KR20160026444A - Primers for testing spinal muscular atrophy, and a method for testing spinal muscular atrophy using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 척수성 근위축증 진단용 프라이머, 프라이머 세트 및 이를 이용한 척수성 근위축증 진단 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a primer, a primer set, and a method for diagnosing spinal muscular atrophy using the same.
척수성 근위축증 (spinal muscular atrophy, SMA)은 척수 운동 뉴런의 퇴행에 의해 발생하는 상염색체 열성 질환이며, 신생아 10,000 명 당 1 명 수준의 유병률을 보인다. SMA의 발병은 근위 부근육 (proximal muscle)의 점진적 위축과 마비, 호흡부전, 영아사망 등을 초래하는 것으로 알려져 있으며, 완치가 일반적으로 불가능해 해당 질병의 예측과 조기진단을 통한 장기적 관리가 필요하다. SMA는 발병 연령과 증세의 심각도에 따라 4 종으로 구분된다. Type III과 IV의 경우 정상인과 비슷한 수준의 수명을 기대할 수 있으나, Type II와 I의 경우 기대 수명이 각각 청소년기와 영유아기를 넘기기 어렵다.Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive disorder caused by degeneration of spinal motor neurons, with a prevalence of one per 10,000 newborns. The onset of SMA is known to cause gradual atrophy of the proximal muscles, paralysis, respiratory failure, infant death, etc., and cure is generally impossible and long-term management through the prediction and early diagnosis of the disease is necessary . SMA is classified into four types according to age of onset and severity of symptom. In Type III and IV, life expectancy can be expected to be similar to that of normal. However, in Type II and I, life expectancy is difficult to pass in adolescence and infancy.
SMA는 염색체 5q13 영역에 정상인의 경우 두 카피가 위치하는 'survival of motor neuron(SMN)' 유전자의 이상에 의해 발병한다. SMA is caused by an abnormality in the 'survival of motor neuron ( SMN )' gene in which two copies are located in the chromosome 5q13 region.
말단소체 방향에 존재하는 SMN (SMN1)과 동원체 방향에 위치하는 SMN (SMN2)은 7번 엑손과 8번 엑손에서 각각 하나의 염기서열 차이를 가지며, 이들 두 단일염기 변이는 SMA의 진단에 있어 매우 중요한 역할을 갖는다. SMN ( SMN1 ) and SMN ( SMN2 ) located in the terminal direction of the nucleus have one base sequence difference in
도 1에서 볼 수 있듯, SMN1의 경우 대부분의 SMN pre-mRNA가 정상적인 길이의 SMN mRNA를 만들도록 스플라이싱되나, SMN2의 경우에는 80% 이상의 SMN pre-mRNA가 선택적 스플라이싱을 통해 비정상적 길이의 mRNA를 만들어낸다. 따라서 SMN1이 결손되거나, 7번 엑손의 c.840에 위치하는 시토신이 SMN2와 같이 티민으로 변이를 일으킨 경우 결과적으로 SMN 단백질이 부족해져 SMA가 발병 하게된다. 따라서 7번 엑손의 c.840 위치의 단일 염기 차이를 정확하게 구분할 경우 SMA 환자 혹은 보인자 여부를 확인 가능하다. As can be seen in FIG. 1, most of SMN pre-mRNAs are spliced into normal length SMN mRNA in case of SMN1 , but more than 80% of SMN pre-mRNAs in SMN2 are spliced by abnormal splicing MRNA < / RTI > Thus SMN1 the defect or if the cytosine which is located in one of the seven exons c.840 caused the transition to thymine as SMN2 As a result, SMN protein runs out is SMA is endemic. Therefore, if the single base difference of c.840 position of
또한 앞에서 언급하였듯이 SMN1 유전자가 결손되었을 경우라도, SMN2 유전자는 20% 가량의 유효한 SMN 단백질을 생산 가능하다. 따라서 환자가 보유한 SMN2의 유전자 카피수가 많으면 많을수록 병증의 강도가 완화되며, 이를 파악하기 위해서는 정량적인 분석 기술이 필요하게 된다.Also, as mentioned above, SMN2 gene can produce about 20% effective SMN protein even if SMN1 gene is defective. Therefore, the greater the number of copies of SMN2 gene in a patient, the more the intensity of the disease is relieved and quantitative analysis technique is needed to understand it.
SMN 유전자 8번 엑손의 단일 염기 차이는 7번 엑손에 비해 중요도가 높지 않은 것으로 알려져 있으나, SMA를 진단하기 위해 개발되었던 과거 기술들의 경우 정량적 분석의 정확도를 향상시키기 위해 7번 엑손과 함께 분석되었다. 또한 이들을 동시에 분석할 경우 SMN1 과 SMN2 간의 다양한 전환 현상을 이해하는 데에 큰 도움을 줄 수 있다. 따라서 7번 엑손과 8번 엑손의 단일 염기 변이를 모두 파악하고 이들의 유전자 카피수를 파악하는 것이 SMA의 정확한 진단에 필수적이라 할 수 있다. Single nucleotide differences in
이에 따라 SMA를 진단하기 위해서 현재 임상에서 SMN 유전자의 카피 수 분석이 가장 널리 사용되고 있다. 현재 단일 염기 차이를 분석하기 위한 다양한 단염기 다형성 분석 기술들이 개발되어 있으나, SMA의 경우 그 정확한 진단을 위해서는 정량적 분석이 필요하며, 따라서 현재 상용화된 기술들 중 MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification) 기술만이 임상에서 활용되고 있다. Therefore, in order to diagnose SMA, the number of copies of SMN gene is most widely used in clinic. Although a variety of monoclonal polymorphism analysis techniques have been developed for analyzing single nucleotide differences, quantitative analysis is required for accurate diagnosis of SMA. Thus, among the currently commercialized technologies, multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) Is being utilized in this clinic.
그러나, MLPA를 이용한 SMN 유전자 카피 수 분석은 SMN1과 SMN2를 동시에 정량적으로 분석이 가능하나, 서로간에 하나의 염기 차이를 갖는 유사한 서열에 특이적으로 혼성화 (hybridization) 및 결찰 (ligation) 하기 위해 16 시간 이상의 혼성화 반응을 필요로 하여 그 효율성이 부족하다는 문제점이 있었다.However, the analysis of SMN gene copy number using MLPA can quantitatively analyze SMN1 and SMN2 at the same time. However, in order to specifically hybridize and ligate to a similar sequence having one base difference from each other, There is a problem in that the efficiency is insufficient.
최근에는 HEC/HPC (hydroxyethyl cellulose/hydroxypropyl cellulose) 고분자 블렌드를 모세관 전기영동용 충진재로 활용하여 SMN1과 SMN2에서 다중 PCR을 통해 얻어진 7번 및 8번 엑손 유래 DNA 단편을 분리 정량하는 기술이 개발되었다. (Anal Bioanal Chem. 2010 July;397(6);2375-83) 해당 기술에서는 기존 모세관 전기영동용 충진재로는 분리하기 어려운 단일 염기 차이를 갖는 DNA 단편들을 HEC/HPC 고분자 블렌드를 이용한 모세관 전기영동을 통해 분리하였다. Recently, a technology to separate and quantify DNA fragments derived from
그러나, 해당 기술에서 얻어진 모세관 전기영동 피크의 경우 서로간의 해상도 차이가 높지 않아 피크 간 겹침이 많아 피크 넓이를 이용한 분석이 불가능하고, 피크의 높이를 이용한 분석만이 가능하여 정량적 분석 능력이 크게 감소하게 된다. 또한, 모세관 전기영동 피크의 경우 7번 엑손과 8번 엑손에서 유래한 피크들을 서로 분리하기 위해 타깃 특이적 프라이머와 공통 프라이머를 이용하는 2 단계의 다중 중합효소 연쇄반응을 이용하며, 이는 분석 시간을 증가시키고 분석 정확도를 감소시키는 원인이 된다.
However, in the capillary electrophoresis peak obtained by the technique, there is not a high resolution difference between the two peaks, and there is a lot of overlap between the peaks, so that it is impossible to analyze using the peak width and only the peak height can be analyzed. do. In order to separate the peaks derived from
본 발명은 상기와 같은 기존 기술의 문제점을 해결하기 위해 공통 프라이머 서열이 포함되지 않은 간편한 SMA 진단용 다중 중합효소연쇄반응 프라이머, 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다. It is an object of the present invention to provide a simple multiplex PCR primer and a primer set for SMA diagnosis that do not include a common primer sequence in order to solve the problems of the conventional techniques.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 SMA 진단용 다중 중합효소연쇄반응 프라이머, 프라이머 세트를 이용하여 CE-SSCP (capillary electrophoresis-based single strand conformation polymorphism)을 통한 SMA 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
It is another object of the present invention to provide an SMA diagnostic method using capillary electrophoresis-based single strand conformation polymorphism (CE-SSCP) using a SMA diagnostic multi-polymerase chain reaction primer and a primer set according to the present invention.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명에 의한 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트는 SMN 유전자 7번 엑손인 SMN 1 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. The present invention provides a primer set for diagnosing spinal muscular atrophy comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2 to solve the above problems. A primer set for the diagnosis of spinal muscular atrophy comprising the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2 according to the present invention is characterized in that it specifically binds to SMN1, an exon of SMN gene .
본 발명은 또한, 서열번호 3의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 4의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명에 의한 서열번호 3의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 4의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트는 SMN 유전자 8번 엑손인 SMN 2 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. The present invention also provides a primer set for diagnosing spinal muscular atrophy comprising a forward primer of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer of SEQ ID NO: 4. The primer set for the diagnosis of spinal muscular atrophy comprising the forward primer of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4 according to the present invention specifically binds to SMN2, the
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트; 및 본 발명에 의한 서열번호 3의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 4의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트; 를 동시에 포함하는 척수성 근위축증 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a primer set for diagnosing spinal muscular atrophy comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2 according to the present invention; A primer set for the diagnosis of spinal muscular atrophy consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3 according to the present invention and a reverse primer of SEQ ID NO: 4; The present invention provides a composition for diagnosing spinal cord muscular atrophy.
본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단용 조성물은 RNase P 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. The composition for diagnosing spinal muscular atrophy according to the present invention is characterized by further comprising a primer set of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for specifically amplifying the RNase P gene.
본 발명은 또한, The present invention also relates to
(a)시료 DNA 를 준비하는 단계; (a) preparing a sample DNA;
(b) 상기 시료 DNA 를 주형으로 하여 제 3 항에 의한 척수성 근위축증 진단용 조성물을 이용하여 PCR 을 수행하는 단계; 및 (b) performing PCR using the sample DNA as a template and using the composition for diagnosing spinal cord muscular atrophy according to (3); And
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 를 포함하는 척수성 근위축증 진단 방법을 제공한다. (c) separating the PCR products by size; And a method for diagnosing spinal cord muscular atrophy.
본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 크기별로 분리는 CE-SSCP(capillary electrophoresis-based single strand conformation polymorphism) 분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다. In the method for diagnosing spinal muscular atrophy according to the present invention, the separation according to the size of step (c) is performed by CE-SSCP (capillary electrophoresis-based single strand conformation polymorphism) analysis.
본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단 방법을 도 2에 개략적으로 나타내었다. 본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단 방법은 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명에 의한 7번 엑손과 8번 엑손을 목표로 하는 프라이머에 의해 시료 DNA 에 대한 다중 중합효소연쇄반응을 수행하고, 이를 통해 얻어진 DNA 단편들을 고해상도를 달성 가능한 CE-SSCP (capillary electrophoresis-based single strand conformation polymorphism)을 통해 분리하는 것을 특징으로 한다. A method for diagnosing spinal muscular atrophy according to the present invention is schematically shown in Fig. As shown in FIG. 2, the method for diagnosing spinal muscular atrophy according to the present invention comprises performing a multiple polymerase chain reaction on a sample DNA with a
모세관 전기영동(이하, "CE"라고 함) 은 아래와 같은 기술적 이점으로 인해 광범위하게 사용되는 분석 방법이다. (i) 분리용 매질을 포함하는 모세관은 높은 표면 대 부피비를 갖고, 효과적으로 열을 발산하며, 이어 이는 고전압 필드가 신속한 분리를 위해 사용되도록 하고; (ii) 최소 시료 부피가 요구되고; (iii) 탁월한 분해능이 달성될 수 있으며; (iv) 상기 기법은 용이하게 자동화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Camilleri, Ed.,Capillary Electrophoresis: Theory and Practice(CRC Press, Boca Raton, 1993)] 및 문헌[Grossman et al., Eds., Capillary Electrophoresis (Academic Press, San Diego, 1992) 참조). 이러한 이점들로 인해, 생체분자의 분리에 CE를 응용하거나, CE를 이용한 단일쇄 형태변환 다변성을 분석하는데 관심을 가져왔다.Capillary electrophoresis (hereinafter referred to as "CE ") is a widely used analytical method due to the following technical advantages: (i) the capillary containing the separation medium has a high surface-to-volume ratio and effectively dissipates heat, which allows the high-voltage field to be used for rapid separation; (ii) a minimum sample volume is required; (iii) excellent resolution can be achieved; (iv) The technique can be easily automated (see, for example, Camilleri, Ed., Capillary Electrophoresis: Theory and Practice (CRC Press, Boca Raton, 1993) and Grossman et al., Eds. , Capillary Electrophoresis (Academic Press, San Diego, 1992)). With these advantages, attention has been paid to the application of CE to the separation of biomolecules, or to the analysis of single-strand conformation polymorphism using CE.
본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단 방법에 있어서, 단일쇄 형태변환 다형성 (SSCP)은 돌연변이에 의한 DNA 뉴클레오티드 서열의 변화가 단일쇄 DNA의 구조적 접힘의 변화를 일으키고, 전기영동시 이동거리에 차이가 생기는 원리, 즉, DNA를 구성하는 염기들(A,T,C,G)이 전기에 끌려가는 정도가 다름을 이용한다. 방법적으로는 정상적인 것과 돌연변이를 갖는 DNA를 고온에서 열변성시켜 급냉시킨 PCR 산물의 DNA 단면은 염기 배열에 따라 특유한 2차 구조가 되며, 전기 영동에 의해 이 구조의 차이를 조사하는 것이다. 즉, 단일 가닥으로 만든 후 다시 결합시키고, 이를 전기영동하면, 한 개의 염기가 바뀌어 있어도 차이가 나타나므로, 전기영동시킨 겔 상태에서 나타나는 DNA의 양상을 정상적인 것과 비교하여 확인하는 방법이다.In the method for diagnosing spinal muscular atrophy according to the present invention, single strand conformation polymorphism (SSCP) is a method in which a change in the DNA nucleotide sequence due to a mutation causes a change in the structural folding of single strand DNA, Principle, that is, the degree to which the bases (A, T, C, G) constituting DNA are attracted to electricity are different. As a method, the DNA fragment of the PCR product which is quenched by heat denaturation of the DNA having the normal and the mutation at a high temperature becomes a secondary structure peculiar to the nucleotide sequence, and the difference of the structure is examined by electrophoresis. That is, when DNA is made into a single strand, it is recombined, and when it is electrophoresed, a difference is observed even when one base is changed. Therefore, it is a method to confirm the appearance of DNA in an electrophoresis gel state.
본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단 방법은 공통 프라이머 서열을 필요로 하지 않는 간편한 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex PCR)을 이용해 척수성 근위축증을 높은 정확도로 진단할 수 있다.
The method of diagnosing spinal muscular atrophy according to the present invention can diagnose spinal muscular atrophy with high accuracy by using simple multiplex PCR which does not require a common primer sequence.
본 발명에 의한 척수성 근위축증 진단용 프라이머 및 이를 이용한 척수성 근위축증 진단 방법은 한번의 다중 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 분석 시간이 단축되면서도 피크간의 겹침이 없어 SMN1과 SMN2를 동시에 높은 해상도로 분리가 가능하여 기존 기술에 비해 정량적 분석 능력이 향상되며, 이에 따라 척수성 근위축증에 대한 정확한 진단이 가능하다.
The primer for the diagnosis of spinal muscular atrophy according to the present invention and the method for diagnosing spinal muscular atrophy using the same are capable of separating SMN1 and SMN2 at a high resolution at the same time because there is no overlap between peaks while shortening the analysis time by using a single polymerase chain reaction Quantitative analysis capability is improved compared to existing techniques, and accurate diagnosis of spinal muscular atrophy is possible.
도 1은 SMN 유전자의 선택적 스플라이싱 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명이 제안하는 SMA진단 기술의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 SMN1 및 SMN2 유전자 유래 7번 및 8번 엑손, 그리고 내부 표준용 RNaseP 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용해 얻어진 DNA 단편을 CE-SSCP를 이용하여 분리 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 SMN1 및 SMN2 유전자 유래 7번 및 8번 엑손, 그리고 내부 표준용 RNaseP 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 다양한 SMA 모사 조건에 대해 적용, 이를 통해 얻어진 DNA 단편을 CE-SSCP를 이용하여 분리 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 SMN1 및 SMN2 유전자 유래 7번 및 8번 엑손, 그리고 내부 표준용 RNaseP 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 다양한 SMA 모사 조건에 대해 적용, 이를 통해 얻어진 CE-SSCP 피크의 넓이를 이용해 정량적 분석 능력을 나타낸 도면이다.1 is a schematic diagram showing an optional splicing process of the SMN gene.
2 is a schematic diagram of the SMA diagnostic technology proposed by the present invention.
FIG. 3 is a photograph showing a DNA fragment obtained by using
FIG. 4 is a graph showing the results obtained by applying the primers for specifically amplifying the RNase P gene for
FIG. 5 is a graph showing the results obtained by applying the primers for specifically amplifying the RNase P gene for
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the present invention is not limited by the following examples.
<실시예 1> 검출 대상이 되는 ≪ Example 1 > SMNSMN 유전자의 서열 결정 및 분석용 프라이머 디자인 Primer design for gene sequencing and analysis
SMA 진단에 있어 가장 중요한 영역인 SMN 유전자 7번 엑손 및 8번 엑손, 그리고 정량적 분석을 수행하는데 있어 필요한 내부 표준용 RNaseP 유전자에 대한 염기서열을 NCBI 유전자 데이터베이스를 통해 획득하였다. The nucleotide sequences of the
이들 염기서열에 대한 프라이머를 설계하기 위해 균일한 PCR 증폭효율과 단일 염기 변이에 대한 이동도 차이를 갖는 조건을 택하였다. 먼저 PCR을 통해 얻어지는 DNA 단편들이 비슷한 증폭 효율을 가질 수 있도록 단편의 길이를 100에서 200 bp를 갖도록 설계하였다. 이러한 길이 범위 내에서는 PCR 수행 시 DNA 단편의 증폭 효율이 이론적 최대값을 가지므로, 모든 DNA 단편이 비슷한 증폭 효율을 가질 수 있다. In order to design the primers for these nucleotide sequences, conditions with homogeneous PCR amplification efficiency and mobility difference for single base mutation were selected. First, the length of the fragment was designed to be 100 to 200 bp so that the DNA fragments obtained by PCR had similar amplification efficiency. Within this length range, the amplification efficiency of DNA fragments at the time of PCR has the theoretical maximum value, so that all DNA fragments can have similar amplification efficiency.
그 다음으로 단일 염기 변이에 따른 이동도 차이를 주기 위해 완전히 변성된 단일 가닥 DNA가 안정한 구조를 갖는 접힌 DNA로 변화할 때 나타나는 Gibb's 자유 에너지 차이를 MFOLD를 이용해 예측하였다. Gibb's 자유 에너지 차이가 일정 이상 나타날 경우, 단일 염기 차이만을 갖는 DNA 단편들의 경우라도 이동도 차이를 갖는 것으로 알려져 있으므로, 이와 같은 조건을 갖는 DNA 단편을 획득 가능한 프라이머를 설계하였다. 또한 이를 모세관 전기영동에서 분석할 수 있도록 한 쪽 프라이머에 형광 표지(FAM)를 표식하였다. 완성된 SMA 진단용 SMN 유전자 분석 프라이머는 다음 표 1과 같다. Next, Gibb's free energy difference, which occurs when fully denatured single-stranded DNA changes into folded DNA with a stable structure, is predicted using MFOLD to give a difference in mobility according to single base mutation. When Gibb's free energy difference is more than a certain level, it is known that DNA fragments having only a single base difference have mobility differences. Therefore, a primer capable of obtaining DNA fragments having such conditions is designed. A fluorescence label (FAM) was labeled on one of the primers so that it could be analyzed by capillary electrophoresis. The completed SMA diagnostic SMN gene analysis primer is shown in Table 1 below.
(서열번호 1) E7-label
(SEQ ID NO: 1)
(서열번호 2)E7-nonlabel
(SEQ ID NO: 2)
(서열번호 3)E8-label
(SEQ ID NO: 3)
(서열번호 4)E8-nonlabel
(SEQ ID NO: 4)
(서열번호 5)RP-label
(SEQ ID NO: 5)
(서열번호 6)RP-nonlabel
(SEQ ID NO: 6)
<실시예 2> SMN 7번 및 8번 엑손 특이적 유전자를 이용한 검출 실험Example 2 Detection Experiment Using Exon-Specific Gene of SMN Nos. 7 and 8
<실시예 2-1> 다증 PCR을 통한 ≪ Example 2-1 > SMNSMN 유전자 유래 증폭 산물 획득 Gene-derived amplification products obtained
SMN 유전자의 7번 및 8번 엑손, 그리고 내부 표준으로 사용될 RNaseP 유전자의 DNA(서열번호 5 및 서열 번호 6)는 reference genomic DNA 를 구입, 이를 클로닝하여 검출에 사용하였다.
다중 PCR을 수행하기 위해 ExTaq DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan)를 구입하여 사용하였다. 다중 PCR 반응은 20L의 혼합액 내에 0.25mM의 각 dNTP와 1 unit의 ExTaq DNA polymerase를 공통으로 포함하였다. 7번 엑손의 증폭을 위해 20 pmol의 FAM-labeled 프라이머(서열번호 1) 와 5 pmol의 non-labeled 프라이머(서열번호 2) 를 사용하였고, 8번 엑손의 증폭을 위해 50 pmol의 FAM-labeled 프라이머(서열번호 3) 와 5 pmol의 non-labeled 프라이머(서열번호 4) 를 사용하였으며, 내부 표준인 RNaseP의 증폭을 위해 20 pmol의 FAM-labeled 프라이머(서열번호 5) 와 5 pmol의 non-labeled 프라이머(서열번호 6) 를 혼합액에 포함시켰다. 해당 혼합액은 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 30회 수행하여 타깃 DNA 단편의 증폭을 수행하였다.
ExTaq DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan) was purchased and used for multiplex PCR. The multiplex PCR reaction contained 0.25 mM each dNTP and 1 unit of ExTaq DNA polymerase in a 20 L mixture. 20 pmol of FAM-labeled primer (SEQ ID NO: 1) and 5 pmol of non-labeled primer (SEQ ID NO: 2) were used for the amplification of
<실시예 2-2> 증폭산물의 CE-SSCP를 통한 검출≪ Example 2-2 > Detection of amplification product by CE-SSCP
얻어진 증폭 산물을 3차 증류수를 사용하여 희석 후 시료 1 ㎕와 ROX 500 size standards (Applied Biosystems) 0.2 ㎕, HiDi deionized formamide 8.8 ㎕ 혼합한 후 95℃에서 5분간 반응시키고 4℃에서 3분 이상 두었다. The obtained amplification product was diluted with tertiary distilled water, mixed with 1 μl of sample, 0.2 μl of ROX 500 size standards (Applied Biosystems) and 8.8 μl of HiDi deionized formamide, reacted at 95 ° C for 5 minutes, and left at 4 ° C for more than 3 minutes.
PEO-PPO-PEO (polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide) 삼중블록궁중합체를 모세관 전기영동용 충진재로 이용하고,이 시료를 ABI 3130xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems)를 사용하여 CE-SSCP (Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 수행하고, 증폭된 DNA 단편들을 CE-SSCP를 이용해 분석하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. PEO-PPO-PEO triple block copolymers were used as fillers for capillary electrophoresis, and these samples were analyzed by CE-SSCP (Capillary Electrophoresis) using an ABI 3130xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Single strand conformation polymorphism was performed, and the amplified DNA fragments were analyzed using CE-SSCP. The results are shown in FIG.
도 3에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 진단 검사용 프라이머는 각 SMN 유전자 유래 엑손에 대해 특이적인 피크를 나타내는 것을 알 수 있으며, 복수의 프라이머를 사용할 경우에도 해당 유전자 유래 엑손을 독립적으로 동시에 분석할 수 있음을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 3, it can be seen that the primer for diagnostic test according to the present invention shows a specific peak for exon derived from each SMN gene, and even when a plurality of primers are used, .
<실시예 3> 각 SMA 모사 조건을 이용한 SMA 진단 검사≪ Example 3 > SMA diagnostic test using each SMA simulation condition
SMN 유전자의 정량적 분석을 위해 SMN 1과 SMN 2의 비율을 조절한 6가지 SMA 조건을 모사하고 이에 대한 동시 분석을 수행하였다. For the quantitative analysis of SMN gene, six SMA conditions were controlled and
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 SMA 진단 검사용 프라이머를 이용, 다중 PCR을 수행한 도면이다. 도 4를 통해 알 수 있듯 각 SMN 유전자 엑손의 양에 따라 다중 PCR 결과에서 피크의 크기가 달라짐을 알 수 있다. FIG. 4 is a diagram showing multiplex PCR performed using the SMA diagnostic test primer obtained in Example 1 of the present invention. FIG. As can be seen from FIG. 4, the magnitude of the peak in the multiplex PCR results varies depending on the amount of each SMN gene exon.
도 5는 해당 실험을 3회 반복하여 수행한 뒤 계측된 상대적 피크 넓이와 모사된 유전자 카피 수 간의 정량적 관계를 나타낸 도면이다. 도 5를 통해 본 발명의 정량적 분석 능력이 탁월함을 확인할 수 있으며, 복수의 프라이머를 사용함에도 불구하고 정량적 분석이 가능함을 알 수 있다.
FIG. 5 is a graph showing the quantitative relationship between the measured relative peak width and the number of copied gene copies after the experiment was repeated three times. It can be seen from FIG. 5 that the quantitative analysis capability of the present invention is superior, and it is possible to perform quantitative analysis even though a plurality of primers are used.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Primers for testing spinal muscular atrophy, and a method for testing spinal muscular atrophy using the same <130> DPP-2013-0286 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 1 gagcaccttc cttctttttg attttgtct 29 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 2 tctatatagc tatttttttt aacttccttt att 33 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 3 gtgaaatatt ttactggact ctatttt 27 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 4 aggcagttga gaaaatttga a 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 5 tcagcgttcg aattccat 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 6 gtgcaggtta tagggagct 19 <110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Primers for testing spinal muscular atrophy, and a method for testing spinal muscular atrophy using the same <130> DPP-2013-0286 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 1 gagcaccttc cttctttttg attttgtct 29 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 2 tctatatagc tatttttttt aacttccttt att 33 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 3 gtgaaatatt ttactggact ctatttt 27 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 4 aggcagttga gaaaatttga a 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 5 tcagcgttcg aattccat 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 6 gtgcaggtta tagggagct 19
Claims (6)
A primer set for the diagnosis of spinal muscular atrophy consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2.
A primer set for the diagnosis of spinal muscular atrophy comprising a forward primer of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer of SEQ ID NO: 4.
제 2 항에 의한 서열번호 3의 정방향 프라이머(forward primer)와 서열번호 4의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진 척수성 근위축증 진단용 프라이머 세트; 를 동시에 포함하는 척수성 근위축증 진단용 조성물.
A primer set for diagnosing spinal muscular atrophy consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2 according to claim 1; And
A primer set for diagnosing spinal muscular atrophy consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer of SEQ ID NO: 4 according to claim 2; At the same time, for the diagnosis of spinal muscular atrophy.
RNase P 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 프라이머 세트를 더 포함하는 척수성 근위축증 진단용 조성물.
The method of claim 3,
A primer set of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for specifically amplifying the RNase P gene.
(b) 상기 시료 DNA 를 주형으로 하여 제 3 항에 의한 척수성 근위축증 진단용 조성물을 이용하여 PCR 을 수행하는 단계; 및
(c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 를 포함하는 척수성 근위축증 진단 방법.
(a) preparing a sample DNA;
(b) performing PCR using the sample DNA as a template and using the composition for diagnosing spinal cord muscular atrophy according to (3); And
(c) separating the PCR products by size; / RTI > a method for diagnosing spinal atrophy.
상기 (c) 단계의 크기별로 분리는 CE-SSCP(capillary electrophoresis-based single strand conformation polymorphism) 분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 척수성 근위축증 진단 방법.
6. The method of claim 5,
Wherein the step (c) is performed by size-independent single-strand conformation polymorphism (CE-SSCP) analysis.
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- 2014-09-01 KR KR1020140115366A patent/KR20160026444A/en active Search and Examination
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