KR20160038392A - Preparation method of proteomic silica capillary column and proteomic silica capillary column obtained thereby - Google Patents

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Abstract

The present invention provides a method for manufacturing a silica capillary column, comprises: attaching a double-bonded ligand to an inner wall of a silica capillary (step 1); manufacturing a polymerization mixture by dissolving a monomer mixture including a functional monomer, a cross-linked monomer, a pore inducing substance with a molecular weight range of 4,000 to 40,000, and a polymerization initiator in a mixed solvent consisting of a hydrogen binding solvent and a a non-hydrogen binding solvent (step 2); filling the silica capillary with a manufactured polymerization mixture (step 3); polymerizing by sealing both ends of the silica capillary filled with the polymerization mixture and heating the silica capillary (step 4); and cleaning the silica capillary after completing the polymerization (step 5). According to the present invention, the silica capillary column where a macromolecule thin film is formed on an inner wall surface of silica tubing to have proper pores has excellent manufacture reproducibility, and the most excellent separation efficiency is shown with respect to separation analysis of a proteomic sample (protein hydrolysis product) in a field of capillary electrochromatography (CEC) up to the present time. Furthermore, since a thin film, which is very easily be cleaned, is generated, the silica capillary column can be used as a high efficiency proteomic CEC column which can be produced in large quantities.

Description

실리카 모세관으로 된 프로테오믹 컬럼의 제조방법 및 상기 제조방법으로 얻어진 프로테오믹 실리카 모세관 컬럼{Preparation method of proteomic silica capillary column and proteomic silica capillary column obtained thereby}The preparation method of the proteomic silica capillary column and the proteomic silica capillary column obtained by the above-mentioned method and the method of preparing the proteomic silica capillary column obtained by the above-

본 발명은 실리카 모세관으로 된 프로테오믹 컬럼의 제조방법 및 상기 제조방법으로 얻어진 프로테오믹 실리카 모세관 컬럼에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a proteomic column made of silica capillary tube and a proteomic silica capillary column obtained by the above-described method.

액체크로마토그래피(liquid chromatograohy)는 복잡한 혼합물로 이루어진 시료의 분리분석에 많이 사용되며, 특히 실리카 모세관을 활용하여 만드는 방법이 많은 연구의 대상이 되고 있다. Liquid chromatography (Liquid Chromatography) is widely used for the separation and analysis of complex mixtures, especially silica capillary.

최근 실리카 마이크로컬럼은 컬럼 전체가 프릿 기능을 동시에 가지는 모노리트형 컬럼으로 신속히 발전하고 있다. 몇 편의 총설 논문(Vissers 등, J. Chromatogr. A, 1999, 856, 117-143; Jinno 등, Trends in Analytical Chemistry, 2000, 19, 664-675; Bartle 등, J. Chromatogr. A, 2000, 892, 279-290)에 그 내용이 상세히 소개되고 있고, 또한 이에 관련된 다양한 특허도 나타나고 있다.
Recently, silica microcolumns have rapidly developed into monolithic columns having the entire frit function simultaneously. Bartle et al., J. Chromatogr. A, 2000, 892 (1982), in a number of general papers (Vissers et al., J. Chromatogr. A, 1999, 856, 117-143; Jinno et al., Trends in Analytical Chemistry, 2000, 19, 664-675; , 279-290), and various patents related thereto are also presented.

마이크로컬럼 또는 모세관 전기 크로마토그래피 컬럼용 모노리트는 무기고분자형과 유기고분자형 두 가지가 있으며, 일반적으로 모노머 혼합물과 중합촉매, 그리고 생성 고분자를 녹이지 않는 용매(porogen)를 섞어서 용액을 만들고 이를 관 안에 넣은 다음 온도를 올리는 등의 방법으로 중합을 진행시키고, 마지막으로 용매와 미반응 모노머를 씻어냄으로써 제작한다.
Monoliths for microcolumns or capillary electrochromatography columns have two types of inorganic polymers and organic polymers. Generally, a monomer mixture, a polymerization catalyst, and a porogen that does not dissolve the produced polymer are mixed to form a solution. And then the polymerization is carried out by raising the temperature or the like, and finally, the solvent and the unreacted monomer are washed away.

무기고분자형 모노리트는 실리카 형이 주종을 이루고 있으며(Bartle 등, J. Chromatogr. A, 2000, 892, 279-290; Tang 등, J. High Resolut. Chromatogr., 2000, 23, 73), 유기고분자형은 스티렌-디비닐벤젠(styrene-divinylbenzene)계 공중합체(Gusev 등, J. Chromatogr. A, 1999, 855, 273-290), 메타크릴레이트(methacrylate)계 공중합체(Peters 등, Anal. Chem., 1988, 70, 2296; Coufal 등, J. Chromatogr. A., 2002, 946, 99-106), 아크릴아미드(acrylamide)계 공중합체(Fujimoto 등, J. Chromatogr. A., 1995, 716, 107; Hoegger 등, J. Chromatogr. A., 2001, 914, 211-222) 등이 있다.
Inorganic polymeric monoliths are predominantly of the silica type (Bartle et al., J. Chromatogr. A, 2000, 892, 279-290; Tang et al., J. High Resolut. Chromatogr., 2000, The polymer type may be a styrene-divinylbenzene copolymer (Gusev et al., J. Chromatogr. A, 1999, 855, 273-290), a methacrylate copolymer (Peters et al., Anal. A. Chromatogr. A., 2002, 946, 99-106), an acrylamide-based copolymer (Fujimoto et al., J. Chromatogr. A., 1995, 716 , 107, Hoegger et al., J. Chromatogr. A., 2001, 914, 211-222).

모세관 전기이동법(capillary electrophoresis, CE) 또는 모세관 전기이동 크로마토그래피(capillary electrochromatography, CEC)는 그 뛰어난 크로마토그래피 분리효율로 잘 알려져 있다. 모세관 전기이동법의 단점은 중성분자들을 분리할 수 없다는 것과 주입할 수 있는 시료의 양에 제한이 있다는 것인데, 이러한 문제점들은 정지상을 도입하는 방법(모세관 전기이동 크로마토그래피)에 의하여 극복되었다. 그러므로 모세관 전기이동 크로마토그래피는 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatograph, HPLC)의 용질분배 기능과 모세관 전기이동법의 높은 분리효율을 결합시킨 유망한 방법이다.
Capillary electrophoresis (CE) or capillary electrochromatography (CEC) is well known for its excellent chromatographic separation efficiency. The disadvantage of capillary electrophoresis is that it is unable to separate neutral molecules and there is a limit on the amount of sample that can be injected. These problems have been overcome by a method of introducing a stationary phase (capillary electrophoresis chromatography). Therefore, capillary electrophoresis chromatography is a promising method that combines the solubilization function of high performance liquid chromatograph (HPLC) with the high separation efficiency of capillary electrophoresis.

분자각인고분자(molecule imprinted polymer, MIP) 기술은 3차원적인 가교고분자로 구성된 유기모노리트 골조에 기공 유도물질(각인분자)를 삽입시키는 기술이다. 즉 기공 유도물질을 기능성모너머, 가교모노머, 중합개시제로 이루어진 모노머 혼합물과 함께 중합용매에 녹여 가열하면 모노리트 구조의 고분자가 생성되는데, 추후 기공 유도물질를 세척하여 제거하면 이 고분자는 그 기공 유도물질의 빈 공간을 영구적으로 내포하게 된다. Molecular imprinted polymer (MIP) technology is a technique for inserting porosity inducing substances (imprinted molecules) into an organic monolith frame composed of three-dimensionally crosslinked polymers. That is, if the pore inducing substance is dissolved in a polymerization solvent together with a monomer mixture composed of a functional moiety, a crosslinking monomer and a polymerization initiator, a monolithic polymer is produced. If the pore inducing substance is subsequently washed and removed, Which is permanently implanted.

분자각인 고분자의 분자인식 능력은 고성능 액체크로마토그래피와 모세관 전기이동 크로마토그래피 분야에서 널리 활용되고 있다. 분자각인 고분자 - 모세관 전기이동 크로마토그래피(MIP-CEC)의 다양한 기술은 몇 개의 총설 논문(P. Spegel 등, Electrophoresis 2003, 24, 3892; C. Liu 등, Electrophoresis 2004, 25, 3997; Z. Liu, 등, Electrophoresis 2007, 28, 127)에 잘 소개되어 있다.
Molecular recognition of molecular imprinted polymers is widely used in high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis chromatography. A variety of techniques of molecular imprinted polymer-capillary electrophoretic chromatography (MIP-CEC) have been described in several general papers (P. Spegel et al., Electrophoresis 2003, 24, 3892; C. Liu et al., Electrophoresis 2004, 25, 3997; Z. Liu , Et al., Electrophoresis 2007, 28, 127).

특히 열린구조형(open tubular, OT) 분자각인 고분자 - 모세관 전기이동 크로마토그래피(OT MIP-CEC)가 낮은 컬럼 압력과 안정한 전기삼투흐름(elctroosmotic flow) 등의 장점으로 인하여 관심을 받고 있다. OT MIP-CEC는 Bruggermann 등의 연구(O. Bruggermann 등, J. Chromatogr. A 1997, 781, 43)에서 처음 소개되었으며, 그 후에도 몇몇 연구(Z.J. Tan 등, Electrophoresis 1998, 19, 2055; L. Schweitz 등, Anal. Chem. 2002, 74, 1192; Y. Huang 등, Electrophoresis, 2004, 25, 554-561)에서 명맥을 유지해왔다.In particular, open-tubular (OT) molecular imprinted polymer-capillary electrophoretic chromatography (OT MIP-CEC) is of interest due to its advantages such as low column pressure and stable electro-osmotic flow. OT MIP-CEC was first introduced in Bruggermann et al. (O. Bruggermann et al., J. Chromatogr. A 1997, 781, 43), and thereafter several studies (ZJ Tan et al., Electrophoresis 1998, 19, 2055; L. Schweitz Et al., Anal. Chem. 2002, 74, 1192; Y. Huang et al., Electrophoresis, 2004, 25, 554-561).

그러나 분자각인 고분자 기술을 고분자 내 동공(pore)을 생성하려는 목적으로 사용한 경우는 아직 보고되고 있지 않았다.
However, the use of molecular imprinted polymer technology for the purpose of generating pores in polymer has not been reported yet.

프로테오믹스는 단백질의 발현, 단백질 기능 및 변이, 단백질의 구조, 그리고 단백질 간 상호작용 등을 분석하여 복잡한 생물학적 시스템을 연구하는 학문으로서, 단백질의 구조 분석이 그 주요 연구 수단이 된다. Proteomics is a study of complex biological systems by analyzing protein expression, protein function and mutation, protein structure, and protein interactions. Protein structure analysis is the main research tool.

전통적 프로테오믹스 전략은 세포별 또는 세포내 소기관 별로 분별해 모으기, 고체상 추출 등을 거쳐 단백질 농축하기, 이차원 폴리아미드 겔 전기영동 (2-dimensional polyamide gel electrophoresis, 2-D PAGE)으로 평면상에 점군으로 분리하기, 그리고 각 점군에 대하여 MALDI-TOF MS 또는 LC-MS-MS로 분석하기 등의 단계를 거치게 된다.
Conventional proteomics strategies are divided into two groups, one is cell sorting and the other is intracellular organelles, the other is protein concentration through solid phase extraction, the two-dimensional polyamide gel electrophoresis (2-D PAGE) And then analyzed by MALDI-TOF MS or LC-MS-MS for each point group.

프로테오믹 분석에는 크게 하향식 (top-down) 과 상향식 (bottom-up 또는 shot gun)의 두 가지 방법이 있다. 하향식은 원 단백질 또는 큰 단백질 조각들에 대한 질량분석법의 분석을 행하는 것이고, 상향식은 단백질 시료를 소화시켜 생성되는 펩티드를 LC-MS 또는 LC-MS-MS 등으로 분석하는 것이다. There are two major approaches to proteomic analysis: top-down and bottom-up or shot gun. Top-down analysis is the mass spectrometry analysis of the original proteins or large protein fragments, and bottom-up analysis is the LC-MS or LC-MS-MS analysis of peptides produced by digesting protein samples.

액체크로마토그래피는 하향식 프로테오믹스에서 시료 준비나 성분별 분할 업무에서 중요하게 쓰이고, 또 상향식 프로테오믹스에서도 소화된 생성 펩티드들의 분리분석에 강력한 수단으로 쓰이기 때문에, 매우 결정적인 역할을 담당 해왔다. Liquid chromatography has played a very decisive role in top-down proteomics because it is important in sample preparation and component partitioning, and also as a powerful tool in the segregation analysis of digested peptides in bottom-up proteomics.

또한 액체크로마토그래피에서 더 좋은 분리성능을 얻으려는 것은 오래 지속되어온 요구 사항으로써, 전형적으로 입자크기 3 마이크론의 C18 정지상으로 충전된 마이크로 또는 나노 컬럼은 상당히 우수한 분리성능을 보여주긴 하지만, 컬럼에 걸리는 높은 압력으로 인하여 컬럼 길이가 대개 20cm 이하로 제한되기 때문에, 컬럼 전체의 분리효율(이론단수)은 그다지 높지 못하였다. It is also a long-standing requirement to achieve better separation performance in liquid chromatography, typically with a particle size of 3 microns C 18 Although stationary phase micro or nano-columns exhibit fairly good separation performance, the separation efficiency (theoretical plate number) of the entire column is not very high because the column length is usually limited to 20 cm or less due to the high pressure applied to the column .

컬럼의 분리효율을 높이는 한 가지 방법으로는, 컬럼의 길이를 연장하는 것이다. 이는, 컬럼의 압력도 증가하기 때문에 열린 구조형 컬럼을 만드는 것이 유력한 방법이다. 실제로 이러한 포맷의 LC 컬럼이 개발되어 기울기 용리 형태로 질량분석기에 연결되어 프로테오믹스 연구에 활용되었다.One way to increase separation efficiency of a column is to extend the length of the column. This is a viable way to make an open structured column because the pressure of the column also increases. In fact, LC columns of this format have been developed and linked to mass spectrometry in the form of gradient elution, which has been utilized in the study of proteomics.

내경이 10 마이크론 정도이고, 길이가 3-5 미터 정도 되는 다공성막 열린구조형 (porous layer open tubular) 컬럼이 사용되어왔으나, 열린구조형 컬럼을 쓸 때 내경에 걸쳐 나타나는 포물선형 유속 분포 때문에 유발되는 띠나비 넓힘을 최소화하기 위하여 그와 같은 좁은 내경의 컬럼이 필요하였다. 이러한 컬럼의 실용적인 유용성은 의심을 받고 있는데, 컬럼의 제조나 사용 시에 컬럼이 막혀서 못쓰게 될 위험이 너무 크기 때문이다. Porous layer open tubular columns having an inner diameter of about 10 microns and a length of about 3 to 5 meters have been used, but when using an open structured column, a band- Such a narrow inner diameter column was needed to minimize the spreading. The practical utility of these columns is questionable, as there is a great risk that the columns will become clogged during manufacture or use of the column.

상기한 문제를 해결하기 위하여 모세관 전기이동 크로마토그래피(CEC)가 LC 대신 사용될 수 있다. 이 경우에는 모세관 내경에 걸쳐 균일 유속 분포를 보이기 때문에, 더 내경이 넓고 (50 마이크론 정도) 길이가 짧은 (50cm 정도) 컬럼으로도 좋은 분리효율을 얻을 수 있으며, 컬럼 제조나 사용 시에 컬럼이 막히는 문제도 해결할 수 있다. 프로테오믹 분석에 있어서 CEC의 사용은 꾸준히 늘고 있으며, 이에 대한 몇 편의 총설 논문도 출판되었다 (Ka등 , Electrophoresis 2012, 33, 48-73; El Rassi 등, Electrophoresis 2010, 31, 174-191; Nilsson 등, Electrophoresis 2011, 32, 1141-1147; Sun 등, Proteomics 2014, 14, 622-628.) Capillary electrophoresis chromatography (CEC) can be used instead of LC to solve the above problems. In this case, since a uniform flow rate distribution is shown over the capillary inner diameter, good separation efficiency can be obtained even with a column having a larger inner diameter (about 50 microns) and a shorter length (about 50 cm) Problems can also be solved. The use of CECs in proteomic analysis is steadily increasing, and several review papers have also been published (Ka et al., Electrophoresis 2012, 33, 48-73; El Rassi et al., Electrophoresis 2010, 31, 174-191; Nilsson Et al., Electrophoresis 2011, 32, 1141-1147; Sun et al., Proteomics 2014, 14, 622-628.)

프로테오믹 분석에서 최고수준의 분리효율은 열린 구조형 모세관 전기 크로마토그래피(open tubular capillary electrochromatography, OT-CEC)에서 얻어졌다.(Karenga 등, J. Sep. Sci. 2008, 31, 2677-2685).The highest level of separation efficiency in proteomic analysis was obtained from open tubular capillary electrochromatography (OT-CEC) (Karenga et al., J. Sep. Sci. 2008, 31, 2677-2685).

한편, 열린 구조형 정지상을 제조하는데 따르는 기술이 보편적으로 확립되지 않아서 현재 OT-CEC 방법이 많이 사용되고 있지는 못하다.
On the other hand, OT-CEC method is not widely used because the technology for manufacturing open structured stationary phase is not universally established.

또한 본 발명자가 속한 연구실에서는 분자각인고분자 기술을 이용하여 OT-CEC 컬럼을 만드는 안정적인 기술을 개발하였고 이를 기공 유도물질의 이성체 분리에 활용하여 매우 분리효율이 높은 결과를 얻었으며, (Zaidi 등, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 2947-2952; Zaidi 등, Electrophoresis 2009, 30, 1603-1607; Zaidi 등, Electrophoresis 2010, 31, 1019-1028; Zaidi 등, J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 1291-1299), 이에 대한 기술도 대한민국 등록특허 10-1012189에 개시된바 있다.
In the laboratory of the present inventor, a stable technique for producing an OT-CEC column using molecular imprinted polymer technology was developed. The result was highly efficient in separating isomers of pore-inducing materials (Zaidi et al., J Zaidi et al., J. Chromatogr. A, 2011, 1218, " Electrophoresis 2009, 30, 1603-1607; Zaidi et al., Electrophoresis 2010, 31, 1019-1028; 1291-1299), and a technique therefor is also disclosed in Korean Patent No. 10-1012189.

본 발명에서는 적절한 분자량을 가지는 고분자를 기공 유도물질로 쓰는 방법으로, 상기 연구의 분자각인 고분자 기술을 동공(pore)생성이라는 목적으로 활용하고, 반응용액의 조성을 적절하게 변형하여 프로테오믹 시료의 분리분석에 유용한 OT-CEC 컬럼을 개발하였다.
In the present invention, by using a polymer having an appropriate molecular weight as a pore inducing material, the molecular imprinting technique of the above-mentioned study is utilized for the purpose of producing pores, and the composition of the reaction solution is appropriately modified to separate the proteomic sample OT-CEC columns useful for analysis have been developed.

특허문헌 1: 대한민국 등록특허 제 10-1012189호Patent Document 1: Korean Patent No. 10-1012189

비특허문헌 1: Zaidi 등, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 2947-2952Non-Patent Document 1: Zaidi et al., J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 2947-2952 비특허문헌 2: Zaidi 등, Electrophoresis 2009, 30, 1603-1607Non-Patent Document 2: Zaidi et al., Electrophoresis 2009, 30, 1603-1607 비특허문헌 3: Zaidi 등, J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 1291-1299Non-Patent Document 3: Zaidi et al., J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 1291-1299 비특허문헌 4: Karenga 등, J. Sep. Sci. 2008, 31, 2677-2685Non-Patent Document 4: Karenga et al., J. Sep. Sci. 2008, 31, 2677-2685 비특허문헌 5: Ka등 , Electrophoresis 2012, 33, 48-73Non-Patent Document 5: Ka et al., Electrophoresis 2012, 33, 48-73 비특허문헌 6: Nilsson 등, Electrophoresis 2011, 32, 1141-1147Non-Patent Document 6: Nilsson et al., Electrophoresis 2011, 32, 1141-1147 비특허문헌 7: El Rassi 등, Electrophoresis 2010, 31, 174-191 Non-Patent Document 7: El Rassi et al., Electrophoresis 2010, 31, 174-191 비특허문헌 9: Sun 등, Proteomics 2014, 14, 622-628Non-Patent Document 9: Sun et al., Proteomics 2014, 14, 622-628 비특허문헌 10: O. Bruggermann 등, J. Chromatogr. A 1997, 781, 43Non-patent document 10: O. Bruggermann et al., J. Chromatogr. A 1997, 781, 43 비특허문헌 11: Z.J. Tan 등, Electrophoresis 1998, 19, 2055; L. Non-Patent Document 11: Z.J. Tan et al., Electrophoresis 1998, 19, 2055; L. 비특허문헌 12 : Schweitz 등, Anal. Chem. 2002, 74, 1192Non-patent document 12: Schweitz et al., Anal. Chem. 2002, 74, 1192 비특허문헌 13: Y. Huang 등, Electrophoresis, 2004, 25, 554-561Non-Patent Document 13: Y. Huang et al., Electrophoresis, 2004, 25, 554-561

본 발명의 목적은 실리카 모세관으로 된 프로테오믹 컬럼의 제조방법 및 상기 제조방법으로 얻어진 프로테오믹 실리카 모세관 컬럼을 제공하는 데 있다.
It is an object of the present invention to provide a method for producing a proteomic column made of a silica capillary tube and a proteomic silica capillary column obtained by the above method.

상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,

본 발명은  The present invention

실리카 모세관 내벽에 이중결합 리간드를 부착시키는 단계(단계 1):Attaching a double bond ligand to the inner wall of the silica capillary (step 1):

기능성 모노머, 가교 모노머, 분자량이 4,000 내지 40,000인 기공 유도물질 및 중합개시제를 포함하는 모노머 혼합물을, 수소결합성 용매 및 비수소결합성 용매로 구성된 혼합용매에 용해시켜 중합혼합물을 제조하는 단계(단계 2);Dissolving a monomer mixture comprising a functional monomer, a crosslinking monomer, a pore inducing material having a molecular weight of 4,000 to 40,000 and a polymerization initiator in a mixed solvent composed of a hydrogen sintering synthesis solvent and a non-hydrogen sintering synthetic solvent to prepare a polymerization mixture (Step 2 );

상기 단계 2에서 제조된 중합혼합물을 상기 실리카 모세관에 채우는 단계(단계 3);Filling the polymeric mixture prepared in step 2 with the silica capillary (step 3);

상기중합혼합물이 채워진 실리카 모세관의 양끝을 봉하고 가열하여 중합시키는 단계(단계 4); 및Sealing both ends of the silica capillary filled with the polymerization mixture and heating to polymerize (step 4); And

상기 중합이 완료된 실리카 모세관 컬럼을 세척하는 단계(단계 5);를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법을 제공한다.
And washing the polymerized silica capillary column (step 5). The present invention also provides a method of manufacturing a silica capillary column.

또한 본 발명은Also,

, 상기 제조방법에 의해 얻어지는 실리카 모세관 컬럼을 제공한다.
, And a silica capillary column obtained by the above production method.

본 발명에 따르면, 실리카 튜빙 내벽 표면에 적절한 동공을 지니도록 고분자 박막을 형성한 실리카 모세관 컬럼은 그 제조재현성이 뛰어나고, 프로테오믹 시료 (단백질 가수분해 산물)의 분리분석에 대하여 현재까지 모세관 전기이동 크로마토그래피(capillary electrochromatography, CEC) 분야에서 어떤 경우와 비교해서도 훨씬 우수한 분리효율을 보일 뿐만 아니라, 또한 매우 세척이 용이한 구조의 박막을 생성함으로써, 대량생산이 가능한 새로운 고효율 프로테오믹 CEC 컬럼으로 사용될 수 있다.
According to the present invention, a silica capillary column having a polymer thin film formed on the inner wall surface of a silica tubing is excellent in reproducibility of the preparation, and the separation and analysis of a proteomic sample (protein hydrolyzate) A new, highly efficient proteomic CEC column capable of mass production by producing thin films that are not only highly separable compared to any case in the field of chromatography (capillary electrochromatography, CEC), but also very easy to clean Can be used.

도 1은 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 모세관 컬럼으로 단백질 시료(용리순서대로 라이소자임(lysozyme), 리보뉴클레아제 A(ribonuclease A), 시토크롬-C(cytochrome-C), α-키모트립시노겐 A(α-chymotrypsinogen A) 및 미오글로빈(myoglobin))를 분리한 것을 나타낸 그래프이고;
도 2는 실시예 2에서 제조된 모세관 컬럼으로 시토크롬C의 가수분해 산물을 분리분석 최적화한 것을 나타낸 그래프이고;
도 3은 실시예 3에서 제조된 모세관 컬럼으로 도 2의 최적화 용리조건 하에서 단백질 시료를 분리분석한 것을 나타낸 그래프이다.Fig. 1 is a graph showing the results obtained by comparing the protein samples (lysozyme, ribonuclease A, cytochrome-C, alpha- A-chymotrypsinogen A and myoglobin), and Fig.
FIG. 2 is a graph showing the separation and analysis optimization of the hydrolysis product of cytochrome C with the capillary column prepared in Example 2; FIG.
FIG. 3 is a graph showing the separation and analysis of a protein sample under the optimized elution conditions of FIG. 2 with the capillary column prepared in Example 3. FIG.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 The present invention

실리카 모세관 내벽에 이중결합 리간드를 부착시키는 단계(단계 1):Attaching a double bond ligand to the inner wall of the silica capillary (step 1):

기능성 모노머, 가교 모노머, 분자량이 4,000 내지 40,000인 기공 유도물질 및 중합개시제를 포함하는 모노머 혼합물을, 수소결합성 용매 및 비수소결합성 용매로 구성된 혼합용매에 용해시켜 중합혼합물을 제조하는 단계(단계 2);Dissolving a monomer mixture comprising a functional monomer, a crosslinking monomer, a pore inducing material having a molecular weight of 4,000 to 40,000 and a polymerization initiator in a mixed solvent composed of a hydrogen sintering synthesis solvent and a non-hydrogen sintering synthetic solvent to prepare a polymerization mixture (Step 2 );

상기 단계 2에서 제조된 중합혼합물을 상기 실리카 모세관에 채우는 단계(단계 3);Filling the polymeric mixture prepared in step 2 with the silica capillary (step 3);

상기중합혼합물이 채워진 실리카 모세관의 양끝을 봉하고 가열하여 중합시키는 단계(단계 4); 및Sealing both ends of the silica capillary filled with the polymerization mixture and heating to polymerize (step 4); And

상기 중합이 완료된 실리카 모세관 컬럼을 세척하는 단계(단계 5);를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법을 제공한다.
And washing the polymerized silica capillary column (step 5). The present invention also provides a method of manufacturing a silica capillary column.

본 발명에 따른 실리카 모세관 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 실리카 모세관 내벽에 이중결합 리간드를 부착시키는 단계로 일례로써, 문헌(S. Hjerten 등, J.Chromatogr. 1985, 347, 191)에 공지된 방법대로 수행될 수 있다.In the silica capillary manufacturing method according to the present invention, step 1 is a step of attaching a double bond ligand to the inner wall of the silica capillary. As an example, there is a method of preparing silica capillary according to the method described in S. Hjerten et al., J. Chromatogr. 1985, 347, Can be performed in a method.

상세하게는 실리카 모세관에 1M NaOH 용액을 6 시간 동안 채우고, 물, 0.1 M HCl, 물, 아세톤의 순서로 잘 씻고 질소 기류를 통과시켜 건조시킨 다음, 4 μL의 메타크릴옥시프로필 트리메톡시실란(methacryloxypropyl trimethoxysilane)을 1mL의 6mM 초산수용액에 녹여 모세관에 채우고 6시간 그대로 두어 반응시킨 후, 메탄올로 철저하게 세척해내고 질소기류로 말리는 과정이다.
Specifically, the silica capillary was filled with 1M NaOH solution for 6 hours, washed thoroughly with water, 0.1 M HCl, water, acetone, dried by passing through a nitrogen stream, and then 4 μL of methacryloxypropyltrimethoxysilane methacryloxypropyl trimethoxysilane) is dissolved in 1 mL of 6 mM acetic acid aqueous solution, filled in a capillary, allowed to react for 6 hours, thoroughly washed with methanol, and dried with a nitrogen stream.

상기 단계 2는 본 발명에 따른 특수 조성의 중합혼합물을 제조하는 단계이다.Step 2 is a step of preparing a polymerization mixture of a special composition according to the present invention.

본 발명은 모세관 전기이동 크로마토그래피에서 사용할 때 분리효율이 뛰어나고 안정적인 전기삼투흐름을 주는 다공성 유기 모노리트 고분자 박막을 실리카 모세관 내벽에 재현성 있게 형성하기 위하여 고안한 특수 중합혼합물의 조성을 제공한다.The present invention provides a composition of a special polymerization mixture designed to reproducibly form a porous organic monolithic polymer thin film having excellent separation efficiency and stable electroosmotic flow when used in a capillary electrophoresis chromatography on the inner wall of a silica capillary.

이에, 상기 단계 2에서는 기능성 모노머 1몰에 대하여, 가교 모노머 2.0 내지 6.0몰, 기공 유도물질은 0.002 내지 0.03몰 및 중합개시제 0.05 내지 0.5몰을 포함하는 것이 바람직하다.
In the step 2, it is preferable that 2.0 to 6.0 moles of the crosslinking monomer, 0.002 to 0.03 moles of the pore-generating material, and 0.05 to 0.5 moles of the polymerization initiator are contained per mole of the functional monomer.

또한 본 발명에 따른 상기 중합 혼합물은 기공 유도물질이 프로테오믹 시료분석에 유용하게 쓰일 수 있도록 정지상 막 내에 적당한 동공생성을 유도하는 목적으로 사용되며, 특히 분자량이 4,000 내지 40,000 정도인 고분자를 사용한다.In addition, the polymerization mixture according to the present invention is used for inducing proper pore generation in a stationary phase membrane so that the pore-generating material can be usefully used for analyzing a proteomic sample, and a polymer having a molecular weight of about 4,000 to 40,000 is used .

상기 범위를 벗어나는 기공 유도물질을 쓰면 프로테오믹 시료 분석에 적절한 동공생성이 되지 않아 분리효율이 부적합한 수준으로 떨어질 수 있다.If pore inducing substances deviating from the above range are used, pore generation suitable for the analysis of the proteomic sample can not be performed and the separation efficiency may drop to an inappropriate level.

이에, 분자량이 4,000 내지 40,000인 기공 유도물질로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐아세톤, 폴리비닐피리딘, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌디아민, 폴리비닐클로라이드, 폴리카프로락탐, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 상기 기공유도물질이 이에 제한되는 것은 아니며, 유기모노리트의 성분과 용매의 물성을 고려하여, 일반적으로 공지된 물질들을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
Thus, examples of the pore inducing material having a molecular weight of 4,000 to 40,000 include polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polyvinyl acetone, polyvinyl pyridine, polyacrylamide, polyacrylonitrile, polyethylene diamine, There may be used at least one selected from the group consisting of chloride, polycaprolactam, polyvinylpyrrolidone, and polyester. However, the pore-generating material is not limited thereto, and the organic monolith and the physical properties of the solvent are taken into consideration , Generally known materials can be appropriately selected and used.

한편 상기 기능성 모노머는 이미 일반적으로 공지된 물질들 중에서 선정하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프로테오믹 분석에서 더 좋은 결과를 주는 분자량 500 이하의 염기성 모노머가 더 바람직하다.On the other hand, the functional monomer may be selected from generally known materials, and more preferably a basic monomer having a molecular weight of 500 or less, which gives better results in the proteomic analysis.

예를 들어, 아크릴산, 메타크릴산, 메틸메타크릴산, 메틸메타크릴레이트, 비닐알코올, 비닐아세테이트, 비닐아세톤, 스티렌, 4-에틸스티렌, 4-히드록시스티렌, 알릴아민, 4-아미노스티렌, 4-비닐피리딘, 2-비닐피리딘, 1-비닐이미다졸, 아크릴아미드 및 메타크릴아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으나, 상기 기능성 모노머가 이에 제한되는 것은 아니며, 1 이상의 이중결합을 지닌 화합물을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
For example, there may be mentioned acrylic acid, methacrylic acid, methylmethacrylic acid, methylmethacrylate, vinyl alcohol, vinyl acetate, vinyl acetone, styrene, 4-ethylstyrene, 4-hydroxystyrene, allylamine, At least one selected from the group consisting of 4-vinylpyridine, 2-vinylpyridine, 1-vinylimidazole, acrylamide and methacrylamide can be used. However, the functional monomer is not limited thereto, A compound having a bond can be appropriately selected and used.

또한, 가교 모노머로는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸프로판트리아크릴레이트, 트리메틸프로판트리메타크릴레이트, 아크릴이소시아누레이트, 1,4-부탄디올디아크릴레이트, 1,4-부탄디올디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올디아크릴레이트, 1,6-헥산디올디메타크릴레이트, 네오펜틸글리콜 디아크릴레이트, 네오펜틸글리콜 디메타크릴레이트, 디시클로펜타디에닐디아크릴레이트, 디시클로펜타디에닐디메타크릴레이트, 펜타에리스리톨 테트라아크릴레이트, 펜타에리스리톨 테트라메타크릴레이트 등에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으나, 상기 가교 모노머가 이에 제한되는 것은 아니며, 2 이상의 이중결합을 지닌 화합물을 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 특히 분자량이 500 이하인 것이 바람직하다. Examples of the crosslinking monomer include ethylene glycol dimethacrylate, trimethylpropane triacrylate, trimethylpropane trimethacrylate, acrylic isocyanurate, 1,4-butanediol diacrylate, 1,4-butanediol dimethacrylate , 1,6-hexanediol diacrylate, 1,6-hexanediol dimethacrylate, neopentyl glycol diacrylate, neopentyl glycol dimethacrylate, dicyclopentadienyl diacrylate, dicyclopentadienyl diacrylate, Methacrylate, pentaerythritol tetraacrylate, pentaerythritol tetramethacrylate, and the like, but the crosslinking monomer is not limited thereto, and a compound having at least two double bonds can be appropriately selected and used And particularly preferably has a molecular weight of 500 or less.

또한, 상기 중합개시제로는 아조비스이소부틸로니트릴 또는 아조비스디메틸발레로니트릴과 같은 아조계 개시제; 벤조일퍼록사이드 또는 라우로일퍼록사이드와 같은 유기 퍼록사이드; 과황산칼륨 및 과황산암모늄과 같은 수용성 개시제 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
Examples of the polymerization initiator include azo-based initiators such as azobisisobutylonitrile or azobisdimethylvaleronitrile; Organic peroxides such as benzoyl peroxide or lauroyl peroxide; A water-soluble initiator such as potassium persulfate and ammonium persulfate may be used.

또한 반응혼합물을 용해시키기 위한 혼합용매는 비수소결합성(aprotic) 용매 80 내지 95 부피% 및 수소결합성 용매 5 내지 20 부피%로 이루어질 수 있다. 이렇게 혼합용매를 사용하는 것은 기공 유도물질의 용해도가 비수소 결합성 용매에 대하여 낮아서 그 용해도를 증가시키기 위한 것이다. The mixed solvent for dissolving the reaction mixture may also be composed of 80 to 95% by volume of an aprotic solvent and 5 to 20% by volume of a hydrogenated synthetic solvent. The use of such a mixed solvent is intended to increase the solubility of the pore-inducing material because the solubility thereof is lower than that of the non-hydrogen-bonding solvent.

상기 수소결합성 용매는 C1 내지 C10의 알코올류를 사용하며, 상기 비수소결합성 용매로는 아세토니트릴, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 테트라클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 모노클로로벤젠, 디클로로벤젠, 니트로벤젠, 디에틸에테르, 메틸아세테이트 또는 에틸아세테이트 등을 사용할 수 있다.
The number of sintered composite solvent is used an alcohol of C 1 to C 10, in the non-aqueous sintered synthetic solvents include acetonitrile, chloroform, dichloromethane, trichloro methane, tetrachloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl Benzene, monochlorobenzene, dichlorobenzene, nitrobenzene, diethyl ether, methyl acetate, ethyl acetate and the like can be used.

상기 모노머 혼합물은 혼합용매 100 중량부에 대하여 5 내지 20 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 만약, 상기 범위를 벗어나 소량으로 혼합용매가 포함되면 중합혼합물을 충분히 용해시킬 수 없는 반면, 과량으로 혼합용매가 포함되면 경제성 제고에 문제가 야기될 수 있다.
The monomer mixture is preferably contained in an amount of 5 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the mixed solvent. If a mixed solvent is contained in a small amount outside the above-described range, the polymerization mixture can not be sufficiently dissolved, but if an excessive amount of a mixed solvent is contained, problems may arise in improving economy.

본 발명에 따른 실리카 모세관 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 특수 조성의 중합혼합물을 상기 제 1단계에서 제조된 실리카 모세관에 채우는 단계이다.
In the method for producing silica capillary according to the present invention, the step 3 is a step of filling the silica capillary produced in the first step with the polymerization mixture of the special composition prepared in the step 2.

상기 단계 4는 상기중합혼합물이 채워진 실리카 모세관의 양끝을 봉하고 가열하여 중합시키는 단계로써, 상기 중합혼합물을 질소로 퍼지하여 산소를 제거하고, 0.2 μm 멤브레인 필터를 매단 주사기로 모세관에 채워, 모세관의 양 끝을 GC용 고무마개(septum)로 봉하고 40 내지 70℃ 항온수조에 넣어 3 내지 12 시간 반응시켜 수행할 수 있다.
Step 4 is a step of sealing both ends of the silica capillary filled with the polymerization mixture and heating to polymerize the polymer mixture to purge the oxygen by nitrogen to fill the capillary with a 0.2 μm membrane filter by a syringe, And the end is sealed with a GC rubber septum and placed in a constant temperature water bath at 40 to 70 DEG C for 3 to 12 hours.

상기 단계 5는 중합이 완료된 모세관 컬럼에 세척용액을 흘려 세척하는 단계이다. 메탄올과 초산의 혼합용매, 아세토니트릴로 및 CEC 용리액 순으로 세척하여 수행할 있다. 또한 이렇게 제조된 컬럼은 그 내벽에 적절한 다공성 박막을 이루게 되어 프로테오믹 시료 분리분석에서 분리능과 분리효율이 뛰어난 결과를 준다. 더불어 컬럼 제조의 재현성도 매우 우수하다.
Step 5 is a step of washing the capillary column with polymerization by flowing a washing solution through the capillary column. A mixed solvent of methanol and acetic acid, acetonitrile, and a CEC eluent. In addition, the column thus formed has a suitable porous thin film on the inner wall thereof, which is excellent in separation efficiency and separation efficiency in the proteomic sample separation analysis. In addition, the reproducibility of column preparation is excellent.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 얻어지는, 내벽에 다공성 유기 모노리트 구조로 고분자 박막이 형성된 모세관 컬럼을 제공한다.Further, the present invention provides a capillary column obtained by the above-described production method, wherein a polymer thin film is formed on the inner wall of the porous organic monolith structure.

본 발명에 따른 모세관 컬럼은 내경이 20 내지 200 μm이고 길이가 25 내지 500 cm의 범위에 걸쳐 만들 수 있으며 그 내벽에 형성되는 고분자 박막의 두께는 0.1 내지 15 μm이다. The capillary column according to the present invention may have an inner diameter ranging from 20 to 200 μm and a length ranging from 25 to 500 cm. The thickness of the polymer thin film formed on the inner wall is 0.1 to 15 μm.

보다 바람직하게는, 모세관 컬럼의 내경이 50-100 μm이고 길이가 30-100 cm, 그리고 고분자 박막의 두께는 1-4 μm인 것이 제조의 재현성과 사용의 편이성에서 가장 바람직하다. More preferably, the capillary column has an inner diameter of 50-100 [mu] m, a length of 30-100 cm, and a thickness of 1-4 [mu] m, which is most preferable in reproducibility and ease of use.

또한 본 발명에 따른 실리카 모세관 컬럼은 프로테오믹스 분석용 칼럼인 것을 특징으로 하며, 예를 들어 50 cm 컬럼으로 펩티드 시료에 대하여 일부 봉우리의 이론단수가 백만을 넘을 정도로 분리효율이 매우 뛰어난 성능을 보인다.
Also, the silica capillary column according to the present invention is characterized by being a column for analysis of proteomics. For example, a 50 cm column shows excellent separation efficiency with respect to a peptide sample in which the theoretical number of peaks exceeds one million.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 단백질 혼합물 시료의 분리 (하향식 프로테오믹 분석)에 사용되는 모세관 컬럼의 제조Example 1 Preparation of Capillary Columns for Separation of Protein Mixture Samples (Top-Down Proteomic Analysis)

단계 1 : 내경 50 μm, 외경 365 μm인 실리카 모세관(길이 50cm)에 1M NaOH 용액을 6 시간 동안 채우고, 물, 0.1M HCl, 물 및 아세톤의 순서로 세척 한후, 질소 기류를 통과시켜 건조시켰다. 그런 다음, 4 μL의 메타크릴옥시프로필 트리메톡시실란(methacryloxypropyl trimethoxysilane)을 1mL의 6mM 초산수용액에 녹여 모세관에 채우고, 6시간 그대로 두어 반응시킨 후 메탄올로 철저하게 세척해내고 질소기류로 말렸다.
Step 1: A 1M NaOH solution was filled in a silica capillary tube (50 cm in length) having an inner diameter of 50 μm and an outer diameter of 365 μm for 6 hours, washed with water, 0.1 M HCl, water and acetone, and then dried by passing through a nitrogen stream. Then, 4 μL of methacryloxypropyl trimethoxysilane was dissolved in 1 mL of 6 mM acetic acid aqueous solution, filled in a capillary tube, allowed to react for 6 hours, washed thoroughly with methanol, and dried with a nitrogen stream.

단계 2: 폴리에틸렌글리콜(분자량 10,000인 기공유도물질) 4.9 mg, 4-아미노스티렌 8.2 μL, EDMA(ethylene glycol dimethacrylate) 59μL 및 AIBN(azobisisobutyronitrile) 3.5 mg을 아세토니트릴(acetonitrile) 0.9 mL와 2-프로판올(2-propanol) 0.1 mL로 이루어진 혼합용매에 녹이고, 10분 이상 질소로 퍼지하여 산소를 제거한 후, 0.2 μm 멤브레인 필터가 달린 시린지로 상기 이중결합 처리된 모세관에 채웠다.
Step 2: 4.9 mg of polyethylene glycol (pore inducer having a molecular weight of 10,000), 8.2 μL of 4-aminostyrene, 59 μL of EDMA (ethylene glycol dimethacrylate) and 3.5 mg of AIBN (azobisisobutyronitrile) were dissolved in 0.9 mL of acetonitrile and 2-propanol 2-propanol), purged with nitrogen for 10 minutes or longer to remove oxygen, and then filled into the double-bonded capillary with a syringe fitted with a 0.2 μm membrane filter.

단계 3 : 상기 모세관 양끝을 GC용 고무마개로 봉하고, 모세관을 50 ℃ 항온수조에 넣어 4 시간 동안 반응시켰다. 그 후 즉시 메탄올과 초산이 9 대 1의 부피비로 섞인 용매로 철저하게 세척하여 기공 유도물질을 제거하고, 아세토니트릴로 다시 세척한 다음 마지막으로 CEC 용리액으로 씻었다.
Step 3: Both ends of the capillary tube were sealed with a rubber cap for GC, and the capillary tube was placed in a constant temperature water bath at 50 캜 for reaction for 4 hours. Immediately thereafter, the pore inducing material was thoroughly washed with a solvent mixed with methanol and acetic acid in a volume ratio of 9: 1, washed again with acetonitrile, and finally washed with CEC eluent.

단계 4: 상기 단계 3에서 제조된 모세관의 출구 끝에서 8.4 cm 위치에 외피 고분자 막을 태워 제거함으로써 자외선 검출창을 만들었다. Step 4: An ultraviolet ray detection window was made by burning the outer polymer film at a position of 8.4 cm from the exit end of the capillary prepared in the above step 3 by burning.

상기 컬럼의 전체 길이는 50.0 cm이고 컬럼 입구에서 검출창까지 유효길이는 41.6 cm이었다.
The total length of the column was 50.0 cm and the effective length from the inlet of the column to the detection window was 41.6 cm.

<실시예 2> 단백질 가수분해 산물(상향식 프로테오믹 분석)에 사용되는 모세관 컬럼의 제조.Example 2 Preparation of Capillary Columns for Protein Hydrolysis Products (Bottom-Up Proteomic Analysis).

단백질의 가수분해로 얻어진 펩티드 혼합물 시료의 분석을 위한 OT-CEC 모세관 컬럼은, 상기 실시예 1의 단계 2에서 반응혼합물의 조성이 폴리에틸렌글리콜(기공유도물질,분자량 10000) 9.8 mg, 4-아미노스티렌 24.6 μL, EDMA(ethylene glycol dimethacrylate) 59 μL, AIBN(azobisisobutyronitrile) 3.5 mg을 아세토니트릴(acetonitrile) 0.9 mL와 2-프로판올(2-propanol) 0.1 mL로 이루어진 혼합용매에 녹인 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 제조과정을 수행하였다.
The OT-CEC capillary column for the analysis of the peptide mixture sample obtained by the hydrolysis of the protein was prepared in the same manner as in Example 1, except that in Step 2 of Example 1, the composition of the reaction mixture was 9.8 mg of polyethylene glycol (pore inducing substance, molecular weight 10000) , 59.6 μL of ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) and 3.5 mg of azobisisobutyronitrile (AIBN) were dissolved in a mixed solvent of 0.9 mL of acetonitrile and 0.1 mL of 2-propanol, 1 was carried out.

<비교예 1>&Lt; Comparative Example 1 &

상기 실시예 1에 있어서, 단계 2에서 분자량이 600인 폴리에틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 수행하여 단백질 혼합물 시료의 분리에 사용되는 모세관 컬럼을 제조하였다.
A capillary column used for separation of the protein mixture sample was prepared in the same manner as in Example 1, except that polyethylene glycol having a molecular weight of 600 was used in Step 2 in Example 1.

<비교예 2>&Lt; Comparative Example 2 &

상기 실시예 1에 있어서, 단계 2에서 분자량이 1,500인 폴리에틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 수행하여 단백질 혼합물 시료의 분리에 사용되는 모세관 컬럼을 제조하였다.
A capillary column to be used for separation of a protein mixture sample was prepared in the same manner as in Example 1, except that polyethylene glycol having a molecular weight of 1,500 was used in Step 2 in Example 1.

<비교예 3>&Lt; Comparative Example 3 &

상기 실시예 1에 있어서, 단계 2에서 분자량이 100,000인 폴리에틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 수행하여 단백질 혼합물 시료의 분리에 사용되는 모세관 컬럼을 제조하였다.
A capillary column used for separation of protein mixture samples was prepared in the same manner as in Example 1 except that polyethylene glycol having a molecular weight of 100,000 was used in Step 2 in Example 1.

<실험예 1><Experimental Example 1>

모세관 컬럼의 프로테오믹 분석 성능을 비교 조사하기 위하여, 라이소자임(lysozyme), 리보뉴클레아제 A(ribonuclease A), 시토크롬-C(cytochrome-C), α-키모트립시노겐 A(α-chymotrypsinogen A) 및 미오글로빈(myoglobin)으로 이루어진 단백질 시료를 제조하였다. To compare the proteomic analysis performance of the capillary columns, lysozyme, ribonuclease A, cytochrome-C, alpha-chymotrypsinogen A ) And myoglobin were prepared.

실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 컬럼을 60/40(부피비)의 아세토니트릴/ pH 6.0 50mM 포스페이트 버퍼를 이동상으로하여 -20 kV의 전압과 25℃의 온도에서 상기 단백질 시료를 용리하였으며, 그 결과를 비교하여 도 1에 도시하였다. The column prepared in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 was eluted with a 60/40 (by volume) acetonitrile / pH 6.0 50 mM phosphate buffer as the mobile phase at a voltage of -20 kV and a temperature of 25 캜 , And the results are compared and shown in Fig.

용리 순서는 라이소자임(lysozyme), 리보뉴클레아제 A(ribonuclease A), 시토크롬-C(cytochrome-C), α-키모트립시노겐 A(α-chymotrypsinogen A) 및 미오글로빈(myoglobin)순으로 단백질을 분리하였다.
The elution order is to separate proteins in the order of lysozyme, ribonuclease A, cytochrome-C, alpha-chymotrypsinogen A and myoglobin. Respectively.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 기공 유도물질의 분자량이 10,000인 경우에만 만족할만한 분리성능을 얻었고, 분자량이 너무 작거나 너무 크면 부적합한 결과를 알 수 있었다. As shown in Fig. 1, satisfactory separation performance was obtained only when the molecular weight of the pore-generating material was 10,000, and when the molecular weight was too small or too large, it was found that the result was inappropriate.

따라서 프로테오믹 시료 분석에 알맞은 동공을 생성하기 위해서는, 기공 유도물질의 분자량이 어느 특정한 범위 안에 들어와야 한다는 것을 알 수 있으며, 본 발명에 따른 기공 유도물질의 분자량은 4,000 내지 40,000일 때 바람직한 것을 알 수 있다.
Therefore, in order to produce a pore suitable for the analysis of the proteomic sample, it can be seen that the molecular weight of the pore-generating material should fall within a certain range, and the molecular weight of the pore-forming material according to the present invention is preferably 4,000 to 40,000. have.

<실험예 2><Experimental Example 2>

실시예 2에서 제조된 모세관 프로테오믹 분석 성능을 비교 조사하기 위하여, 단백질의 가수분해로 얻어진 펩티드 혼합물 시료를 다음과 같이 제조하였다.In order to comparatively examine the capillary proteomic analysis performance prepared in Example 2, a peptide mixture sample obtained by hydrolysis of protein was prepared as follows.

시토크롬C (cytochrom C) 2.5 mg을 트립신(소화효소) 1.0 mg, 2.0 M 우레아 0.5 mL 및 0.1M 암모늄수소탄산 0.5 mL와 혼합한 후 37 ℃에서 24시간 숙성하였고, 반응을 종결하기 위하여 0.1% 삼불화초산 수용액 1 mL를 가하여 펩티드 시료를 제조하였으며, 실시예 2에서 제조된 모세관 컬럼으로 상기 시토크롬C의 가수분해 산물을 분리분석 최적화한 결과를 도 2에 나타내었다.
2.5 mg of cytochrome C was mixed with 1.0 mg of trypsin (digestive enzyme), 0.5 mL of 2.0 M urea and 0.5 mL of 0.1 M ammonium hydrogen carbonate, and the mixture was aged at 37 ° C for 24 hours. To complete the reaction, 0.1% 1 mL of an aqueous solution of acetic acid fluoride was added to prepare a peptide sample. FIG. 2 shows the result of the separation and analysis of the hydrolysis product of the cytochrome C with the capillary column prepared in Example 2.

최적화 용리조건을 판단하는 지표로서 시료 성분의 머무름 시간 범위를 아세톤(전기삼투흐름 지시 용질)의 머무름 시간으로 나눈 값을 삼았고, 이것이 최대가 되는 조건을 찾았다. 최적화된 용리액은 부피비 60/40인 아세토니트릴/ pH 7.0 50mM 포스페이트 버퍼로 확인되었다.
As an indicator for determining the optimum elution condition, the retention time range of the sample component was divided by the retention time of acetone (electroosmotic flow eluting solute), and a condition for obtaining this maximum was found. The optimized eluant was identified with an acetonitrile / pH 7.0 50 mM phosphate buffer, 60/40 by volume.

도 2에서 볼 수 있듯이, 분리된 펩티드 봉우리의 띠나비는 매우 좁은 것을 확인할 수 있다. 또한 각 봉우리의 이론단수는 적어도 200,000/m 이상이고, 대부분은 500,000/m 이상이며, 일부분은 1,000,000/m 이상으로 분리효율이 높은 결과를 나타냄으로써, 본 발명에 따른 컬럼의 분리성능이 매우 좋은 것을 알 수 있다.
As can be seen from Fig. 2, it can be seen that the band-width of the separated peptides peaks is very narrow. In addition, since the number of theoretical peaks of each peak is at least 200,000 / m, most of them are more than 500,000 / m, and some of them are more than 1,000,000 / m, the separation efficiency is high and thus the separation performance of the column according to the present invention is very good Able to know.

한편, 실시예 2에서 제조된 컬럼으로 도 2의 용리조건 하에서 단백질 혼합물 시료를 분리분석한 결과는 도 3에 나타내었고, 분리성능은 도 1과 유사한 결과인 것을 알 수 있다.
The results of separation and analysis of the protein mixture sample under the elution conditions of FIG. 2 with the column prepared in Example 2 are shown in FIG. 3, and the separation performance is similar to that of FIG.

Claims (12)

실리카 모세관 내벽에 이중결합 리간드를 부착시키는 단계(단계 1):
기능성 모노머, 가교 모노머, 분자량이 4,000 내지 40,000인 기공 유도물질 및 중합개시제를 포함하는 모노머 혼합물을, 수소결합성 용매 및 비수소결합성 용매로 구성된 혼합용매에 용해시켜 중합혼합물을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 제조된 중합혼합물을 상기 실리카 모세관에 채우는 단계(단계 3);
상기중합혼합물이 채워진 실리카 모세관의 양끝을 봉하고 가열하여 중합시키는 단계(단계 4); 및
상기 중합이 완료된 실리카 모세관 컬럼을 세척하는 단계(단계 5);를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
Attaching a double bond ligand to the inner wall of the silica capillary (step 1):
Dissolving a monomer mixture comprising a functional monomer, a crosslinking monomer, a pore inducing material having a molecular weight of 4,000 to 40,000 and a polymerization initiator in a mixed solvent composed of a hydrogen sintering synthesis solvent and a non-hydrogen sintering synthetic solvent to prepare a polymerization mixture (Step 2 );
Filling the polymeric mixture prepared in step 2 with the silica capillary (step 3);
Sealing both ends of the silica capillary filled with the polymerization mixture and heating to polymerize (step 4); And
And washing the polymerized silica capillary column (step 5). &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 11. &lt; / RTI &gt;
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 기공 유도물질은 분자량이 4,000 내지 40,000인 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐아세톤, 폴리비닐피리딘, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌디아민, 폴리비닐클로라이드, 폴리카프로락탐, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the pore inducing material of step 2 is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polyvinyl acetone, polyvinyl pyridine, Wherein at least one selected from the group consisting of nitrile, polyethylene diamine, polyvinyl chloride, polycaprolactam, polyvinylpyrrolidone and polyester is used.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 기능성 모노머는 아크릴산, 메타크릴산, 메틸메타크릴산, 메틸메타크릴레이트, 비닐알코올, 비닐아세테이트, 비닐아세톤, 스티렌, 4-에틸스티렌, 4-히드록시스티렌, 알릴아민, 4-아미노스티렌, 4-비닐피리딘, 2-비닐피리딘, 1-비닐이미다졸, 아크릴아미드 및 메타크릴아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 모노머인 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the functional monomer of step 2 is selected from the group consisting of acrylic acid, methacrylic acid, methyl methacrylic acid, methyl methacrylate, vinyl alcohol, vinyl acetate, vinyl acetone, styrene, At least one monomer selected from the group consisting of allyl amine, 4-aminostyrene, 4-vinylpyridine, 2-vinylpyridine, 1-vinylimidazole, acrylamide and methacrylamide. &Lt; / RTI &gt;
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 가교 모노머는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸프로판트리아크릴레이트, 트리메틸프로판트리메타크릴레이트, 아크릴이소시아누레이트, 1,4-부탄디올디아크릴레이트, 1,4-부탄디올디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올디아크릴레이트, 1,6-헥산디올디메타크릴레이트, 네오펜틸글리콜 디아크릴레이트, 네오펜틸글리콜 디메타크릴레이트, 디시클로펜타디에닐디아크릴레이트, 디시클로펜타디에닐디메타크릴레이트, 펜타에리스리톨 테트라아크릴레이트 및 펜타에리스리톨 테트라메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 모노머인 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the crosslinking monomer in step 2 is at least one selected from the group consisting of ethylene glycol dimethacrylate, trimethylpropane triacrylate, trimethylpropane trimethacrylate, acrylic isocyanurate, 1,4-butanediol diacrylate, Butanediol dimethacrylate, 1,6-hexanediol diacrylate, 1,6-hexanediol dimethacrylate, neopentyl glycol diacrylate, neopentyl glycol dimethacrylate, dicyclopentadienyldiacrylate Wherein the monomer is at least one monomer selected from the group consisting of dicyclopentadienyldimethacrylate, pentaerythritol tetraacrylate, and pentaerythritol tetramethacrylate.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 가교 모노머는 기능성 모노머 1몰당 2.0 내지 6.0 몰을 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the crosslinking monomer in step 2 comprises from 2.0 to 6.0 moles per mole of functional monomer.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 기공 유도물질은 기능성 모노머 1몰당 0.002 내지 0.03 몰을 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the porosity inducing material of step 2 comprises 0.002 to 0.03 mol per mol of the functional monomer.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 중합개시제는 기능성 모노머 1몰당 0.05 내지 0.5몰을 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
2. The method according to claim 1, wherein the polymerization initiator in step 2 comprises 0.05 to 0.5 mol per 1 mol of the functional monomer.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 혼합용매는 비수소결합성 용매가 80 부피% 내지 95 부피%, 수소결합성 용매가 5 부피% 내지 20 부피%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method for producing a silica capillary column according to claim 1, wherein the mixed solvent of step 2 comprises 80 to 95% by volume of a non-hydrogenated synthesis solvent and 5 to 20% by volume of a hydrogenation synthesis solvent .
제 1항에 있어서, 상기 단계 2의 모노머 혼합물은 혼합용매 100 중량부에 대하여 5 내지 20 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the monomer mixture in step 2 is included in an amount of 5 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the mixed solvent.
제 1항의 제조방법에 의해 얻어지는 실리카 모세관 컬럼.
A silica capillary column obtained by the production method of claim 1.
제 10항에 있어서, 상기 실리카 모세관 컬럼의 내경이 20 내지 200μm이고, 컬럼의 길이는 25 내지 500cm이며, 컬럼의 내벽의 두께가 0.1 내지 15μm인 다공성 모노리트 분자각인고분자 박막이 형성되는 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼.
11. The method of claim 10, wherein the silica capillary column has an inner diameter of 20 to 200 mu m, a column length of 25 to 500 cm, and an inner wall thickness of the column of 0.1 to 15 mu m. Silica capillary column.
제 10항에 있어서, 상기 컬럼은 프로테오믹스 분석용 칼럼인 것을 특징으로 하는 실리카 모세관 컬럼. 11. The silica capillary column according to claim 10, wherein the column is a column for proteomic analysis.
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