KR20160014980A - 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다:
[화학식 1]

.
본 발명에 따르면, 비알코올성 지방간의 발생과 진행과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 염증 반응의 억제를 통하여 비알코올성 지방간의 병리 기전 전반에 탁월한 효과를 가질 수 있으며, 비알코올성 지방간의 예방 및 치료를 통해 대사증후군, 당뇨병, 심혈관질환으로의 진행을 차단하고 간경화, 간암으로의 진전을 억제할 수 있다.

Description

비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of non-alcoholic fatty liver disease}

본 발명은 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비알코올성 지방간(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 간기능 장애의 주요 원인으로, 비만증(obesity), 이상지질혈증(dyslipidemia), 제2형 당뇨병(type 2 diabetes)과 같은 대사증후군과 밀접한 관련이 있는 요소이다(비특허문헌 1). 근래 들어 비알코올성 지방간은 급증하고 있고, 이에 대한 치료를 위하여 메트포민(metformin), 치아졸리딘다이온(thiazolidinedione) 계의 약제, 스타틴(statin) 계의 약제, 항산화제 등이 시도되었으나, 현재까지 치료제로 확립된 약제는 없으며, 간효소 수치의 부분적 개선에 대한 보고는 있으나 간조직 검사의 개선을 포함한 포괄적인 치료제로서 인정받는 약제가 미비한 실정이다.

한편, 간 내부에서 합성되는 단백질의 일종인 페투인-A(fetuin-A)는 최근에 내장비만, 인슐린 저항성, 비알코올성 지방간 등과 관계된 것으로 지목되고 있다(비특허문헌 2, 3). 페투인-A 이외에도, 최근 페투인 패밀리(fetuin familly)의 일종인 페투인-B(fetuin-B) 또한 간 조직에서 고도로 발현하는 것으로 확인되었다(비특허문헌 4). 페투인은 골형성(osteogenesis) 및 미네랄리제이션(mineralization) 조절 등의 다양한 기능을 가진 혈청 단백질이다(비특허문헌 4). 페투인-A가 제거된 쥐는 인슐린 감수성, 체중 증가에 대한 저항, 낮은 혈청 유리지방산과 트리글리세라이드(Triglyceride, TG) 레벨, 간 지방증(hepatic steatosis)에 대한 개선을 보였다(비특허문헌 5). 간의 페투인-A mRNA의 발현은 지질과 포도당 대사의 열쇠효소들(key enzymes)의 간 mRNA 레벨(hepatic mRNA level)과 관련이 있다(비특허문헌 6).

Stefan 등은 수소 자기공명분광법을 이용하여 페투인-A의 농도는 인슐린 감수성과 부정적인 연관성이 있고, 지방간과 긍정적인 연관성이 있다는 점을 발견하였다(비특허문헌 2). Reinehr과 Roth는 횡단면 연구(cross-sectional)와 종단 연구(longitudinal studies)를 통해 페투인-A의 농도는 비알코올성 지방간 및 대사증후군과 높은 연관성이 있음을 보고하였다(비특허문헌 7). 이러한 연구들은 페루틴-A가 비알코올성 지방간의 발생과 진행뿐만 아니라 간세포에서의 지질과 포도당 대사에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

만성 염증(Chronic inflammation)은 인슐린 저항성의 발병에 중추적 역할을 하고, 제2형 당뇨병과 대사증후군과 같은 비만과 관련된 장애와 밀접한 관련이 있다. NFκB(Nuclear Factor Kappa B)는 염증 경로의 마스터 스위치(master switch) 이며, 비만은 지방조직과 간에서 NFκB 활성을 자극하고 결과적으로 인슐린 저항성을 야기한다(비특허문헌 8). 고용량의 살리실레이트(salycylate) 염은 NFκB와 아스피린을 억제하여 포도당 수치를 감소시킨다(비특허문헌 9). 그러나 출혈, 위염과 같은 부작용이 살리실레이트 염의 임상적 유용성을 제한한다.

대조적으로, 살리실레이트의 프로드러그(prodrug)인 살사레이트(salsalate)는 장기간의 임상 경험에 의할때, 사용이 용인되며 상대적으로 안전한 것으로 여겨진다(비특허문헌 10). 최근의 다기관 무작위 배정 임상시험을 통해, 살사레이트는 당화혈색소(HbA1c)와 TG 레벨을 상당히 낮추는 것으로 알려졌다(비특허문헌 11). 저아디포넥틴혈증(hypoadiponectinemia)은 비만, 대사증후군, 인슐린 저항성과 관련이 있다. 종래의 연구들은 아디포넥틴이 간의 인슐린 저항성을 감소시키고, 간의 염증과 섬유증을 약화시킨다는 것을 보여준다(비특허문헌 12).

아디포넥틴의 유익한 효과는 인슐린 감수성의 증가 및 항염증 작용으로부터 비롯된 것이다(비특허문헌 13). 간에서, 아디포넥틴은 5'-AMP-활성화 단백질 키나아제(5'-AMP-activated protein kinase, AMPK)와 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 알파(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPAR-α)의 활성을 통해서 행동한다(비특허문헌 12).

그러나, 그들의 잠재적인 상호 작용에도 불구하고, 페투인-A에서 살사레이트 또는 풀 랭스-아디포넥틴(full length-adiponectin, fAd)의 효과와, 간세포에서 그들의 조절 기작에 대하여는 보고되어 있지 않다.

이에 본 발명의 발명자는 (1) 팔미테이트에 의해 유도되는 지질대사 장애 및 TG 축적에서 페투인-A 모듈레이션(fetuin-A modulation)의 중요성; (2) 페투인-A의 발현에서 살사레이트와 살리실레이트의 효과와 AMPK 및 NFκB를 포함한 그들의 조절기작; (3) 고지방 조건에서 HepG2 세포의 페투인-A의 발현 및 지질 대사에 미치는 fAd의 영향; (4) 동물 모델의 예비 생체 실험에서 살사레이트와 살리실레이트의 페투인-A 발현과 지방증에 대한 효과;에 대한 연구를 통해 살사레이트의 항염증작용을 비알코올성 지방간에 적용하였으며, 종래 약제들이 대사개선에 초점을 맞추어 온 것과는 달리, 비알코올성 지방간의 발생과 진행과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 염증 반응의 억제를 통하여 비알코올성 지방간의 병리 기전 전반에 긍정적인 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

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본 발명은 비알코올성 지방간의 발생과 진행과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 염증 반응의 억제를 통하여 비알코올성 지방간의 병리 기전 전반에 탁월한 효과를 가진다는 점에 기초하여, 비알코올성 지방간의 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 윤활제, 교정제, 감미제, 풍미제, 착색제, 안정화제, 항상화제, 유동화제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 정제, 발포정, 과립제 또는 캅셀제로 단위투여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따르면, 비알코올성 지방간의 발생과 진행과정에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 염증 반응의 억제를 통하여 비알코올성 지방간의 병리 기전 전반에 탁월한 효과를 가질 수 있으며, 비알코올성 지방간의 예방 및 치료를 통해 대사증후군, 당뇨병, 심혈관질환으로의 진행을 차단하고 간경화, 간암으로의 진전을 억제할 수 있다.

도 1은 HepG2 세포에서 TG 축적 및 SREBP-1C 유도에 대한 페투인-A의 작용을 나타내는 도면이다.
도 2는 팔미테이트에 의해 조절된 페투인-A 발현 및 분비에 대한 살사레이트의 방지 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 HepG2 세포에서 AMPK와 관련된 살사레이트의, 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A 억제효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 AMPK 의존적인 NFκB 경로와 관련된 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A에 대한 살사레이트의 억제효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 HepG2 세포에서 지방 생성 억제를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적을 개선시키는 살사레이트의 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 HepG2 세포에서 지질 대사 개선을 통해 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적을 방지하는 풀랭스-아디포넥틴(Full length-adiponectin, fAd) 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 지방간, 간의 페투인-A mRNA 및 단밸질 발현뿐만 아니라 유전자 발현을 방지하는 침투성의 살사레이트 및 살리실레이트의 투여효과를 나타내는 도면이다.
도 8은 페투인-A 및 지방간에 대한 살사레이트의 억제효과의 가능한 메커니즘을 개략적으로 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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상기 화학식 1을 갖는 화합물은, 항염증 관절염 치료제로 널리 알려진 살사레이트(salsalate)이며, 다이살시드(Disalcid), 살플렉스(Salflex), 디살정(Disal tab) 등의 상표명으로 판매되고, 그 IUPAC 명은 2-(2-hydroxybenzoyl)oxybenzoic acid 이다.

간 내부에서 합성되는 단백질의 일종인 페투인-A(fetuin-A)는 최근에 내장비만, 인슐린 저항성, 비알코올성 지방간 등과 관계된 것으로 지목되고 있다. 살리실레이트의 프로드러그(prodrug)인 살사레이트는 항염증 효과 및 낮은 부작용 기록을 가지고 있으며, 무작위배정 임상시험을 통해 살사레이트는 포도당(glucose)과 트리글리세라이드(Triglyceride, TG) 레벨을 상당히 낮추어 주고, 아디포넥틴(adiponectin)의 농도를 상승시켜 주는 것으로 나타났다.

본 발명의 발명자는 팔미테이트(Palmitate) 처리된 HepG2 세포에서 페투인-A의 발현, 지방증과 지질대사에 미치는 살사레이트 및 fAD의 효과 및 조절 기작을 실험하였다.

팔미테이트 처리하여 간세포를 배양하면, siRNA가 이러한 변화들을 회복시키는 것에 의해서 지방증과 페투인-A의 녹다운을 초래하는 페투인-A와 SREBP-1c 발현을 상당히 증가시킨다. 살사레이트는 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A mRNA의 발현과 분비를 투약 및 시간 의존적으로 상당히 하향-조절(down-regulated)한다. 살사레이트에 의한 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 억제는 AMPK siRNA 또는 AMPK의 억제자에 의해 차단된 AMPK-매개 NFκB의 감소에 의해 매개된다. 살사레이트는 간세포에서 SREBP-1c의 조절을 통해 팔미트산에 의한 과도한 지방증을 약화시킨다. 더욱이, fAd 또한 SREBP-1c, PAPR-a 및 CD36의 회복과 함께 AMPK 경로 및 지방증의 개선을 통해 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 억제를 보여주었다. 예비 생체 실험에서 살사레이트 처리는 SD계 랫트의 고지방식이(high fat diet, HFD)로 유도된 지방증뿐만 아니라 페투인-A mRNA 및 단백질 발현을 억제하였다.

결론적으로, 살사레이트와 fAd는 간세포에서 AMPK-NFκB 경로를 통한 페투인-A의 억제를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 지방증과 지질대사 장애를 개선하였다.

따라서, 본 발명에서는 화학식 1로 표시되는 화합물, 즉 살사레이트 또는 그 약리학적으로 허용가능한 염을 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하고자 한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 투여에 적합한 제형으로서, 특히 정제, 발포정, 과립제 및 갑셀제의 형태로 제형화할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 단위투여 제형을 되는 것이 바람직하며, 이때 각 투여 제형은 소정량의 살사레이트를 유효성분으로 함유하는데, 이 밖에도 통상적인 약제방법에 따라 적당한 희석제, 담체 또는 기타 부형제를 선택하여 함께 혼합시켜 제형화할 수 있다. 가령 정제는 활성충전제 외에 통상의 과립화제, 희석제, 붕해제, 활택제, 차광제, 조미제, 윤활제, 교정제, 감미제, 풍미제, 착색제, 안정화제, 항산화제, 유동화제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수도 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

1. 재료 및 방법

1.1 세포배양, 시약 및 항체( Cell culture , reagents , and antibodies )

인간 헤파토마 HepG2 세포주(ATCC, Manassas, VA)는 10% 우태아 혈청(Invitrogen), 100 units/ml 페니실린(penicillin) 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)(Invitrogen)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbeco's modified eagle medium, DMEM)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 세포들은 5% CO₂ at 37.8 ℃의 가습분위기에서 배양되었다. 쥐의 1차 간세포는 ZenBio(Research Triangle Park, NC)에서 구매하였다. 세포들은 간세포 플레이팅 배지(ZenBio)에서 콜라겐 타입-I(collagen type-I)이 코팅된 6-well 플레이트에 플레이팅 되었다. 어태치먼트(attachment) 8시간 후에, 배지는 Hepatocyte Maintenance Medium (ZenBio)로 변경하였다. 살사레이트(Sigma, St. Louis, MO)는 다이메틸설폭사이드(DMSO)에, 살리실레이트(Sigma)를 증류수에 용해시켰다. 인간 페투인-A는 Sino Biological (Beijing, China)로부터 구매하였고, 인간 fAd는 Abcam (Cambridge, UK)으로부터 구매하였다. 컴파운드 C(Compound C)(Sigma)와 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-b-d-ribonucleoside (AICAR; Sigma)를 DMSO에 용해시키고 배양 배지에 첨가하였다. DMSO의 최종 농도는 세포 생존 또는 AMPK 인산화에 영향을 미치지 않도록 0.1%를 넘지않도록 하였다. 팔미테이트 염(Sigma)은 DMEM에 용해되어 있는 2% BSA (fatty acid free; Sigma)에 컨쥬게이트 하였다. 모든 실험에서 팔미테이트(palmitate)-BSA는 24시간 동안 처리되었고, 2% BSA는 대조군으로 사용되었다. 안티-페투인-A(Anti-fetuin-A), 안티-포스포 AMPK(anti-phospho AMPK), 안티-토탈 AMPK(anti-total AMPK), 안티-NFkBp65(anti-NFkBp65), 안티-포스포 IκB(anti-phospho IκB), 안티-포스포 mTOR(anti-phospho mTOR), 및 안티-mTOR(anti-mTOR)는 Cell signaling (Beverly, MA)으로부터 구매하였고, 안티-SREBP-1C(Anti-SREBP-1C), 안티-PPAR-α(anti-PPAR-α), 안티-CD36(anti-CD36), 및 베타-액틴(beta-actin)은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 구매하였다.

1.2 동물, 먹이 및 치료( Animals , feeding and treatment )

본 발명에 따른 실험은 고려대학교의 동물실험 관련 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받고 진행하였다. 대조군과 실험군은 정상(normal fat diet (NFD) 및 8주 동안 상대적으로 22% 지방(0.15% 콜레스테롤), 19% 단백질 및 49.5%의 탄수화물을 함유한 고지방 식이(high fat diet (HFD))를 제공한 6 주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 계열의 랫트를 사용하였다. HFD-살사레이트 그룹은 추가적으로 6주 동안 임의적으로(ad libitum) HFD 내에 혼합된 200 mg/kg/day의 살사레이트를 제공받았다. 5 주령(5-week-old) Male homozygous B6.Cg-m +/+ Leprdb/J (db/db) 쥐는 8 주령(8-week-old)까지 NFD를 제공받았다. Wild-type C57BL/6J (B6) 쥐는 lean 대조군으로 사용되었다. db/db 쥐는 5주 동안 하루에 한 번씩 50 mg/kg day의 살리실레이트가 복강내로(intraperitoneally, I.P)주입되었다.

1.3 RNA 분리와 리얼타임 PCR( RNA isolation and quantitative real - time PCR )

각각의 cDNA 샘플의 유전자 발현을 리얼타임 PCR(the fluorescent TaqMan 5'-nuclease assay on an Applied Biosystems 7000 sequence detection system을 사용)을 통해 분석하였다. 태퀴먼 리얼타임 PCR은(TaqMan real-time PCR)은 2 × TaqMan Master Mix와 20 × premade TaqMan gene expression assays (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다 : 95 ℃ 10 분, 95 ℃ 15 초 및 60 ℃ 1 분 45 사이클(cycles). 랫트 페투인-A(Rn 00563700_ml; Applied Biosystems) mRNA 발현의 레벨은 랫트 베타-액틴(Rn 00667869_ml; Applied Biosystems)에 대해서 정규화하였다. 마우스 페투인-A(Mn 00442674_ml; Applied Biosys-tems) mRNAs 발현의 레벨은 마우스 베타-액틴(Mn 00607939_sl; Applied Biosystems)에 대해서 정규화하였다.

1.4 단백질 발현 분석( Protein expression analysis )

HepG2 세포들을 하베스트(harvest)하고, 4 ℃, 60분 동안 라이시스 버퍼(PRO- PREPTM; Intron Biotechnology, Seoul, Korea)로 추출하였다.

핵 단백질 추출물은 제조업체의 지시에 따라 단백질 분리 키트(protein fractionation kit (Biovision, Mountain View, CA))를 사용하여 준비하였다.

단백질 샘플들(30 ㎎)은 10% SDS- PAGE를 받았고, 니트로섬유소 막 (Amersham Bioscience, Westborough, MA)으로 운반되었고, 프라이머리 항체를 조사하고 뒤이어 2차 항체에 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; Amersham Bioscience)를 결합시켜 주었다. 샘플들은 화학 루미네선스 키트(chemiluminescence kits; Amersham Bioscience)로 검출하였다.

1.5 siRNA 트랜스펙션 ( transfection ) 및 재조합형( recombinant ) 페투인 -A 처리( fetuin -A treatment )

20 ㎛의 siRNA 올리고뉴클레오티드들(oligonucleotides)은 AMPK와 페투인-A (SC- 45312 and SC-39442; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 억제에 사용되었다. 제조업체의 지시에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 트랜스펙션(Transfection)을 수행하였다. 페투인-A SiRNA 트렌스펙션 후에, 트렌스펙트 된 세포들은 페투인-A가 남아있는 것을 배제하기 위해 PBS로 2번 세척하고 혈장이 없는 상태에서 분석하였다. 세척된 세포들은 37.8 ℃에서 6시간 동안 안정화하였고, 인간 재조합 페투인-A로 신선하게 처리하였다.

1.6 간세포의 오일 레드 오 염색( Oil Red -O staining of hepatocytes )

세포내에서의 중성 지방 방울(neutral lipid droplet) 축적을 측정하기 위해, HepG2 세포들과 쥐의 1차 간세포를 오일 레드-오 법(Oil Red-O method)으로 염색하였다. 30 분 동안 10 % 포르말린(formalin)으로 고정(fixation) 후, 세포들을 37.8 ℃에서 30분 동안 오일 레드-오 용액으로 염색하였다.

오일 레드-오 함량 수준을 정량하기 위해, 상온에서 5분 동안 흔들어 놓은(shaken) 각 샘플에 이소프라판올(isopropanol)을 첨가하고, 각각 100 ㎖의 이소프로판올-추출된 샘플은 510 ㎚에서 분광광도계(spectrophotometer)로 판독하였다.

1.7 전기 영동상 변화 분석( electrophoretic mobility - shoft assay , EMSA )

페투인-A 프로모터 영역의 NFκB 결합 부위(5'-GCA CCT GGG TTG GTC CCG AAG C-3')에 대한 특정 올리고뉴클레오티드 프로브들을 가진 여러 처리 그룹으로부터 핵 추출물을 준비하였다. supershift 분석을 위해, 2 ㎎의 안티-NFκBp65(Cell Signaling)는 핵 추출물에 첨가되었고, 샘플들은 화학 루미네선스 키트(chemiluminescence kits; Amersham Bioscience)로 검출하였다.

1.8 염색질 면역침전분석( chromatin immunoprecipitation assay , ChIP assay)

고정된 염색질 복합체들은 안티-NFκBp65 항체(Cell Signaling)를 사용하거나 또는 대조군으로 정상 토끼 혈청과 함께 48 ℃에서 12시간 동안 면역 침전시켰다. 인간 페투인-A 프로모터 서열의 증폭에 사용되는 프라이머는 5'-CAG AGC ACC TGG GTT GG-3'(forward) 및 5'-GCC CCA GAG CTG AGC AA-3'(reverse)이다.

1.9 조직학적 평가( histological evaluation )

실험 SD계 랫트와 쥐의 간을 하베스트 하고 난 후, 5% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였으며, 추가적인 조직학적 평가를 위해 파라핀에 임베디드(embedded) 시켰다. H&E 및 오일 레드-오 염색은 간 구역에서 수행하였고, 지방증은 숙련된 병리학자의 반 정량적 채점 시스템(semi-quantitative scoring system)에 의해 평가하였다. TG는 클로로폼(chloroform)과 메탄올(methanol)이 2:1로 혼합된 혼합물로 추출하였다. 유기층(The organic layer)을 건조 및 60% 메탄올에 용해시켰다. 추출된 TG는 TG 비색 분석 키트(colorimetric TG assay kit; Biovision)를 이용하여 측정하였다.

1.10 통계적 분석( statistical analysis )

모든 분석은 SPSS/PC 통계 프로그램(version 12.0 for Windows; SPSS, Inc., Chicago, IL)을 사용하여 수행하였다. 결과는 컨트롤 값(control values)의 배수(folds)로 표시한다(평균(mean)±표준오차(SEM)). 시험관 내 실험은 최소 3회 수행하였다. 통계적 분석에는 스튜던트의 T 검정(Student's t test) 또는 이원분산분석(two-way ANOVA)이 사용하였다.

2. 결과

2.1 간세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 지방증에 관계된 페투인 -A (Fetuin-A is involved in palmitate - induced steatosis in hepatocytes )

본 발명에서는 간세포에서 지방증 및 지질 대사에 대한 페투인-A의 역할을 평가하였다. 도 1은 HepG2 세포에서 TG 축적 및 SREBP-1C 유도에 대한 페투인-A의 작용을 나타내는 도면이다. 도 1A 및 1B는 스크램블(scramble)된 siRNA 또는 페투인-A siRNA 형질전환된 HepG2 세포들을 250 mM (HepG2 세포) 또는 200 mM(쥐의 1차 간세포)의 팔미테이트, 30 ㎎/㎖의 페투인-A(HepG2 세포)과 함께 배양하고, 오일 레드-오 염색을 통해 TG 축적을 측정하고 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 오일 레드-오 염색된 지질은 이소프로필 알코올 추출에 의해 정량화하였다. 도 1C 및 1D는 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 HepG2 세포 또는 쥐의 1차 간세포에서의 mTOR 인산화 및 SREBP-1C 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 1E는 HepG2 세포를 30 ㎎/㎖의 페투인-A 및 10 nM의 라파마이신 처리한 후 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 mTOR 인산화 및 SREBP-1C 발현을 측정한 결과를 나타낸다. β-Actin 및 mTOR 총량은 내부 표준(internal standards)으로 사용되었고 평균±표준오차(Means±SEM)는 세 번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

HepG2 세포의 배양(도 1의 A 및 C) 또는 쥐의 1차 간세포(도 1의 B 및 D)의 팔미테이트 처리는, 상당한 TG 축적을 유도하였고, mTOR의 인산화 및 SREBP-1C의 발현을 증가시켰다. siRNA에 의한 페투인-A 발현의 녹다운은 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적, mTOR의 인산화 및 SREBP-1C의 발현을 개선하였다(도 1의 A-D). 페투인-A의 녹다운 조건에서의 mTOR의 인산화 및 SREBP-1C의 발현의 억제는 페투인-A 처리에 의해 반전되었다(도 1의 C). 그러나, 페투인-A의 녹다운에 의해 유도된 TG 축적의 억제는 페투인-A 처리에 의해 반전되지 않았다(도 1의 A). SREBP-1C는 페투인-A 처리에 의해 유도되었다. 그러나, 이러한 유도는 특정 mTOR 억제제(inhibitor)인 라파마이신(rapamycin)에 의해 차단되었다(도 1의 E).

2.2 살사레이트와 살리실레이트의 HepG2 세포에서 팔이테이트에 의해 유도된 페투인 A의 억제( Both salsalate and salicylate inhibit palmitate - induced fetuin-A in HepG2 cells )

본 발명에서는 살사레이트가 HepG2 간세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현 및 분비를 감소시킬 수 있는지 테스트하였다.

인간에게 경구 살사레이트(90 mg/kg) 처리시 살리실레이트의 혈장 농도는 3 mM인 것으로 보고되었다(Fleischman A, Shoelson SE, Bernier R, Goldfine AB. Salsalate improves glycemia and inflammatory parameters in obese young adults. Diabetes Care 2008;31:289-94) 따라서, 본 발명에서는 처리 조건을 최적화하기 위해 살사레이트 및 살리실레이트의 농도 범위를 결정하였다.

도 2는 팔미테이트에 의해 조절된 페투인-A 발현 및 분비에 대한 살사레이트의 방지 효과를 나타내는 도면이다. 도 2A는 HepG2 세포들을 250 mM의 팔미테이트 및 서로 다른 농도의 살사레이트를 24시간 동안 처리한 뒤 배양 후, 세포추출물들을 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 적용하여 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 2B는 HepG2 세포들을 250 mM의 팔미테이트 및 7.5 mM의 살사레이트를 서로 다른 기간에 처리한 뒤 배양 후, 세포추출물들을 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 적용하여 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. β-Actin은 내부 표준(internal standards)으로 사용되었다. 도 2C는 HepG2 세포들을 250 mM의 팔미테이트 및 서로 다른 농도의 살사레이트를 24시간 동안 처리한 뒤 배양 후, ELISA(enzyme linked immunoassay)를 통해 배지로 방출된 페투인-A의 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 2D는 HepG2 세포들을 250 mM의 팔미테이트 및 7.5 mM의 살사레이트를 서로 다른 기간에 처리한 뒤 배양 후, ELISA(enzyme linked immunoassay)를 통해 배지로 방출된 페투인-A의 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 평균±표준오차(Means±SEM)는 세 번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

팔미테이트 처리는 페투인-A의 발현 및 분비를 상당히 증가시켰다. 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현 및 분비는 살사레이트 처리에 의해 투약 및 시간 의존적으로 감소하였다(도 2). 살사레이트의 1차 대사 산물인 살리실레이트는 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현에 살사레이트와 유사한 효과를 보여주었다. 또한 10 mM 농도의 살사레이트 및 살리실레이트에 의한 세포 독성은 관찰되지 않았다.

2.3 살사레이트 및 살리실레이트의 AMPK 활성화를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 페투인 -A의 발현 억제( Both salsalate and salicylate suppress palmitate -induced fetuin -A expression through AMPK activation )

도 3은 HepG2 세포에서 AMPK와 관련된 살사레이트의, 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A 억제효과를 나타내는 도면이다. 도 3A는 HepG2 세포들에 서로 다른 농도의 살사레이트를 24시간 동안 처리 또는 7.5 mM의 살사레이트를 다른 기간에 처리한 후에, 스크램블 siRNA, AMPK siRNA, 20 mM의 컴파운드 C 및 2 mM의 AICAR을 시험한 결과를 나타낸다. 도 3B는 스크램블 siRNA 또는 AMPK siRNA 형질전환된 HepG2 세포들을 250 mM 팔미테이트 및 7.5 mM 살사레이트 처리한 후, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3C는 대조군 또는 컴파운드 C 처리된 HepG2 세포들을 팔미테이트 및 살사레이트 처리한 후, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3D는 대조군 또는 컴파운드 C 처리된 쥐의 1차 간세포들을 200 mM의 팔미테이트 및 살사레이트 처리한 후, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3E는 대조군 또는 AICAR 처리된 HepG2 세포들을 팔미테이트 및 살사레이트 처리한 후, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 총AMPK 및 β-actin은 내부표준으로 사용되었고, 평균±표준오차(Means±SEM)는 세 번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

본 발명에서는 살사레이트가 투약 및 시간 의존적으로 AMPK의 인산화를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다(도 3의 A). 또한, 살사레이트에 의한 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 억제는 AMPK siRNA 및 컴파운드 C와 같은 AMPK 억제제에 의해 상당하게 감소 되었다(도 3의 B, C). 또한, 쥐의 1차 간세포의 살사레이트 처리는 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현을 방지하였다. 그러나, 컴파운드 C는 이러한 변화를 반전시켰다(도 3의 D). 대조적으로, HepG2 세포에서 AICAR에 의한 AMPK의 활성화는 살사레이트 처리 효과와 유사하게, 팔미테이트에 의해 자극된 페투인-A의 발현을 억제하였다(도 3의 E). 살리실레이트 또한 AMPK를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A를 억제하였다.

2.4 살사레이트 및 살리실레이트의 , AMPK 에 의해 매개된 NF κB 활성의 감소를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 페투인 -A의 발현 억제( Both salsalate and salicylate inhibit palmitate - induced fetuin -A expression through AMPK -mediated reduction of NFkB activity )

AMPK의 표적 분자들의 다운스트림(downstream)을 탐색하기 위해, 간의 지질대사에 관련되어 있고 AMPK에 의한 NFκB의 활성을 억제하는 것으로 보고(Cacicedo JM, Yagihashi N, Keaney Jr JF, Ruderman NB, Ido Y. AMPK inhibits fatty acid-induced increases in NF-kappaB transactivation in cultured human umbilical vein endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004;324:1204-9)된 NFκB를 후보로 고려하였다.

따라서, 본 발명에서는 간세포에서 AMPK-의존적인 NFκB 경로를 통해 살사레이트가 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 억제를 상향조절(up-regulation)할 수 있는지를 평가하였다.

도 4는 AMPK 의존적인 NFκB 경로와 관련된 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A에 대한 살사레이트의 억제효과를 나타내는 도면이다. 도 4A는 HepG2 세포들을 24시간 동안 250 mM 팔미테이트 및 7.5 mM 살사레이트 처리하거나, 살사레이트 처리하지 않은 것, 컴파운드 C 처리한 것으로 나누고, 세포질(Cytosolic), 핵(nuclear), 세포 총 분획(total fractions)을 안티-NFκBp65를 사용하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 적용한 결과를 나타낸다. 도 4B는 안티-포스포 IκB-α 및 안티 β-actin 항체들을 사용하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 적용한 결과를 나타낸다. β-actin은 내부표준으로 사용하였다. 도 4C는 HepG2 세포들을 24시간 동안 250 mM 팔미테이트 및 7.5 mM 살사레이트 처리하거나, 살사레이트 처리하지 않은 것, 컴파운드 C 처리한 것으로 나누고, ChIP 분석을 통해 페투인-A 프로모터에 결합하는 NFκB를 측정한 결과를 나타낸다. 도 4D는 상기 언급한 배양된 세포들의 핵 추출물을 EMSA 적용한 것으로 슈퍼쉬프트(Supershift) 분석을 위해 안티-NFκBp65 항체가 사용되었다. 비표지된 프로브는 페투인-A 프로모터에 특이적으로 결합하는 NFκB를 결정하기 위하여 사용되었다. 평균±표준오차(Means±SEM)는 세 번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

종래 보고와 일치하는 결과로서, HepG2 세포에서 팔미테이트는 IκB의 인산화와 NFκB의 핵 전좌(nuclear translocation)를 유도하였다. 살사레이트는 팔미테이트의 IκB의 인산화와 NFκB의 핵으로의 핵 전좌(nuclear translocation) 효과를 약화시켰고, 팔미테이트에 의해 유도된 NFκB 활성화 효과에 대한 살사레이트의 억제 효과는 컴파운드 C에 의해 부분적으로 차단되었다(도 4의 A, B).

페투인-A 프로모터는 NFκB 결합부위를 포함하고 있기 때문에(Dasgupta S, Bhattacharya S, Biswas A, Majumdar SS, Mukhopadhyay S, Ray S. NF-kappaB mediates lipid-induced fetuin-A expression in hepatocytes that impairs adipocyte function effecting insulin resistance. Biochemical Journal 2010;429:451-62), 본 발명에서는 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 자극된 NFκB의 DNA 결합 활성에 대한 살사레이트의 효과를 조사하였다.

본 발명에서는 ChIP assay를 수행하였고 NFκB의 페투인-A로의 결합활성은 살사레이트에 의해 차단된 팔미테이트에 의해 상당히 증가한다는 것을 발견하였다. 그러나, 이러한 살사레이트의 억제 효과는 컴파운드 C에 의해 반전되었다(도 4의 C). 팔미테이트 처리한 HepG2 세포로부터 획득한 핵 추출물들을 살사레이트 처리한 것과 살사레이트 처리하지 않은 것으로 나누어, NFκBp65 항체와 페투인-A 프로모터 영역에서 NFκB 결합 부위를 숨겨놓은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 EMSA-supershift 분석을 실시하였다.

도 4의 D는 팔미테이트에 의한 자극에 의해 NFκB의 DNA 결합이 상당히 증가하는 것을 보여준다. 그러나 살사레이트는 팔미테이트에 의한 NFκB의 DNA 결합 활성을 극적으로 감소시킨다.

대조적으로, 컴파운드 C는 팔미테이트에 의해 유도된 NFκB의 DNA 결합 활성에 대한 살사레이트의 억제 효과를 차단한다.

또한, 본 발명에서는 AMPK 활성화를 통한 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A mRNA의 발현에 대한 살사레이트의 억제 효과를 평가하였다. 살사레이트 처리한 HepG2 세포들은 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A mRNA의 발현을 억제하였다. 그러나, 추가적인 컴파운드 C의 처리는 이러한 변화들을 크게 반전시켰다(도 4의 E). 살리실레이트 살사레이트와 동일하게, NFκB 모듈레이션(modulation)을 통한 페투인-A 억제 효과를 보여주었다.

2.5 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적에 대한 살사레이트의 억제 효과( The inhibitory effect of salsalate against palmitate - induced TG accumulation in HepG2 cells )

도 5는 HepG2 세포에서 지방 생성 억제를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적을 개선시키는 살사레이트의 효과를 나타내는 도면이다. 도 5A는 HepG2 세포들을 24시간 동안 250 mM 팔미테이트 및 7.5 mM 살사레이트 처리하거나, 살사레이트 처리하지 않은 것으로 나누어, 오일 레드-오 염색을 통해 TG 축적을 측정하고 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 오일 레드-오 염색된 지질은 이소프로필 알코올 추출에 의해 정량화하였다. 도 5B는 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 SREBP-1C, PPAR-a, 및 CD36 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 5C는 HepG2 세포들을 24시간 동안 30 ㎎/㎖의 페투인-A 및 7.5 mM 살사레이트 처리하거나, 살사레이트 처리하지 않은 것으로 나누어, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 mTOR 인산화를 측정한 결과를 나타낸다. β-Actin 및 mTOR 총량은 내부 표준(internal standards)으로 사용되었고 평균±표준오차(Means±SEM)는 세 번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

본 발명에 따른 실험을 통해 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적은 살사레이트에 의해 방지된다는 것을 발견하였다(도 5의 A). 팔미테이트에 의해 유도된 SREBP-1C 발현은 살사레이트에 의해 상당히 감소한다. 그러나 CD36와 PPAR-α의 발현은 크게 영향 받지않았다(도 5의 B). 페투인-A에 의해 유도된 mTOR 인산화는 살사레이트에 의해 상당히 억제되었다(도 5의 C). 살리실레이트는 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적 및 관련된 유전자 조절에 대하여 살사레이트와 유사한 효과를 나타내었다.

2.6 팔미테이트에 의해 유도된 페투인 -A 발현 및 지방증에 대한 아디포넥틴 의 억제효과( Adiponectin inhibits palmitate - induced fetuin -A expression and steatosis )

An 등은(An Y, Liu K, Zhou Y, Liu B. Salicylate inhibits macrophage-secreted factors induced adipocyte inflammation and changes of adipokines in 3T3-L1 adipocytes. Inflammation 2009;32:296-303) 아디포넥틴 mRNA 발현은 3T3-L1 지방세포(adipocytes)에서 RAW 264.7 세포 배양 배지에 노출되었을때 감소하고, 살사레이트는 이러한 변화들을 효과적으로 반전시킨다는 것을 보고하였다.

인간의 연구는 살사레이트 처리가 글루코스와 지질 프로파일의 개선과 함께 아디포넥틴의 순환 농도를 상당히 증가시킨다는 것을 보여준다(Goldfine AB, Fonseca V, Jablonski KA, Pyle L, Staten MA, Shoelson SE. The effects of salsalate on glycemic control in patients with type 2 diabetes: a randomized trial. Annals of Internal Medicine 2010;152:346-57).

따라서, 본 발명에서는 fAD 처리가 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현을 억제할 수 있는 지에 대하여 실험하였다. 도 6은 HepG2 세포에서 지질 대사 개선을 통해 팔미테이트에 의해 유도된 TG 축적을 방지하는 풀랭스-아디포넥틴(Full length-adiponectin, fAd) 효과를 나타내는 도면이다. 도 6A는 fAd 농도 및 처리 기간을 최적화 하고, HepG2 세포들을 24시간 동안 250 mM 팔미테이트 및30 ㎎/㎖의 fAd 처리하거나, fAd 처리하지 않은 것, 20 mM의 컴파운드 C를 처리한 것으로 나누어, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 6B는 쥐의 1차 간세포들을 24시간 동안 200 mM 팔미테이트 및 fAd 처리하거나, fAd 처리하지 않은 것, 컴파운드 C를 처리한 것으로 나누어, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 6C는 오일 레드-오 염색을 통해 TG 축적을 측정하고 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 도 6D는 오일 레드-오 염색된 지질을 이소프로필 알코올 추출에 의해 정량화한 결과를 나타낸다. 도 6E는 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 SREBP-1C, PPAR-a, 및 CD36 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 도 6F는 HepG2 세포들을 24시간 동안 30 ㎎/㎖의 페투인-A 및 30 ㎎/㎖의 fAd 처리하거나, fAd 처리하지 않은 것으로 나누어, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 mTOR 인산화를 측정한 결과를 나타낸다. β-Actin 및 mTOR 총량은 내부 표준(internal standards)으로 사용되었고 평균±표준오차(Means±SEM)는 세 번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.

fAD 처리는 AMPK 경로를 통해 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현을 상당히 억제하였다(도 6의 A). 또한, 쥐의 1차 간세포에 fAD 처리를 하면 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A의 발현을 약화시켰다. 그러나 컴파운드 C는 이러한 변화들을 반전시켰다(도 6의 B). 아디포넥틴은 db/db 마이스(mice)의 간에서뿐만 아니라 배양된 간세포에서도 SREBP-1C를 억제하는 것으로 보고되었다(Awazawa M, Ueki K, Inabe K, Yamauchi T, Kaneko K, Okazaki Y, et al. Adiponectin suppresses hepatic SREBP1c expression in an AdipoR1/LKB1/AMPK dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications 2009;382:51-6).

종래 보고와 일치하는 결과로서, fAd 처리는 팔미테이트에 의해 유도된 지방증(도 6의 C, D) 및 SREBP-1C(도 6의 E)를 막아준다. 또한, fAd 처리는 HepG2 세포에서 팔미테이트에 의해 억제된 PPAR-a 및 CD36을 회복시켜 준다(도 6의 E). 페투인-A에 의해 유도된 mTOR 인산화는 fAd에 의해 상당히 억제되었다(도 6의 F).

2.7 살사레이트 및 살리실레이트의 , 상대적으로 고지방식이된 SD 계 랫트 및 db/db/ 마이스(mice)의 지방간과 페투인 -A의 발현 방지효과( Salsalate and salicylate treatment prevent hepatic steatosis and fetuin -A expression in HFD-fed SD rats and db / db mice , respectively )

본 발명에서는 H&E 염색 및 오일 레드-오 염색을 수행하여 지방 방울(lipid droplet)을 노출한 SD 계 랫트의 예비 생체 실험을 통해 살사레이트의 간 조직에 대한 효과를 평가하였다. 도 7은 지방간, 간의 페투인-A mRNA 및 단밸질 발현뿐만 아니라 유전자 발현을 방지하는 침투성의 살사레이트 및 살리실레이트의 투여효과를 나타내는 도면이다. 도 7A는 정상 지방 식이(normal fat diet, NFD), 고지방식이(high fat diet, HFD), 고지방 및 살사레이트 식이(HFD+Sal)된 SD 계 랫트의, 실험동물의 간 구역에서의 H&E 및 오일 레드-오 염색을 통한 TG 축적을 나타낸다. 도 7B는 간 구역세서의 H&E 염색을 통한 B6(Lean), db/db 마이스(mice) (db), and 살리실레이트 식이된 db/db 마이스(mice)(db+Sac)의 TG 축적을 나타낸다. 간의 TG는 TG 비색 분석 키트(colorimetric TG assay kit; Biovision)를 이용하여 측정하였다. 지방간의 레벨은 숙련된 병리학자에 의해 해석되었다(도 7C, D). 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 페투인-A 단백질 발현을 측정하였고, 리얼타임 PCR 분석법을 통해 페투인-A mRNA 발현을 측정하였다(도 7E, F). 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 AMPK, mTOR 인산화 및 SREBP-1C 발현을 측정하였다. β-Actin 및 각각의 토털폼(total form)은 내부표준으로 사용되었다 (n = 7 animals per treatment group).

고지방식이된 SD 계 랫트의 간에서 TG 축적 및 지방증 레벨은 상당히 증가하였지만, 살사레이트 처리는 이러한 변화들을 복원하였다(도 7의 A). 또한, 고지방식이된 SD 계 랫트에서 간의 페투인-A mRNA 및 단백질 발현은 모두 상승하였고, 살사레이트 처리에 의해 현저하게 억제되었다(도 7의 C). 또한, 고지방식이된 SD 계 랫트의 간에서 억제된 AMPK 및 증가된 mTOR 인산화뿐만 아니라 SREBP-1C 발현 또한 살사레이트 처리에 의해 반전되었다(도 7의 E). 살리실레이트 또한 db/db 마이스에서 지방간 및 페투인-A 발현에 대하여 살사레이트와 유사한 효과를 나타내었다(도 7의 B, D, F).

3. 결론

AHSG(α2-Heremans-Schmid glycoprotein)로도 알려진 페투인-A는 특히 지방간에서 간에 의해 독점적으로 발현 및 분비된다(Pischon T. Use of obesity biomarkers in cardiovascular epidemiology. Disease Markers 2009;26:247-63).

최근에 FGF(Fibroblast growth factor) 21 및 페투인-A와 같은 헤파토킨들(hepatokines)은 제2형 당뇨병 및 대사증후군 치료를 위한 핵심 타겟(target)으로 제안되었다(Seo JA, Kim NH. Fibroblast growth factor 21: a novel metabolic regulator. Diabetes & Metabolism Journal 2012;36:26-8).

페투인-A는 간세포와 골격근에서 인슐린 저항성을 초래하는 인슐린 수용체 티로신인산화 효소(insulin receptor tyrosine kinase)를 억제한다(Srinivas PR, Wagner AS, Reddy LV, Deutsch DD, Leon MA, Goustin AS, et al. Serum alpha 2-HS-glycoprotein is an inhibitor of the human insulin receptor at the tyrosine kinase level. Molecular Endocrinology 1993;7:1445-55).

고지방식에 도전할 때, 페투인-A 녹아웃 마이스는 인슐린에 민감하고, 체중증가에 저항성을 가진다(Mathews ST, Singh GP, Ranalletta M, Cintron VJ, Qiang X, Goustin AS, et al. Improved insulin sensitivity and resistance to weight gain in mice null for the Ahsg gene. Diabetes 2002;51:24508).

인간의 경우, 높은 페투인-A의 농도는 대사증후군과 깊은 연관이 있고(Ix JH, Shlipak MG, Brandenburg VM, Ali S, Ketteler M, Whooley MA. Association between human fetuin-A and the metabolic syndrome: data from the Heart and Soul Study. Circulation 2006;113:1760-7), 미래에 당뇨병의 위험을 예측하도록 한다(Ix JH, Wassel CL, Kanaya AM, Vittinghoff E, Johnson KC, Koster A, et al. Fetuin-A and incident diabetes mellitus in older persons. JAMA 2008;300:182-8).

또한, 높은 페투인-A 레벨은 비알코올성 지방간(NAFLD)과 연관되어 있고, 라이프스타일의 수정은 NAFLD의 개선과 함께 혈청 페투인-A의 레벨을 감소시킬 수 있다(Stefan N, Hennige AM, Staiger H, Machann J, Schick F, Krober SM, et al. Alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein/fetuin-A is associated with insulin resistance and fat accumulation in the liver in humans. Diabetes Care 2006;29:8537., Mori K, Emoto M, Yokoyama H, Araki T, Teramura M, Koyama H, et al. Association of serum fetuin-A with insulin resistance in type 2 diavetic and nondiavetic subjects. Diabetes Care 2006;29:468).

그러나, NAFLD의 발병의 페투인-A의 역할의 직접적인 증거는 제한되어 있고, 기본적인 기작은 불분명한 것으로 남아있다. 본 발명에서는 팔미테이트가 간세포에서 페투인-A 발현의 상향조절, TG 축적 및 SREBP-1C의 유도를 유발하고, siRNA에 의한 페투인-A의 녹다운이 이러한 변화들을 회복시킨다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명에서는 페투인-A가 SREBP- 1C 발현 및 프로세싱(processing)을 유도하는 것으로 보고된(Bakan I, Laplante M. Connecting mTORC1 signaling to SREBP-1 activation. Current Opinion in Lipidology 2012;23:226-34) mTOR 인산화를 유도한다는 것을 최초로 발견하였다.

라마이신은 SREBP-1C 발현에 대한 페투인-A의 효과를 차단한다. 이러한 결과는 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A가 mTOR-SREBP-1C 경로를 통해 지방증을 초래한다는 것을 제시한다.

NFκB는 대사 증후군 및 NAFLD의 주요 기작으로 간주 되는 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성의 발병과 연관이 있다. 간, 지방, 대식세포들(macrophages)에서의 NFκB의 활성은 인슐린 저항성을 초래하고, NFκB의 억제는 비만과 연관된 인슐린 저항성을 감소시킨다(Goldfine AB, Fonseca V, Shoelson SE. Therapeutic approaches to target inflammation in type 2 diabetes. Clinical Chemistry 2011;57:1627). 한편, AMPK는 세포 수준에서의 에너지 상태 감지의 중추적 역할을 하는 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)이다.

높은 수크로오스(sucrose)가 식이된 마이스는 감소된 AMPK와 관련된 NAFLD를

발전시킨다(Song Z, Deaciuc I, Zhou Z, Song M, Chen T, Hill D, et al. Involvement of AMPactivated protein kinase in beneficial effects of betaine on high-sucrose dietinduced hepatic steatosis. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2007;293:G894-902).

간에서 본질적으로 활성화된 (CA)- AMPK-α1를 발현하는 형질전환 마우스 모델에서, 체중 증가 및 간 지방 축적에 대한 저항성을 초래하는 SREBP-1C의 발현 및 그것의 타겟 유전자들은 감소한다(Yang J, Maika S, Craddock L, King JA, Liu ZM. Chronic activation of AMPactivated protein kinase-alpha1 in liver leads to decreased adiposity in mice. Biochemical and Biophysical Research Communications 2008;370:248-53).

AMPK는 배양된 인형 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells) 내에서 지방산에 의해 유도된 NFκB의 증가를 억제하는 것으로 밝혀졌다(Cacicedo JM, Yagihashi N, Keaney Jr JF, Ruderman NB, Ido Y. AMPK inhibits fatty acid-induced increases in NF-kappaB transactivation in cultured human umbilical vein endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004;324:1204-9). 최근, 1년의 효과와 안전성을 평가하는 전향적 무작위 배정 대조군 임상 연구에서 살사레이트가 2형 당뇨병 환자의 혈당증을 개선하고, 염증 매개물질을 감소시키는 것으로 나타났다(Goldfine AB, Fonseca V, Jablonski KA, Chen YD, Tipton L, Staten MA, et al. Salicylate (salsalate) in patients with type 2 diabetes: a randomized trial. Annals of Internal Medicine 2013;159:1-12).

따라서, 본 발명에서는 팔미테이트 처리된 간세포에서 AMPK-NFkB 경로와 관련되어 있는 페투인-A 발현에 대한 살사레이트의 효과에 대하여 연구하였다. 본 발명에서는 살사레이트가 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A 발현의 증가를 투약 및 시간 의존적으로 억제시킬수 있다는 것을 최초로 발견하였다. 또한, AICAR의 효과는 살사레이트와 유사한 반면에, AMPK siRNA 또는 컴파운드 C가 살사레이트의 이러한 억제효과를 차단한다는 것을 발견하였다. 또한, 페투인-A 프로모터에 대한 팔미테이트에 의해 자극된 NFκB 결합 활성, IκB-α 인산화, NFκB 핵전좌는 살사렝트에 의해 회복된다는 것을 발견하였다. 최종적으로 살사레이트 처리는 지방 생성과 관련된, 팔미테이트에 의해 유도된 지방증 및 SREBP-1C 발현을 방지해 준다는 것을 발견하였다. 이러한 결과들은 AMPK-NFκB 경로를 통한 페투인-A 억제 기작에 기반한 살사레이트 처리는 NAFLD 치료를 위한 유망한 전략이 될 수 있다는 것을 시사한다.

아디포넥틴은 지방조직으로부터 분비되는 30 KDa의 단백질이다. 아디포넥틴이 없는 마이스(Adiponectin null mice)는 고지방 식이와 함께 인슐린 저항성이 증가하고, 반대로 아디포넥틴 처리는 인슐린 민감성을 향상시키는 경향이 있다(Maeda N, Shimomura I, Kishida K, Nishizawa H, Matsuda M, Nagaretani H, et al. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30. Nature Medicine 2002;8:731-7).

페투인-A 및 아디포넥틴의 유전자들은 당뇨병과 대사 증후군의 감수성 유전좌자(susceptibility locus)로 알려진 인간 게놈의 3q27에 위치해 있다(Vionnet N, Hani EH, Dupont S, Gallina S, Francke S, Dotte S, et al. Genomewide search for type 2 diabetes-susceptibility genes in French whites: evidence for a novel susceptibility locus for early-onset diabetes on chromosome 3q27-qter and independent replication of a type 2-diabetes locus on chromosome 1q21-q24. American Journal of Human Genetics 2000;67:1470-80). 흥미롭게도, 페투인-A와 아디포넥틴의 농도는 반대 방향으로 작용하는 동안 대사증후군과 지속적으로 관련이 있다. 또한, 혈청 페투인-A 및 아디포넥틴의 농도는 반비례하는 관계에 있다(Ix JH, Sharma K. Mechanisms linking obesity, chronic kidney disease, and fatty liver disease: the roles of fetuin-A, adiponectin, and AMPK. Journal of the American Society of Nephrology 2010;21:406-12).

Hennige 등은 페투인-A 처리한 마이스에서, 지방 조직내의 아디포넥틴 mRNA 발현이 감소하고, 동반하여 TNF-α 및 IL-6의 발현이 증가한다는 것을 보여주었다(Hennige AM, Staiger H, Wicke C, Machicao F, Fritsche A, Haring HU, et al. Fetuin-A induces cytokine expression and suppresses adiponectin production. PLoS ONE 2008;3:e1765).

본 발명을 통해 아디포넥틴 처리는 반대로, 팔미테이트 처리된 간세포에서 AMPK 경로를 통해 페투인-A 발현을 억제한다는 것을 최초로 발견하였다. 이러한 발견은 페투인-A 및 아디포넥틴이 간과 지방 조직 사이에서 크로스토크(crosstalk)를 매개할 수 있고, 함께 인슐린 저항성을 조절할 수 있다는 것을 시사한다.

아디포넥틴 수용체로서 AdipoR1 및 AdipoR2가 확인되었다; 전자는 편재하여 발현되는 것에 비해 후자는 주로 간세포에서 발현된다. AdipoR2가 PPAR-α의 자극을 매개하는 반면, AdipoR1는 주로 AMPK의 자극을 매개한다(Kadowaki T, Yamauchi T, Kubota N. The physiological and pathophysiological role of adiponectin and adiponectin receptors in the peripheral tissues and CNS. FEBS Letters 2008;582:74-80).

AMPK 활성화는 간 지방 축적을 차단하여 아디포넥틴의 효과를 매개한다(Viollet B, Guigas B, Leclerc J, Hebrard S, Lantier L, Mounier R, et al. AMPactivated protein kinase in the regulation of hepatic energy metabolism: from physiology to therapeutic perspectives. Acta Physiologica (Oxford) 2009;196:81-98).

본 발명을 통해 살사레이트와 유사한 효과로서, 아디포넥틴 처리가 AMPK 경로를 통해 팔미테이트 처리된 간세포에서 지방증의 회복 및 SREBP-1C 발현과 함께 페투인-A 발현을 하향 조절한다는 것을 보여주었다.

살사레이트에 의해 유도된 아디포넥틴의 증가(Goldfine AB, Fonseca V, Shoelson SE. Therapeutic approaches to target inflammation in type 2 diabetes. Clinical Chemistry 2011;57:1627)를 고려하면, 이러한 기작은 NAFLD에 대한 살사레이트의 가능한 간접효과를 매개할 수 있다.

그러나 살사레이트와는 달리 아디포넥틴은 지방산 산화와 관련된 팔미테이트에 의해 억제된 PPAR-α와 CD36을 상향 조절할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 결과는 살사레이트와 아디포넥틴이 AMPK-fetuin-A-SREBP-1C 신호 경로를 공유함에도 불구하고, 지질대사에서 PPAR-α 및 CD36 경로를 통해 아디포넥틴이 추가적인 별개의 역할을 가질 수 있다는 것을 암시한다. 생체 외 실험에서의 이러한 연구 결과를 바탕으로, 본 발명의 예비 생체 실험에서 동물 모델의 간에서 살사레이트 또는 살리실레이트 투여가 페투인-A 발현 및 지방증을 조절할 수 있는 지에 대하여 조사하였다. 시험관 실험에서와 같이 실제로도, 살사레이트 또는 살리실레이트 처리에 의해 지방간 뿐만 아니라 페투인-A 발현도 개선되었다.

도 8은 페투인-A 및 지방간에 대한 살사레이트의 억제효과의 가능한 메커니즘을 개략적으로 나타내는 도면이다. 결론적으로, 살사레이트는 AMPK-NFκB 경로의 의존을 통해 팔미테이트에 의해 유도된 페투인-A 발현을 억제하고, 결과적으로 간 TG의 축적과 지질대사 장애를 개선한다(도 8). 본 발명에 따르면, 살사레이트의 AMPK-NFκB 경로 의존을 통한 페투인-A의 조절은 NAFLD 치료에 대한 새로운 접근이 될 수 있다는 것을 시사한다.

Claims (3)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   .
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 정제, 발포정, 과립제 또는 캅셀제로 단위투여 제형화되는 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 과립화제, 희석제, 붕해제, 활택제, 차광제, 조미제, 윤활제, 교정제, 감미제, 풍미제, 착색제, 안정화제, 항산화제, 유동화제 및 용해보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간 예방 및 치료용 약학적 조성물.

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