KR20160017520A - Cell line for cell-based high-throughput screening of CLC-Ka channel modulators using YFP fluorescence imaging and broad-spectrum studies of CLC-Ka channels - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a cell line which includes a gene to code a CLC-Ka channel, a gene to code Barttin (Y98A), and a gene to code fluorescence protein by being transformed to a plasmid. The CLC-Ka channel and the Barttin (Y98A) are epitope-tagged to an N-terminal or a C-terminal and the fluorescence protein reacts to a halide ion as a yellow color. The cell line stably expresses the CLC-Ka channel, the Barttin (Y98A), and the fluorescence protein. Moreover, the cell line has a stable induction expression system expressed by tetra-cycline induction, can be used for a high efficiency search using cell-based fluorescence imaging, can be used for a study of a signal transmission process within a cell wherein the CLC-Ka channel and the Barttin (Y98A) are involved by stably expressing the CLC-Ka channel and the Barttin (Y98A), and can be widely used for a molecule level study for a CLC-Ka channel code of action using the cell line according to the present invention, a physiologic function study, and the prevention and therapeutic agent development of kidney and heart diseases related to the CLC-Ka channel such as hyponatremia or the likes.

Description

CLC-Ka 염화 이온 채널 조절물질 도출을 위한 세포기반 형광 이미징 고효율 검색 및 광범위 특성 연구용 세포주 {Cell line for cell-based high-throughput screening of CLC-Ka channel modulators using YFP fluorescence imaging and broad-spectrum studies of CLC-Ka channels}[0001] Cell-Based Fluorescence Imaging for Deriving CLC-Ka Chloride Ion Channel Regulators [0002] Cell lines for high-throughput and broad-spectrum characterization studies are described in the following: Cell line for cell-based high-throughput screening of CLC-Ka channel modulators using YFP fluorescence imaging and broad- -Ka channels}

본 발명은 CLC-Ka 염화 이온 채널 조절물질을 도출하기 위한 세포기반의 형광 이미징 고효율 검색 및 광범위 특성 연구용 세포주에 관한 것이다.The present invention relates to a cell line for cell-based fluorescence imaging, high-throughput screening and broad-spectrum characterization for deriving a CLC-Ka chloride ion channel modulating substance.

전압의존성 염화 이온 채널 (voltage-gated chloride channel)인 CLC 채널은 세포막 사이 염화 이온의 흐름을 조절함으로써 근육 이완 및 수축, 호르몬 분비, 염의 재흡수 등 다양한 세포내 작용을 조절한다. 이러한 인간 CLC 채널은 현재까지 CLC-1 채널부터 CLC-7 채널, 그리고 CLC-Ka 채널과 CLC-Kb 채널을 포함하여 총 9종이 알려져 있으며, 신경, 근육, 심혈관, 상피조직 등에서 중요한 기능을 담당하고 있다. 또한, CLC 채널은 근 무력증, 간질, 망막퇴화, 만성 신장질환, 골다공증, 희귀 유전질환인 바터증후군과 Dent 증후군 등에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.The voltage-gated chloride channel, the CLC channel, regulates various intracellular actions such as muscle relaxation and contraction, hormone secretion, and salt reabsorption by regulating the flow of chloride ions across the cell membrane. These human CLC channels have been known to date, including CLC-1 to CLC-7 channels, and CLC-Ka and CLC-Kb channels, and they play important roles in nerve, muscle, cardiovascular and epithelial tissues have. In addition, CLC channels are known to be associated with myasthenia, epilepsy, retinal degeneration, chronic kidney disease, osteoporosis, Bartter syndrome and Dent syndrome, which are rare genetic diseases.

이 중, CLC-Ka 채널은 신장과 귀에 발현하여 중요한 생리적 기능을 담당한다. 귀에 발현하는 CLC-Ka 채널은 내임파 (endolymph)로의 칼륨 분비를 도와 내이(內耳) 생모세포 (hair cells)에서 감각전달 기능을 담당하고, 신장에 발현하는 CLC-Ka 채널은 신장의 네프론에서 헨레 고리 (Henle's loop)의 얇은 오름 가지 부분에 발현하여 염화 이온 조절을 통해 신장 수질에서 용질의 경사도를 가파르게 유지하는 역할을 한다. 이 가파른 용질 경사도를 통해 요에서 혈액으로의 수분 흡수가 일어나므로 CLC-Ka 채널을 선택적으로 저해할 경우 신장 수질에서 용질의 경사도가 줄어들고 이는 수분 배출의 증가로 이어진다. 따라서 CLC-Ka 채널 저해제는 저나트륨혈증의 치료제로 주목받고 있다.Among them, the CLC-Ka channel plays an important physiological function by expressing in the kidney and the ear. The CLC-Ka channel, which expresses in the ear, is responsible for the secretion of potassium into the endolymph and serves as a sensory transfer function in the inner ear hair cells. The CLC-Ka channel expressed in the kidneys is called the " It is expressed in the thin ascending part of the Henle's loop, and plays a role of steeply maintaining the gradient of the solute in the elongated water quality by controlling the chloride ion. This steep solute inclination causes water absorption from the urine to the blood, so selective inhibition of the CLC-Ka channel leads to a decrease in the inclination of the solute in the renal water quality, leading to an increase in water excretion. Therefore, CLC-Ka channel inhibitors are attracting attention as therapeutic agents for hyponatremia.

저나트륨혈증은 심부전 환자가 수분을 배출하는 신장 기능을 상실할 때 동반하는 심각한 급성 또는 만성 질환으로, 이러한 증상에는 주로 이뇨제가 처방되지만 수분과 함께 다량의 나트륨이 함께 배출되어 저나트륨혈증 증상을 더 악화시킬 수 있으므로, 수분만을 선택적으로 배출시키는 약이 필요하다.Hyponatremia is a serious acute or chronic disease associated with loss of kidney function in patients with heart failure. This symptom is mainly treated with a diuretic, but a large amount of sodium together with water is discharged together with the symptoms of hyponatremia It may be exacerbated, so that a medicine for selectively discharging only water is required.

지금까지 바소프레신-2 수용체 저해제가 유일하게 미국 식약청의 허가를 받았으나 약 20%의 환자에게는 이 약이 듣지 않으므로 새로운 분자 표적이 필요하다. CLC-Ka 채널 저해제는 바소프레신-2 수용체 저해제의 완벽한 대안이며 간 질환, 대사 증후군, 이뇨제 부작용 등에 동반하는 저나트륨혈증에도 폭넓게 사용될 수 있다. So far, vasopressin-2 receptor inhibitors have been approved by the US Food and Drug Administration but new drug targets are needed because about 20% of patients do not take this drug. CLC-Ka channel inhibitors are a perfect alternative to vasopressin-2 receptor inhibitors and can be widely used for hyponatremia associated with liver disease, metabolic syndrome, and diuretic side effects.

CLC-Ka 채널을 포함하는 CLC 채널은 발현 장소에 따라 각기 중요한 생리학적 기능을 담당하며 각종 질환에 연관되어 있으나 이에 선택적으로 작용하는 조절물질은 상당히 제한적이다. 지금까지 알려진 CLC 채널 조절물질은 DIDS (4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid) 또는 NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid) 등으로 그 수에서 매우 제한적이며 (약 10종) 낮은 효능과 (IC50 값: 10~300 μM) 낮은 선택성으로 다른 종류의 염화 이온 채널과 수송체, 심지어는 양이온 채널도 저해하는 것으로 알려져 있다.CLC channels, including the CLC-Ka channel, play important physiological functions depending on the site of expression and are involved in various diseases, but the regulatory substances selectively acting on them are quite limited. Previously known CLC channel modulators are very limited in their number by DIDS (4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid) or NPPB (5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzoic acid) (About 10 species) with low potency (IC 50 values: 10-300 μM) and low selectivity are known to inhibit other types of chloride ion channels, transporters, and even cation channels.

이 외에도, CLC-2 채널 저해제로 알려진 전갈 독소는 재연성이 없는 것으로 판명되었으며((Isolation and characterization of a high affinity peptide inhibitor of CLC-2 chloride channels. Thompson CH, Olivetti PR, Fuller MD, Freeman CS, McMaster D, French RJ, Pohl J, Kubanek J, McCarty NA. J Biol Chem. 2009; 284(38): 26051-26062), CLC-K 채널 저해제로 개발된 합성 화합물은(Molecular switch for CLC-K Cl- channel block/activation: optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands. Liantonio A, Picollo A, Carbonara G, Fracchiolla G, Tortorella P, Loiodice F, Laghezza A, Babini E, Zifarelli G, Pusch M, Camerino DC. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(4): 1369-1373) CLC-Ka 채널과 CLC-Kb 채널 사이의 선택성이 부족하다.In addition, the scorpion toxin, known as the CLC-2 channel inhibitor, was found to be non-reproducible (Isolation and characterization of a high affinity peptide inhibitor of CLC-2 chloride channels. Thompson CH, Olivetti PR, Fuller MD, Freeman CS, McMaster D, French RJ, Pohl J, Kubanek J, McCarty NA. J Biol Chem . 2009; 284 (38): 26051-26062), CLC-K channel inhibitor is a synthetic compound developed by (Molecular switch for CLC-K Cl - channel block / activation:. Optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands Liantonio A, Picollo A, Carbonara G, Fracchiolla G, Tortorella P , Loiodice F, Laghezza A, Babini E, Zifarelli G, Pusch M, Camerino DC. Proc Natl Acad Sci USA . 2008; 105 (4): 1369-1373) lacks selectivity between the CLC-Ka channel and the CLC-Kb channel.

따라서, CLC-Ka 채널에 선택적인 조절물질 개발과 기능 및 기전 연구를 위해 CLC-Ka 채널을 연구할 수 있는 시스템이 절실히 요구된다.Therefore, a system capable of studying the CLC-Ka channel for the development of selective regulatory substances in the CLC-Ka channel and for studying the function and mechanism is desperately needed.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 테트라사이클린 유도에 의해 발현되는 유도 안정적 발현시스템을 가지며, 세포기반 형광 이미징을 이용한 고효율 검색에 활용할 수 있으며, 에피토프 태그가 연결된 CLC-Ka 채널과 Barttin(Y98A)를 안정적으로 발현함으로써 CLC-Ka 채널과 Barttin이 관여하고 있는 세포 내 신호전달과정 연구에 활용할 수 있는 세포주를 제공하는 것이다.The object of the present invention is to provide an inducible expression system which is expressed by tetracycline induction, which can be used for high-efficiency retrieval using cell-based fluorescence imaging, stable CLC-Ka channel to which epitope tag is connected and Barttin (Y98A) To provide a cell line that can be utilized in the intracellular signal transduction process involved in CLC-Ka channel and Barttin.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 세포주를 이용하여, 세포기반 형광 이미징을 이용한 CLC-Ka 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a highly efficient method for detecting CLC-Ka channel modulating substances using cell-based fluorescence imaging using the cell line.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,In order to solve the above problems,

CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포주로서, 상기 CLC-Ka 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그되어 있고, 상기 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하고, 상기 CLC-Ka 채널, Barttin(Y98A) 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포주를 제공한다.A cell line transformed with a plasmid comprising a gene encoding CLC-Ka channel, a gene encoding Barttin (Y98A) and a gene encoding a fluorescent protein, wherein the CLC-Ka channel and Barttin (Y98A) Characterized in that the fluorescent protein is epitope tagged at the C-terminus and that the fluorescent protein reacts with the halide ion in the yellow color and stably expresses the CLC-Ka channel, Barttin (Y98A) and fluorescent protein do.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플라스미드는 상기 유전자들이 서열번호 7 또는 9로 표시되는 2A 펩타이드로 연결된 것일 수 있고, 도 2의 개열지도로 표시되는 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the plasmid may be one in which the genes are linked to the 2A peptide represented by SEQ ID NO: 7 or 9, and may be represented by a cleavage map in Fig.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the gene encoding the CLC-Ka channel may be represented by SEQ ID NO: 1.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the gene encoding Barttin (Y98A) may be represented by SEQ ID NO: 3.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 YFP(H148Q/I152L)일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the gene coding for the fluorescent protein may be YFP (H148Q / I152L) represented by SEQ ID NO: 5.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 에피토프 태그는 HA(Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV 또는 His6일 수 있다.According to another embodiment of the invention, the epitope tag may be a HA (Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV, or His 6.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 세포주는 수탁번호 KCTC18306P로 기탁된 것일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the cell line may be one deposited with Accession No. KCTC18306P.

또한, 본 발명은 (a) 상기 세포주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 세포주를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 완충용액에서 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 세포주에 요오드 이온을 주입하는 단계; 및 (d) 요오드 이온의 세포 내 유입에 따른 YFP 형광 소광을 측정하는 단계;를 포함하는 CLC-Ka 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공한다.(A) culturing the cell line; (b) washing the cultured cell line with a buffer solution in which the chloride ion is replaced with gluconate; (c) injecting iodine ions into the washed cell line; And (d) measuring YFP fluorescence quenching due to intracellular inflow of iodine ions. The present invention also provides a highly efficient method for detecting CLC-Ka channel control substances.

본 발명에 따른 세포주는 인간 CLC-Ka 채널 유전자와 인간 Barttin(Y98A), 그리고 형광 단백질 유전자가 각각 안정적으로 발현함으로써 CLC-Ka 채널에 선택적으로 작용하는 조절물질의 검색 효율을 증가시키고, CLC-Ka 채널의 신호전달에 관여하는 선택적 결합 단백질에 대한 연구시간을 단축할 수 있으며, 특히 염화 이온을 검출할 수 있는 형광 단백질을 함께 발현시킴으로써 형광 물질의 표지 없이도 고효율 검색이 가능하도록 한다. 따라서, 본 발명에 따른 세포주를 이용한 CLC-Ka 채널 작용기작에 대한 분자수준의 연구, 생리학적 기능 연구, 저나트륨혈증 등 CLC-Ka 채널과 관련된 신장 및 심장질환의 예방 및 치료제 개발에 널리 활용될 수 있다.The cell line according to the present invention stably expresses the human CLC-Ka channel gene, human Barttin (Y98A), and fluorescent protein gene, thereby increasing the search efficiency of the regulatory substance selectively acting on the CLC-Ka channel, The time for selective binding protein involved in signal transduction of the channel can be shortened. In particular, a fluorescent protein capable of detecting chloride ion is co-expressed to enable highly efficient detection without labeling of the fluorescent substance. Therefore, it is widely used for development of a preventive and therapeutic agent for kidney and heart disease related to CLC-Ka channel such as study of molecular level of CLC-Ka channel mechanism using cell line according to the present invention, study of physiological function, hyponatremia .

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 2A 펩타이드로 연결된 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자를 포함하는 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 co-transfection에 사용된 pOG44 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 4는 야생형 T-REx HEK293 세포의 Hygromycin B에 대한 세포 생존력을 측정한 그래프이다.
도 5는 RT-PCR 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) mRNA의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 Western blot 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주에서 HA-CLC-Ka 채널, Barttin(Y98A)-Myc 및 YFP(H148Q/I152L) 단백질 각각의 개체로의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 형광 이미징 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 YFP(H148Q/I152L) 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 CLC-Ka 채널의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram of HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) linked with a 2A peptide according to one embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a cleavage map of a plasmid containing HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing a cleavage map of pOG44 plasmid used for co-transfection according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing cell viability of wild-type T-REx HEK293 cells against Hygromycin B. FIG.
FIG. 5 shows the results of RT-PCR of YFP (H148Q / I152L) gene of T-REx HEK293 cell line transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) I152L) < / RTI > mRNA.
6 shows the results of Western blot analysis of HA-CLC-Ka (H982Q) cells in a T-REx HEK293 cell line transformed with the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) Channel, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) proteins, respectively.
FIG. 7 is a graph showing the fluorescence intensity of YFP (H148Q / I152L) of a T-REx HEK293 cell line transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) ) ≪ / RTI > protein.
FIG. 8A is a graph showing the relationship between the concentration of iodide in the T-REx HEK293 cell line transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene according to an embodiment of the present invention, / I152L) fluorescence measurement results.
FIG. 8B is a graph showing the effect of iodine ion concentration on the T-REx HEK293 cell line transformed with the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene according to an embodiment of the present invention. And the channel activity is measured.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

다양한 세포 내 작용을 조절하는 전압의존성 염화 이온 채널 (voltage-gated chloride channel)인 CLC 채널 중 하나로 알려진 CLC-Ka 채널은 신장과 귀에 발현하여 중요한 생리적 기능을 담당한다.The CLC-Ka channel, known as one of the CLC channels, a voltage-gated chloride channel that regulates a variety of intracellular functions, is expressed in the kidneys and ears and plays an important physiological function.

구체적으로, 귀에 발현하는 CLC-Ka 채널은 내임파 (endolymph)로의 칼륨 분비를 도와 내이(內耳) 생모세포 (hair cells)에서 감각전달 기능을 담당하고, 신장에 발현하는 CLC-Ka 채널은 신장의 네프론에서 헨레 고리 (Henle's loop)의 얇은 오름 가지 부분에 발현하여 염화 이온 조절을 통해 신장 수질에서 용질의 경사도를 가파르게 유지하는 역할을 한다. 이 가파른 용질 경사도를 통해 요에서 혈액으로의 수분 흡수가 일어나므로 CLC-Ka 채널을 선택적으로 저해할 경우 신장 수질에서 용질의 경사도가 줄어들고 이는 수분 배출의 증가로 이어진다. 따라서 CLC-Ka 채널 저해제는 저나트륨혈증의 치료제로 주목받고 있다.Specifically, the CLC-Ka channels expressing in the ear serve to secrete potassium into the endolymph and serve as sensory transfer functions in inner ear hair cells, and the CLC-Ka channel expressed in the kidneys It is expressed in the thin ascending part of the Henle's loop in the nephron, and plays a role in maintaining the steepness of the solute in the kidney water by controlling the chloride ion. This steep solute inclination causes water absorption from the urine to the blood, so selective inhibition of the CLC-Ka channel leads to a decrease in the inclination of the solute in the renal water quality, leading to an increase in water excretion. Therefore, CLC-Ka channel inhibitors are attracting attention as therapeutic agents for hyponatremia.

저나트륨혈증은 심부전 환자가 수분을 배출하는 신장 기능을 상실할 때 동반하는 심각한 급성 또는 만성 질환으로, 이러한 증상에는 주로 이뇨제가 처방되지만 수분과 함께 다량의 나트륨이 함께 배출되어 저나트륨혈증 증상을 더 악화시킬 수 있으므로, 수분만을 선택적으로 배출시키는 약이 필요하다.Hyponatremia is a serious acute or chronic disease associated with loss of kidney function in patients with heart failure. This symptom is mainly treated with a diuretic, but a large amount of sodium together with water is discharged together with the symptoms of hyponatremia It may be exacerbated, so that a medicine for selectively discharging only water is required.

지금까지 바소프레신-2 수용체 저해제가 유일하게 미국 식약청의 허가를 받았으나 약 20%의 환자에게는 이 약이 듣지 않으므로 새로운 분자 표적이 필요하다. CLC-Ka 채널 저해제는 바소프레신-2 수용체 저해제의 완벽한 대안이며 간 질환, 대사 증후군, 이뇨제 부작용 등에 동반하는 저나트륨혈증에도 폭넓게 사용될 수 있다.So far, vasopressin-2 receptor inhibitors have been approved by the US Food and Drug Administration but new drug targets are needed because about 20% of patients do not take this drug. CLC-Ka channel inhibitors are a perfect alternative to vasopressin-2 receptor inhibitors and can be widely used for hyponatremia associated with liver disease, metabolic syndrome, and diuretic side effects.

CLC-Ka 채널을 포함하는 CLC 채널은 발현 장소에 따라 각기 중요한 생리학적 기능을 담당하며 각종 질환에 연관되어 있으나 이에 선택적으로 작용하는 조절물질은 상당히 제한적이다. 지금까지 알려진 CLC 채널 조절물질은 DIDS (4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid) 또는 NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid) 등으로 그 수에서 매우 제한적이며(약 10종) 낮은 효능과 (IC50 값: 10~300 μM) 낮은 선택성으로 다른 종류의 염화 이온 채널과 수송체, 심지어는 양이온 채널도 저해하는 것으로 알려져 있다.CLC channels, including the CLC-Ka channel, play important physiological functions depending on the site of expression and are involved in various diseases, but the regulatory substances selectively acting on them are quite limited. Previously known CLC channel modulators are very limited in their number by DIDS (4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid) or NPPB (5-nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzoic acid) (About 10 species) with low potency (IC 50 values: 10-300 μM) and low selectivity are known to inhibit other types of chloride ion channels, transporters, and even cation channels.

따라서, CLC-Ka 채널에 선택적인 조절물질 개발과 기능 및 기전 연구를 위해 CLC-Ka 채널을 연구할 수 있는 시스템이 절실히 요구된다.Therefore, a system capable of studying the CLC-Ka channel for the development of selective regulatory substances in the CLC-Ka channel and for studying the function and mechanism is desperately needed.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 연구를 수행한 결과, 인간 CLC-Ka 채널 유전자 및 인간 Barttin(Y98A) 유전자와, 형광 단백질 유전자가 각각 안정적으로 발현함으로써 CLC-Ka 채널에 선택적으로 작용하는 조절물질의 검색 효율을 증가시키며 CLC-Ka 채널과 결합하는 단백질 연구에 활용될 수 있는 세포주를 개발하였다.As a result of conducting studies to achieve the above object, the present inventors have found that a regulatory substance which selectively acts on a CLC-Ka channel by stably expressing a human CLC-Ka channel gene, a human Barttin (Y98A) gene and a fluorescent protein gene, And to develop a cell line that can be used in protein studies that bind to the CLC-Ka channel.

구체적으로, 본 발명은 CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포주로서, 상기 CLC-Ka 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그되어 있고, 상기 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하고, 상기 CLC-Ka 채널, Barttin(Y98A) 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포주를 제공한다.Specifically, the present invention provides a cell line transformed with a plasmid containing a gene encoding CLC-Ka channel, a gene encoding Barttin (Y98A), and a gene encoding a fluorescent protein, wherein the CLC-Ka channel and Barttin (Y98A ) Is epitope tagged at the N-terminal or C-terminal, and the fluorescent protein reacts with the halide ion in yellow, and is characterized in that the CLC-Ka channel, Barttin (Y98A) and fluorescent protein are stably expressed Lt; / RTI > cell line.

이때, 사용되는 숙주세포는 HEK293, COS-7, CHO-K1 또는 CHO-G5A인 것이 바람직하며, HEK293인 것이 더욱 바람직하다.At this time, the host cell used is preferably HEK293, COS-7, CHO-K1 or CHO-G5A, more preferably HEK293.

본 발명에 따른 형질전환은 형질주입(transfection) 시스템 및 Flp-In 재조합(recombination) 시스템을 이용하여 수행되며, 이때 상기 형질주입은 리포펙타민(Lipofectamine), Dojindo사의 Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene 및 DreamFect로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 시약을 이용하여 수행되는 것이 바람직하고, 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기청공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.The transformation according to the present invention is carried out using a transfection system and a Flp-In recombination system, wherein the transfection is carried out using Lipofectamine, Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene, And DreamFect, and it is preferable to use one of commercially available reagents selected from the group consisting of calcium-phosphate, positively charged polymer, liposome, nanoparticle, nucleofection, a method using electroporation, heat shock, magnetofection, and a method using retrovirus are preferably used.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플라스미드는 CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 유전자들이 서열번호 7 또는 9로 표시되는 2A 펩타이드로 연결되어 하나의 유전자를 구성하며, 이를 통해 한 유전자에서 인간 CLC-Ka 채널, 인간 Barttin(Y98A) 및 YFP(H148Q/I152L)이 각각의 단백질 개체로 발현될 수 있도록 하였다.According to one embodiment of the present invention, the plasmid comprises a gene encoding CLC-Ka channel, a gene encoding Barttin (Y98A), a gene encoding a fluorescent protein, and a 2A peptide represented by SEQ ID NO: 7 or 9 (Y98A) and YFP (H148Q / I152L) can be expressed as individual proteins from a single gene. The human CLC-Ka channel, human Barttin (Y98A) and YFP (H148Q / I152L)

이때, 상기 2A 펩타이드는 Thoseaasigna virus 2A(T2A) 또는 Equine rhinitis A virus 2A(E2A)인 것이 바람직하며, T2A의 염기서열은 서열번호 7에, 이의 아미노산 서열은 서열번호 8에 기재된 바와 같고, E2A의 염기서열은 서열번호 9에, 이의 아미노산 서열은 서열번호 10에 기재되어 있는 바와 같다.Preferably, the 2A peptide is one of Thoseaasigna virus 2A (T2A) or Equine rhinitis A virus 2A (E2A), the nucleotide sequence of T2A is as shown in SEQ ID NO: 7, its amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 8, The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 10.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 플라스미드는 도 2의 개열지도로 표시되는 pcDNA5/FRT/TO 인 것이 바람직하다.Also, the plasmid according to an embodiment of the present invention is preferably pcDNA5 / FRT / TO represented by the cleavage map of FIG.

본 발명에 따른 상기 CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 기재되어 있는 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재되어 있는 바와 같다.The nucleotide sequence of the gene encoding the CLC-Ka channel according to the present invention is as shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 2.

본 발명에 사용된 Barttin(Y98A) 돌연변이는 Barttin의 98번째 아미노산인 타이로신 (Tyrosine; Y)을 알라닌 (Alanine; A)으로 치환한 형태로 Barttin의 단백질 안정성을 증가시켜 CLC-Ka 채널의 기능적 발현을 증가시키지만, 그 전기 생리학적 성질은 변화시키지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 Barttin(Y98A) 단백질은 heterologous 발현 시스템에서 야생형 Barttin을 대신하여 널리 사용되고 있으며, 상기 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 3에 기재되어 있는 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 4에 기재되어 있는 바와 같다.The Barttin (Y98A) mutation used in the present invention is a form in which Barttin's 98th amino acid, tyrosine (Y), is substituted with alanine (A) and increases the protein stability of Barttin, , But it is known that it does not change its electrophysiological properties. Therefore, the Barttin (Y98A) protein is widely used in place of the wild-type Barttin in the heterologous expression system, and the nucleotide sequence of the gene encoding Barttin (Y98A) is as shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: Lt; / RTI >

또한, 본 발명에 사용된 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하며, 특히 노란색 형광 단백질 (Yellow Fluorescence Protein; YFP)의 148번째 아미노산인 히스티딘 (Histidine; H)이 글루타민 (Glutamine; Q)으로, 그리고 152번째 아미노산인 아이소루신 (Isoleucine; I)이 루신 (Leucine; L)으로 치환된 돌연변이 YFP(H148Q/I152L)인 것이 바람직하다. YFP(H148Q/I152L)는 할라이드 계열의 이온에 의해 형광 소광(fluorescence quenching)을 나타내므로 CLC-Ka 채널을 통한 염화 이온의 흐름을 YFP 형광으로 측정할 수 있고 이는 새로운 CLC-Ka 채널 조절물질 개발에 이용될 것으로 기대된다. 특히, YFP(H148Q/I152L)을 이용하는 방법은 고비용의 형광 염료를 사용할 필요가 없으므로 검색 비용과 시간을 크게 줄일 수 있으며 염료 사용에 따른 세포 독성에서도 자유로울 수 있다. 본 발명에 사용된 형광 단백질인 상기 YFP(H148Q/I152L)을 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 5에 기재되어 있는 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 6에 기재되어 있는 바와 같다.The fluorescent protein used in the present invention is characterized in that it is reacted with a halide ion in yellow color. Especially, Histidine (H) which is the 148th amino acid of Yellow Fluorescence Protein (YFP) reacts with glutamine ) And a mutant YFP (H148Q / I152L) in which the 152th amino acid isoleucine (I) is substituted with Leucine (L). Since YFP (H148Q / I152L) exhibits fluorescence quenching by halide ions, the flow of chloride ions through the CLC-Ka channel can be measured by YFP fluorescence. This is a new CLC-Ka channel control substance It is expected to be used. In particular, the method using YFP (H148Q / I152L) does not require the use of a high-cost fluorescent dye, which can greatly reduce the search cost and time, and can be free from cytotoxicity due to dye use. The nucleotide sequence of the gene encoding the YFP (H148Q / I152L), which is a fluorescent protein used in the present invention, is as shown in SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO:

본 발명에 따른 상기 CLC-Ka 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그(epitope tag)를 코딩하는 서열을 추가로 포함하여 발현되는 단백질의 추적이 용이하도록 한다. 이때, 사용되는 상기 에피토프 태그는 HA(Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV 또는 His6인 것이 바람직하고, 본 발명의 일 실시예에 따르면, HA 또는 c-MYC인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 HA 태그는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌에서 유래한 단편을 말하는 것으로, 일반적으로 발현 벡터에 포함되어 정제 및 분리를 용이하게 하기 위한 태그 용도로 사용된다. 상기 HA 태그는 괄호의 염기서열(tac cct tac gat gtt cca gat tac gct) 및 아미노산 서열(YPYDVPDYA)을 가지는 것일 수 있으며, 또한, 상기 c-MYC 태그는 괄호의 염기서열(gag cag aaa ctc atc tct gaa gag gat ctg) 및 아미노산 서열(EQKLISEEDL)을 가지는 것일 수 있으며, 상기 서열과 다소 차이가 있더라도 단백질 발현을 유도함에 있어 실질적으로 동등한 활성을 가지는 서열 변이체를 포함할 수 있다.The CLC-Ka channel and Barttin (Y98A) according to the present invention further include a sequence encoding an epitope tag at the N-terminus or C-terminus to facilitate tracking of the expressed protein. In this case, the epitope tag to be used is preferably HA (Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV, or the His 6, According to one embodiment of the present invention, it is more preferable to be HA or c-MYC. Further, the HA tag refers to a fragment derived from human influenza hemagglutinin, and is generally included in an expression vector and used for tagging to facilitate purification and separation. The HA tag may have a nucleotide sequence of parentheses (tac cct tac gat gtt cca gat tac gct) and an amino acid sequence (YPYDVPDYA), and the c-MYC tag may have a nucleotide sequence of parentheses (gag cag aaa ctc atc tct gaa gag gat ctg) and an amino acid sequence (EQKLISEEDL), and may have a sequence variant having substantially equivalent activity in inducing protein expression even if slightly different from the above sequence.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포주는 2014년 6월 20일 자로 한국생명공학연구원 미생물 자원센터(Korean Collection for Type Cultures; KCTC)에 기탁된 것으로 수탁번호 KCTC18306P인 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 기탁된 본 발명에 따른 세포주는 도 1에 표시된 바와 같이 T-REX HEK293 세포를 N-말단에 HA 태그된 인간 CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자, C-말단에 c-MYC 태그된 인간 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 코딩하는 유전자가 포함된 것으로, 이를 포함하는 도 2의 개열지도로 표시되는 플라스미드로 형질전환시킨 것으로서, HA-CLC-Ka와 Barttin(Y98A)-Myc 사이에 Thoseaasigna virus 2A (T2A) 펩타이드를, 그리고 Barttin(Y98A)-Myc과 YFP(H148Q/I152L) 사이에 Equine rhinitis A virus 2A (E2A) 펩타이드를 삽입하여 하나의 유전자로 구성하였고, 이를 통해 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 한 유전자에서 HA-CLC-Ka 채널과 Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)이 각각의 단백질 개체로 발현되도록 한 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the present invention, the cell line is deposited on the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) on June 20, 2014 and is a deposit number KCTC18306P. Specifically, As shown in Fig. 1, the cell line according to the present invention was prepared by inserting T-REX HEK293 cells into a culture medium containing a gene encoding a human CLC-Ka channel tagged with HA at the N-terminus, a gene encoding c-MYC c- Y98A), and a gene encoding YFP (H148Q / I152L), which was transformed with a plasmid represented by the cleaved map of FIG. 2, which contained HA-CLC-Ka and Barttin (Y98A ) -Myc and the Equine rhinitis A virus 2A (E2A) peptide between Barttin (Y98A) -Myc and Y148Q / I152L were constructed as a single gene. Through HA-CLC-Ka-Barttin (Y9 HA-CLC-Ka channel, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) were expressed as individual proteins in one gene of the yeast cell line (8A) -Myc-YFP (H148Q / I152L).

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명은 테트라사이클린-조절 발현 인간 신장 배아 세포주인 T-REx HEK293 (Tetracycline-Regulated Expression Human Embryonic Kidney cell line)를 사용하였고, 도 1의 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자를 BamH I과 Xho I 제한효소로 처리한 후 이를 동일하게 처리한 pcDNA5/FRT/TO 벡터에 도입한 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드를 사용하여 야생형 T-REx HEK293 세포를 형질전환시킨 후 배양하여 HA-CLC-Ka 채널과 Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 개별 단백질로 각각 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주를 얻을 수 있었다.As described above, according to one embodiment of the present invention, the tetracycline-regulated human kidney embryo cell line T-REx HEK293 (Tetracycline-Regulated Expression Human Embryonic Kidney cell line) CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene was amplified with BamHI and XhoI (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) -pcDNA5 / FRT / TO plasmid which was introduced into pcDNA5 / FRT / TO vector treated with the restriction enzyme T-REx HEK293 cells were transformed and cultured to obtain the cell line of the present invention in which HA-CLC-Ka channel, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) .

본 발명에서 확립한 세포주가 HA-CLC-Ka 채널과 Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 개별 단백질로 각각 안정적으로 발현하는지 여부는 하기에서 설명할 실시예 등에서 RT-PCR 방법과 Western blot 방법으로 mRNA 수준과 단백질 수준에서 각각 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 세포주는 테트라사이클린 유도로만 단백질을 발현함으로써 배양과정에서 CLC-Ka 채널의 과발현에 의한 세포 유해성을 방지할 수 있다. 또한 세포주에서 같이 발현되는 YFP(H148Q/I152L) 형광을 이용하여 CLC-Ka 채널을 통한 세포 내 할라이드 이온 농도변화를 확인함으로써 본 발명에서 확립한 세포주가 발현하는 CLC-Ka 채널이 세포 내에서 정상적인 기능을 보임을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에서 확립한 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293 세포주는 CLC-Ka 채널을 체계적으로 연구할 수 있는 토대를 제공함이 밝혀졌다.Whether or not the cell line established in the present invention stably expresses the HA-CLC-Ka channel, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) as individual proteins can be determined by RT-PCR And Western blot method, respectively. In particular, the cell line according to the present invention can prevent cytotoxicity due to overexpression of the CLC-Ka channel during the culturing by expressing the tetracycline-inducible pathway protein. Also, by confirming the change in intracellular halide ion concentration through the CLC-Ka channel using YFP (H148Q / I152L) fluorescence expressed in the cell line, the CLC-Ka channel expressing the cell line established in the present invention exhibits a normal function Respectively. Thus, it was found that the H-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) T-REx HEK293 cell line established in the present invention provides a basis for systematically studying the CLC-Ka channel.

또한, 본 발명에 따른 상기 세포주를 이용하여, 세포기반 형광 이미징을 이용한 CLC-Ka 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공할 수 있으며, 구체적으로 (a) 상기 세포주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 세포주를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 완충용액에서 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 세포주에 요오드 이온을 주입하는 단계; 및 (d) 요오드 이온의 세포 내 유입에 따른 YFP 형광 소광을 측정하는 단계;를 포함하는 CLC-Ka 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공한다.
In addition, the method of the present invention can provide a highly efficient screening method of a CLC-Ka channel control substance using cell-based fluorescence imaging using the cell line according to the present invention, and more specifically, (a) culturing the cell line; (b) washing the cultured cell line with a buffer solution in which the chloride ion is replaced with gluconate; (c) injecting iodine ions into the washed cell line; And (d) measuring YFP fluorescence quenching due to intracellular inflow of iodine ions. The present invention also provides a highly efficient method for detecting CLC-Ka channel control substances.

이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments and the like. It will be apparent to those skilled in the art, however, that these examples are provided for further illustrating the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.

이하의 실시예 등에서 사용된 세포주는 T-REx HEK293 (Invitrogen) 세포주이다. T-REx HEK293 세포주는 테트라사이클린-조절 발현 인간 신장 배아 세포주로 본 발명에 사용된 pcDNA5/FRT/TO 벡터에 적합한 세포주이다. 야생형 T-REx HEK293 세포주를 대조군으로, HA-CLC-Ka, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 안정적으로 발현하는 본 발명의 T-REx HEK293 세포주 (HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293)에 대해 실험을 진행한다.
The cell line used in the following examples is the T-REx HEK293 (Invitrogen) cell line. The T-REx HEK293 cell line is a tetracycline-regulated human kidney embryo cell line suitable for the pcDNA5 / FRT / TO vector used in the present invention. The T-REx HEK293 cell line (HA-CLC-Ka-I) of the present invention stably expressing HA-CLC-Ka, Barttin (Y98A) -Myc and YFP (H148Q / I152L) Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) T-REx HEK293).

실시예Example 1. 형질전환 세포주 제작 1. Production of transformed cell line

1-1. 야생형 세포주 배양1-1. Cultivation of wild type cell line

T-REx HEK293 세포주를 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Penicillin/Streptomycin), 15 ㎍/㎖의 블라스티시딘 (Blasticidin), 100 ㎍/㎖의 제오신 (Zeocin)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37 ℃, 95% 공기와 5% CO2의 가습 조건에서 배양한다. 상기 배양액은 3-4일에 한 번씩 교환하고, 세포는 매 주마다 분주(sub-culture)한다.
T-REx HEK293 cell lines were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin / Streptomycin, 15 ug / ml blasticidin, 100 ug / ml Zeocin, In Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium at 37 ° C, humidified with 95% air and 5% CO 2 . The culture medium is exchanged once every 3-4 days, and cells are subcultured every week.

1-2. 야생형 T-1-2. The wild type T- RExREx HEK293HEK293 세포의  Cell HygromycinHygromycin B에 대한 세포 생존력 측정 Measurement of cell viability for B

도 4는 야생형 T-REx HEK293 세포의 Hygromycin B에 대한 세포 생존력을 측정한 그래프이다. HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자로 형질 전환하기 전, 야생형 T-REx HEK293 세포주의 Hygromycin B에 대한 저항성 및 생존력 확인하기 위한 것으로서, 0~600 ㎍/㎖ 사이의 상이한 Hygromycin B 농도에서 야생형 T-REx HEK293 세포를 배양하여 세포 생존력을 확인한 결과, 100 ㎍/㎖ 이상의 Hygromycin B를 처리할 경우 대부분의 세포가 사멸하는 것을 확인하였다.FIG. 4 is a graph showing cell viability of wild-type T-REx HEK293 cells against Hygromycin B. FIG. To confirm the resistance and viability of the wild-type T-REx HEK293 cell line to Hygromycin B before transformation with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene, Ml of Hygromycin B at a concentration of 100 μg / ml or more, and the viability of wild-type T-REx HEK293 cells was observed at different Hygromycin B concentrations.

상기의 결과를 바탕으로 형질 전환 이후 실험에서는 상기 농도의 Hygromycin B를 이용하여 형질 전환된 세포를 선별하였고, 배양과정에서도 동일한 농도를 사용하였다.
Based on the above results, in the post-transformation experiment, the transformed cells were selected using Hygromycin B at the above concentrations, and the same concentrations were used in the culturing process.

1-3. 1-3. HAHA -- CLCCLC -- KaKa -- BarttinBarttin (( Y98AY98A )-) - MycMyc -- YFPYFP (( H148QH148Q // I152LI152L )-) - pcDNA5pcDNA5 // FRTFRT // TOCTR 플라스미드에 의한 형질 전환 세포주 제작 Production of transformed cell line by plasmid

HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드를 이용하여 HA-CLC-Ka, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)이 안정적으로 발현되는 T-REx HEK293 세포주를 다음과 같이 제작한다. 35-mm 배양접시에 1x106개의 야생형 T-REx HEK293 세포를 분주하여 37 ℃, 공기와 CO2가 95:5(%) 비율로 충전된 배양기에서 12시간 동안 배양한다. 배양 후, 도 2의 개열지도로 표시되는 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드와 도 3의 개열지도로 표시되는 pOG44 플라스미드 및 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000)을 1:9:25의 비율 (HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드 0.4 ㎍, pOG44 플라스미드 3.6 ㎍, Lipofectamine 10 ㎕)로 Opti-MEM에 섞은 혼합액을 배양접시에 넣어 세포주를 형질 전환시킨다. 또한, co-transfection하는 pOG44 플라스미드에 의한 Hygromycin B 저항성 획득을 확인하기 위해 pOG44 플라스미드와 Lipofectamine 2000을 1:2.5의 비율로 (pOG44 4 ㎍ , Lipofectamine 10 ㎕) 같은 조건 하에서 형질전환시킨다. 6시간 후에 DMEM 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 15 ㎍/㎖의 Blasticidin, 100 ㎍/㎖의 Zeocin)를 교환하고, 24시간 배양 후 같은 배지에 선별 항생제(selective antibiotics)인 100 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B (Hygromycin B)를 첨가하여 저항성 있는 세포를 선택적으로 배양한다. 2주 동안 선택 배양을 통해 HA-CLC-Ka, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 안정적으로 발현하는 세포주를 얻을 수 있다. pOG44 플라스미드로만 형질 전환한 세포는 대부분 사멸하므로 pOG44 플라스미드에 의한 Hygromycin B 저항성 획득은 없다고 할 수 있다. 상기 세포는 100 ㎍/㎖의 Hygromycin B로 선택 배양된 세포이므로 이후의 배지에는 해당 농도의 Hygromycin B를 첨가한다.
HA-CLC-Ka, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) were constructed by using the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) -pcDNA5 / FRT / TO plasmid Stably expressing the T-REx HEK293 cell line is prepared as follows. 1 x 10 6 wild-type T-REx HEK293 cells are seeded in a 35-mm culture dish and incubated for 12 hours at 37 ° C in an incubator filled with air and CO 2 at a ratio of 95: 5 (%). After the incubation, the plasmid HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) -pcDNA5 / FRT / TO shown in the cleavage map of FIG. 2 and pOG44 plasmid and lipo Pectin 2000 (Lipofectamine 2000) was added at a ratio of 1: 9: 25 (0.4 μg of HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) -pcDNA5 / FRT / TO plasmid, 3.6 μg of pOG44 plasmid, Lipofectamine 10 μl) is added to Opti-MEM mixed solution to transform the cell line. In addition, pOG44 plasmid and Lipofectamine 2000 were transformed at a ratio of 1: 2.5 (4 ㎍ of pOG44, 10 L of Lipofectamine) to confirm Hygromycin B resistance acquisition by co-transfected pOG44 plasmid. After 6 hours, DMEM medium (10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin, 15 μg / ml Blasticidin, 100 μg / ml Zeocin) was exchanged and cultured for 24 hours. 100 μg of selective antibiotics / Ml of Hygromycin B is added to selectively cultivate resistant cells. A cell line stably expressing HA-CLC-Ka, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) can be obtained through selective culturing for 2 weeks. Most of the cells transfected with the pOG44 plasmid are killed, so that no resistance to Hygromycin B is obtained by the pOG44 plasmid. Hygromycin B is added to the medium after the cells are selected as 100 ㎍ / ㎖ of Hygromycin B.

실시예Example 2.  2. 테트라사이클린Tetracycline 유도발현 시스템의 확인 Identification of inducible expression systems

상기 실시예 1-3에 의해 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포에서 테트라사이클린에 의해 HA-CLC-Ka, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 유도 발현하기 위해 다음과 같이 실험을 진행한다. 100-㎜ 배양접시에 5x106개의 세포를 분주하고, 24시간 후 테트라사이클린 유도 발현을 위해 기존의 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 후, 새로운 배지에 6 ㎍/㎖의 doxycycline을 처리한다. 12시간 후 RT-PCR 방법으로 YFP mRNA 발현을, Western blot 방법으로 각각의 단백질 발현을, 그리고 형광 현미경으로 YFP 단백질 발현을 확인한다.
HA-CLC-Ka and Barttin (T) were transfected by tetracycline in T-REx HEK293 cells transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L). 5 × 10 6 cells were seeded in a 100-mm culture dish. After 24 hours, the existing medium was removed for tetracycline-induced expression, washed once with PBS, and then treated with 6 μg / ml of doxycycline in the new medium. After 12 hours, the expression of YFP mRNA was confirmed by RT-PCR, the expression of each protein was determined by Western blot method, and the expression of YFP protein was confirmed by fluorescence microscopy.

2-1. 2-1. YFPYFP mRNAmRNA 발현 확인을 위한  For confirmation of expression RTRT -- PCRPCR 방법  Way

HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포에서 YFP mRNA 발현을 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 진행한다. Superscript Ⅲ Cells Direct cDNA Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 역전사 (reverse transcription)를 수행한 후, YFP primers (forward primer: 5'-AAGTTCATCTGCACCACCG-3', reverse primer: 5'-AGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'), 또는 positive control로 ß-actin primers (forward primer: 5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3', reverse primer: 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3')를 이용하여 합성한 cDNA를 주형(template)으로 PCR 반응을 수행한다. Negative control로 야생형 T-REx HEK293 세포(N/C)를 사용하고 positive control로 ß-actin (315 bp)을 사용하며, 1.2% agarose gel에서 전기영동 (electrophoresis)으로 PCR 결과물 (YFP: 474 bp, ß-actin: 315 bp)을 확인한다.In order to confirm YFP mRNA expression in T-REx HEK293 cells transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene, the following experiment is conducted. (Reverse primer: 5'-AAGTTCATCTGCACCACCG-3 ', reverse primer: 5'-AGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3') after reverse transcription using Superscript III Cells Direct cDNA Synthesis System (Invitrogen) PCR was performed using a cDNA synthesized using ß-actin primers (forward primer: 5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3 ', reverse primer: 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3') as a positive control. The PCR product (YFP: 474 bp) was amplified by electrophoresis on 1.2% agarose gel using β-actin (315 bp) as a positive control and wild type T-REx HEK293 cells (N / C) ß-actin: 315 bp).

도 5는 RT-PCR 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) mRNA의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.FIG. 5 shows the results of RT-PCR of YFP (H148Q / I152L) gene of T-REx HEK293 cell line transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) I152L) < / RTI > mRNA.

상기의 RT-PCR 실험을 통해 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환시킨 6개 (1~6)의 서로 다른 T-REx HEK293 세포를 테스트한 결과, 예상되는 크기 (474 bp)의 밴드가 형성된 4, 6번 세포에서 YFP mRNA가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
Six (1 to 6) different T-REx HEK293 cells transformed with the plasmid containing the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) As a result of testing the cells, it was confirmed that YFP mRNA was expressed in cells 4 and 6 in which the band of expected size (474 bp) was formed.

2-2. 2-2. WesternWestern blotblot 방법으로  By way of HAHA -- CLCCLC -- KaKa 채널과  Channel and BarttinBarttin (( Y98AY98A )-) - MycMyc , 그리고 YFP(H148Q/I152L) 단백질 각각의 개체로의 발현 확인 , And YFP (H148Q / I152L) protein, respectively.

100-㎜ 배양 접시에 배양한 5x106개 세포를 Protease Inhibitor Cocktail (Sigma)이 첨가된 RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) 완충용액 (Cell Nest)에서 분쇄 (lysis) 시킨 후, BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce)를 이용하여 단백질을 정량한다. Gradi-Gel Ⅱ Gradient PAGE Analysis Kit (ELPiS)로 제작한 polyacrylamide gradient gel(10% running gel, 5% stacking gel)에 웰 당 50 ㎍의 단백질 시료를 로딩(loading)하여 200 V에서 35분 동안 전기영동 한다. 크기에 따라 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 100 V에서 45분 동안 transfer시킨 후, PVDF membrane을 5% skim milk로 상온에서 2시간 동안 blocking한다. HA-CLC-Ka, Barttin-Myc, YFP 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 HA antibody (F-7), c-Myc antibody (9E10), GFP antibody (B-2)(Santa Cruz Biotechnology)를 5% skim milk에 1:200 비율로 희석하여 4 ℃에서 약 12-16시간 동안 반응시킨다. 정량 및 positive control로 사용하는 ß-actin antibody (8H10D10) (Cell Signaling Technology)는 1:1,000 비율로 희석한다. Primary antibody host에 특이적으로 결합하는 anti-mouse IgG, HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology)를 5% skim milk에 1:10,000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. Secondary antibody에 tagged된 horseradish peroxidase를 Super Signal West Pico (c-Myc, ß-actin) 또는 Femto(HA, GFP) Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)를 이용하여 검출한다.5 × 10 6 cells cultured in a 100-mm culture dish were lysed in a RIPA (Radioimmuno Precipitation Assay) buffer (Cell Nest) supplemented with a Protease Inhibitor Cocktail (Sigma), and then cultured in a BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce) To quantify the protein. 50 μg of protein sample per well was loaded onto polyacrylamide gradient gel (10% running gel, 5% stacking gel) prepared with Gradi-Gel II Gradient PAGE Analysis Kit (ELPiS) and electrophoresis do. Proteins separated by size were transferred to a PVDF membrane at 100 V for 45 min and blocked with 5% skim milk at room temperature for 2 h. (5%) of HA antibody (F-7), c-Myc antibody (9E10) and GFP antibody (B-2) (Santa Cruz Biotechnology) that specifically bind to HA-CLC-Ka and Barttin- skim milk at a ratio of 1: 200 and reacted at 4 ° C for about 12-16 hours. Quantitative and positive control ß-actin antibody (8H10D10) (Cell Signaling Technology) is diluted 1: 1,000. Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (Cell Signaling Technology), which specifically binds to the primary antibody host, is diluted 1: 10,000 in 5% skim milk and reacted at room temperature for 2 hours. Secondary antibody-tagged horseradish peroxidase is detected using Super Signal West Pico (c-Myc, ß-actin) or Femto (HA, GFP) Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific).

도 6은 Western blot 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주에서 HA-CLC-Ka 채널, Barttin(Y98A)-Myc 및 YFP(H148Q/I152L) 단백질 각각의 개체로의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.6 shows the results of Western blot analysis of HA-CLC-Ka (H982Q) cells in a T-REx HEK293 cell line transformed with the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) Channel, Barttin (Y98A) -Myc, and YFP (H148Q / I152L) proteins, respectively.

이를 통해, 본 발명에 따른 세포주는 인간 CLC-Ka 채널 유전자와 인간 Barttin(Y98A), 그리고 형광 단백질 유전자가 각각 안정적으로 발현된다는 것을 확인할 수 있고, 따라서 CLC-Ka 채널에 선택적으로 작용하는 조절물질의 검색 효율을 증가시키고, CLC-Ka 채널의 신호전달에 관여하는 선택적 결합 단백질에 대한 연구시간을 단축할 수 있으며, 특히 염화 이온을 검출할 수 있는 형광 단백질을 함께 발현시킴으로써 형광 물질의 표지 없이도 고효율 검색이 가능하도록 하는 등, 본 발명에서 확립한 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293 세포주는 CLC-Ka 채널을 체계적으로 연구할 수 있는 토대를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
Thus, it can be confirmed that the human CLC-Ka channel gene, human Barttin (Y98A), and fluorescent protein gene are stably expressed in the cell line according to the present invention, and thus the regulatory substance selectively acting on the CLC-Ka channel It is possible to increase the retrieval efficiency and shorten the time for selective binding protein involved in the signal transduction of the CLC-Ka channel. In particular, by expressing a fluorescent protein capable of detecting chloride ion, (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) T-REx HEK293 cell line established in the present invention provides a basis for systematically studying the CLC-Ka channel It can be seen that

2-3. 2-3. YFPYFP 단백질 발현 확인을 위한 형광  Fluorescence for confirmation of protein expression 이미징Imaging 방법 Way

도 7은 형광 이미징 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.FIG. 7 is a graph showing the fluorescence intensity of YFP (H148Q / I152L) of a T-REx HEK293 cell line transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc- YFP (H148Q / I152L) ) ≪ / RTI > protein.

이를 통해, 본 발명에 따른 세포주는 염화 이온을 검출할 수 있는 형광 단백질을 함께 발현시킴으로써, 형광 물질의 표지 없이도 고효율 검색이 가능하다는 것을 알 수 있다.
Thus, it can be seen that the cell line according to the present invention is able to perform high-efficiency retrieval without labeling the fluorescent substance by expressing a fluorescent protein capable of detecting chloride ion.

실시예Example 3. 플레이트 리더를 이용한  3. Using a plate reader CLCCLC -- KaKa 채널 활성 측정 및 그에 따른  Measure the channel activity and consequently YFPYFP 형광변화 Fluorescence change

형광 이미징 고효율 검색을 위해 사용한 기기는 미국 Molecular Devices 사의 FlexStation3이다. 이 기기는 파장 가변형 형광 리더와 pipettor를 결합하였고, 약물 이동 시스템 (compound transfer system)과 8 채널 또는 16 채널의 dispenser를 내장하여 세포 기반 고효율 검색에 최적화되어있다.
The device used for fluorescence imaging high-efficiency retrieval is FlexStation3 from Molecular Devices, USA. The device combines a wavelength tunable fluorescent reader with a pipettor and is optimized for cell-based, high-efficiency retrieval with a compound transfer system and an 8-channel or 16-channel dispenser.

3-1. 플레이트 리더용 96-웰 플레이트 세포배양 조건3-1. 96-well plates for plate reader Cell culture conditions

FlexStation3를 이용한 형광 이미징은 플레이트 아래에서 빛이 투과하는 방식으로 형광 측정이 가능한 96-웰 플레이트(Nunc)를 사용하여 실험한다. 활성검색 24시간 전에 폴리-L-라이신(0.05 ㎎/㎖)이 처리된 96-웰 플레이트에 웰 당 6 ㎍/㎖의 doxycycline으로 발현이 유도된 1x105개 세포를 분주하고 37 ℃, 습한 조건의 95% 공기와 5% CO2 배양기에서 배양한다. 실험 당일 96-웰 플레이트에 부착된 세포를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 HBSS-HEPES 완충용액 (150 mM Na-Gluconate, 5 mM KCl, 0.5 mM CaCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4)에서 세척한 후 최종 부피를 108 ㎕로 맞춘다.
Fluorescence imaging using FlexStation3 is performed using a 96-well plate (Nunc) capable of fluorescence measurement in the manner that light passes under the plate. Cells were seeded in 96-well plates treated with poly-L-lysine (0.05 mg / ml) 24 hours prior to active detection at a concentration of 1 x 10 5 cells expressing 6 μg / ml doxycycline per well. Incubate in 95% air and 5% CO 2 incubator. On the day of the experiment, the cells attached to the 96-well plate were suspended in HBSS-HEPES buffer (150 mM Na-Gluconate, 5 mM KCl, 0.5 mM CaCl 2 , 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4 ) And the final volume is adjusted to 108 [mu] l.

3-2. 플레이트 리더를 이용한 3-2. Plate reader CLCCLC -- KaKa 채널 활성 측정 Measure channel activity

세포주에서 CLC-Ka 채널과 같이 발현하며 세포내 요오드 이온의 농도에 민감한 YFP(H148Q/I152L)을 이용하여 CLC-Ka 채널 활성에 따른 YFP 형광을 측정한다. 구체적으로 FlexStation3에 장착된 제논램프 광원에서 시료의 excitation에 필요한 485-㎚ 파장을 선택적으로 세포에 노출시킨다. 515-㎚ cut-off 조건에서 매 30초 간격으로 방출 형광 (emitter fluorescence light)을 96 웰 각각에 대해 520-㎚ 파장에서 측정한다. 데이터 분석은 Molecular Devices 사에서 제공한 FlexStation3 전용 프로그램을 이용한다. 세포가 준비된 96-웰 플레이트 외에 상이한 농도의 요오드 이온을 포함한 96-웰 약물 플레이트를 준비한다. FlexStation3의 경우 약물 주입 시스템은 있지만 흡입 시스템은 없기 때문에 5배로 농축된 요오드 이온을 HBSS-HEPES 완충용액에 27 ㎕ 준비하여 최종 부피 135 ㎕(배양세포 108 ㎕ + 5배 요오드 이온 27 ㎕)에서 측정한다. 2분 pre-reading 후 0~100 mM 사이의 상이한 농도로 준비한 요오드 이온을 96-웰 플레이트에서 배양한 세포에 처리하고 40분 동안 CLC-Ka 채널 활성에 의한 YFP 형광 시그널을 구한다.YFP fluorescence is measured by CLC-Ka channel activity using YFP (H148Q / I152L), which is expressed in the cell line as CLC-Ka channel and sensitive to the concentration of iodine ion in the cell. Specifically, the 485-nm wavelength required for sample excitation is selectively exposed to cells in a xenon lamp light source mounted on FlexStation 3. Emitter fluorescence light is measured at 520-nm wavelength for each of the 96 wells at intervals of 30 seconds at 515-nm cut-off conditions. The data analysis uses a program dedicated to FlexStation3 provided by Molecular Devices. A 96-well drug plate containing different concentrations of iodine ions is prepared in addition to the 96-well plate in which cells are prepared. For FlexStation 3, 27 μl of iodine ion concentrated in 5-fold concentration is prepared in HBSS-HEPES buffer solution and measured in a final volume of 135 μl (108 μl of cultured cells + 27 μl of iodine ion 5 times) since there is no suction system . After 2 minutes pre-reading, iodine ions prepared at different concentrations between 0 and 100 mM are treated to cells cultured in a 96-well plate and a YFP fluorescence signal due to CLC-Ka channel activity is obtained for 40 minutes.

도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 YFP(H148Q/I152L) 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다. RFU (Relative Fluorescence Unit)는 485-nm excitation 파장과 520-nm emission 파장에서 측정한 형광 세기를 나타내며, 도 8a를 통해 세포 밖 요오드 이온의 농도가 높아질수록 CLC-Ka 채널에 의한 요오드 이온의 세포 내 유입이 증가하고 결과적으로 YFP 형광이 소광(quenching) 된다는 것을 알 수 있다.FIG. 8A is a graph showing the relationship between the concentration of iodide in the T-REx HEK293 cell line transformed with HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene according to an embodiment of the present invention, / I152L) fluorescence measurement results. The RFU (Relative Fluorescence Unit) shows fluorescence intensities measured at 485-nm excitation wavelength and 520-nm emission wavelength. As shown in FIG. 8a, as the concentration of extracellular iodide ion increases, the intracellular It can be seen that the influx increases and consequently the YFP fluorescence is quenched.

도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 CLC-Ka 채널의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이를 통해, 본 발명을 통해 확립된 HA-CLC-Ka-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293 세포주는 요오드 이온에 대하여 농도 의존성을 가짐을 알 수 있다.FIG. 8B is a graph showing the effect of iodine ion concentration on the T-REx HEK293 cell line transformed with the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) gene according to an embodiment of the present invention. And the channel activity is measured. Thus, it can be seen that the HA-CLC-Ka-Barttin (Y98A) -Myc-YFP (H148Q / I152L) T-REx HEK293 cell line established through the present invention has a concentration dependence on iodine ion.

한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)Korea Institute of Bioscience and Biotechnology Center (KCTC) KCTC18306PKCTC18306P 2014062020140620

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Cell line for cell-based high-throughput screening of CLC-Ka channel modulators using YFP fluorescence imaging and broad-spectrum studies of CLC-Ka channels <130> HPC-5240 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2064 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaggagt tggtggggct gcgtgagggc ttctcagggg accctgtgac tctgcaggag 60 ctgtggggcc cctgtcccca catccgccga gccatccaag gtggcctgga gtggctaaag 120 cagaaggtgt tccgcctggg agaagactgg tacttcctga tgaccctcgg ggtgctcatg 180 gccctggtca gctatgccat gaactttgcc atcgggtgtg tggtccgagc acaccagtgg 240 ctgtacaggg agattgggga cagccacctg ctccggtatc tttcctggac tgtgtaccct 300 gtggccctcg tctctttctc ctcaggcttc tcccagagca tcacgccctc ctctggaggt 360 tctggaatcc cggagctgaa gaccatgttg gcgggtgtga tcttggagga ctacctggat 420 atcaagaact ttggggccaa ggtggtgggc ctctcctgca ccctggccac cggcagcacc 480 ctgttcctgg gcaaagtggg ccctttcgtg cacctgtctg taatgatcgc tgcctacctg 540 ggccgtgtgc gcaccacgac catcggggag cctgagaaca agagcaagca aaacgaaatg 600 ctggtggcag cggcggcagt gggcgtggcc acagtctttg cagctccctt cagcggcgtc 660 ctgttcagca tcgaggtcat gtcttcccac ttctctgtcc gggattactg gaggggcttc 720 tttgcggcca cctgcggggc cttcatattc cggctcctgg cagtcttcaa cagcgagcag 780 gagaccatca cctccctcta caagaccagt ttccgggtgg acgttccctt cgacctgcct 840 gagatcttct tttttgtggc gctgggtggc atctgcggcg tcctgagctg tgcttacctc 900 ttctgtcagc gaaccttcct cagcttcatc aagaccaatc ggtacagctc caaactgctg 960 gctactagca agcctgtgta ctccgctctg gccaccttgc ttctcgcctc catcacctac 1020 ccgcctggtg tgggccactt cctagcttct cggctgtcca tgaagcagca tctggactcg 1080 ctgttcgaca accactcctg ggcgctgatg acccagaact ccagcccacc ctggcccgag 1140 gagctcgacc cccagcacct ttggtgggaa tggtaccacc cgcggttcac catctttggg 1200 acccttgcct tcttcctggt tatgaagttc tggatgctga ttctggccac caccatcccc 1260 atgcctgccg ggtacttcat gcccatcttt atccttggag ctgccatcgg gcgcctcttg 1320 ggagaggctc ttgccgtcgc cttccctgag ggcattgtga ctggaggggt taccaatccc 1380 atcatgcccg gggggtatgc tctggcaggg gctgcagcct tctcaggggc tgtgacccac 1440 accatctcca cggcgctgct ggcctttgag ctgaccggcc agatagtgca tgcactgccc 1500 gtgctgatgg cggtgctggc agccaacgcc attgcacaga gctgccagcc ctccttctat 1560 gatggcacca tcattgtcaa gaagctgcca tacctgccac ggattctggg ccgcaacatc 1620 ggctcccacc atgtgagggt ggagcacttc atgaaccaca gcatcaccac actggccaag 1680 gacacgccgc tggaggaggt ggtcaaggtt gtgacctcca cagacgtgac cgagtatccc 1740 ctggtggaga gcacagagtc ccagatcctg gtaggcatcg tgcagagggc ccagctggtg 1800 caggccctcc aggctgagcc tccttccagg gctccaggac accagcagtg tctccaggac 1860 atcttggcca ggggctgccc cacggaacca gtgaccctga cgctattctc agagaccacc 1920 ttgcaccagg cacaaaacct ctttaagctg ttgaaccttc agtccctctt cgtgacatcg 1980 cggggcagag ctgtgggctg cgtgtcctgg gtggagatga agaaagcaat ttccaacctg 2040 acaaatccgc cagctccaaa gtga 2064 <210> 2 <211> 687 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Glu Leu Val Gly Leu Arg Glu Gly Phe Ser Gly Asp Pro Val 1 5 10 15 Thr Leu Gln Glu Leu Trp Gly Pro Cys Pro His Ile Arg Arg Ala Ile 20 25 30 Gln Gly Gly Leu Glu Trp Leu Lys Gln Lys Val Phe Arg 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aacgttggag gatgagcccc aagaggggca gcagtgggaa 780 atagccctgc ccaacaactg gcagcggtac ccaaggacaa aggtggagga gaaggaggct 840 tcggacacag gtggggagga acctgagaag gaagaggaag acctgtacta tgggctgcca 900 gatggagccg gggacctcct cccggacaag gagctgggtt ttgagcctga cacccaaggc 960 tga 963 <210> 4 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Asp Glu Lys Thr Phe Arg Ile Gly Phe Ile Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ala Leu Gly Thr Phe Leu Met Ser His Asp Arg Pro Gln 20 25 30 Val Tyr Gly Thr Phe Tyr Ala Met Gly Ser Val Met Val Ile Gly Gly 35 40 45 Ile Ile Trp Ser Met Cys Gln Cys Tyr Pro Lys Ile Thr Phe Val Pro 50 55 60 Ala Asp Ser Asp Phe Gln Gly Ile Leu Ser Pro Lys Ala Met Gly Leu 65 70 75 80 Leu Glu Asn Gly Leu Ala Ala Glu Met Lys Ser Pro Ser Pro Gln Pro 85 90 95 Pro Ala Val Arg Leu Trp Glu Glu Ala Ala Tyr Asp Gln Ser Leu Pro 100 105 110 Asp Phe Ser His Ile Gln Met Lys Val Met Ser Tyr Ser Glu Asp His 115 120 125 Arg Ser Leu Leu Ala Pro Glu Met Gly Gln Pro Lys Leu Gly Thr Ser 130 135 140 Asp Gly 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catccgccga gccatccaag gtggcctgga gtggctaaag 120 cagaaggtgt tccgcctggg agaagactgg tacttcctga tgaccctcgg ggtgctcatg 180 gccctggtca gctatgccat gaactttgcc atcgggtgtg tggtccgagc acaccagtgg 240 ctgtacaggg agattgggga cagccacctg ctccggtatc tttcctggac tgtgtaccct 300 gtggccctcg tctctttctc ctcaggcttc tcccagagca tcacgccctc ctctggaggt 360 tctggaatcc cggagctgaa gaccatgttg gcgggtgtga tcttggagga ctacctggat 420 atcaagaact ttggggccaa ggtggtgggc ctctcctgca ccctggccac cggcagcacc 480 ctgttcctgg gcaaagtggg ccctttcgtg cacctgtctg taatgatcgc tgcctacctg 540 ggccgtgtgc gcaccacgac catcggggag cctgagaaca agagcaagca aaacgaaatg 600 ctggtggcag cggcggcagt gggcgtggcc acagtctttg cagctccctt cagcggcgtc 660 ctgttcagca tcgaggtcat gtcttcccac ttctctgtcc gggattactg gaggggcttc 720 tttgcggcca cctgcggggc cttcatattc cggctcctgg cagtcttcaa cagcgagcag 780 gagaccatca cctccctcta caagaccagt ttccgggtgg acgttccctt cgacctgcct 840 gagatcttct tttttgtggc gctgggtggc atctgcggcg tcctgagctg tgcttacctc 900 ttctgtcagc gaaccttcct cagcttcatc aagaccaatc ggtacagctc caaactgctg 960 gctactagca agcctgtgta ctccgctctg gccaccttgc ttctcgcctc catcacctac 1020 ccgcctggtg tgggccactt cctagcttct cggctgtcca tgaagcagca tctggactcg 1080 ctgttcgaca accactcctg ggcgctgatg acccagaact ccagcccacc ctggcccgag 1140 gagctcgacc cccagcacct ttggtgggaa tggtaccacc cgcggttcac catctttggg 1200 acccttgcct tcttcctggt tatgaagttc tggatgctga ttctggccac caccatcccc 1260 atgcctgccg ggtacttcat gcccatcttt atccttggag ctgccatcgg gcgcctcttg 1320 ggagaggctc ttgccgtcgc cttccctgag ggcattgtga ctggaggggt taccaatccc 1380 atcatgcccg gggggtatgc tctggcaggg gctgcagcct tctcaggggc tgtgacccac 1440 accatctcca cggcgctgct ggcctttgag ctgaccggcc agatagtgca tgcactgccc 1500 gtgctgatgg cggtgctggc agccaacgcc attgcacaga gctgccagcc ctccttctat 1560 gatggcacca tcattgtcaa gaagctgcca tacctgccac ggattctggg ccgcaacatc 1620 ggctcccacc atgtgagggt ggagcacttc atgaaccaca gcatcaccac actggccaag 1680 gacacgccgc tggaggaggt ggtcaaggtt gtgacctcca cagacgtgac cgagtatccc 1740 ctggtggaga gcacagagtc ccagatcctg gtaggcatcg tgcagagggc ccagctggtg 1800 caggccctcc aggctgagcc tccttccagg gctccaggac accagcagtg tctccaggac 1860 atcttggcca ggggctgccc cacggaacca gtgaccctga cgctattctc agagaccacc 1920 ttgcaccagg cacaaaacct ctttaagctg ttgaaccttc agtccctctt cgtgacatcg 1980 cggggcagag ctgtgggctg cgtgtcctgg gtggagatga agaaagcaat ttccaacctg 2040 acaaatccgc cagctccaaa gtga 2064 <210> 2 <211> 687 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Glu Leu Val Gly Leu Arg Glu Gly Phe Ser Gly Asp Pro Val   1 5 10 15 Thr Leu Gln Glu Leu Trp Gly Pro Cys Pro His Ile Arg Arg Ala Ile              20 25 30 Gln Gly Gly Leu Glu Trp Leu Lys Gln Lys Val Phe Arg Leu Gly Glu          35 40 45 Asp Trp Tyr Phe Leu Met Thr Leu Gly Val Leu Met Ala Leu Val Ser      50 55 60 Tyr Ala Met Asn Phe Ala Ile Gly Cys Val Val Arg Ala His Gln Trp  65 70 75 80 Leu Tyr Arg Glu Ile Gly Asp Ser His Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Trp                  85 90 95 Thr Val Tyr Pro Val Ala Leu Val Ser Phe Ser Ser Gly Phe Ser Gln             100 105 110 Ser Ile Thr 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Pro Val Leu Ala Val Ale Ala Ala Asn Ala Ile Ala             500 505 510 Gln Ser Cys Gln Pro Ser Phe Tyr Asp Gly Thr Ile Ile Val Lys Lys         515 520 525 Leu Pro Tyr Leu Pro Arg Ile Leu Gly Arg Asn Ile Gly Ser His His     530 535 540 Val Arg Val Glu His Phe Met Asn His Ser Ile Thr Thr Leu Ala Lys 545 550 555 560 Asp Thr Pro Leu Glu Glu Val Val Lys Val Val Thr Ser Thr Asp Val                 565 570 575 Thr Glu Tyr Pro Leu Val Glu Ser Thr Glu Ser Gln Ile Leu Val Gly             580 585 590 Ile Val Gln Arg Ala Gln Leu Val Gln Ala Leu Gln Ala Glu Pro Pro         595 600 605 Ser Arg Ala Pro Gly His Gln Gln Cys Leu Gln Asp Ile Leu Ala Arg     610 615 620 Gly Cys Pro Thr Glu Pro Thr Leu Thr Leu Phe Ser Glu Thr Thr 625 630 635 640 Leu His Gln Ala Gln Asn Leu Phe Lys Leu Leu Asn Leu Gln Ser Leu                 645 650 655 Phe Val Thr Ser Arg Gly Arg Ala Val Gly Cys Val Ser Trp Val Glu             660 665 670 Met Lys Lys Ala Ile Ser Asn Leu Thr Asn Pro Pro Ala Pro Lys         675 680 685 <210> 3 <211> 963 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggctgacg agaagacctt ccggatcggc ttcattgtgc tggggctttt cctgctggcc 60 ctcggtacgt tcctcatgag ccatgatcgg ccccaggtct acggcacctt ctatgccatg 120 ggcagcgtca tggtgatcgg gggcatcatc tggagcatgt gccagtgcta ccccaagatc 180 accttcgtcc ctgctgactc tgactttcaa ggcatcctct ccccaaaggc catgggcctg 240 ctggagaatg ggcttgctgc cgagatgaag agccccagcc cccagccgcc cgctgtaagg 300 ctgtgggagg aagccgccta tgaccagagc ctgcctgact tcagccacat ccagatgaaa 360 gtcatgagct acagtgagga ccaccgctcc ttgctggccc ctgagatggg gcagccgaag 420 ctgggaacca gtgatggagg agaaggtggc cctggcgacg ttcaggcctg gatggaggct 480 gccgtggtca tccacaaggg ctcagacgag agtgaagggg aaagacgcct aactcagagc 540 tggcccggcc ccctggcctg tccccagggc cctgccccct tggcttcctt ccaagatgac 600 ctggacatgg actccagtga aggcagcagc cccaatgcat ctccacatga cagggaggaa 660 gcttgttccc cacaacagga acctcagggc tgcaggtgcc cgctggaccg cttccaagac 720 tttgccctga ttgatgcccc aacgttggag gatgagcccc aagaggggca gcagtgggaa 780 atagccctgc ccaacaactg gcagcggtac ccaaggacaa aggtggagga gaaggaggct 840 tcggacacag gtggggagga acctgagaag gaagaggaag acctgtacta tgggctgcca 900 gatggagccg gggacctcct cccggacaag gagctgggtt ttgagcctga cacccaaggc 960 tga 963 <210> 4 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Asp Glu Lys Thr Phe Arg Ile Gly Phe Ile Val Leu Gly Leu   1 5 10 15 Phe Leu Leu Ala Leu Gly Thr Phe Leu Met Ser His Asp Arg Pro Gln              20 25 30 Val Tyr Gly Thr Phe Tyr Ala Met Gly Ser Val Met Val Ile Gly Gly          35 40 45 Ile Ile Trp Ser Met Cys Gln Cys Tyr Pro Lys Ile Thr Phe Val Pro      50 55 60 Ala Asp Ser Asp Phe Gln Gly Ile Leu Ser Pro Lys Ala Met Gly Leu  65 70 75 80 Leu Glu Asn Gly Leu Ala Ala Glu Met Lys Ser Pro Ser Pro Gln Pro                  85 90 95 Pro Ala Val Arg Leu Trp Glu Glu Ala Ala Tyr Asp Gln Ser Leu Pro             100 105 110 Asp Phe Ser His Ile Gln Met Lys Val Met Ser Tyr Ser Glu Asp His         115 120 125 Arg Ser Leu Leu Ala Pro Glu Met Gly Gln Pro Lys Leu Gly Thr Ser     130 135 140 Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Val Gln Ala Trp Met Glu Ala 145 150 155 160 Ala Val Val Ile His Lys Gly Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu Arg Arg                 165 170 175 Leu Thr Gln Ser Trp Pro Gly Pro Leu Ala Cys Pro Gln Gly Pro Ala             180 185 190 Pro Leu Ala Ser Phe Gln Asp Asp Leu Asp Met Asp Ser Ser Glu Gly         195 200 205 Ser Ser Pro Asn Ala Ser Pro His Asp Arg Glu Glu Ala Cys Ser Pro     210 215 220 Gln Gln Glu Pro Gln Gly Cys Arg Cys Pro Leu Asp Arg Phe Gln Asp 225 230 235 240 Phe Ala Leu Ile Asp Ala Pro Thr Leu Glu Asp Glu Pro Gln Glu Gly                 245 250 255 Gln Gln Trp Glu Ile Ala Leu Pro Asn Asn Trp Gln Arg Tyr Pro Arg             260 265 270 Thr Lys Val Glu Glu Lys Glu Ala Ser Asp Thr Gly Gly Glu Glu Pro         275 280 285 Glu Lys Glu Glu Glu Asp Leu Tyr Tyr Gly Leu Pro Asp Gly Ala Gly     290 295 300 Asp Leu Leu Pro Asp Lys Glu Leu Gly Phe Glu Pro Asp Thr Gln Gly 305 310 315 320 <210> 5 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VECTORS <400> 5 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccagaac gtctatctga tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720                                                                          720 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YELLOW FLUORESCENCE PROTEIN <400> 6 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu   1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly              20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile          35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr      50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys  65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu                  85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu             100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly         115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr     130 135 140 Asn Tyr Asn Ser Gln Asn Val Tyr Leu Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser                 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly             180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu         195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe     210 215 220 Val Thr Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Thoseaasigna virus 2A <400> 7 gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Thoseaasigna virus 2A <400> 8 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro   1 5 10 15 Gly Pro         <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Equine rhinitis A virus 2A <400> 9 caatgtacta actacgcttt gttgaaactc gctggcgatg ttgaaagtaa ccccggtcct 60                                                                           60 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Equine rhinitis A virus 2A <400> 10 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser   1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro              20

Claims (9)

CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환시킨 세포주로서,
상기 CLC-Ka 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그되어 있고, 상기 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하고,
상기 CLC-Ka 채널, Barttin(Y98A) 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포주.A cell line transformed with a plasmid containing a gene encoding CLC-Ka channel, a gene encoding Barttin (Y98A), and a gene encoding a fluorescent protein,
The CLC-Ka channel and Barttin (Y98A) are epitope-tagged at the N-terminal or C-terminal, and the fluorescent protein reacts with the halide ion in yellow.
Wherein the CLC-Ka channel, Barttin (Y98A) and fluorescent protein are stably expressed. 제1항에 있어서,
상기 플라스미드는 상기 유전자들이 서열번호 7 또는 9로 표시되는 2A 펩타이드로 연결된 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
Wherein the plasmid is linked to the 2A peptide of SEQ ID NO: 7 or 9. 제1항에 있어서,
상기 플라스미드는 도 2의 개열지도로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
Wherein the plasmid is represented by a cleavage map of Fig. 제1항에 있어서,
상기 CLC-Ka 채널을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
Wherein the gene encoding the CLC-Ka channel is represented by SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서,
상기 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
Wherein the gene encoding Barttin (Y98A) is represented by SEQ ID NO: 3. 제1항에 있어서,
상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 YFP(H148Q/I152L)인 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
Wherein the gene encoding the fluorescent protein is YFP (H148Q / I152L) represented by SEQ ID NO: 5. 제1항에 있어서,
상기 에피토프 태그는 HA(Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV 또는 His6인 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
The epitope tag is HA (Hemagglutinin), c-MYC , FLAG, V5, VSV-G, a cell line characterized in that the HSV or His 6. 제1항에 있어서,
상기 세포주는 수탁번호 KCTC18306P로 기탁된 것을 특징으로 하는 세포주.The method according to claim 1,
Wherein said cell line is deposited with Accession No. KCTC18306P. (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포주를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 세포주를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 완충용액에서 세척하는 단계;
(c) 상기 세척된 세포주에 요오드 이온을 주입하는 단계; 및
(d) 요오드 이온의 세포 내 유입에 따른 YFP 형광 소광을 측정하는 단계;를 포함하는 CLC-Ka 채널 조절물질의 고효율 검색방법.(a) culturing a cell line according to any one of claims 1 to 8;
(b) washing the cultured cell line with a buffer solution in which the chloride ion is replaced with gluconate;
(c) injecting iodine ions into the washed cell line; And
(d) measuring YFP fluorescence quenching due to intracellular influx of iodine ions.
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