (IL-4, IL-5, IL-13, ) Production. Here, pulmonary eosinophilia mediated by RSV G protein is known to be associated with a secondary T cell epitope comprising the 184-193 amino acid residues of the RSV G protein. However, Th-mGcf, a fusion protein of mGcf containing the CD4 + T cell epitope of RSV F (F51-66) and alanine substitution of amino acid residues 185 and 188, caused vaccine-induced lung eosinophilia or severe weight loss It is known that it induces a high RSV G-specific antibody response and shows a virus removal effect. In addition, vaccination of cholera toxin and RSV B Gcf into mice via the sublingual route has been shown to result in RSV B-specific antibody response but not severe lung eosinophilia in the airways. For this reason, RSV G protein is still considered as a promising vaccine candidate.

한편, RSV는 항체의 인지 패턴 및 G 단백질의 서열 차이를 바탕으로 A 및 B의 두 가지 아형으로 구분된다. 상기 두 가지 아형이 RSV 유행병에서 모두 발견되며, 1 내지 2년 주기로 유행하는 RSV 균주의 우위가 이동한다. 또한, 일생 동안 RSV의 재감염이 발생하며, 상기 두 가지 주요 항원성 서브그룹 간의 G 단백질 항원성 차이를 통하여 기 존재하던 숙주의 면역 반응 회피가 촉진되는 것으로 알려져 있다. 이는, RSV의 국한된 기질 및 다른 유전형의 기존 감염에 의해 생산된 기 존재하는 지역 면역을 회피하기 위한 RSV의 능력과 관련되어 있을 것이다. 이러한 점이 RSV 발병도에 영향을 줄 수 있으며, 더 많은 질병 발생 및 반복되는 감염을 야기할 수 있다. 따라서, 어떠한 RSV 아형이 우세할지 염려되는 상황에서 RSV 아형 모두에 면역을 부여할 수 있는 범용 RSV 백신의 개발이 요구되는 상황이다.
On the other hand, RSV is divided into two subtypes, A and B, based on recognition patterns of antibodies and sequence differences of G proteins. These two subtypes are found in all RSV epidemics, and the predominance of the RSV strain, which is prevalent every one to two years, migrates. In addition, reinfection of RSV occurs over a lifetime, and it is known that the immune response avoidance of the present host is promoted through the difference in G protein antigenicity between the two major antigenic subgroups. This may be related to the ability of RSV to avoid existing local immunity produced by existing infections of RSV's localized substrate and other genotypes. This may affect the incidence of RSV and may lead to more disease outbreaks and repeated infections. Therefore, there is a need to develop a general-purpose RSV vaccine that can immunize all RSV subtypes in a situation where there is concern that any RSV subtype will prevail.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 범용 RSV 백신을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 호흡기 신시치아 바이러스(RSV) A 아형의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment) 및 호흡기 신시치아 B 아형의 Gcf 단백질을 서로 결합시킨 융합 단백질의 경우, 아쥬반트가 없는 경우에도 RSV A 및 B 아형 모두에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도하면서도 몸무게 감소 등의 부작용이 없어, RSV 범용 백신으로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have made intensive efforts to develop a general-purpose RSV vaccine. As a result, the present inventors have found that fusion of RSV G protein core fragment (RSV) and Gcf protein of the respiratory syncytial B subtype Protein of the present invention can be effectively used as an RSV universal vaccine without inducing side effects such as weight reduction while effectively inducing an immune response to both RSV A and B subtypes even when there is no adjuvant and completed the present invention .

본 발명의 하나의 목적은 호흡기 신시치아 바이러스(RSV) A 아형의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment) 및 호흡기 신시치아 B 아형의 Gcf 단백질의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a respiratory syncytial virus vaccine comprising a RSV G protein core fragment of the respiratory syncytial virus (RSV) A subunit and a fusion protein of the Gcf protein of the respiratory syncytia B subtype as an active ingredient To provide a composition.

본 발명의 다른 목적은 상기 백신 조성물을 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 보호 면역을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for increasing protective immunity against respiratory syncytial virus, comprising the step of administering the vaccine composition to a subject in need of immunization against respiratory syncytial virus.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스에 의한 호흡기 감염 질환의 예방 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for preventing respiratory infections caused by respiratory syncytial virus, comprising the step of administering the vaccine composition to a subject requiring immunization against respiratory syncytial virus.

본 발명의 또 다른 목적은 호흡기 신시치아 바이러스(RSV) A 아형의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment) 및 호흡기 신시치아 B 아형의 Gcf 단백질의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a fusion protein of a respiratory syncytial virus (RSV) A subtype Gcf protein (RSV G protein core fragment) and a respiratory syncytial B subtype Gcf protein, a polynucleotide encoding the fusion protein, And an expression vector comprising the nucleotide and the above expression vector.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 호흡기 신시치아 바이러스(RSV) A 아형의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment) 및 호흡기 신시치아 B 아형의 Gcf 단백질의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물을 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides, as one embodiment, a method for producing a fusion protein of respiratory syncytial virus (RSV) A subtype Gcf protein (RSV G protein core fragment) and respiratory syncytia B subtype Gcf protein &Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI > respiratory syncytial virus vaccine composition.

본 발명에서 용어, "RSV의 G 단백질"은 RSV 주요 부착 단백질로서, 본 발명에서는 이의 일 부분이 호흡기 신시치아 바이러스 백신 면역원의 구성 성분으로 사용된다. 상기 RSV의 G 단백질 및 이를 코딩하는 유전자의 정보는 미국 국립 보건원 유전자 은행과 같은 공지의 데이터 베이스를 통하여 수득할 수 있으며, 구체적으로 RSV A의 G 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, RSV B의 G 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the term "G protein of RSV" is a RSV major attachment protein. In the present invention, a part thereof is used as a component of a respiratory syncytial virus vaccine immunogen. The information on the G protein of the RSV and the gene encoding the G protein can be obtained through a known database such as the National Institute of Health's Gene Bank. Specifically, the G protein of RSV A may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 And the G protein of RSV B may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "RSV의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment)"은 RSV G 단백질의 중심 보존된 도메인(central conserved domain) 부위에 대한 아미노산 서열로 구성된 단백질을 말한다. As used herein, the term "RSV G protein core fragment" refers to a protein consisting of an amino acid sequence for the central conserved domain region of the RSV G protein.

상기 RSV A 아형의 Gcf 단백질은 그 예로 RSV A 아형의 G 단백질의 120 내지 230번 부위, 130 내지 230번 부위, 131 내지 230번 부위로 구성된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않으며, RSV A 아형에 대한 면역 효과를 나타낼 수 있는 한, 상기 부위의 단편 형태도 포함한다. Examples of the RSV A subtype Gcf protein include, but are not limited to, the RSV A subtype G protein 120 to 230, 130 to 230, and 131 to 230, As long as it can exhibit an immunological effect on the immune system.

상기 RSV A 아형의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, RSV Long 또는 A2 또는 A 아형에 속하는 임상분리주일 수 있으며, 구체적으로는 RSV A2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 RSV A2 Gcf 단백질로서, 서열번호 5로 구성된 단백질을 사용하였다. 상기 서열번호 5의 Gcf 단백질은 서열번호 1로 표시되는 RSV A2 G 단백질의 131 내지 230 부위에 해당한다.
The type of the RSV A subtype is not particularly limited, but may be a clinical isolate belonging to RSV Long or A2 or A subtype, and may be RSV A2, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the protein consisting of SEQ ID NO: 5 was used as the RSV A2 Gcf protein. The Gcf protein of SEQ ID NO: 5 corresponds to the 131 to 230 region of the RSV A2 G protein of SEQ ID NO: 1.

또한, 상기 RSV B 아형의 Gcf 단백질은 그 예로 RSV B 아형 G 단백질의 120 내지 230번 부위, 120 내지 231번 부위, 129 내지 230번 부위, 129 내지 231번 부위, 130 내지 230번 부위, 130 내지 231번 부위, 131 내지 230번 부위, 또는 131 내지 231번 부위로 구성된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않으며, RSV B 아형에 대한 면역 효과를 나타낼 수 있는 한, 상기 부위의 단편 형태도 포함한다. The Gcf protein of the RSV B subtype includes, for example, the 120 to 230 region, the 120 to 231 region, the 129 to 230 region, the 129 to 231 region, the 130 to 230 region, the 130 to 230 region, 231, 131 to 230, or 131 to 231, but is not particularly limited to, and includes the fragment form of the region as long as it can exhibit an immunological effect on the RSV B subtype.

상기 RSV B 아형의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, RSV B1, BA, 또는 RSV B 아형에 속하는 임상분리주 등이 있으며, 구체적인 종류로는 HRSV-B에 속하는 KR/B/10-12 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 RSV B1 Gcf 단백질로서, 서열번호 6으로 구성된 단백질을 사용하였다. 상기 서열번호 6의 Gcf 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 RSV B1 단백질의 129 내지 231번 아미노산 부위에 해당한다.
Examples of the RSV B subtype include KRV B1, BA, or a clinical isolate belonging to the RSV B subtype, and specific examples thereof include KR / B / 10-12 belonging to HRSV-B. But is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the protein consisting of SEQ ID NO: 6 was used as the RSV B1 Gcf protein. The Gcf protein of SEQ ID NO: 6 corresponds to amino acid positions 129 to 231 of the RSV B1 protein represented by SEQ ID NO: 3.

또한, 본 발명에서 상기 RSV G 단백질 또는 RSV의 Gcf 단백질은, 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 변이체를 포함한다. G 단백질의 변이체란 G 단백질의 야생형 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 야생형 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. In the present invention, the Gcf protein of RSV G protein or RSV includes a protein having a wild-type amino acid sequence as well as a mutant thereof. A variant of a G protein refers to a protein having a sequence that differs from a wild-type amino acid sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of one or more amino acid residues from the wild-type amino acid sequence of the G protein, or a combination thereof.

또한, 상기 RSV G 단백질 또는 RSV의 Gcf 단백질은 상기 서열로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 Gcf 부위가 RSV A 또는 B 바이러스에 대한 면역원성을 나타낼 수 있다면, 본 발명의 범주에 제한 없이 포함된다. In addition, the RSV G protein or the Gcf protein of RSV has not only the amino acid sequence described in the above sequence, but also 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more, still more specifically 95 % Homologous to the RSV A or B virus, as long as the Gcf site can exhibit immunogenicity against the RSV A or B virus.

본 발명에서 용어, "상동성"은 주어진 단백질 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.
As used herein, the term "homology" means the degree to which a given protein sequence or polynucleotide sequence corresponds and may be expressed as a percentage. In the present specification, a homologous sequence having the same or similar activity as a given polypeptide sequence or polynucleotide sequence is expressed as "% homology ". For example, standard software for calculating parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or by sequential hybridization experiments under defined stringent conditions, . &Lt; / RTI >

본 발명은, 상기 RSV의 G 단백질 중 Gcf 단백질 부위를 백신 면역원의 제조에 이용한다. 본 발명에서 상기 RSV A 아형의 G 단백질의 Gcf 부위를 Gcf/A로 명명되며, RSV B 아형의 G 단백질의 Gcf 부위를 Gcf/B로 명명된다. In the present invention, the Gcf protein portion of the G protein of the RSV is used for the preparation of a vaccine immunogen. In the present invention, the Gcf region of the G protein of the RSV A subtype is designated as Gcf / A and the Gcf region of the G protein of the RSV B subtype is designated as Gcf / B.

본 발명의 일 양태에 따르면, Gcf/A 및 Gcf/B를 융합하여 백신 면역원으로 사용하는 경우, Gcf/A 및 Gcf/B의 혼합물을 사용하는 경우에 비해서도 RSV A 및 B 아형 모두에 대한 우수한 면역원성을 나타낼 수 있다. According to one aspect of the present invention, when Gcf / A and Gcf / B are fused and used as vaccine immunogens, superior immunity to both RSV A and B subtypes, compared to the case of using a mixture of Gcf / A and Gcf / B It can show originality.

따라서, 본 발명의 백신 조성물은 RSV에 대한 높은 면역원성을 나타낼 수 있도록, 상기 Gcf/A 및 Gcf/B의 융합 단백질을 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물의 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
Accordingly, the vaccine composition of the present invention is characterized in that the fusion protein of Gcf / A and Gcf / B is contained as an active ingredient of a respiratory syncytial virus vaccine composition so as to exhibit high immunogenicity against RSV.

상기 융합 단백질은 본 발명에서 Gcf/AB로 명명된다. 상기 융합 단백질은 서열번호 7 또는 9로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 융합 단백질은 상기에서 기술한 서열 외에도 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 RSV A 및 B 바이러스에 대해 면역원성을 나타낼 수 있다면, 본 발명의 범주에 제한 없이 포함된다. 또한, 이의 변이체도 본 발명의 범위에 포함됨은 당업자에게 자명하다. The fusion protein is named Gcf / AB in the present invention. The fusion protein may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9, but is not limited thereto. In addition to the above-described sequences, the fusion protein may further comprise RSV A and / or RSV as an amino acid sequence having 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more, and still more specifically 95% B " virus < / RTI > in the context of the present invention. It is also apparent to those skilled in the art that variants thereof are also included in the scope of the present invention.

또한, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 상기 융합 단백질에 포함되는 Gcf/A 및 Gcf/B에서, RSV G 단백질의 173번, 176번, 182번 및 186번 아미노산의 시스테인 잔기가 보존된 것이 바람직하다. It is also preferred that the cysteine residues of amino acids 173, 176, 182 and 186 of the RSV G protein are conserved in Gcf / A and Gcf / B contained in the fusion protein, though not particularly limited thereto.

상기 4가지 아미노산 잔기는 보존된 시스테인 잔기를 가짐으로써, RSV에 대한 면역원성을 효과적으로 나타낼 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
The above four amino acid residues can effectively exhibit immunogenicity against RSV by having conserved cysteine residues, but are not particularly limited thereto.

상기 융합 단백질의 Gcf/A 및 Gcf/B는 직접 연결된 형태이거나, 링커(linker)로 서로 연결된 것일 수 있다. The Gcf / A and Gcf / B of the fusion protein may be in a directly linked form or linked to each other by a linker.

본 발명에서 용어, "링커"는 두 개의 서로 다른 융합 파트너를 서로 연결할 수 있는 연결체를 말한다. 상기 링커는 바람직하게는 펩타이드 링커일 수 있으며, 그 예로 G4S 링커 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "linker" refers to a linkage capable of linking two different fusion partners to each other. The linker may preferably be a peptide linker, and examples thereof include, but are not limited to, a G4S linker and the like.

또한, 상기 융합 단백질의 Gcf/A 및 Gcf/B는 Gcf/A의 C-말단에 Gcf/B가 연결되거나, Gcf/B의 C-말단에 Gcf/A가 연결된 형태일 수 있으나, 이에 결합 형태가 제한되는 것은 아니다. Gcf / A and Gcf / B of the fusion protein may be Gcf / B linked to the C-terminal of Gcf / A or Gcf / A connected to the C-terminal of Gcf / B, Is not limited.

또한, 상기 융합 단백질은 이의 N-말단, C-말단 또는 둘 다에 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the fusion protein may further comprise a protein tag at its N-terminus, C-terminus, or both.

상기 단백질 태그(tag)의 예로는, 플루오레세인과 같은 화학적 형광물질(Fluorescein), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩티드 형광물질을 포함한 형광분자일 수 있고, T7 태그, 믹(Myc) 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘(Histidine) 태그, 루신(Leucine) 태그, IgG 태그 및 스트랩타비딘(Streptavidin) 태그 등 에피토프(epitope) 태그일 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상적으로 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기를 가지나, 이에 제한되지 않는다. Examples of the protein tag may be a fluorescent molecule containing a polypeptide fluorescent substance such as a fluorescein such as fluorescein, a fluorescent protein (GFP), or a related protein, and may be a T7 tag, a Myc tag, But is not limited to, an epitope tag such as a tag, a Flag tag, a histidine tag, a Leucine tag, an IgG tag, and a Streptavidin tag. Tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, and typically have about 8 to 50 amino acid residues, but are not limited thereto.

또한, 상기 융합 단백질은 Gcf/A 및 Gcf/B의 융합 단백질의 제조 과정에서 포함되는 제한 효소 절단 위치 서열에 해당하는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 특정 두 단백질의 융합 단백질 제조에 융합 하고자 하는 단백질의 서열 외에도 상기와 같이 융합 단백질의 제조 과정에 필요한 서열이 최종적으로 제조된 융합 단백질에 포함될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
In addition, the fusion protein may include an amino acid sequence corresponding to a restriction enzyme cleavage position sequence included in the preparation of a fusion protein of Gcf / A and Gcf / B, and may include a protein to be fused It is apparent to those skilled in the art that the sequence necessary for the production of the fusion protein may be included in the finally prepared fusion protein.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물은 RSV A 및 B에 대한 면역 효과를 모두 나타낸다. 따라서, 상기 융합 단백질을 포함하는 본 발명에 따른 백신 조성물은 RSV 범용 백신으로 사용될 수 있다.또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물은 아쥬반트를 포함하지 않고도 RSV A 및 B에 대한 우수한 면역 효과를 나타낸다.According to one aspect of the present invention, the vaccine composition comprising the fusion protein according to the invention exhibits both immunological effects against RSV A and B. Therefore, the vaccine composition according to the present invention containing the fusion protein can be used as a general vaccine for RSV. According to one aspect of the present invention, the vaccine composition comprising the fusion protein according to the present invention comprises adjuvant Gt; RSV < / RTI > < RTI ID = 0.0 > A < / RTI >

단백질을 유효성분으로 포함하는 백신, 즉 단백질 또는 펩티드 백신의 경우, 그 자체로 충분한 면역반응의 유도가 어려워 백신 조성물에 아쥬반트를 포함하는 것이 일반적이다. 그러나, 본 발명의 백신 조성물은 아쥬반트를 포함하지 않고 상기 융합 단백질만을 사용하더라도 RSV A 및 B에 대한 보호 면역 효과를 효과적으로 나타낼 수 있다. 아쥬반트의 경우, 면역원성을 위해 포함되는 것이 불가피한 경우가 많으나 이에 의하여 또 다른 부작용이 야기될 위험이 있다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물에 아쥬반트를 포함시키지 않고 상기 융합 단백질로 구성된 유효성분을 포함시키는 경우, 보다 높은 안정성을 제공할 수 있으나, 상기 기술한 바에 제한되는 것은 아니다.
In the case of a vaccine containing a protein as an active ingredient, that is, a protein or a peptide vaccine, it is generally difficult to induce a sufficient immune response by itself, so that the vaccine composition usually contains an adjuvant. However, the vaccine composition of the present invention can effectively exhibit the protective immunity effect against RSV A and B even when only the fusion protein is used without adjuvant. In the case of adjuvants, it is inevitable that they are included for immunogenicity, but there is a risk that they will cause another side effect. Therefore, when the vaccine composition of the present invention contains an active ingredient composed of the fusion protein without including adjuvant, it can provide higher stability, but is not limited to the above description.

본 발명의 범주가 상기 기술한 바에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 백신 조성물은 추가로 아쥬반트를 포함할 수 있다. The scope of the present invention is not limited to the above description, and the vaccine composition of the present invention may further include an adjuvant.

상기 아쥬반트는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 포함될 수 있는 성분으로, 그 예로 콜레라 톡신(CT), 알루미늄 하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 또는 생분해성(Biodegradable) 오일이 있다. The adjuvant is a component that can be included to improve or enhance the immune response, such as cholera toxin (CT), aluminum hydroxide, carbopol, mineral oil or biodegradable oil.

또한, 본 발명의 백신조성물은 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. In addition, the vaccine composition of the present invention may include one or more adjuvants or the like to improve or enhance the immune response. Suitable adjuvants include compositions composed of peptides, mineral hydroxides, aluminum phosphates, mineral oils such as aluminum oxide and Marcol 52 or vegetable oils and one or more emulsifiers, or surface active substances such as ricinsecitin, polyvalent cations and polyvalent anions But is not limited thereto. The route of administration of the composition may be administered via any conventional route so long as it can reach the target tissue.

본 발명에서 용어, "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 백신 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 점막 또는 근육 내 투여일 수 있다. The term "administering" in the present invention means introducing a given substance into an individual by any suitable method. The route of administration of the vaccine composition is not particularly limited, but may be mucosal or intramuscular administration.

상기 점막 투여는 바람직하게는 비강 투여(intranasal administration)를 통한 것일 수 있다. "비강 투여(intranasal administration)"란, 활성 성분의 국부적 또는 전신적 효과를 얻기 위하여 투약 제형을 비강(nasal cavity) 하부에 적용하여 비점막으로 흡수시키는 투여 경로를 의미한다.
The mucosal administration may preferably be via intranasal administration. By "intranasal administration" is meant a route of administration in which the dosage form is applied to the lower part of the nasal cavity and absorbed into the nasal mucosa to obtain local or systemic effects of the active ingredient.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. The vaccine composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.

본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 유효성분의 활성, 투여 경로, 제거 속도, 치료 지속 기간, 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to exhibit a vaccine effect and an amount not causing side effects or serious or excessive immune response, The severity, the activity of the active ingredient, the route of administration, the rate of elimination, the duration of treatment, the drugs used in combination or concurrently, the age, weight, sex, diet, general health status of the subject, And will depend on a variety of factors.

"약제학적으로 유효한 양" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다. Various general aspects to be considered in determining the "pharmaceutically effective amount" are known to those skilled in the art and are described, for example, in Gilman et al., Eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press , 1990] and [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990].

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art. The composition may also be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.

또한, 상기 백신 조성물은 호흡기 신시치아 바이러스에 의해 유발되는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 가져올 수 있다. In addition, the vaccine composition can prevent or treat respiratory diseases caused by respiratory syncytial virus.

본 발명에서 용어, "예방"이란, 조성물의 투여로 호흡기 신시치아 바이러스 감염에 의해 유발되는 호흡기 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. The term "prevention" in the present invention means any action that inhibits or delays the onset of a respiratory disease caused by respiratory syncytial virus infection upon administration of the composition.

본 발명에서 용어, "치료"란, 조성물의 투여로 호흡기 신시치아 바이러스 감염에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다. The term "treatment" in the present invention means any action that improves or alleviates symptoms of a disease already caused by respiratory syncytial virus infection upon administration of the composition.

호흡기 신시치아 바이러스 감염에 의해 유발되는 호흡기 질환은 기침, 재채기, 고열, 천명, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 천식, 크룹 및 호흡기 부전 등을 예로 들 수 있다.
Respiratory tract Respiratory diseases caused by infection with CNS virus include cough, sneezing, fever, wheezing, bronchitis, bronchiolitis, pneumonia, asthma, croup and respiratory failure.

본 발명의 백신 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The vaccine composition of the present invention may also comprise a pharmaceutically acceptable carrier. "Pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, adjuvants, stabilizers, diluents, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, Examples of the carrier, excipient and diluent which can be contained in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, glycerin, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.In addition, the vaccine composition of the present invention can be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like in the form of oral preparations and sterilized injection solutions according to a conventional method. In the case of formulation, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like which are usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc may also be used. As the liquid preparation for oral administration, suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like may be used. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, . Formulations for non-oral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, and freeze-drying agents. As the non-aqueous preparation and suspension, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.

본 발명의 실시예에서는, RSV A 아형의 대표적인 Gcf 단백질인, 서열번호 5의 Gcf 단백질 및 RSV B 아형의 대표적인 Gcf 단백질인, 서열번호 6의 Gcf 단백질의 융합 단백질을 제조하였다(실시예 1). 그 다음, 상기 융합 단백질의 효과를 확인하기 위하여 아쥬반트의 부재 하에서 Gcf/AB를 비강 또는 근육 내 투여하여 점막 또는 전신 면역을 유도하였고, 또한, 이의 효과를 비교하기 위하여 Gcf/A, Gcf/B, 및 Gcf/A 및 Gcf/B의 혼합 투여(Gcf/A + Gcf/B) 역시 각각 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 Gcf/AB를 투여한 군은 투여 경로와 무관하게 다른 군 모두에 비해서도 가장 높은 RSV A2 및 B1 특이적 항체를 유발하였다. 특히, 본 발명의 Gcf/AB 군은 Gcf/A + Gcf/B 군에 비해서도 같은 분자수의 Gcf/A 및 Gcf/B를 포함함에도 혈청 IgG를 유도하는 정도가 높았으며, 특히 B 세포 에피토프에 대한 항체 유도 효과의 경우, 본 발명의 Gcf/AB 군에서만 높은 정도로 유도되었다(도 2 및 3). 또한, 상기 Gcf/AB의 백신화가 RSV A 및 B에 대한 보호 면역 효과를 유도할 수 있는지 확인한 결과, 상기 Gcf/AB 투여군의 경우, Gcf/A 투여군, Gcf/B 투여군, 및 Gcf/A + Gcf/B 투여군 모두에 비하여 현저히 낮은 폐 바이러스 역가를 나타내면서도, 몸무게 감소를 가져오지 않았다(도 4 및 5). 이러한 결과들은 Gcf/A 및 Gcf/B를 융합 단백질 형태로 포함함으로써, Gcf/A 및 Gcf/B의 면역원성을 현저히 높일 수 있음을 나타내는 것이다. 특히, 아쥬반트를 포함하지 않고도 높은 면역원성을 나타내므로, 안전성이 높은 RSV 범용 백신으로서 사용될 수 있음을 시사하였다.
In Example of the present invention, a fusion protein of Gcf protein of SEQ ID NO: 5, which is a representative Gcf protein of RSV A subtype, and Gcf protein of RSV B subtype, which is a typical Gcf protein, was prepared (Example 1). Then, in order to confirm the effect of the fusion protein, mucosal or systemic immunity was induced by intranasal or intramuscular administration of Gcf / AB in the absence of adjuvant, and Gcf / A, Gcf / B , And a mixed administration of Gcf / A and Gcf / B (Gcf / A + Gcf / B), respectively. As a result, the Gcf / AB-administered group of the present invention induced the highest RSV A2 and B1 specific antibodies regardless of the administration route, as compared with all other groups. Particularly, the Gcf / AB group of the present invention has a higher degree of inducing serum IgG than Gcf / A + Gcf / B group even though Gcf / A and Gcf / B having the same molecular number are contained. Especially, the antibody against B cell epitope Induction effects were induced only to a high degree in the Gcf / AB group of the present invention (Figs. 2 and 3). As a result of confirming that the vaccination of Gcf / AB could induce a protective immunity effect against RSV A and B, Gcf / A administration group, Gcf / B administration group and Gcf / A + Gcf / B administration group, but did not result in weight loss (FIGS. 4 and 5). These results indicate that the immunogenicity of Gcf / A and Gcf / B can be significantly enhanced by including Gcf / A and Gcf / B in the form of a fusion protein. In particular, it showed high immunogenicity without containing adjuvant, suggesting that it can be used as a highly safe RSV universal vaccine.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 백신 조성물을 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역을 증가시키는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for increasing immunity against respiratory syncytial virus, comprising administering the vaccine composition to a subject in need of immunization against respiratory syncytial virus.

상기 백신 조성물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. The above-mentioned vaccine composition is as described above.

상기 개체는 호흡기 신시치아 바이러스가 감염될 수 있는 유기체라면 제한 없이 포함하며, 구체적으로는 호흡기 질환이 발병할 수 있다는 특성상 호흡기관을 포함하는 고등 척추동물이 될 수 있고, 더욱 구체적으로는 포유동물이 될 수 있으며, 더욱더 구체적으로는 영장류가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
Such an organism is not limited as long as it is an organism that can be infected with a respiratory syncytial virus. Specifically, the organism may be a high vertebrate animal including a respiratory organ due to the fact that respiratory diseases may develop. More specifically, And more specifically may be a primate, but is not particularly limited thereto.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 백신 조성물을 호흡기 신시치아 바이러스에 대한 면역이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 신시치아 바이러스에 의한 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating a respiratory infectious disease caused by respiratory syncytial virus, comprising the step of administering the vaccine composition to a subject requiring immunization against respiratory syncytial virus.

상기 백신 조성물, 개체, 질환, 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
The vaccine composition, individual, disease, prevention and treatment are as described above.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 호흡기 신시치아 바이러스(RSV) A 아형의 Gcf 단백질(RSV G protein core fragment) 및 호흡기 신시치아 B 아형의 Gcf 단백질의 융합 단백질을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a fusion protein of a respiratory syncytial virus (RSV) A subtype Gcf protein (RSV G protein core fragment) and a Gcf protein of the respiratory syncytia B subtype.

상기 융합 단백질 및 이를 구성하는 요소들에 대한 설명은 앞서 기술한 바와 같다.
The description of the fusion protein and the constituent elements thereof is as described above.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
In another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide encoding the fusion protein, an expression vector comprising the polynucleotide, and a transformant other than a human comprising the expression vector.

본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 융합 단백질의 발현을 높이기 위하여 아미노산 번역 코돈을 최적화(optimization)시킬 수 있다. 구체적으로, 코돈의 축퇴성으로 인하여, 또는 목적 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호하는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
The nucleic acid sequence encoding the fusion protein of the present invention can optimize the amino acid translation codon to enhance the expression of the fusion protein. Specifically, various modifications to the coding region can be made within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide, due to codon degeneracy of the codon, or considering the codons preferred in the organism to which the target protein is to be expressed.

본 발명의 융합 단백질을 발현시킬 수 있다면, 숙주세포의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로는 원핵세포, 예컨대 대장균을 숙주세포로 이용하여 발현시킬 수 있다. 통상적으로 단백질 번역 후 수식과정이 단백질의 면역원성에 영향을 미치기 때문에 항원 단백질발현은 동물세포 등 진핵세포에서 이루어져 왔다. 그러나 본 발명의 융합 당백질은 원핵세포, 바람직하게는 대장균에서 발현시켜도 우수한 면역원성을 보유함을 본 발명자가 밝혀내었다. 따라서, 백신을 경제적으로 제조할 수 있고, 정제된 단백질 형태로 투여하기 때문에 바이러스 벡터 상태로 감염시키는 것에 비하여 안전하다.
If the fusion protein of the present invention can be expressed, the type of the host cell is not particularly limited, but specifically, prokaryotic cells such as E. coli can be used as a host cell to express the fusion protein. Since protein modification usually affects the immunogenicity of proteins, antigen protein expression has been found in eukaryotic cells such as animal cells. However, the present inventors have found that the fusion protein of the present invention has excellent immunogenicity even when expressed in prokaryotes, preferably Escherichia coli. Therefore, the vaccine can be economically produced, and is safe as compared with infecting with a viral vector state because it is administered in the form of a purified protein.

본 발명에서 용어, "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. As used herein, the term "expression vector" refers to a recombinant vector capable of expressing a desired protein in a suitable host cell, which gene construct comprises an essential regulatory element operably linked to the expression of the gene insert, Standard recombinant DNA techniques can be used to produce.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터일 수 있다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 오퍼레이터 서열, 목적하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 개시 코돈 및 종결코돈은 일반적으로 면역원성 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주될 수 있으며, 유전자 작제물이 도입되었을 때 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein to perform a general function. For example, a nucleic acid sequence that encodes a promoter and a protein may affect the expression of a nucleic acid sequence that is operably linked. The type of the recombinant vector is not particularly limited as long as it expresses the desired gene in various host cells and functions to produce the desired protein. However, the recombinant vector may contain a promoter that exhibits strong activity and an exogenous protein May be a vector capable of mass production. The recombinant vector preferably contains at least a promoter, an initiation codon, a gene encoding a desired protein, and a termination codon terminator. In addition, DNA encoding the signal peptide, an operator sequence, a non-specific region on the 5 'side and a 3' side of the desired gene, a selectable marker region, or a replicable unit may suitably be contained. The initiation codon and the termination codon can generally be regarded as part of the nucleic acid sequence encoding the immunogenic target protein and must function when the gene construct is introduced and in the coding sequence and in frame. The promoter of the vector may be constitutive or inducible.

본 발명에서, 상기 융합 단백질은 상기 발현벡터를 사용해서 숙주세포를 형질전환시킨 후 배양하여 수득할 수 있다. 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다. In the present invention, the fusion protein can be obtained by transforming a host cell with the above expression vector and culturing. Methods for preparing transformants by introducing expression vectors into host cells are described in Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989 A calcium phosphate method or a calcium chloride / rubidium chloride method, an electroporation method, an electroinjection method, a chemical treatment method such as PEG, and a method using a gene gun.

상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. When the transformant expressing the vector is cultured in a nutrient medium, a large amount of useful protein can be prepared and isolated.

배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다. The medium and culture conditions can be suitably selected depending on the host cell. The conditions such as temperature, medium pH and incubation time should be appropriately adjusted so as to be suitable for cell growth and mass production of the protein during culturing.

본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포는 원핵 세포를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 에쉐리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 주지의 원핵 숙주들이 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 일 실시예에서는 대장균을 사용하였다.
A host cell that can be transformed with an expression vector according to the present invention includes a prokaryotic cell, a host having high efficiency of introduction of DNA and high efficiency of expression of the introduced DNA is usually used. An example of a bacteria, for instance Escherichia Sherry (Escherichia), Pseudomonas (Pseudomonas), Bacillus (Bacillus), a host cell with a known prokaryotic host, such as a Streptomyces (Streptomyces) may be used for. In one embodiment of the present invention, Escherichia coli was used.

단백질의 발현은 유도인자, 예건대 IPTG 등을 사용하는 방법으로 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서, 재조합적으로 생산된 펩티드는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 펩티드 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리. 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교화크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
Expression of the protein can be induced by a method using an inducer such as IPTG, and the induction time can be controlled to maximize the amount of the protein. In the present invention, recombinantly produced peptides can be recovered from the medium or cell lysate. If membrane bound, it can be liberated from the membrane by using a suitable surfactant solution (e.g., Triton-X 100) or by enzymatic cleavage. Cells used for peptide expression can be disrupted by various physical or chemical means such as freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption or cell disruption, and are isolated by conventional biochemical separation techniques. Inc., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. San Diego, CA, 1990). (Ion-exchange chromatography, affinity chromatography, immuno-adsorption affinity chromatography, reversed phase HPLC, gel permeation HPLC), isoelectric focusing, and various changes and combinations thereof Including but not limited to:

본 발명에 따른 융합 단백질은 RSV A 및 B 아형 모두에 대한 면역을 효과적으로 유도하므로, RSV 범용 백신의 면역원으로 유용하게 사용할 수 있다.
The fusion protein according to the present invention effectively induces immunity against both RSV A and B subtypes, and thus can be usefully used as an immunogen of RSV universal vaccine.

도 1은, 재조합 Gcf/AB 단백질을 발현하는 컨스트럭트의 구조 및 상기 단백질의 정제에 관한 것이다. (A) pET-21d-Gcf/AB 발현 벡터를 모식도로 나타내었다. Gcf/AB는 RSV A2 및 RSV B1 G 단백질 각각의 129번 내지 231번 아미노산 단편을 수 번의 클로닝 과정을 통하여 유전공학적으로 서로 연결하여 제조하였다. (B) 발현된 Gcf/AB를 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 통하여 정제한 다음, SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 내지 c는 Gcf/AB 백신화에 의해 유도되는 RSV-A 특이적 항체 반응에 관한 도이다.
도 2a는 면역화 및 공격 접종에 대한 실험적 과정을 모식도로 나타낸 것이다. Balb/C 마우스에 20 μg Gcf/AB, 10 μg Gcf/A, 10 μg Gcf/B, 또는 Gcf/A 및 Gcf/B가 각 10 μg씩 혼합된 혼합물(Gcf/A + Gcf/B)을 도에 표시한 경로로 두 차례 면역화하였다.
도 2b는 부스팅 백신접종 14일 후 ELISA로 RSV A2 특이적 혈청 항체 역가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 부스팅 백신접종 14일 후 RSV A2 G 174-187 펩타이드 특이적 혈청 항체 역가를 ELSIA로 측정한 결과를 나타낸다.
상기 도 2b 및 c의 실험 결과는 두 번의 독립적인 실험에 대한 대표적인 결과이다. OD는 강학 밀도(optical density)를 의미하며, 에러 바(bar)는 표준 편차를 나타낸다. PBS에 대한 결과와의 유의적 차이는 * *, P<0.05 ***, P<0.005로 나타내었다.
도 3a 및 b는 Gcf/AB 백신접종에 의한 RSV-B-특이적 항체 반응에 관한 도이다. Balb/C 마우스에 20 μg Gcf/AB, 10 μg Gcf/A, 10 μg Gcf/B, 또는 Gcf/A 및 Gcf/B가 각 10 μg씩 혼합된 혼합물(Gcf/A + Gcf/B)을 표시한 경로로 두 차례 면역화하였다.
도 3a는 부스팅 백신접종 14일 후 RSV KR/B/10-12(HRSV B에 속함) 특이적 혈청 항체 역가를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다.
도 3b는 부스팅 백신접종 14일 후 RSV B G 174-187 펩타이드 특이적 혈청 항체 역가를 ELSIA로 측정한 결과를 나타낸다.
상기 도 3a 및 b의 실험 결과는 두 번의 독립적인 실험에 대한 대표적인 결과이다. OD는 강학 밀도(optical density)를 의미하며, 에러 바(bar)는 표준 편차를 나타낸다. PBS에 대한 결과와의 유의적 차이는 * *, P<0.05 ***, P<0.005로 나타내었다.
도 4a 및 b는 Gcf/AB의 점막 또는 전신 백신 접종의 RSV A2 바이러스에 대한 보호 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 각 군의 마우스에 면역화한 지 4주 후 1 X 10⁶PFU RSV A2를 공격 접종한 다음, 폐 균질 혼합물을 제조하고, RSV A2 바이러스 증식 수준을 플라크 어세이를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 검출 한계는 200 PFU/폐 무게(g)였고, N.D.는 검출되지 않았음을 나타낸다.
도 4b는 각 군의 마우스에 RSV A2 바이러스를 공격 접종하고, 매일 몸무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 결과값은 각 군의 4개의 마우스의 평균 ± 표준 오차로 나타내었다.
도 5a 및 b는 Gcf/AB의 점막 또는 전신 백신 접종의 KR/B/10-12(HRSV-B에 속함) 바이러스에 대한 보호 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 각 군의 마우스에 면역화한 지 4주 후, 2 또는 4 X 10⁶PFU의 KR/B/10-12를 공격 접종하였고, 폐 균질 혼합물을 준비하였고, 바이러스 증식 수준을 플라크 어세이를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 검출 한계는 200 PFU/폐 무게(g)였고, N.D.는 검출되지 않았음을 나타낸다. PBS 결과와 유의한 차이는 *, P < 0.05로 나타내었다.
도 5b는 각 군의 마우스에 KR/B/10-12 바이러스를 공격 접종하고, 매일 몸무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 결과값은 각 군의 4개의 마우스의 평균 ± 표준 오차로 나타내었다. Figure 1 relates to the structure of a construct expressing recombinant Gcf / AB protein and to the purification of said protein. (A) pET-21d-Gcf / AB expression vector. Gcf / AB was prepared by linking amino acid fragments 129 to 231 of RSV A2 and RSV B1 G proteins, respectively, through genetic engineering several times through cloning. (B) expressing the purified Gcf / AB through affinity chromatography and gel filtration chromatography, followed by SDS-PAGE.
Figures 2a-c illustrate RSV-A specific antibody responses induced by Gcf / AB vaccination.
2A is a schematic diagram illustrating an experimental process for immunization and attack inoculation. (Gcf / A + Gcf / B) in which 20 μg of Gcf / AB, 10 μg of Gcf / A, 10 μg of Gcf / B or each of 10 μg of Gcf / A and Gcf / And then immunized twice with the indicated route.
Figure 2B shows the results of RSV A2-specific serum antibody titers measured by ELISA 14 days after boosting vaccination.
FIG. 2C shows the results of RSV A2 G 174-187 peptide-specific serum antibody titers measured by ELSIA after 14 days of boosting vaccination.
The experimental results of FIGS. 2B and C above are representative results for two independent experiments. OD denotes the optical density, and error bar denotes the standard deviation. Significant differences from the results for PBS were * *, P <0.05 ***, P <0.005.
Figures 3a and 3b are graphs of RSV-B-specific antibody responses by Gcf / AB vaccination. (Gcf / A + Gcf / B) mixed with 20 μg Gcf / AB, 10 μg Gcf / A, 10 μg Gcf / B or each 10 μg of Gcf / A and Gcf / B in Balb / C mice And immunized twice with one route.
Figure 3A shows the results of ELISA for RSV KR / B / 10-12 (belonging to HRSV B) -specific serum antibody titers 14 days after boosting vaccination.
FIG. 3B shows the results of measurement of RSV BG 174-187 peptide-specific serum antibody titers by ELISA after 14 days of boosting vaccination.
The experimental results of FIGS. 3A and 3B are representative results for two independent experiments. OD denotes the optical density, and error bar denotes the standard deviation. Significant differences from the results for PBS were * *, P <0.05 ***, P <0.005.
FIGS. 4A and 4B are graphs showing the results of confirming the protective effect of mucosal or systemic vaccination of Gcf / AB against RSV A2 virus. FIG.
FIG. 4A shows the result of inoculation of 1 X 10 ⁶ PFU RSV A2 4 weeks after immunization of each group of mice, followed by preparation of a lung homogenous mixture, and confirmation of RSV A2 virus proliferation level by plaque assay . The detection limit was 200 PFU / lung weight (g), indicating that ND was not detected.
FIG. 4B shows the result of daily inoculation of RSV A2 virus in mice in each group and measurement of body weight every day. Results were expressed as mean ± standard error of 4 mice in each group.
5A and 5B show the results of confirming the protective effect of KR / B / 10-12 (belonging to HRSV-B) virus of mucosal or systemic vaccination of Gcf / AB.
FIG. 5A shows that 4 weeks after immunization of mice in each group, 2 or 4 X 10 ⁶ PFU of KR / B / 10-12 were inoculated by inoculation, and a lung homogenous mixture was prepared, The results are shown in Fig. The detection limit was 200 PFU / lung weight (g), indicating that ND was not detected. Significant differences from PBS results were *, P <0.05.
FIG. 5B shows the result of daily weight measurement of KR / B / 10-12 virus inoculated with mice in each group. Results were expressed as mean ± standard error of 4 mice in each group.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1: 실험방법 1: Experimental method

(1) (One) RSVRSV 스톡의Stock 제조 Produce

RSV A2 또는 KR/B/10-12의 제조 및 분리는 Kim et al (PloS one 7, e32226, 2012) 또는 Jang et al (PloS one 6, e23797, 2011)에 기술한 방법대로 수행하였다. 요약하면, 단층으로 배양된 Hep-2 세포(ATCC, Manassas, VA)를 포함하는 30개의 150 mm 배양접시에 0.01의 MOI로 스톡 바이러스를 감염시켰다. 60 내지 80%의 세포 변성 효과(cytopathic effect)가 관찰될 때, 대개 3 내지 4일 후에 얼음 위에서 세포 배양 상등액 및 세포를 수집하였다. 2,000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛을 솔비톨을 10% 최종 농도로 포함하는, 수집된 세포 배양 상등액 25ml에 재현탁하였고, 재현탁된 용액을 항온수조 초음파 파쇄기를 이용하여 초음파 파쇄하였다. 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 수집하였고, 남은 배양 상등액과 합쳤다. 25,000rpm에서 60분간 원심분리한 다음, 희끄무레한 색의 바이러스 펠렛을 700μl 차가운 무혈청 MEM에 재현탁하였다. 모은 바이러스 펠렛을 15초 인터벌(interval)로 2분간 초음파 분쇄한 다음, 25-게이지 바늘을 사용하여 주사기로 재현탁하였다. RSV A2 또는 KR/B/10-12 바이러스 스톡을 나눈 다음(aliquoted), -70°C에 보관하였다. 역가는 일반적인 플라크 어세이를 사용하여 측정하였다.
Preparation and isolation of RSV A2 or KR / B / 10-12 were performed as described by Kim et al (PloS one 7, e32226, 2012) or Jang et al (PloS one 6, e23797, 2011). Briefly, 30 150 mm culture dishes containing Hep-2 cells cultured as monolayers (ATCC, Manassas, Va.) Were infected with Stock Virus at an MOI of 0.01. When a cytopathic effect of 60-80% was observed, cell culture supernatants and cells were collected on ice, usually 3 to 4 days later. After centrifugation at 2,000 rpm for 10 minutes, the cell pellet was resuspended in 25 ml of the collected cell culture supernatant containing 10% final concentration of sorbitol, and the resuspended solution was ultrasonically disrupted using a thermostatic bath sonicator . After centrifugation at 3,000 rpm for 10 min, the supernatant was collected and combined with the remaining culture supernatant. After centrifugation at 25,000 rpm for 60 minutes, the whitish-colored virus pellet was resuspended in 700 μl cold serum-free MEM. The pooled viral pellet was sonicated for 2 minutes at a 15 second interval and resuspended in a syringe using a 25-gauge needle. The RSV A2 or KR / B / 10-12 virus stock was aliquoted and stored at -70 ° C. The potency was measured using a conventional plaque assay.

(2) (2) RSVRSV A 및 B 아형 유래 G 중심 단편(G A and B subtype derived G center fragment (G corecore fragmentfragment )의 융합 ) Fusion of 컨스트럭트의Constructed 제조 Produce

Gcf/A 및 Gcf/B에 대한 발현 플라스미드(각각 pET-21d-GcfA, pET-21d-GcfB)는 Kim et al (PloS one 7, e32226, 2012) 또는 Cheon et al(PloS one 9, e94269, 2014)에 기술되어 있다. Expression plasmids for Gcf / A and Gcf / B (pET-21d-GcfA and pET-21d-GcfB, respectively) were obtained from Kim et al (PloS one 7, e32226, 2012) or Cheon et al (PloS one 9, e94269, 2014 ).

Gcf/AB 발현 플라스미드의 제조를 위하여 RSV B1 바이러스의 RSV G 단백질 129 내지 231번 아미노산 잔기 부분을 cDNA로부터 정방향 프라이머(5’-AAA AGC TTA CAA CCG CCC AGA CC-3’, 서열번호 11) 및 역방향 프라이머(5’-CCC TCG AGG GGG TTT GTG GTT GTT-3’, 서열번호 12)를 사용하여 PCR 증폭하였고, 증폭된 DNA 단편은 아가로스 전기영동을 통하여 분리하였다. 그 다음, 분리된 DNA 단편을 pGEM-T 이지 벡터에 연결하였다. 형질전환 콜로니는 IPTG 및 X-gal (파란색 및 하얀색을 이용한 스크리닝)을 포함한 LB 배지에서 암피실린(50μg/mL)을 이용하여 선별하였고, 양성 재조합 콜로니를 스크리닝하였고, T7 프라이머(5′-TAATACGACTCACTATAGG-3’, 서열번호 13) 및 SP6 프라이머(5′- TATTTAGGTGACACTATAG-3’, 서열번호 14)를 이용한 서열분석 및 제한효소 절단을 통하여 규명하였다. RSV B1 바이러스의 G 단백질의 129번 내지 231번 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 pGEM-Teasy - Gcf/B 플라스미드를 적합한 제한 효소인 HindIII 및 XhoI으로 절단하였고, 상기 129번 내지 231번 부위에 대한 DNA 단편은 아가로스 전기영동으로 분리하였다. 그 다음, 상기 DNA 단편을 pET-21d-Gcf/A 플라스미드의 Hind III 및 Xho I 사이트에 연결하여, pET21d-GcfAB 벡터를 제조하였다(도 1의 A). pET21d-GcfAB 벡터는 HindIII 및 XhoI 효소(New England Bio labs, Beverly, MA)를 사용하여 이중 절단(double digestion)한 후 정제하였다. 그 다음, 이를 대장균 DH5a 컴피턴트 세포에 형질전환하였고, 형질전환 콜로니를 LB 배지에서 암피실린(50μg/mL)을 사용하여 선별하였다. 그 다음, 재조합 콜로니를 제한효소 절단 및 서열분석하여 보다 구체적으로 규명하였다.
For the production of the Gcf / AB expression plasmid, the RSV G protein 129 to 231 amino acid residue portion of the RSV B1 virus was amplified from cDNA using a forward primer (5'-AAA AGC TTA CAA CCG CCC AGA CC-3 ', SEQ ID NO: PCR was amplified using primers (5'-CCC TCG AGG GGG TTT GTG GTT-3 ', SEQ ID NO: 12), and the amplified DNA fragments were separated by agarose electrophoresis. Then, the separated DNA fragment was ligated to the pGEM-T ectopic vector. Transformed colonies were screened using Ampicillin (50 μg / mL) in LB medium containing IPTG and X-gal (blue and white screening), screened for positive recombinant colonies, and T7 primers (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3 ', SEQ ID NO: 13) and SP6 primer (5'-TATTTAGGTGACACTATAG-3', SEQ ID NO: 14) and restriction enzyme cleavage. The pGEM-Teasy-Gcf / B plasmid containing the sequence coding for the 129th to 231rd portions of the G protein of the RSV B1 virus was digested with the appropriate restriction enzymes HindIII and XhoI, and the DNA for the 129th to 231th regions The fragments were separated by agarose electrophoresis. Then, the DNA fragment was ligated to the Hind III and Xho I sites of the pET-21d-Gcf / A plasmid to prepare a pET21d-GcfAB vector (FIG. 1A). The pET21d-GcfAB vector was double digested with HindIII and XhoI enzymes (New England Bio labs, Beverly, MA) and purified. Then, it was transformed into E. coli DH5a competent cells and transfected colonies were selected using ampicillin (50 mu g / mL) in LB medium. The recombinant colonies were then further digested with restriction enzymes and sequenced.

상기와 같이 제조한 GcfAB는 서열번호 9의 아미노산 서열(서열번호 10의 핵산 서열)로 구성되며, Met-T7 태그-클로닝 사이트(서열번호 9에서 1 내지 16번 잔기), Gcf/A 부위(서열번호 9에서 17번 내지 116번 부위), HindIII 제한효소 절단위치(서열번호 9에서 117-118번 부위), Gcf/B 부위(서열번호 9에서 119번 내지 221번 부위; RSV B G 단백질의 129번 내지 231번 부위에 해당), XhoI 제한효소 절단위치(서열번호 9에서 222-223번 부위) 및 6x히스(His) 태그(서열번호 9에서 224번 내지 229번 부위)의 순서로 구성된다.
The GcfAB thus prepared is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 10), the Met-T7 tag-cloning site (residues 1 to 16 in SEQ ID NO: (Positions 117-118 in SEQ ID NO: 9), Gcf / B site (positions 119-121 in SEQ ID NO: 9, position 129 in RSV BG protein (Positions corresponding to positions 231 to 231), a XhoI restriction enzyme cleavage site (positions 222-223 in SEQ ID NO: 9), and a 6x His tag (positions 224 to 229 in SEQ ID NO: 9).

(3) (3) RSVRSV G 중심 단편의 발현 및 정제 Expression and purification of G core fragment

RSV A2 바이러스 G 단백질의 131 내지 230 부위를 포함하는 정제된 pET-21d-Gcf/A 플라스미드 및 RSV B1 바이러스 G 단백질의 129 내지 231 부위를 포함하는 pET-21d-Gcf/B 플라스미드는 Kim et al (PloS one 7, e32226, 2012) 또는 Cheon et al(PloS one 9, e94269, 2014)에 기술되어 있는 바와 같이 발현시키고, 정제하였다. The pET-21d-Gcf / B plasmid containing the purified pET-21d-Gcf / A plasmid and the 129-231 region of the RSV B1 virus G protein, comprising the 131-230 sites of the RSV A2 virus G protein, PloS one 7, e32226, 2012) or Cheon et al (PloS one 9, e94269, 2014).

Gcf/A (a.a. 131-230) 및 Gcf/B (a.a. 129-231)가 인프레임(in-frame)으로 존재하는 pET-21d-Gcf/AB 플라스미드는 대장균 BL21(DE3) 컴피턴트 세포에 일반적인 열 충격 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 후, 단일 콜로니를 가져와 50 μg/ml의 암피실린을 포함하는 LB 배지에 접종하였고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 밤새 배양한 세포 배양액 0.5ml을 적합한 항생제를 포함하는 새로운 500ml LB 배지에 이동하였고, OD600 값이 0.5에 이를 때까지(약 2시간가량이나 형질전환된 플라미스미드의 종류에 따라 차이가 남) 강하게 혼합시켜 배양하였다. IPTG는 최종 농도가 1mM가 되도록 첨가하였고, 세포 배양액은 4시간 동안 인큐베이션하였다. 6,000 × g에서 20분간 원심분리한 다음, 리터 배양액의 세포 펠렛을 40ml 결합 완충액(20 mM KPO4, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole; pH 7.4)에 재현탁하였고, 얼음 위에서 초음파 분쇄시켰다. 15,000 × g에서 20분간 원심분리한 다음 수득한 세포 배양 상등액을 결합 완충액으로 전-평형화한 니켈-나이트릴로트라이아세트산 (Ni-NTA) 레진 컬럼에 로딩하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 세척하고 용출 완충액(20 mM KPO4, 500 mM NaCl, 1M imidazole)을 사용하여 용출시켰다. 용출된 목적 단백질을 포함하는 분획을 수집하고, Centrifugal Filter 디바이스(Centricon 15 mL, 30-kDa MWCO, Millipore, USA)를 이용하여 농축하였고, 완충액을 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하였다.
The pET-21d-Gcf / AB plasmid in which Gcf / A (aa 131-230) and Gcf / B (aa 129-231) are present in-frame is a common column for E. coli BL21 (DE3) And transformed using an impact method. After transformation, single colonies were picked and inoculated into LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and incubated for 24 hours. 0.5 ml of overnight cultured cell culture was transferred to a new 500 ml LB medium containing appropriate antibiotics and incubated until the OD600 value reached 0.5 (about 2 hours, depending on the type of plasmids transformed) Followed by mixing. IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cell culture was incubated for 4 hours. After centrifugation at 6,000 x g for 20 minutes, the cell pellet of the litter culture was resuspended in 40 ml binding buffer (20 mM KPO4, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4) and sonicated on ice. After centrifugation at 15,000 x g for 20 minutes, the resulting cell culture supernatant was loaded onto a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin column pre-equilibrated with binding buffer. The column was then washed and eluted using elution buffer (20 mM KPO4, 500 mM NaCl, IM imidazole). Fractions containing the eluted protein of interest were collected and concentrated using a Centrifugal Filter device (Centricon 15 mL, 30-kDa MWCO, Millipore, USA) and the buffer was replaced with PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4).

농축된 시료의 앨리컷(aliquot)을 PBS로 평형화된 Superdex™75 10/300GL 컬럼에 로딩하였다. 다량체 및 단량체 피크 분획을 각각 수집하였고, 이를 4°C에서 centrifugal filter 디바이스를 이용하여 1 내지 3mg/mL의 농도로 농축하였다.
The aliquot of the concentrated sample was loaded onto a Superdex (TM) 75 10/300 GL column equilibrated with PBS. The monomeric and monomeric peak fractions were respectively collected and concentrated at a concentration of 1 to 3 mg / mL using a centrifugal filter device at 4 ° C.

상기 단백질 시료의 엔도톡신 수준을 ε-폴리-l-라이신 엔도톤신 제거 레진 (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 감소시켰다. 단백질의 엔도톡신 수준은 LAL(limulus amebocyte lysate) 어세이를 사용하여 측정하였으며, 0.6 EU/ μg 이하인 것을 확인하였다.
The endotoxin levels of the protein samples were reduced using < RTI ID = 0.0 > epsilon-poly-l-lysine < / RTI > endodomain removal resin (Pierce, Rockford, IL). The endotoxin level of the protein was measured using a LAL (limulus amebocyte lysate) assay and was found to be below 0.6 EU / μg.

단백질의 쿠마시 블루 염색을 위하여 농축된 단백질을 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 포함하는 4 X SDS(sodium dodecyl sulfate) 샘플 로딩 완충액으로 1:3 (vol:vol)의 비율로 희석시켰다. 그 다음, 이를 95 °C에서 5분간 변성시켰고, 12% 불연속적인 SDS-PAGE로 분리시켰다. 분리된 단백질은 CBB(Coomassie Brilliant Blue) R-250로 염색하여 시각화하였다. Gcf/AB의 대략적인 분자량은 34kDa였다(도 1의 B). 정제된 목적 단백질(Gcf/AB, Gcf/A, 및 Gcf/B)의 단량체 분획을 각각 준비하고, 이를 마우스에 면역화하였다.
For protein coomassie blue staining, concentrated proteins were diluted in a ratio of 1: 3 (vol: vol) with 4 X SDS (sodium dodecyl sulfate) sample loading buffer containing dithiothreitol. It was then denatured at 95 ° C for 5 min and resolved by 12% discontinuous SDS-PAGE. The separated proteins were visualized by staining with CBB (Coomassie Brilliant Blue) R-250. The approximate molecular weight of Gcf / AB was 34 kDa (Fig. 1B). The monomer fractions of the purified target proteins (Gcf / AB, Gcf / A, and Gcf / B) were each prepared and immunized with mice.

(4) 마우스 면역화 및 바이러스 공격 접종((4) mouse immunization and virus attack inoculation challengechallenge ))

6내지 7주령이고, 특정 병원체 부재인 암컷 BALB/c 마우스를 찰스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories, Orient Bio, Korea)에서 구입하였다. RSV G 중심 단편을 0일 및 14일 두 번에 걸쳐 마우스의 비강 내 또는 근육 내로 접종하였다.
Female BALB / c mice, 6 to 7 weeks of age and specific pathogen member, were purchased from Charles River Laboratories (Orient Bio, Korea). The RSV G center fragment was inoculated intranasally or intramuscularly in mice twice on days 0 and 14.

비강 면역화를 위하여, BALB/c 마우스(4/그룹)을 아이소플레인으로 흡입마취시키고 20 μg의 Gcf/AB, 10 μg의 Gcf/A, 10 μg의 Gcf/B, 또는 각 10 μg의 Gcf/A 및 Gcf/B가 혼합된 혼합물(20 μg, Gcf/A + Gcf/B)를 50μl PBS(pH 7.4)에 용해시켜 면역화하였다. Gcf/AB(34 kDa)의 분자량이 Gcf/A(17 kDa) 또는 Gcf/B(17 kDa)에 비해 두 배 가량 크기 때문에, 면역화하는 Gcf/AB의 양은 각 분자가 전달되는 Gcf/A 및 Gcf/B 각 분자와 동등한 분자수가 전달되도록 조절하였다. For nasal immunization, BALB / c mice (4 / group) were anesthetized with an iso-plane and anesthetized with 20 μg of Gcf / AB, 10 μg of Gcf / A, 10 μg of Gcf / And Gcf / B (20 μg, Gcf / A + Gcf / B) were dissolved in 50 μl PBS (pH 7.4) and immunized. Since the molecular weight of Gcf / AB (34 kDa) is twice as large as that of Gcf / A (17 kDa) or Gcf / B (17 kDa), the amount of Gcf / AB that immunizes is the amount of Gcf / A and Gcf / B < / RTI >

근육 내로 면역화하기 위하여, 마우스를 적절하게 누르고 대퇴근육에 주사기를 사용하여 주입하였다. 최종 면역화하고 3 내지 4주 후, 마우스에 비강 내 투여로 1×10⁶ PFU/RSV A2 마우스 또는 2 - 4 × 10⁶ PFU/KR/B/10-12 마우스로 공격 접종하였다. 모든 동물 실험은 이화여자대학교 동물윤리위원회의 승인을 받았다(승인 ID: 2010-9-4).
For immunization into the muscle, the mouse was pressed appropriately and injected into the femoral muscles using a syringe. After 3 to 4 weeks of final immunization, mice were challenged with 1 x 10 ⁶ PFU / RSV A2 or 2-4 x 10 ⁶ PFU / KR / B / 10-12 mice by intranasal administration. All animal experiments were approved by Ewha Womans University Animal Ethics Committee (approval ID: 2010-9-4).

(5) (5) ELISAELISA

면역화하고 2주 후, 면역화한 BALB/c 마우스의 레트로-오비탈 정맥(retro-orbital vein)으로부터 헤파린 처리된 모세관 튜브를 사용하여 혈액을 채취하였고, 1.5ml 마이크로 튜브에 수집하였다. 5,600rpm에서 20분간 원심분리한 다음, 혈청을 수집하였고, 사용 전까지 -20°C에서 보관하였다. RSV G에 특이적인 항체 역가는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 요약하면, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 20 mg/ml 스트렙타아비딘 (in PBS)을 웰 당 200ng이 되도록 밤새 코팅하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 PBST (0.05% tween 20 in PBS)으로 다섯 차례 세척하였고, 0.1% 무지방 우유에 포함된 PBS에 존재하는 바이오틴이 부착된 G 펩타이드 400ng을 해당하는 웰 위치에 첨가하고, 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 4시간 후 세척하고, 마우스 혈청을 1% 스킴-밀크/PBST에 1:64의 비율로 희석한 것을 2배 희석하여 캡쳐된 펩타이드를 포함하는 플레이트의 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 37°C에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 PBST로 5차례 세척하고, 1:1000 희석한 HRP(horseradish peroxidase)-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG (Abcam, Cambridge, UK) (in 1% skim-milk/PBST)로 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 5차례 세척하였고, 그 다음 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 퍼옥시다아제 기질 (KPL, Gaithersburg, MD)을 첨가하여 전개하였고, 상기 반응을 1M H3PO4로 중지시켰다. 그 다음, Thermo ELISA 플레이트 리더로 450nm에서 측정하였다.
Two weeks after immunization, blood was collected from retro-orbital vein of immunized BALB / c mice using a heparinized capillary tube and collected in 1.5 ml microtube. After centrifugation at 5,600 rpm for 20 minutes, serum was collected and stored at -20 ° C until use. Antibody titers specific for RSV G were measured using an ELISA. Briefly, 20 mg / ml streptavidin (in PBS) was coated overnight on a 96-well MaxiSorp plate (Nunc, Roskilde, Denmark) to a final concentration of 200 ng per well. The plate was then washed five times with PBST (0.05% tween 20 in PBS) and 400 ng of biotin-attached G peptide present in PBS in 0.1% non-fat milk was added to the corresponding wells, Lt; / RTI > at room temperature. After 4 hours, the mouse serum was diluted 1:64 in 1% Scheme-Milk / PBST at a ratio of 1: 64 and added to each well of the plate containing the captured peptide diluted 2-fold and incubated for 2 hours at 37 ° C Lt; / RTI > The plates were then washed five times with PBST and incubated for one hour with HRP (horseradish peroxidase) -conjugated anti-mouse IgG (Abcam, Cambridge, UK) (1% skim-milk / PBST) diluted 1: Lt; / RTI > The plates were washed five times, then developed by the addition of 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, Md.) And the reaction was stopped with 1M H3PO4. It was then measured at 450 nm with a Thermo ELISA plate reader.

(6) 폐 조직에서의 (6) RSVRSV 역가Potency (( titertiter ) 측정 ) Measure

바이러스 챌린지 4일 후, 희생시킨 마우스의 폐 조직에 10U/ml 헤파린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 PBS 5ml를 25-게이지 바늘을 장착한 주사기를 사용하여 우심실을 통하여 관류시켰고, MEM(Minimum Essential Medium) 3ml에서 균질화하였다. 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거한 다음, 70-μm 세포 스트레이너(BD Labware, Franklin Lakes, NJ)에 통과시켜 미세 물질을 제거하였다. 상등액은 10배 계열 희석하였고, SF-MEM을 사용하여 6-웰 플레이트에서 HEp-2 세포를 접종하기 위해 사용하였다. 15 내지 30분 마다 쉐이킹하며 37°C에서 접종하였고, 세포를 10% MEM/1% 아가로스 3 ml/웰로 덮었다. 4일 후, 1% 아가로스/MEM 용액에 포함된 Neutral Red 2ml을 각 웰에 첨가하였다. 24시간 추가적인 인큐베이션 후, 폐의 RSV 바이러스 역가를 살아있는 Neutral Red가 염색된 세포로 둘러싸인 희끄무레한 지역으로 나타나는 플라크를 계수함으로써 산정하였다. 상기 데이터는 폐 조직 그람(gram) 당 PFU로 표시하였고, 검출 한계값은 200 PFU/폐g였다.
Four days after the virus challenge, 5 ml of PBS containing 10 U / ml heparin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) was perfused through the right ventricle using a syringe equipped with a 25-gauge needle to the lung tissue of the sacrificed mice , And MEM (Minimum Essential Medium). Cell debris was removed by centrifugation and then passed through a 70-μm cell strainer (BD Labware, Franklin Lakes, NJ) to remove the fine material. The supernatant was diluted 10-fold and used to inoculate HEp-2 cells in 6-well plates using SF-MEM. Shaked every 15-30 minutes and inoculated at 37 ° C and cells were covered with 3 ml / well of 10% MEM / 1% agarose. After 4 days, 2 ml of Neutral Red contained in 1% agarose / MEM solution was added to each well. After 24 hours of additional incubation, the RSV viral titers of the lungs were estimated by counting plaques that appeared as whitish areas surrounded by living Neutral Red stained cells. The data were expressed as PFU per gram of lung tissue and the detection limit was 200 PFU / lung g.

(7) 통계 분석(7) Statistical analysis

통계 분석은 마이크로소프트 엑셀에 포함된 데이터 분석을 사용하여 수행하였다. 스튜던트 t-분포는 모든 분석에 사용하여 표시하였다. P <0.05인 경우, 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다 (*P < 0.05, **P < 0.01).
Statistical analysis was performed using data analysis included in Microsoft Excel. The Student's t-distribution was used for all analyzes. P <0.05 was considered statistically significant (* P <0.05, ** P <0.01).

실시예Example 2: 점막 또는 전신 면역에 의해 유도되는 2: induced by mucosal or systemic immunity RSVRSV A 아형에 대한 항체 반응 Antibody response to subtype A

RSV는 G 단백질의 중심(core) 비당화 부위에 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하고 있다. RSV A 바이러스 및 RSV B 바이러스에 감염된 인간 개체의 혈청을 사용하여 다양한 RSV G 에피토프에 대한 혈청 면역원성을 분석하였을 때, RSV G 단백질의 중심 보존된 부위에 대한 동형 및 아형 IgG 반응이 증가하는 것이 알려진 바 있다. 또한, 보호 면역반응이 기대되는 다양한 Gcf 단편들은 RSV A 및/또는 B의 보존된 B 세포 에피토프를 포함한다. B 세포 에피토프 중 하나인 펩타이드는 RSV G 단백질의 174번 내지 187번 아미노산 서열로 구성된다. RSV contains a CD4 + T cell epitope in the core unglycosylated region of the G protein. Analysis of serum immunogenicity against a variety of RSV G epitopes using sera from human subjects infected with the RSV A and RSV B viruses indicates that homologous and subtype IgG responses to centrally conserved regions of RSV G protein are increased There is a bar. In addition, the various Gcf fragments for which a protective immune response is expected include conserved B cell epitopes of RSV A and / or B. One of the B cell epitopes consists of the amino acid sequence 174 to 187 of the RSV G protein.

이에, RSV 바이러스뿐만 아니라 G 단백질의 중심 바당화 부분에 있는 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응 유발 여부를 조사하였다.Thus, we investigated the induction of the antibody response to the B cell epitope in the centralized portion of the G protein as well as the RSV virus.

구체적으로, 6주령의 BALB/c 마우스에 20 μg Gcf/AB, 10 μg Gcf/A, 10 μg Gcf/B, 또는 각 10 μg Gcf/A 및 10 μg Gcf/B의 혼합물을 비강 내 또는 근육 내 경로로 두 차례 면역화하였다(도 2a). 마지막 면역화 2주 후, 항원-특이적 IgG 항체 반응을 RSV A2 또는 RSV A2 G 174-187 펩타이드에 대한 ELISA로 측정하고, 그 결과를 도 2b 및 2c에 각각 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 재조합 아데노바이러스 기반의 RSV 백신인 rAd/3xG를 비강 내로 단일 투여한 경우, 강한 G-특이적 혈청 IgG 반응을 유발하며, RSV에 대한 보호 면역을 야기함을 확인한 바 있다(Yu et al., Journal of virology 82, 2350-2357). 따라서, rAd3XG로 면역화한 마우스의 혈청을 양성 대조군으로 사용하였다. Specifically, a mixture of 20 μg Gcf / AB, 10 μg Gcf / A, 10 μg Gcf / B, or each 10 μg Gcf / A and 10 μg Gcf / B was injected intranasally or intramuscularly into 6-week- (Fig. 2a). Two weeks after the last immunization, antigen-specific IgG antibody responses were measured by ELISA for RSV A2 or RSV A2 G 174-187 peptides, and the results are shown in Figures 2b and 2c, respectively. In addition, the present inventors have confirmed that a single administration of a recombinant adenovirus-based RSV vaccine, rAd / 3xG, intranasally induces a strong G-specific serum IgG response and induces protective immunity against RSV (Yu et al., Journal of virology 82, 2350-2357). Therefore, the serum of mice immunized with rAd3XG was used as a positive control.

그 결과, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, Gcf/A 및 Gcf/B를 모두 포함하는 Gcf/AB의 비강 내 또는 근육 내 면역화는 PBS 면역화 군에 비교하여 RSV A2 또는 RSV A2 G 174-187 펩타이드에 특이적인 항체 반응이 매우 높았다. 특히, Gcf/AB를 근육 내 투여한 경우, 비강 내 투여한 경우에 비하여 RSV A2 또는 RSV A2 G174-187 펩타이드에 특이적인 항체 반응이 조금 더 높은 결과를 보였다. As a result, as shown in FIGS. 2B and 2C, intranasal or intramuscular immunization of Gcf / AB, including both Gcf / A and Gcf / B, was significantly inhibited by RSV A2 or RSV A2 G 174-187 peptides Specific antibody response was very high. In particular, when Gcf / AB was administered intramuscularly, the antibody response specific to RSV A2 or RSV A2 G174-187 peptide was slightly higher than that of intranasal administration.

Gcf/A 및 Gcf/B를 혼합한 군(Gcf/A + Gcf/B 군)의 비강 내 또는 근육 내 면역화는 rAd3XG를 비강 내로 단일 면역화한 군과 비교하였을 때, RSV A2 바이러스 입자에 대한 유사한 항체 반응을 유도하였다. 그러나, Gcf/A + Gcf/B 군을 비강 내 투여한 경우, RSV A2 G 174-187 특이적 항체 반응을 매우 낮은 수준으로 유도하는 결과를 나타낸 반면, 근육 내 투여한 경우에서는 보통 수준의 항체 반응을 야기하였다. Intranasal or intramuscular immunization of Gcf / A and Gcf / B (Gcf / A + Gcf / B) group was similar to that of RSV A2 viral particles when compared to single intranasal rAd3XG The reaction was induced. However, intranasal administration of the Gcf / A + Gcf / B group resulted in a very low level of RSV A2 G 174-187 specific antibody response, while in the case of intramuscular administration, .

기존의 연구에 따르면, 20 μg의 Gcf/A를 콜레라 톡신 아쥬반트 유무와 관계 없이 설하, 비강 또는 근육 내 투여하여 면역화하였을 때, G 특이적 항체 반응이 유도될 수 있음이 알려졌다(Kim et al., PloS one 7, e32226). 그러나, 본 발명에 따르면, Gcf/A 또는 Gcf/B 단독을 10 μg의 양으로 비강 또는 근육 투여하는 것은 유의한 RSV A2 또는 RSV A2 G 174-187 펩타이드에 특이적인 항체 반응을 야기하지 못하는 결과를 보였다. Previous studies have shown that G-specific antibody responses can be induced when 20 μg of Gcf / A is immunized by sublingual, nasal, or intramuscular administration regardless of cholestatoxin adjuvant (Kim et al. , PloS one 7, e32226). However, according to the present invention, nasal or muscle administration of Gcf / A or Gcf / B alone in an amount of 10 [mu] g resulted in no significant antibody response to the significant RSV A2 or RSV A2 G 174-187 peptides .

상기 결과를 모두 종합하면, Gcf/A 및 Gcf/B를 융합 단백질 형태로 모두 포함하는 Gcf/AB를 비강 내 또는 근육 내 면역화하는 경우, 아쥬반트의 사용 없이도 RSV-A 아형-특이적 항체 반응을 전신에서 성공적으로 유도할 수 있음을 시사한다.
Taken together, these results suggest that, in the intranasal or intramuscular immunization of Gcf / AB containing both Gcf / A and Gcf / B in the form of fusion proteins, RSV-A subtype-specific antibody response Suggesting that it can be successfully induced in the whole body.

실시예Example 3: 점막 또는 전신 면역에 의해 유도되는 3: induced by mucosal or systemic immunity RSVRSV B 아형에 대한 항체 반응 Antibody response to subtype B

본 발명에 따른 Gcf/AB의 RSV B 아형에 대한 효능을 검증하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to verify the efficacy of the Gcf / AB of the present invention on RSV B subtypes, the following experiment was conducted.

구체적으로, 20 μg Gcf/AB, 10 μg Gcf/A, 10 μg Gcf/B, 또는 각 10 μg의 Gcf/A 및 Gcf/B의 혼합군(Gcf/A + Gcf/B)을 비강 내 또는 근육 내 면역화한 다음, RSV B1 또는 RSV B1 G 174-187 펩타이드에 대한 특이적 항체 반응 유발 여부를 조사하였다. 마지막 면역화 2주 후, 혈청에 포함된 항원-특이적 IgG 항체 역가를 ELISA로 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.Specifically, a mixed group of 20 μg Gcf / AB, 10 μg Gcf / A, 10 μg Gcf / B, or each 10 μg of Gcf / A and Gcf / B (Gcf / A + Gcf / B) After immunization, RSV B1 or RSV B1 G 174-187 peptides were tested for specific antibody response. Two weeks after the last immunization, the antigen-specific IgG antibody titer contained in the serum was measured by ELISA and the results are shown in FIG.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 대조군을 제외한 나머지 군의 경우, RSV B 아형-특이적 항체 반응이 효과적으로 유발되었다. 특히, 도 3b에 확인할 수 있듯, Gcf/A 및 Gcf/B를 융합 단백질 형태로 모두 포함하는 본 발명에 따른 Gcf/AB의 경우, 비강 내 또는 근육 내 면역화하는 경우, PBS 군에 비하여 RSV B1 또는 RSV B1 G 174-187에 특이적인 항체 반응이 가장 높은 결과를 나타내었다. As a result, as shown in Fig. 3A, RSV B subtype-specific antibody reaction was effectively induced in the other groups except for the control group. In particular, as shown in FIG. 3B, in the case of Gcf / AB according to the present invention which includes both Gcf / A and Gcf / B in the form of fusion protein, RSV B1 or The antibody response specific for RSV B1 G 174-187 was the highest.

반면, Gcf/A + Gcf/B 군의 경우, 비강 투여 또는 근육 투여군 모두 RSV B1 또는 RSV B1 G 174-187에 대한 낮은 혈청 IgG 항체 값을 나타내었다(도 3a 및 b). RSV CH18537 G 단백질의 131 내지 230 아미노산 잔기에서 유래한 RSV B Gcf의 경우, 2 μg의 CT (List Biological Lab. Inc. Campbell, CA)와 함께 설하 투여한 마우스한 마우스에서 RSV B 특이적 혈청 IgG를 높은 수준으로 나타내었다(Cheon, PloS one 9, e94269l, 2014). 그러나, 본 발명에 따르면 Gcf/B 백신화는 비강 내 또는 근육 내 투여 경로는 RSV B1 또는 RSV B1 G 174-187 펩타이드에 대한 항체 반응을 검출가능한 정도로 유도하지 못하였다. On the other hand, in the Gcf / A + Gcf / B group, both the nasal administration group and the muscle group showed low serum IgG antibody values against RSV B1 or RSV B1 G 174-187 (FIGS. For RSV B Gcf derived from the 131-230 amino acid residues of the RSV CH18537 G protein, RSV B specific serum IgG was detected in one mouse administered sublingually with 2 μg of CT (List Biological Lab, Inc. Campbell, CA) (Cheon, PloS one 9, e94269l, 2014). However, according to the present invention, the intranasal or intramuscular route of administration of Gcf / B vaccination failed to induce an antibody response to the RSV B1 or RSV B1 G 174-187 peptide to a detectable extent.

상기와 같은 결과를 종합하면, 접종 루트와 무관하게 본 발명에 따른 Gcf/AB의 면역화는 RSV B에 특이적인 항체 반응을 가장 강하게 유도함을 나타내는 것이다.
Taken together, these results indicate that immunization of Gcf / AB according to the present invention, regardless of the inoculation route, strongly induces an antibody response specific to RSV B.

실시예Example 4: 4: RSVRSV A2의 비강 내 공격 접종 후 보호 효과 확인 Confirmation of protection effect after intranasal attack of A2

점막 또는 전신 Gcf/AB 백신화가 RSV A2 바이러스에 대한 보호 효과를 유도할 수 있는지를 알아보기 위하여, 마지막 면역화를 한 지 4주 후, 면역화한 마우스에 RSV A2를 1 X 10⁶ PFU로 비강 내로 공격 접종하였다. 개별적인 마우스 폐의 바이러스 증식을 비교하기 위하여, 바이러스 증식이 정점에 이르는 공격 접종 4일 후(day 4 post-challenge)에 폐 균질 분쇄물을 준비하여, 이를 이용하여 플라크 어세이를 수행하였고, 그 결과를 도 4a에 나타내었다. To determine whether mucosal or systemic Gcf / AB vaccination could induce a protective effect against RSV A2 virus, four weeks after the last immunization, immunized mice were challenged intranasally with 1 x 10 ⁶ PFU of RSV A2 Respectively. To compare the virus proliferation of individual mouse lungs, a homogenous pulverized material was prepared on the day 4 post-challenge four days after the inoculation of the virus to the peak, and plaque assay was performed using the same Is shown in Fig. 4A.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, Gcf/AB 및 Gcf/A 면역화한 마우스의 폐 균질 분쇄물에서는 RSV 증식이 검출되지 않아, Gcf/AB 및 Gcf/A의 비강 내 또는 근육 내 면역화는 RSV A2 바이러스 감염에 대한 보호 효과가 우수함을 나타내었다. 또한, RSV 공격 접종 후 바이러스 양(viral load)은 Gcf/AB 또는 Gcf/A를 비강 및 근육 투여 경로로 두 번 면역화한 경우에는 3000배 이상 감소하는 결과를 나타내었다. 그러나, Gcf/B의 비강 또는 근육 투여는 바이러스 증식 감소를 가져오지 않았다.
As a result, RSV proliferation was not detected in the pulmonary homogenate of Gcf / AB and Gcf / A immunized mice, as shown in FIG. 4A, and intranasal or intramuscular immunization of Gcf / AB and Gcf / Indicating that the protective effect against virus infection is excellent. In addition, the viral load after RSV challenge decreased by more than 3000 times when Gcf / AB or Gcf / A was immunized twice with the nasal and muscular route. However, nasal or muscle administration of Gcf / B did not result in decreased virus proliferation.

몸무게 감소는 백신에 의한 면역 병리 현상의 기본적인 측정 방법이다. 따라서, RSV A2 바이러스 감염 후 Gcf/AB, Gcf/A, Gcf/B 및 Gcf/A + Gcf/B 투여 군의 몸무게를 매일 측정하였고, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.Weight reduction is a fundamental measure of the immunological pathogenesis of vaccines. Therefore, the body weights of Gcf / AB, Gcf / A, Gcf / B and Gcf / A + Gcf / B groups were measured daily after RSV A2 virus infection and the results are shown in FIG.

그 결과, Gcf/AB 또는 Gcf/A 면역 마우스의 경우, RSV A2 바이러스 공격 후에도 유의적인 몸무게 감소가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 아쥬반트를 포함하지 않는 경우에도 Gcf/AB 백신화가 효과적으로 보호 면역을 제공함을 시사하는 결과이다.
As a result, in the case of Gcf / AB or Gcf / A immunized mice, no significant weight loss was observed after the RSV A2 virus attack. These results suggest that Gcf / AB vaccination effectively provides protective immunity even without adjuvant.

실시예Example 5: 5: RSVRSV B 아형에 속하는 Belonging to the B subtype KRKR /B/10-12로 비강 내 공격 접종 후 보호 효과 확인/ B / 10-12 to confirm the protective effect after intranasal inoculation

RSV는 이의 단백질의 항원 속성(antigenic properties)에 따라 RSV A 및 B의 두 가지 아형으로 분류되며, 많은 경우, 두 아형 모두가 입원한 영아 및 노년층에서 순환하는 것으로 알려져 있다. 따라서, RSV B 바이러스 감염에 대한 보호 면역을 조사하기 위하여 Gcf/AB, Gcf/A+ Gcf/B, Gcf/A, 또는 Gcf/B를 비강 및 근육 투여 경로로 0일 및 14일에 두 차례 면역화하였고, RSV-B 아형에 속하는 RSV KR/B/10-12를 2 또는 4 X 10⁶ PFU로 비강 내 접종하였다. RSV is classified into two subtypes of RSV A and B, depending on the antigenic properties of its protein. In many cases, both subtypes are known to circulate in hospitalized infants and elderly people. Thus, to investigate protective immunity against RSV B virus infection, Gcf / AB, Gcf / A + Gcf / B, Gcf / A, or Gcf / B were immunized twice on days 0 and 14 with the nasal and muscular route , RSV KR / B / 10-12 belonging to the RSV-B subtype were intranasally inoculated with 2 or 4 X 10 ⁶ PFU.

RSV KR/B/10-12 분리균은 한국의 소아 환자의 비인두 시료로부터 수집하였고, Hep-2 세포주에 적용하였다. 상기 기술한 바와 같이, 폐 균질 분쇄물을 공격 접종 4일 후에 준비하였고, 이를 이용하여 바이러스 플라크 어세이를 수행하여 그 결과를 도 5a에 나타내었다.RSV KR / B / 10-12 isolates were collected from nasopharyngeal samples from pediatric patients in Korea and applied to Hep-2 cell lines. As described above, the homogenized pulverized material was prepared 4 days after the inoculation of the vaccine, and the viral plaque assay was carried out using the same. The results are shown in FIG. 5A.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 비강 및 근육 투여 경로로 Gcf/AB로 두 차례 면역화한 폐에서 RSV KR/B/10-12 접종한 후 바이러스 양(viral load)이 1400배 이상 감소한 결과를 나타내었다. 반면, Gcf/A, Gcf/A + Gcf/B 군의 경우, 비강 내 면역화한 경우 각각 약 73% 및 74%까지 감소하였고, 근육 내 면역화한 경우 각각 60% 및 63%까지 감소하여, 상기 군의 경우 부분적인 보호 효과만을 나타낼 뿐이었다.As a result, as shown in FIG. 5A, the viral load decreased more than 1,400 times after RSV KR / B / 10-12 inoculation in the lungs twice immunized with Gcf / AB through the nasal and muscular administration route Respectively. On the other hand, in the case of Gcf / A and Gcf / A + Gcf / B, it decreased to about 73% and 74% when intranasally immunized, and decreased to 60% and 63% Only partial protective effects were shown.

또한, Gcf/B 단독 투여군(비강 내 또는 근육 내 면역화)의 경우, 바이러스 증식을 유의하게 감소시키지 못하는 결과를 나타내었다. In addition, the Gcf / B alone group (intranasal or intramuscular immunization) did not significantly reduce the virus proliferation.

또한, RSV KR/B/10-12 바이러스 감염한지 4일 후 상기 모든 군의 몸무게를 매일 측정하였고, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.In addition, after 4 days of RSV KR / B / 10-12 virus infection, the weights of all the above groups were measured daily and the results are shown in FIG. 5B.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 상기 모든 군에서 유의한 몸무게 변화는 나타내지 않았다.As a result, as shown in FIG. 5B, no significant weight change was shown in all the groups.

상기 결과를 모두 종합하면, 본 발명에 따른 Gcf/AB의 점막 및 전신 백신화는 RSV B 바이러스 공격 접종에 대한 보호 효과를 나타냄을 시사하는 것으로, 특히 아쥬반트와 같은 백신 강화 면역병리 없이도 우수한 보호 효과를 나타냄을 시사하였다.
Taken together, these results suggest that the mucosal and systemic vaccination of Gcf / AB according to the present invention shows a protective effect against the RSV B virus attack inoculation, and in particular, it shows excellent protection without vaccine-enhanced immunopathies such as adjuvant .

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art to which the present invention pertains that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being covered by the scope of the present invention, rather than the above detailed description, and all changes or modifications derived from the equivalents thereof will be included in the scope of the present invention.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Respiratory syncytial virus universal vaccine <130> KPA140780-KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 298 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus A <400> 1 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe 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cacgaccaca 720 gaaagagaca ccagcacctc acaatccact gtgctcgaca caaccacatt agaacacaca 780 atccaacagc aatccctcca ctcaaccacc cccgaaaaca cacccaactc cacacaaaca 840 cccacagcat ccgagccctc tacatcaaat tccacccaaa atacccaatc acatgcttag 900 900 <210> 5 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> RSVA Gcf (131-230 of RSVA G protein) <400> 5 Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp 20 25 30 Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn 35 40 45 Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro 50 55 60 Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr 65 70 75 80 Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu Val Pro 85 90 95 Thr Thr Lys Pro 100 <210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> RSV B Gcf (129-231 of RSV B G protein) <400> 6 Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Thr Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn 1 5 10 15 Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Leu Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 35 40 45 Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Ser Ser Asn 50 55 60 Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr 65 70 75 80 Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Thr Thr Lys 85 90 95 Lys Glu Thr Thr Thr Asn Pro 100 <210> 7 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gcf / AB fusion protein <400> 7 Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp 20 25 30 Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn 35 40 45 Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro 50 55 60 Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr 65 70 75 80 Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu Val Pro 85 90 95 Thr Thr Lys Pro Lys Leu Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Thr Thr 100 105 110 Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Leu Lys Asn 115 120 125 Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe 130 135 140 Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys 145 150 155 160 Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro 165 170 175 Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr 180 185 190 Pro Ala Lys Thr Thr Lys Lys Glu Thr Thr Thr Asn Pro 195 200 205 <210> 8 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gcf / AB fusion protein <400> 8 gtcaagacca aaaacacaac aacaactcaa acacaaccca gcaagcccac cacaaaacaa 60 cgccaaaaca aaccaccaag caaacccaat aatgattttc actttgaagt gttcaacttt 120 gtaccctgca gcatatgcag caacaatcca acctgctggg ctatctgcaa aagaatacca 180 aacaaaaaac caggaaagaa aaccactacc aagcccacaa aaaaaccaac cctcaagaca 240 accaaaaaag atcccaaacc tcaaaccact aaatcaaagg aagtacccac caccaagccc 300 aagcttacaa ccgcccagac caagggcaga accacaacca gcacccagac caacaagccc 360 agcaccaagc ccagactgaa gaaccctccc aagaagccca aagacgacta ccacttcgag 420 gtgttcaact tcgtgccctg cagcatctgc ggcaacaacc agctgtgcaa gagcatctgc 480 aagaccatcc ccagcaacaa gcccaagaag aaacccacca tcaagcccac caacaagccc 540 acaaccaaga ccacaaacaa gagagacccc aagacccccg ccaagacaac aaagaaagag 600 acaaccacaa acccc 615 <210> 9 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gcf / AB fusion protein <400> 9 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Ile Arg Ile Pro 1 5 10 15 Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro 20 25 30 Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp 35 40 45 Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn 50 55 60 Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro 65 70 75 80 Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr 85 90 95 Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu Val Pro 100 105 110 Thr Thr Lys Pro Lys Leu Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Thr Thr 115 120 125 Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Leu Lys Asn 130 135 140 Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe 145 150 155 160 Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys 165 170 175 Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro 180 185 190 Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr 195 200 205 Pro Ala Lys Thr Thr Lys Lys Glu Thr Thr Thr Asn Pro Leu Glu His 210 215 220 His His His His His 225 <210> 10 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gcf / AB fusion protein <400> 10 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcggatcc gaattcccgt caagaccaaa 60 aacacaacaa caactcaaac acaacccagc aagcccacca caaaacaacg ccaaaacaaa 120 ccaccaagca aacccaataa tgattttcac tttgaagtgt tcaactttgt accctgcagc 180 atatgcagca acaatccaac ctgctgggct atctgcaaaa gaataccaaa caaaaaacca 240 ggaaagaaaa ccactaccaa gcccacaaaa aaaccaaccc tcaagacaac caaaaaagat 300 cccaaacctc aaaccactaa atcaaaggaa gtacccacca ccaagcccaa gcttacaacc 360 gcccagacca agggcagaac cacaaccagc acccagacca acaagcccag caccaagccc 420 agactgaaga accctcccaa gaagcccaaa gacgactacc acttcgaggt gttcaacttc 480 gtgccctgca gcatctgcgg caacaaccag ctgtgcaaga gcatctgcaa gaccatcccc 540 agcaacaagc ccaagaagaa acccaccatc aagcccacca acaagcccac aaccaagacc 600 acaaacaaga gagaccccaa gacccccgcc aagacaacaa agaaagagac aaccacaaac 660 cccctcgagc accaccacca ccaccactga 690 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 aaaagcttac aaccgcccag acc 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ccctcgaggg ggtttgtggt tgtt 24 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 taatacgact cactatagg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tatttaggtg acactatag 19

Claims

A respiratory syncytial virus vaccine composition comprising, as an active ingredient, a fusion protein of a respiratory syncytial virus (RSV) A subtype Gcf protein (RSV G protein core fragment) and a respiratory syncytia B subtype Gcf protein.

The vaccine composition of claim 1, wherein the vaccine composition has a protective immunity against RSV A and B, even when the vaccine composition does not contain adjuvant and is composed of a fusion protein.

The respiratory syncytial virus vaccine composition of claim 1, wherein the Gcf protein of the respiratory syncytial virus A subtype of the fusion protein and the Gcf protein of the respiratory syncytial virus B subtype are linked to each other by a linker.

7. The composition of claim 1, wherein said fusion protein further comprises a protein tag at its N-terminus, C-terminus, or both.

The respiratory syncytial virus vaccine composition according to claim 1, wherein the Gcf protein of the respiratory syncytial virus A subtype is represented by SEQ ID NO: 5.

The respiratory syncytial virus vaccine composition of claim 1, wherein the Gcf protein of the respiratory syncytial virus B subtype is represented by SEQ ID NO: 6.

The vaccine composition of claim 1, wherein the fusion protein comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 9.

The respiratory syncytial virus vaccine composition of claim 1, wherein the respiratory syncytial virus vaccine composition exhibits both a protective immunity effect against the RSV A subtype and the RSV B subtype.

The respiratory syncytial virus vaccine composition of claim 1, wherein the respiratory syncytial virus vaccine composition further comprises an adjuvant.

10. The composition of claim 9, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of cholorotoxins, aluminum hydroxides, carbopol, mineral oils, and biodegradable oils.

2. The vaccine composition of claim 1, wherein the vaccine composition is for mucosal or intramuscular administration.

A fusion protein of the RSV G protein core fragment of the respiratory syncytial virus (RSV) A of SEQ ID NO: 5 and the Gcf protein of the respiratory syncytia B subtype of SEQ ID NO: 6.

13. The fusion protein of claim 12, wherein the fusion protein further comprises a protein tag at its N-terminus, C-terminus, or both.

13. The fusion protein of claim 12, wherein the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 9.

A polynucleotide encoding the fusion protein of claim 12.

16. An expression vector comprising the polynucleotide of claim 15.

A transformant, excluding human, comprising the expression vector of claim 16.