KR20160011534A

KR20160011534A - Gmr 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 gmr 메조포러스 물질

Info

Publication number: KR20160011534A
Application number: KR1020140092811A
Authority: KR
Inventors: 유재수; 시타 라마 라주 간지; 고영환
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-22
Filing date: 2014-07-22
Publication date: 2016-02-01

Abstract

본 발명은 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR) 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 매리골드 꽃 형태를 가짐으로써 넓은 표면적을 가질 수 있고, 페길레이션을 통해 세포핵에 대한 침투능력을 향상시켜 의료 응용 분야에 사용하기 적합할 뿐만 아니라 분말 형태로 제조하여 광학, 촉매, 가스 감지 등 다양한 분야에 적용할 수 있는 GMR 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질에 관한 것이다.

Description

GMR 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질{SYNTHESIS METHOD OF PEGylated α-GADOLINIUM MOLYBDATE MESOPOROUS MATERIAL AND ITS PRODUCT THEREFROM}

페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR) 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 매리골드 꽃 모양의 독특한 구조로 넓은 표면적을 가지고, 분말 형태로 대량 생산이 가능함으로써 광학, 촉매, 가스 감지, 의료응용 등 다양한 분야에 적용할 수 있는 GMR 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질에 관한 것이다.

다공성물질은 그 크기에 따라 마이크로포러스 물질, 메조포러스 물질, 매크로포러스 물질로 구별할 수 있다. 마이크로포러스 물질은 2nm 이하의 직경을 가진 공극을 포함하고, 매크로포러스 물질은 50nm 이상의 직경을 가진 공극을 포함하며, 메조포러스 물질은 2~50nm 사이의 직경을 갖는 공극을 포함한다. 전형적인 메조포러스 물질은 정밀한 크기의 미세 기공을 갖는 실리카(silica) 및 알루미나(alumina) 종류가 있고, IUPAC에 따르면, 메조포러스 물질은 메조구조(mesostructure)에 의해 규칙적이거나 불규칙적일 수 있다.

메조포러스 물질은 나노입자들의 집단적인 행동과 광학, 촉매, 가스 감지, 의료 응용과 같은 바람직한 목적을 위한 유용한 기능을 수행할 수 있는(ability to adopt smart function) 능력 때문에 중요한 관심분야이다. 최근에는, 의료 응용 분야에서 비독성이고 다기능(이미징(imaging), 약물 표적화(targeting), 약물 전달(drug delivery))적인 메조포러스 물질의 개발에 초점이 맞추어져 왔다. 금속, 금속 산화물, 고분자와 같은 다른 형태 및 조성을 가진 몇몇의 생체적합적 물질들이 암이나 다른 질병에 걸린 세포들에 대해 다기능적인 의료물질(biomaterial)로서 사용되어 왔다. 대한민국 공개특허공보 10-2010-0122480에도 메조포러스가 형광성 입자 및 엽산의 전달을 위한 조절성 약물 전달 장치의 제조에 이용될 수 있다는 내용이 개시되어 있다. 그러나, 대부분의 물질들은 침투능력의 부족으로 세포질에 머물러 있다. 따라서 연구노력은 세포핵에 대한 입자의 침투능력 향상에 집중되었다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 물에 대한 용해성을 높여주고 안정성을 증가시키며 독성을 줄여주는 효과가 있을 뿐만 아니라 인체에 무해하여 약물 합성에 많이 사용되는 고분자이다. 몇몇의 연구단체들은 금속, 금속 산화물, 나노입자 또는 메조입자와의 페길레이션(PEGylation)이 세포핵에 대한 침투능력을 증진할 수 있는지를 평가하고 있다. 그러나 몇몇의 무기 화합물은 분자들 사이의 낮은 반응성 때문에 결정도를 포함한 분명한 형태로 합성하기가 어렵고, 입자의 형태를 파괴하는 추가적인 열처리가 필요하다. 따라서 페길레이션을 이용하면서도 뚜렷한 형태를 가진 메조포러스 물질에 대한 개발이 요청되고 있다.

[특허문헌]대한민국 공개특허공보 10-2010-0122480

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로서, 본 발명의 목적은 매리골드 꽃 형태를 가짐으로써 넓은 표면적을 가지고 있고, 페길레이션을 통해 세포핵에 대한 침투능력을 향상시켜 의료 응용 분야에 사용하기 적합하며, 분말 형태로 제조하여 광학, 촉매 등 다양한 분야에 적용할 수 있는 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR) 메조포러스 물질 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 보다 분명해 질 것이다.

상기 목적은 본 발명의 일 양상인 (a) 용매열 합성법을 이용하여 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMO) 전구체를 제조하는 단계; (b) 수열 합성법을 이용하여 GMO 전구체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시켜 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR)을 제조하는 단계; 및 (c) GMR을 건조 및 하소하는 단계;를 포함하는 GMR 메조포러스 물질 제조방법에 의해 달성될 수 있다.

다른 양상으로 (b)단계는 (b1) 상기 GMO 전구체의 아민 그룹과 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 결합하는 뉴클리에이션(nucleation) 단계; (b2) 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 결합한 상기 GMO 전구체의 표면에서 변형이 일어나고, 결정이 형성되는 표면 변형(Surface modification) 및 결정화(crystallization) 단계; 및 (b3) 자체부착(oriented attachment)을 통한 자가-조립(Self-assembling) 단계;를 포함할 수 있다.

또 다른 양상으로 (c) 단계는 하소 온도가 300~400℃일 수 있다.

상기 목적은 본 발명의 일 양상인 상술한 제조방법에 의해 제조된 GMR 메조포러스 물질에 의해 달성될 수 있다.

다른 양상으로 GMR 메조포러스 물질은 희토류 원소로 도핑될 수 있다.

본 발명에 따르면, 매리골드 꽃 형태를 가짐으로써 넓은 표면적을 가질 수 있고, 페길레이션을 통해 세포핵에 대한 침투능력을 향상시켜 의료 응용 분야에 사용하기 적합하며, 분말 형태로 제조하여 광학, 촉매 등 다양한 분야에도 적용할 수 있는 효과를 가진다.

다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR) 메조포러스 물질의 제조 메커니즘을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 GMR 메조포러스 물질의 제조 메커니즘에 따른 SEM 사진이다.
도 3은 다른 하소 온도에서의 GMR 메조포러스 물질의 SEM사진 및 확대된 SEM사진이다.
도 4는 GMR 메조포러스 물질에 대한 FTIR 그래프이다.
도 5는 GMR 메조포러스 물질의 XRD 패턴과 이에 대응되는 SAED, 400℃에서 하소한 후의 HRTEM 및 다른 하소 온도에서의 BET 표면적 분포도를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 6은 PLE 및 PL 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 췌장암 세포계 Mia-PaCa-2에 의한 메조포러스 입자의 흡수 공초점 사진이다.
도 8은 다른 GMR 메조포러스 입자들로 처리한 Mia-PaCa-2 세포의 생존과 PBS 용액으로 처리된 또는 미처리된 GMR1, GMR2 메조포러스 물질을 나타낸 그래프 및 사진이다.

이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.

본 명세서에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본 명세서에 기재된다.

본 발명의 일 양상에 따른 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR) 메조포러스 물질 제조방법은 (a) 용매열 합성법을 이용하여 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMO) 전구체를 제조하는 단계; (b) 수열 합성법을 이용하여 GMO 전구체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시켜 GMR을 제조하는 단계; 및 (c) GMR을 건조 및 하소하는 단계;를 포함할 수 있다.

여기서, GMO는 알파 가돌리늄 몰리브데이트(α- Gd₂(MoO₄)₃)을 의미하고, GMR은 “GMO Regrowth”의 약자로서 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(PEGylatedα- Gd₂(MoO₄)₃)를 의미하며, GMO 전구체는 GMR이 합성되기 전 단계의 물질을 의미한다.

일 실시예에 따르면, (a) 단계에서 아모퍼스(amorphous) GMO 전구체는 몰리브데넘(molybdenum) 소스(source)로서 암모니움 헵타몰리브데이트 (ammoniumheptamolybdate)를 사용하고, 용매로서 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)을 사용하여 용매열 합성법을 통해 제조되는 것으로서, 아민 그룹(amine moieties)을 포함한다. 용매열 합성법은 210~230℃에서 40~50시간 진행한다. 도 1을 참조하면, 최초물질은 PEG와 결합하기 전 용매열 합성법에 의해 제조된 GMO 전구체를 나타낸다.

(b) 단계에서 GMR은 수열 합성법을 통해 제조한다. 수열 합성법은 고온고압 하에서 물 또는 수용액을 이용하여 물질을 합성하는 방법으로써 137~143℃에서 GMO 전구체 : PEG를 1 : 2.5~3.5의 질량비로 혼합하는 것이 바람직하다. PEG의 양이 2.5 미만일 경우 용액에 분산이 완벽히 이루어지지 않기 때문에 균일하게(uniformly) 성장이 되지 않고, 꽃 모양의 GMR이 형성되지 않는다. 또한 PEG의 양이 3.5를 초과할 경우 표면에 PEG가 너무 많이 캡핑(capping)되어 수열합성법에 의해서 결정성장이 되지 않아 역시 꽃 모양의 GMR이 형성되지 않는다. GMO 전구체의 아민 그룹은 PEG와의 결합(PEGylation)에서 핵심적인 역할을 수행(play)한다. GMR 메조포러스 제조방법의 전 과정에서 아민 그룹을 통한 GMO와 PEG의 결합은 성장 메커니즘의 원동력(driving force)이다. PEG는 캡핑제(capping agent)로서 행동(act) 할 뿐 아니라 뉴클리에이션 (nucleation)의 속도를 유도한다. 또한, 표면 변형(surface modification) 및 결정화(crystallization) 단계와 조립 과정(assembling process)에서 소프트 템플릿(soft template)으로 행동(act)한다. 도 1을 참조하면, 반응 시간에 따른 GMR 제조과정을 확인할 수 있다.

(c) 단계에서는 (b)단계에 의해 제조된 GMR을 건조한 후, 고온에서 하소하여 분말 형태의 GMR 메조포러스 물질을 제조한다.

본 발명의 일 양상에 따른 GMR 메조포러스 물질 제조방법은 (a) 용매열 합성법을 이용하여 GMO 전구체를 제조하는 단계; (b) 수열 합성법을 이용하여 GMO 전구체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시켜 GMR을 제조하는 단계; 및 (c) GMR을 건조 및 하소하는 단계;를 포함할 수 있고, (b) 단계는 (b1) GMO 전구체의 아민 그룹과 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 결합하는 뉴클리에이션(nucleation) 단계; (b2) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 결합한 GMO 전구체의 표면에서 변형이 일어나고, 결정이 형성되는 표면 변형(Surface modification) 및 결정화(crystallization) 단계; 및 (b3) 자체부착(oriented attachment)을 통한 자가-조립(Self-assembly) 단계;를 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, (a) 및 (c) 단계는 상술한 바와 같다. (b1) 단계는 (b) 단계의 초기단계로서, GMO 전구체와 PEG가 결합하여 뉴클리에이션(nucleation)을 한다. 적혈구 형태를 보이며, 이는 도 2의 a에서 확인할 수 있다. (b2) 단계는 표면 변형(surface modification) 및 결정화(crystallization) 단계로서, 반응 시간이 증가하여 4시간이 되면, 안쪽 공간은 증가하고, 얇은 표면을 가진 입자들이 쭉 뻗고, 둘 또는 그 이상의 입자의 조합이 관찰되는 등 표면 변형(surface modification)이 발생한다. 이는 도 2의 b에서 확인할 수 있다. 반응 시간이 6시간으로 증가하면, 도 2의 c에서 확인할 수 있는 것처럼, 표면 변형(surface modification)이 완성되면서 완벽하게 형성된 얇은 꽃잎(petal)형태가 관찰된다. (b3) 단계는 자가-조립(self-assembly) 단계이다. 수용액에서, 인접한 표면 사이의 브라운 운동과 근거리(shortrange) 상호작용은 나노결정(nanocrystal)의 회전을 유발하고, PEG는 캡핑제(capping agent)로 작용한다. 반응시간이 8시간으로 증가하면, 다른 꽃잎(petal) 형태들이 명백하게 관찰되고, 매리골드 싹 형태를 띄게 된다(도 2의 d). 반응시간이 10시간으로 증가하면, 도 2의 e에서 확인할 수 있는 것처럼, 매리골드 싹 형태는 더욱 성장한다. 반응시간이 12시간이 되면 활짝 핀 매리골드 꽃의 형태를 보인다(도 2의 f). (b) 단계의 개략적인 메커니즘은 도 1을 통해서 확인할 수 있다.

본 발명의 일 양상에 따른 GMR 메조포러스 물질 제조방법은 (a) 용매열 합성법을 이용하여 GMO 전구체를 제조하는 단계; (b) 수열 합성법을 이용하여 GMO 전구체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시켜 GMR을 제조하는 단계; 및 (c) GMR을 건조 및 하소하는 단계;를 포함할 수 있고, (c) 단계에서 하소 온도는 300~400℃일 수 있다.

일 실시예에 따르면, (a) 및 (b) 단계는 상술한 바와 같다. (c) 단계는 (b) 단계에 의해 제조된 GMR을 건조한 후, 고온에서 하소하여 분말 형태의 GMR 메조포러스 물질을 제조하는 단계로서, 하소온도는 300~700℃일 수 있고, 바람직하게 300~400℃이다. 분말 형태의 GMR 메조포러스 물질은 광학, 촉매, 가스 감지 등 다양한 분야에 적용하여 사용될 수 있지만, 의료 응용분야에 적용함에 있어서는 300~400℃로 하소된 GMR 메조포러스 물질이 적합하다. 400℃를 넘어서 하소할 경우, 소수성이 증가하여 세포핵에 대한 침투능력이 없어지기 때문이다.

본 발명의 일 양상에 따른 GMR 메조포러스 물질은 상술한 GMR 메조포러스 물질 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

일 실시예에 따르면, GMR 메조포러스 물질의 합성에 이용되는 GMO 전구체는 몰리브데넘(molybdenum) 소스(source)로서 암모니움 헵타몰리브데이트(ammonium heptamolybdate)를 사용하고, 용매로서 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)을 사용하기 때문에 아민 그룹(amine moieties)을 포함한다. 아민 그룹은 PEG와의 결합(PEGylation)에서 핵심적인 역할을 수행(play)한다. GMR 메조포러스 제조방법의 전 과정에서 아민 그룹을 통한 GMO와 PEG의 결합은 성장 메커니즘의 원동력(driving force)이다. PEG는 캡핑제(capping agent)로서 행동(act) 할 뿐 아니라 뉴클리에이션 (nucleation)의 속도를 유도한다. 또한, 표면 변형(surface modification) 및 결정화(crystallization) 단계와 조립 과정(assembling process)에서 소프트 템플릿(soft template)으로 행동(act)한다. 초기 단계에서, GMO 결정 성장에 대한 PEG의 효과는 매우 과포화된 전구체 용액으로부터 빠른 반응 때문에 분명하지 않다. 그러므로, 많은 핵센터(nucleatin center)가 전구체의 형태 변화 없이 GMO 결정의 아민 그룹과 PEG 리간드 결합에 의해 형성된다. 이 과정에서, 결합되지 않은 몇몇의 PEG 분자는 물과의 특별한 상호작용에 의해 상대적으로 안정한 상태에 도달하기 위해 나선-형태(helix-like)의 집합체를 형성한다. 반응 4시간 후에, 성장과정에서 유착(coalescence)때문에, 프라이머리 결정(primary crystals)의 표면 변형(surface modification)은 초기 단계에서 형성된 핵센터(nucleation center)의 수를 줄임으로써 발생한다. 이 단계에서, 상대적으로 높은 PEG의 농도 덕분에, 물분자와 에터 그룹간의 내부 수소결합 때문에 PEG 분자들은 GMR 복합체 나노입자에 느슨하게 결합된다. 반응이 6시간으로 늘어나면, PEG 집합체(aggregates)의 도움으로, 선택적인 결정면(crystallographic planes)에 대한 PEG 분자의 특정한 표면 흡착 때문에 자체부착(oriented attachment)을 통한 인접 입자들의 자발적인 자가-조립이 완성된다. PEG 집합체(aggregates)는 인접한 PEG 분자의 부착에 의한 입체 반발을 경험하면서 소프트 템플릿(soft template)으로서 행동(act)한다. 이것은 나노입자들 사이에 메조포러스의 형성과 나노꽃잎들(nanopetals) 사이에 공극(voids)의 형성을 가능하게 하면서, 나노입자들과 나노꽃잎들 사이의 빈 공간에 차례로 이르게 한다. 자가-조립(self-assembling) 과정은 불포화 결합과 관련된 표면 에너지를 최소화 함으로써 전체 에너지를 줄인다. 자가-조립(self-assembling) 현상은 반응시간이 10시간으로 증가함으로써 더욱 분명해지고, 마침내 12시간 후에는 매리골드 꽃 형태와 아주 유사한(well-defined) 형태를 갖는 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR)를 형성하면서, 동적평형 상태에 이르게 된다.

이렇게 제조된 GMR 메조포러스 물질은 지금까지의 메조포러스 물질과는 다른 매리골드 꽃 모양의 독특한 형태를 가지고, 이에 따라 넓은 표면적을 가질 수 있으며, 분말 형태로 제조됨으로써 광학, 촉매, 가스 감지, 의료 등 다양한 분야에 적용하기가 용이하다.

본 발명의 일 양상에 따른 GMR 메조포러스 물질은 희토류 원소로 도핑될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 희토류 원소로 도핑된 GMR 메조포러스 물질은 형광물질로서 쓰일 수 있다. 적당한 온도로 하소한 후 희토류 원소로 도핑할 경우, 세포핵에 대한 침투능력도 가지고 있어 의료 응용 분야에 특히 유용하게 적용될 수 있다. 따라서 기존의 복잡하고 비싼 공정이 요구되는 형광물질 제조방법을 대체할 수 있다.

이하, 실시예와 도면을 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 실시예와 도면은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예와 도면에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[제조예]

GMR 메조포러스 물질의 합성

GMR(5 mol % Eu³⁺) 메조포러스 물질은 용매열 합성법 및 수열 합성법을 이용한 재성장 기술에 의해 합성된다. 1단계로, GMO 전구체 분말은 고순도의 가돌리늄 나이트레이트 헥사하이드레이트(Gd(NO₃)₃ㆍ6H₂O), Eu(NO₃)₃ㆍ5H₂O, 및 암모니움 몰리브데이트 테트라하이드레이트((NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O)에 기초한 81~83%의 MoO₃의 화학량론을 취함으로써 합성된다. 희토류 나이트레이트(Gd³⁺ 1.33mM과 Eu³⁺ 소스의 0.007mM(5 mol%), 총 희토류 원소(element)는 70mL에서 1mM) 에틸렌 글리콜 30mL에 용해되었고, 0.375mM(70mL에 대해 0.22mM)의 몰리브데넘 소스는 분리된 비커에서 초음파 처리(sonication) 및 자석 교반(magnetic stirring)의 도움으로 에틸렌 글리콜 40mL에 용해되었다. 교반(stirring)은 균일한 용액이 형성될 때가지 계속되었고, 두 용액을 하나의 비커에 혼합하였다. 한 시간 후, 용액은 Teflon liner(용기의 크기에 따라 채우는 부피가 달라지는데 50~60%정도면 바람직하다)와 함께 스테인리스 스틸 오토클레이브(stainless steel autoclave)(총 내부 부피는 250cm³)로 옮겨졌고, 그 후 2℃/min의 속도로 220℃까지 가열되었다. 교반(stirring)은 반응물들 사이에 안정한 네트워크를 만드는 최고 온도 220℃까지 48시간 동안 계속되었다. 그 후 점진적으로 상온까지 식히고, 침전물은 물과 에탄올로 여러 번 씻는다. 그리고 주변대기(ambient atmosphere)에서 하루동안 80℃로 건조한다. 2단계로 폴리(에틸렌 글리콜)(H(OCH₂CH₂)nOH)(PEG-10,000Da)1.5g을 삼포증류방향수(triple distilled water) 70mL에 녹였고, 이어서 GMO 전구체 0.5g을 PEG 용액에 첨가한다. 3시간 교반 후, 용액은 Teflon liner로 옮겨졌고, 2℃/min의 속도로 140℃까지 가열되었다, 그리고나서 12시간동안 이 온도에서 유지하였다(교반은 140℃에 도달할 때가지 계속되었다). 그 후 점진적으로 상온으로 식히고, 침전물은 원심분리기에서 3000rpm으로 3분동안 분리되었으며, 에탄올과 물로 씻었다. 얻어진 침전물은 주변대기(ambient atmosphere)에서 하루동안 60℃로 건조했다.

세포배양 및 세포증식(cell culture and cell proliferation)

간략하게, Mia-PaCa2 세포계(cell line)는 96 웰 플레이트 또는 8 웰 챔버 플레이트(7ⅹ10³ 세포/웰)에서 배양되었고, CO₂ 인큐베이터 안에서 37℃, 36시간 동안 20μM의 GMR1-GMR4 메조포러스 입자(멸균수에 의해 희석)와 함께 배양(incubation)되었다. 세포의 생존능력은 제조업자의 지침(ATCC; Catalog No. 30-1011K)에 따른 XTT 분석에 의해서 결정되었다. 36시간 후, 50μL의 XTT 시약이 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가되었고, 2시간동안 배양(incubation)되었다. 흡수는 96 웰 마이크로 플레이트 리더(96 well micro plate reader)를 사용하여 475nm에서 읽혔다.

GMR 흡수 생체 형광 현미경(In vitro Fluorescence Microscopy of GMR Uptake)

In vitro cell nucleo-cytochemical 분석이 수행되었다. GMR 메조포러스 입자 흡수 생체 형광 현미경을 위해서, Mia-PaCa2 세포는 8 웰 챔버 슬라이드에서 성장하였고, 36시간 동안 GMR로 처리되었다. 세포들은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정(fixed)되었고, 1XPBS로 5분 동안 인터웰(interwell)에서 3번 씻겼다. 이어서, 4’-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 핵 대비염색제(counterstaining)로 사용되었고, 장착되었다. 세포는 405, 458, 477, 488, 514, 543, 633nm의 여기, 방출 레이저와 DAPI와 GMR 나노 입자의 방출 신호를 수집할 수 있는 적절한 대역 필터를 갖춘 Zeiss LSM 510 Meta Confocal 형광현미경(Peabody, MA)을 사용한 형광현미경 관찰법에 의해 검사되었다.

[실시예1]

하소 온도 효과(calcination temperature effect)

도 3은 다른 하소 온도에서의 SEM사진 및 확대된 SEM사진이다. a는 GMO 전구체를 나타낸 것이다. b는 300℃에서 하소하였고, 두께가 감소된 것을 보여준다. c는 400℃에서 하소하였고, 구멍을 볼 수 있다. d는 500℃에서 하소하였고, 자가조립과 함께 결정이 발달하였고, 정밀한 구멍이 보인다. e는 600℃에서 하소하였고, 입자들이 다리걸친 집합체가 더욱 확연하게 보인다. f는 600℃에서 하소하였고, 입자가 더욱 커지고 구멍이 사라진다.

도 3을 참조하면, 각각의 온도에서 하소된 GMR 메조포러스 물질을 확인할 수 있는데, SEM(scanning electron microscope)사진은 영향받지 않은 꽃 형태의 텍스쳐(unaffected flower-like texture)를 확인할 수 있고, 반면 고확대 SEM 사진은 다른 하소온도에서 구멍의 변화를 보여준다. 도 3의 a,b를 비교해보면, 300℃에서 하소된 샘플(GMR1)은 얇고 부드러운 나노꽃잎(nanopetal)을 보인다. 이는 PEG 보호층의 제거와 나노꽃잎(nanopetal)의 표면으로부터 물 분자의 흡수가 있음을 나타낸다. 하소온도가 400℃(GMR2)로 증가하면, 꽃잎(petal)의 가장자리에서 매우 얇은 꽃잎(petal)과 작은 볼 수 있는 구멍이 형성된다.(도 3의 c) 이러한 관찰은 흡수된 또는 결합된(coordinated) 탄소 및 하이드록실 분자의 분해를 나타낸다. 하소온도가 500℃(GMR3)에서는, 꽃잎(nanopetal)들의 자체-응집(self-aggregation) 뿐만 아니라 정밀한 구멍과 함께 나노입자들의 뚜렷한 연결을 보여준다(도 3의 d). 이는 거의 모든 하이드록실기 분자의 분해를 의미하고, FTIR(Fourier transform infrared)와 XRD(X-ray diffraction) 패턴으로도 확인할 수 있다. 도 3의 e, f를 참조하면, 600℃(GMR4)에서는 입자들이 다리 형태(bridged-like)의 쌍(pair)으로 보이고, 700℃(GMR5)에서는 유착(coalescence)과 오스왈트 숙성(Ostwald's ripening)의 결합된 효과에 의한 자체-응집(self-aggregation)의 증가 때문에 더 큰 입자들 및 완벽하게 사라진 구멍들과 함께 더욱 뚜렷해졌다.

[실시예2]

페길레이션의 확인(confirmation of PEGylation)

도 4는 GMR의 FTIR 스펙트럼이다. 대응되는 FTIR 스펙트럼은 점차적으로 PEG 흡수띠가 사라지는 것을 보여준다. 도 5의 a는 GMR의 XRD 패턴을 보여주고, 도 5의 b는 대응되는 SAED를 보여준다. 여기서 PEG의 둥근면과 α-GMO의 밝은 점(spots)을 볼 수 있다. 도 5의 c는 400℃에서 하소한 후의 HRTEM이다.

다공성 구조에서 PEG의 안정성은 다른 하소 온도에서 FTIR 스펙트럼에 의해 평가되었다. 이는 도 4를 통해 확인할 수 있다. GMO 전구체는 740 cm^-1에서 N-H 웨그(wag), 1584 cm^-1에서 N-H 굽힘(bending) 진동을 보여준다. 준비된(as-prepared) 복합체는 917 cm^-1(υ₁), 808 cm^-1(υ₃) 및 700 cm^-1에서 Mo-O-Mo(υ) 브릿지(bridge)에 위치한 MoO42- 음이온의 전형적인 신축 진동을 보여준다. 진동 파수는 결정 구조 표면의 PEG와 함께 메조포러스 구조의 하이브리드 화학적 특성(nature)을 설명했다. 3170 cm^-1에 위치한 O-H 신축 진동은 성장과정 동안 분자간 수소결합이 있다는 것을 의미한다. 2876 cm^-1에서의 흡수는 O-H 신축 진동에 덧붙여진 C-H의 신축 진동을 나타낸다. 3565 cm^-1에서의 날카로운 피크는 자유 하이드록실(O-H) 결합의 존재를 의미한다. 카보닐 신축 진동(C=O)에 덧붙여진 아마이드 그룹의 N-H 진동은 1624와 1579 cm^-1(υ₃)에서 관찰되고, 각각 GMO 전구체로부터 복합된 것이며, 아민 N-H 결합은 강한 흡수를 보인다(도 4). PEG의 카복실기 부분과 결합된 아민은 GMO와 페길레이션의 원인이 되는 아마이드 그룹의 형성을 이끈다. 아마이드 결합의 존재는 입체 효과와 강한 내부 수소결합의 존재를 나타낸다. C-O-C 신축진동과 PEG의 결정(crystallization) 피크는 1103, 948 cm^-1에서 각각 관찰되었다. 알코올 및 하이드록실기의 주파수는 하소 온도가 증가함에 따라 점차적으로 사라지고, 500℃에서는 거의 자취를 감추었다.

XRD 패턴은 GMR 결정 표면의 변형을 확인했다. 왜냐하면 PEG의 단위세포는 a=8.16Å, b=12.99Å, c=19.30Å, β=126.5°이고, 7₂ 나선의 4가지 사슬로 구성된 단사정계이기 때문이다. 단사정계 상태에서 PEG 분자 사슬의 움직임은 더욱 활발하고, 열역학적으로 안정하다. 복합 시스템에서 녹는점이 증가하기 때문이다. 그러므로, 약간의 변형(modification)과 함께 단사정계 GMO 결정 구조의 재배열은 그것의 고유 특성을 변화시키는 것 없이 쉽게 될 수 있고, 생물학적 응용을 위해 요구되는 스마트한 기능 또한 쓸 수 있다(adopt). 도 5의 a로부터, 낮은 각반사를 제외하고, GMR 회절 피크는 JCPDS #24-0428과 일치하는 것은 자명하다. 왜냐하면 2θ= 19.2°와 23.4°에서 PEG 반사가 낮은 각 측(angle side)을 커버(cover)했기 때문이다. 고분해능 TEM 분석(도 5의 c)이 이를 뒷받침해주고, GMO와 PEG의 두 면(planes)을 확인해준다. 하소온도가 증가할 때, PEG 회절 피크의 강도는 점차 감소하고, 500℃에서는 거의 사라진다. 이것은 FTIR 스펙트럼과 일치한다. 28.5℃에서 (-221)에 해당하는 XRD 피크가 좁아지는 것을 제외하고, 핵심 회절 피크는 보통의 위치에서 변하지 않았고, 전형적인 GMR 회절 피크는 600℃에서 나타나기 시작했다. C2/c 그룹의 완벽한 단사정계 GMO 상(JCPDS #26-0655)은 700℃에서 관찰되었다. XRD 결과는 GMO의 결정질 상(crystalline phase)을 저해(hinders)할 뿐만 아니라 결정 성장을 촉진하는 PEG의 존재를 나타낸다. 도 5의 b는 상응하는 제한 시야 회절(selected area diffraction, SAED) 패턴을 나타낸다. SAED 패턴은 고리 패턴에 겹쳐진(superimposed) 밝은 점(spots)을 가지고 있다. 고리 패턴은 하소 온도가 증가함에 따라 사라졌고, 꽃잎(petal) 위에 고분자와 GMO 나노입자의 존재를 나타내는 두드러진 개별 지점이 관찰되었다.

[실시예3]

표면적 분석(Surface area analysis)

도 5의 d는 다른 하소 온도에서 BET 표면적과 구멍크기 분포를 보여준다. GMR 화합물의 표면적과 다공성은 질소 가스 흡착-탈착 등온선 측정에 의해 평가받는다. 등온선은 메조포러스의 특징을 규명(establish)하는 이력 곡선(hysteresis loop)인 타입 Ⅳ를 나타내었다(도 5의 d). 여분의 PEG와 물의 제거 때문에 최대 표면적은 샘플이 300℃에서 하소될 때 관찰되었다. 분명히, 도 5의 d로부터, 하소 온도가 300℃ 이상으로 증가되었을 때, 등온선은 높은 상대 압력쪽으로 이동하고, 나노꽃잎(nanopetal)안에 넓은 내부 입자 구멍을 유도한다. 700℃에서 이력곡선(hysteresis loop)의 부재는 입자의 상당히 큰 평균 크기 때문에 고온에서 텍스쳐(texture)의 변화없이 메조다공성을 잃는 것을 의미한다. GMR1, GMR2, GMR3, GMR4에 대한 BET 특정 표면적은 46.4, 21.3, 11.6, 4.2 m²/g으로 각각 결정되었다. 도 5의 d가 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 공극 크기 분포점을 보여준다. 샘플은 분산적인 공극 분포 곡선을 가진다. 작은 공극은 나노입자 사이의 구멍에 상응하고, 중간에서 큰 구멍은 꽃의 나노꽃잎(nanopetal)들 사이의 간극 공간(interstitial space)에서 발견된다. 이것은 다른 형태와 비교했을 때 많은 약을 나르는데 이점이 된다. 샘플 GMR1, GMR2, GMR3, GMR4의 나노꽃잎(nanopetal)에 있는 나노입자 사이의 평균 공극 직경은 각각 14.63, 29, 37.65, 64.53 nm이고, 상응하는 공극의 부피는 각각 0.17, 0.154, 0.109, 0.068 cm³/g이다.

[실시예4]

발광 특성(Luminescent properties)

도 6의 a는 GMR 화합물의 광루미네센스 여기(PLE)와 방출(PL) 스펙트럼을 보여준다. 이것은 향상된 결정성 때문에 증가되는 강도를 제외하고 하소 온도가 증가함에 따라 비슷한 행동을 보여준다. PLE 스펙트럼은 리간드에서 금속으로의 전하이동(ligand to metal charge transfer, LMCT)(O^2-에서 Mo⁶⁺)에 의한 중첩되는 띠(band)와 완전하게 채워진 O^2-의 2p 오비탈로부터 부분적으로 채워진 Eu³⁺ 이온의 f-f 오비탈로의 전하이동띠(charge transfer band, CTB)로 이루어진다. 더욱이, 긴 파장 영역에서, 몇몇의 f-f 전이가 Eu³⁺의 근자외선 및 가시선 여기(excitation) 띠(band)와 함께 관찰되었고, 그 전이는 도 6에 표시하였다. 여기(excitation) 결과는 UV(영역(r)=220-356nm, eodurchleo(bm)=295nm), 보라색(r=391-406nm, bm=395nm), 파란색(r=459-479, bm=467nm), 초록색(r=523-548nm, bm=536nm) 파장이 GMR로부터 고-순도(high-purity) 적색 방출을 얻는데 유효한 펌핑 소스(pumping source)라는 것을 나타낸다. 많은 생물학적 시스템이 자외선에 의해 파괴되기 때문에 가시 자극(visible excitation)은 바이오이미징(bioimaging)에 있어 좋은 이점이다.

GMR(5 mol% Eu³⁺)은 자외선, 보라색, 파란색, 초록색 파장에 의해 들뜸으로써 비슷한 방출 띠를 나타냈다. 그러나, 도 6의 b에서는 초록색 파장에 의해 들뜬 PL 스펙트럼을 나타내었다. 왜냐하면 이것이 바이오이미징(bioimaging)의 보편적인 소스(source)이기 때문이다. PL 스펙트럼은 616nm의 대역최대와 5.22의 반값전폭에서 발생하는 C2/c 공간그룹의 α-GMO 비반전 센터(과민한(hypersensitive))로부터 고강도 적색(⁵D₀ → ⁷F₂) 방출을 드러냈다. 592nm의 중앙에 위치한 약한 방출 띠는 자기 쌍극자 ⁵D₀ → ⁷F₁ 전이와 상응한다. 또한, 2개의 전형적인 약한 방출 띠는 651nm(⁵D₀ → ⁷F₃) 와 702nm(⁵D₀ → ⁷F₄)의 짙은(deeper) 적색 영역에서 관찰되었다. Judd-Ofelt 이론에 의하면, 전기 쌍극자 전이가 주변환경에 민감하다는 것과 자기 쌍극자 전이가 주변환경에 독립적이라는 것은 잘 알려져 있다. 과민한 전이는 자기 쌍극자 전이보다 매우 크다는 것이 명백하고, 이는 Eu³⁺ 이온이 C2/c 대칭 지역에 있음을 나타낸다. 계산된 불균형적 비율(적색(⁵D₀ → ⁷F₂)/오렌지색(⁵D₀ → ⁷F₁))은 13이고, 색도 조정은 0.644, 0.355이다. PL 결과는 이러한 종류의 페길레이션이 그것의 보통 특성의 대부분이 변화없이 효율적인 생체물질로 발달하는 놀라운 기회를 준다는 것을 설명한다. 높은 온도에서 GMR3, GMR4, GMR5와 같은 GMRs 샘플을 하소하는 것은 YAG:Ce³⁺와 혼합했을 때와 파란색 파장에 의해 들뜰 때 자연적인 백색광을 얻는데 유용하다.

[실시예5]

바이오이미징(생체)(Bioimaging(in Vitro))

도 7은 췌장암 세포계 Mia-PaCa-2에 의한 메조포러스 입자의 흡수 공초점 이미지이다. DAPI 핵염료는 파란색에서 관찰된다. GMR1, GMR2 메조포러스 입자의 형광은 적색에서 관찰되고, 이는 세포질과 핵질에 형광입자가 존재한다는 것을 의미한다. 도 8의 a는 다른 GMR 메조포러스 입자들로 처리한 Mia-PaCa-2 세포의 생존을 보여준다. 세포는 36시간 동안 배양되고, GMR1, GMR2, GMR3, GMR4는 10, 20, 50μM 사용되었다. 그래프는 평균 ±SD를 나타낸다. 대조군과 GMR 메조포러스 입자들로 처리된 세포 모두에서 생존에 관해 주요한 차이점은 발견되지 않는다. 도 8의 b는 ⅰ) PBS 용액 없는 GMR1, ⅱ)PBS 용액 없는 GMR1의 가장자리 부분, ⅲ)PBS 용액으로 처리한 후의 각각의 나노꽃잎(nanopetal)을 보여준다. 도 8의 c는 ⅰ) PBS 용액 없는 GMR2, ⅱ)PBS 용액 없는 GMR2의 가장자리 부분, ⅲ)PBS 용액으로 처리한 후의 각각의 나노꽃잎(nanopetal)을 보여준다.

GMR은 세포를 침투하는 능력을 가지고 있고, 핵으로 이동할 수 있다. GMR의 투과성과 자리옮김(translocation)을 확인하기 위해서 생체 형광 현미경 분석을 수행했다. 이 분석은 대조군, GMR3, GMR4와 비교했을 대 GMR1, GMR2만이 Mia-PaCa2의 핵과 세포질 모두에서 적색을 상당히 방출했다는 것을 나타냈다(도 7). GMR1과 GMR2는 작은 구멍과 친수성을 가진 PEG에 의해 안정화되고, 하소 온도와 함께 PEG의 분해가 증가했다. 결과적으로, GMR3과 GMR4는 소수성이 증가했다. 소수성과 자체-응집(self-aggregation) 때문에 GMR3과 GMR4는 우선적으로 세포막 근처에 위치했다. 그러므로 GMR1, GMR2만이 페길레이션에 의한 친수성 때문에 세포질과 핵질에서 형광을 보였고, 메조포러스 텍스쳐(texture)에서 개별적인 나노입자들의 집단적 행동 때문에 투과성을 증진했다. XTT분석은 GMR이 Mia-PaCa2 세포 확산에 영향을 주지 않는다는 것을 확인했다(도 8의 a).

세포핵으로의 GMR 투과성과 자리 옳김(translocation)을 밝히기 위해, GMR을 개별적으로 포스페이트(phosphate) 버퍼 용액(PBS, pH=7.4)에 떨어뜨렸다. 생물학적 환경(biological environment) 조성을 위해 37±0.5℃에서 3 중량%의 소 혈청 알부민을 넣었다. 중간속도로 저었다. 세포 이미지는 처리한지 6시간 후에 관찰하기 때문에 5시간 후에, 용액의 TEM 이미지를 관찰하기 위해 사용되었다; 흥미롭게도, 각각의 꽃잎이 깨어진 형태로 관찰되었다(도 8의 b, c). 그러나 형태의 안정성은 하소 온도의 증가와 함께 증가하였다. 이러한 결과는 GMR1, GMR2와 같이 낮은 온도에서 하소된 페길화된 메조포러스 나노꽃잎(nanopetal)이 핵에 대한 증가된 투과성의 원인이라는 것을 나타낸다. 소수성에 더해서, 깨어지지 않은 형태 또한 감소된 투과성의 원인이다.

S1 : 뉴클리에이션(Nucleation) 단계
S2 : 표면 변형(Surface modification) 및 결정화(Crystallization) 단계
S3 : 자가-조립(Self-assembling) 단계

Claims

(a) 용매열 합성법을 이용하여 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMO) 전구체를 제조하는 단계;
(b) 수열 합성법을 이용하여 상기 GMO 전구체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시켜 페길화된 알파 가돌리늄 몰리브데이트(GMR)을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 GMR을 건조 및 하소하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, GMR 메조포러스 물질 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계는
(b1) 상기 GMO 전구체의 아민 그룹과 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 결합하는 뉴클리에이션(nucleation) 단계;
(b2) 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 결합한 상기 GMO 전구체의 표면에서 변형이 일어나고, 결정이 형성되는 표면 변형(Surface modification) 및 결정화(crystallization) 단계; 및
(b3) 자체부착(oriented attachment)을 통한 자가-조립(Self-assembling) 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, GMR 메조포러스 물질 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 (c) 단계는 300~400℃의 온도에서 하소되는 것을 특징으로 하는, GMR 메조포러스 물질 제조방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된, GMR 메조포러스 물질.
제 4항에 있어서,
상기 GMR 메조포러스 물질은 희토류 원소로 도핑된 것을 특징으로 하는, GMR 메조포러스 물질.