KR20160007176A - 골드 입자로 표면 처리된 임플란트 및 그 제작방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은: 생체 이식용 임플란트 몸체(Implant Body); 그리고 상기 임플란트 몸체의 표면에 화학결합되는 골드 입자들(Gold Particles)을 포함하여 구성되는 임플란트(Implant) 및 그 제작방법을 개시한다. 본 발명에 따르면, 임플란트의 표면에 구비되는 골드 입자가 골 분화를 촉진시키므로 생체 적합성이 향상되고 골 세포의 분화가 촉진될 수 있으며, 무독성이므로 인체 이식에 따른 부작용이 방지될 수 있고, 임플란트의 골유착에 소요되는 기간이 단축될 수 있으므로 임플란트 시술기간이 전체적으로 감소될 수 있다. 그리고, 본 발명에 따르면, 생체 적합성을 갖는 임플란트의 제작 공정이 단순화될 수 있고 골드 입자들이 용이하게 임플란트의 표면에 고정될 수 있으므로, 세포활성 및 골분화능 등의 생체 적합성을 갖는 임플란트의 제작이 용이하고, 제조비용과 제조시간이 절감될 수 있다.

Description

골드 입자로 표면 처리된 임플란트 및 그 제작방법{Implant Surface Treated With Gold Particle And Fabrication Method Thereof}

본 발명은 생체에 이식되는 임플란트 및 그 제작방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 골드 입자 특히 골드 나노입자를 이용하여 표면 개질된 생체적합성 임플란트 및 그 제작방법에 관한 것이다.

일반적으로 임플란트(Implant)는 인공 재료 및/또는 천연 재료로 구성되며, 생체조직의 결손을 보완하기 위해 결손부에 이식되어서 상기 결손부의 형태를 재건하거나 기능을 대행하고, 기타 각종의 치료를 위해 조직을 지지하거나 부착시키는 등의 용도로 사용되는 구조물 또는 이식술을 지칭하며, 대표적인 예로는 인공 치아(Dental Implant)나 인공 관절 등이 있다. 즉 상기 임플란트는 생체 내에 이식되어 소정의 기능을 발휘하는 생체 이식용 의료기구이다.

상기 임플란트는 생체조직에 대하여 안정적인 생체 친화성(생체 적합성)이 요구되므로, 부작용이 없고 화학 및 생화학적 반응을 유발하지 않는 재료로 제작되어야 하고, 생체에 이식된 후에는 골과 임플란트 사이에 골이 채워져서 골융합이 잘 이루어져야 한다. 또한, 상기 임플란트는 반복되는 하중 및 순간적인 충격에도 변형되거나 파괴되지 않아야 하므로 기계적 강도가 매우 높은 소재로 제조되어야 한다.

상기 임플란트에 적절한 소재(재료)로 현재까지 다양한 금속 및 합금이 개발되었으나, 생체재료로서 갖추어야 할 조건인 생체 친화성(Biocompatibility), 화학적 적합성(Chemicalcompatibility), 및 기계적 적합성(Mechanical compatibility)이 제대로 충족되지 못하고 있는 실정이다.

상기 임플란트의 재료 중 가장 많이 사용되고 있는 것은 생체 적합성이 뛰어난 티타늄, 티타늄 합금 등이다. 상기 티타늄은 가공이 용이할 뿐만 아니라, 다른 금속에 비해 상대적으로 가벼우며, 다른 금속과의 합금으로 제조되거나 적절한 처리과정을 거치면 강도가 향상될 수 있고, 큰 부식저항성을 가진다.

그리고, 상기 임플란트는 골내에 이식되었을 때 골유착(osteointegration)이 잘 이루어져야 하는데, 이를 위하여 티타늄이나 티타늄 합금으로 된 임플란트의 표면에 골과의 결합 촉진을 유도하는 여러가지 표면 처리 방법이 도입되고 있으며, 예를 들면, 티타늄, 티타늄 합금 재질의 임플란트 표면을 생체 친화성 인산 칼슘(calcium phosphate)계 세라믹인 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 코팅하여 임플란트의 금속이온 용출을 방지함과 동시에 생체 친화성 및 기계적 강도를 향상시키는 기술과, 금속 임플란트의 표면을 거칠게 기계가공하는 기술(US 5,876,453A)과, 세라믹 입자를 이용하여 블라스팅(blasting)하거나 또는 황산과 염산의 혼합물을 이용하여 표면을 화학적으로 에칭(etching)함으로써 임플란트 표면을 거칠게 하는 기술(US 5,603,338A)이 알려져 있다.

치과용 임플란트 분야에서도 생체활성 물질을 표면에 직접 처리하여 치조골과 치과용 임플란트의 골 융합을 촉진시키는 연구가 진행되고 있다. 그러나 종래의 임플란트 표면처리 기술은 생체 안정성과 골분화능 촉진에 한계가 있고, 복잡한 기계적 및/또는 화학적 처리과정을 거쳐야 하므로 표면처리가 어려우며, 생체 친화성 향상을 위한 표면 처리비용이나 생체활성물질 자체의 비용이 경제적이지 못하고, 제작 공정도 복잡해서 제조에 시간이 많이 소요되는 등의 문제점이 있는데, 본 발명자는 상기 임플란트의 표면을 골드 입자로 처리하여 세포활성 및 골분화능 등 생체 적합성이 크게 향상되며 저비용으로 간단한 공정을 통해 제조가 용이한 임플란트를 개발하게 되었다.

대한민국 공개특허공보 제10-2008-0108687호, 2008년 12월 16일 공개, 서울대학교 산학협력단 대한민국 공개특허공보 제10-2004-0021218호, 2004년 3월 10일, 주식회사 솔고 바이오메디칼

본 발명은 상술한 종래의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 임플란트의 생체 적합성과 골분화능이 향상되도록 골드 입자들 특히 골드 나노입자들이 임플란트의 표면에 결합되어 있는 구조의 임플란트 및 그 제작방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상술한 목적의 해결을 위하여, 본 발명은: 생체 이식용 임플란트 몸체(Implant Body); 그리고 상기 임플란트 몸체의 표면에 화학결합되는 골드 입자들(Gold Particles)을 포함하여 구성되는 임플란트(Implant) 및 그 제조방법을 제공한다.

상기 골드 입자들의 크기는 15㎚~100㎚, 보다 상세하게는 30㎚~50㎚이다.

상기 임플란트 몸체의 표면에는 황(S)을 원소로 포함하는 임플란트 표면층이 구비되며; 상기 골드 입자들은 상기 임플란트 표면층의 황(S)에 화학결합되는 것을 특징으로 한다.

상기 임플란트 표면층은, 상기 임플란트 몸체의 표면 산화막이 알칼리(Alkali)와 실란(Silane)에 의해 순차적으로 개질된 구조를 갖는다.

상기 알칼리는 수산화나트륨(NaOH)이며, 상기 실란은 메르캅토기(SH기; Mercapto group)을 갖는 티올실란(SH-Silane)인 것을 특징으로 한다.

상기 골드 입자들 각각은 두개의 황 원자와 화학결합해서 상기 임플란트 표면층에 구비된다.

다른 일 형태로서 본 발명은: 산화막이 형성된 임플란트의 표면을 개질하여 상기 임플란트의 표면에 수산기(OH기)를 형성하는 (a)단계; 상기 수산기를 갖는 임플란트의 표면을 개질하여 상기 임플란트 표면에 메르캅토기(SH기)을 형성하는 (b)단계; 그리고 상기 메르캅토기를 갖는 임플란트 표면을 골드 입자들과 반응시켜서 상기 임플란트 표면에 상기 골드 입자들을 화학결합시키는 (c)단계를 포함하는 임플란트 제작방법을 제공한다.

상기 (a)단계는, 상기 산화막이 형성된 임플란트의 표면을 알칼리와 반응시켜서 상기 임플란트의 표면에 수산기(OH기)를 형성하는 단계를 포함하고; 상기 (b)단계는, 상기 수산기를 갖는 임플란트의 표면을 메르캅토기(SH기)를 갖는 티올실란(SH-Silane) 또는 MDPA(12-Mercaptododecylphosphonic acid) 등 메르캅토기를 갖는 물질과 반응시켜서 상기 임플란트 표면에 상기 메르캅토기를 형성하는 단계를 포함한다.

상기 티올실란의 예로는 (3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilane이 있으며, 상기 알칼리는 수산화나트륨(NaOH)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시 예에서, 상기 (c)단계는 상기 골드 입자들이 포함된 용액에 상기 임플란트를 침지함으로써 수행된다.

상기 골드 입자들은, 15㎚~100㎚ 보다 바람직하게는 30㎚~50㎚ 크기의 골드 나노입자들인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 임플란트의 표면에 구비되는 골드 입자가 세포내로 이동/함입되어서 골 분화를 촉진시키므로, 임플란트의 생체 적합성이 향상되고 골 세포의 분화가 촉진될 수 있으며, 무독성이므로 인체 이식에 따른 부작용이 방지될 수 있고, 임플란트의 골유착에 소요되는 기간이 단축될 수 있으므로 임플란트 시술기간이 크게 감소될 수 있다.

그리고, 본 발명에 따르면, 생체 적합성을 갖는 임플란트의 제작 공정이 단순화될 수 있고 골드 입자들이 용이하게 임플란트의 표면에 고정될 수 있으므로, 세포활성 및 골분화능 등의 생체 적합성을 갖는 임플란트의 제작이 용이하고, 제조비용과 제조시간이 절감될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 임플란트가 생체에 이식된 상태에서 세포 내의 글루타치온(GSH)이 골드 입자와 황 원자 간의 화학결합을 끊어주므로, 골드 입자가 임플란트 주변의 세포에 용이하게 함입될 수 있고 이로 인해 세포의 분화능이 광범위한 영역에서 진행될 수 있다.

본 발명의 특징 및 장점들은 후술되는 본 발명의 실시 예들에 대한 상세한 설명과 함께 다음에 설명되는 도면들을 참고하여 더 잘 이해될 수 있으며, 상기 도면들 중:
도 1은 본 발명에 따른 임플란트의 일 실시 예가 생체조직이 이식된 상태를 나타낸 도면;
도 2는 본 발명에 따른 임플란트의 일 실시 예를 개략적으로 나타낸 사시도;
도 3은 도 2에 도시된 임플란트의 단면도;
도 4는 초기 이식 상태에서 임플란트의 표면 구조를 확대하여 나타낸 단면도;
도 5는 임플란트 이식 후 골드 입자(G)의 이동을 보여주는 단면도;
도 6은 본 발명에 따른 임플란트 제조방법의 일 실시 예를 개략적으로 나타낸 플로우 챠트;
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 일 실시 예에 따른 임플란트의 제조 과정을 나타낸 도면들;
도 8a는 산화 티타늄 디스크의 표면을 나타낸 주사전자현미경 사진;
도 8b는 수산화 티타늄 디스크의 표면을 나타낸 주사전자현미경 사진;
도 8c는 티올 티타늄 디스크의 표면을 나타낸 주사전자현미경 사진;
도 8d는 GNP 티타늄 디스크의 표면을 나타낸 주사전자현미경 사진;
도 9는 산화 티타늄 디스크와 GNP 티타늄 디스크의 친수성 평가 사진;
도 10은 세포 증식 실험에 의한 독성 평가 사진;
도 11은 세포 증식 정도(세포 생존능)를 나타낸 그래프;
도 12는 골 분화 정도를 ALP 활성도 값으로 나타낸 그래프;
도 13a는 골 분화 평가를 위한 1주차 A-red Staining 사진;
도 13b는 골 분화 평가를 위한 2주차 A-red Staining 사진;
도 13c는 골 분화 평가를 위한 3주차 A-red Staining 사진;
도 14a 내지 도 14d는 RT PCR 실험을 대표적인 분화 마커별로 나타낸 그래프;
도 14e는 골 분화 평가를 위해 세포 실험 그룹별 칼슘 침착(Calcium deposition) 정도를 나타낸 그래프;
도 15는 동물 실험에 의한 조직내 골 부피 백분율(BV/TV, Percent Bone Volume, %)을 나타낸 그래프; 그리고
도 16은 동물 실험에 의한 골 표면 밀도(BS/TV, Bone Surface Density, 1mm)를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시 예들이 첨부도면들을 참조하여 상세히 설명되며, 본 발명의 실시 예들을 설명함에 있어서 동일 구성에 대해서는 동일 도면 부호가 사용된다.

본 명세서에서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소에 "결합된다"거나 또는 "구비된다"는 기재는, 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소에 직접적으로 결합되거나 구비되는 구조와, 다른 별도의 구성 요소를 매개로 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소에 간접적으로 결합되거나 구비되는 구조를 포함하는 개념이다.

본 발명에 따른 임플란트는 생체조직에 이식되어서 조직을 지지하거나 결손부의 기능을 대행하는 의료기구로서, 기본 몸체를 이루는 생체 이식용 임플란트 몸체(Implant Body)와, 골 분화능 향상을 위해 상기 임플란트 몸체의 표면에 화학결합되는 골드 입자들(Gold Particles) 특히 골드 나노입자들(Gold Nanoparticles)을 포함하여 구성된다.

이에 따라, 본 발명의 실시 예에 따른 임플란트는 골유착 성능이 향상되고 우수한 생체 적합성을 갖는다. 다시 말해서, 본 발명의 실시 예에 따른 임플란트는 생체에 대한 부작용을 일으키지 않으며 생체접착과 세포 분화 기타 세포활성을 촉진시킨다.

먼저, 도 1 내지 도 3을 참조하여 본 발명에 따른 임플란트의 구체적인 일 실시 예에 대한 구조가 설명된다. 도 1은 본 발명에 따른 임플란트의 일 실시 예가 생체조직이 이식된 상태를 나타낸 도면이며, 도 2와 도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따른 임플란트, 보다 구체적으로는 덴탈 임플란트(100)를 나타낸 사시도와 단면도이다.

도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시 예에 따른 임플란트(100)는, 생체 이식용 임플란트 몸체(110)의 일 예로서 인공 치근을 이루는 매식체(Fixture, 이하 임플란트 몸체와 동일한 도면 부호를 적용함)와 상기 임플란트 몸체 즉 매식체(110)의 표면에 화학결합되는 골드 입자(G)들을 포함하여 구성된다.

본 실시 예에 있어서, 상기 매식체(100)는 외주면에 치조골(B)과의 기계적 결합을 위한 나사산(수나사)가 형성되고, 내부에는 지대주(Abutment; 10)와의 결합을 위한 지대주 결합홀이 형성된 구조이나 상기 매식체의 구조가 이에 한정되는 것은 아니다. 참고로 인공 치아에서 상기 지대주(10)는 치관(C)에 의해 덮인다.

그리고 상기 매식체(100)는 생체 친화성이 우수한 금속 재질 특히 티타늄 기반의 재질(티타늄이나 티타늄 합금 재질)을 가지며, 상기 매식체 그 자체는 일반적으로 공지된 구성이므로 그에 대한 부가적인 설명은 생략된다. 본 실시 예에서는 상기 임플란트의 예로서 치과용 임플란트가 제시되어 있으나 본 발명이 이에 한정되는 것이 아님은 물론이다.

본 실시 예에서, 상기 골드 입자(G; Gold Particle)들은 나노미터(㎚) 크기의 입자 즉 나노 입자로서 골드 나노입자(Gold Nanoparticle)이 적용되며, 보다 구체적으로 상기 골드 입자(G)들의 크기는 15㎚~100㎚, 보다 상세하게는 30㎚~50㎚로서, 30㎚~50㎚ 크기의 골드 입자가 세포내 침투(함입)에 우수하다.

그리고, 상기 골드 입자(G)들은 임플란트 몸체의 표면층 즉 임플란트 표면층(120)에 화학결합되어서 임플란트 즉 덴탈 임플란트(100)의 생체 적합성을 향상시킨다. 보다 구체적으로 설명하면, 임플란트 이식 후에 상기 골드 입자(G)들은 임플란트 표면에서 분리되어 주변 세포로 이동해서 함입되며, 세포의 분화를 촉진시킨다.

상기 임플란트 표면층(120)은, 상기 임플란트 몸체(110)의 표면에 구비되며, 황(S, Sulfur)을 원소로 포함하는 구조, 즉 황을 원소롤 포함하는 물질로 구성된다. 그리고 상기 골드 입자(G)들은 상기 임플란트 표면층(120)의 황(S)과 화학결합된다. 도 4 및 도 5를 참조하면, 상기 골드 입자(G)는 황(S)과 쉽게 결합되며, 본 실시 예에서 상기 골드 입자(G)에는 두개의 황(S) 원자들이 결합된다. 따라서 골드 입자(G)들과 황(S) 원자들간의 화학결합 비율은 1:2가 된다.

그리고, 상기 임플란트(100)가 생체 조직 예를 들면 치조골에 식립되면, 상기 골드 입자(G)들이 상기 임플란트 표면층(120)에서 분리되어 골 세포(Cell)의 분화를 촉진한다.

보다 구체적으로 설명하면, 상기 골드 입자(G)와 황(S)의 결합은 세포 내의 글루타치온(GSH)에 의해 쉽게 끊어지며, 상기 임플란트 표면층(120)에서 분리된 골드 입자(G)들은 치조골의 골 세포(Cell)에 함입되어 골 분화를 촉진시킨다.

본 실시 예에 따른 임플란트(100)는, 골드 입자(G)들을 금속 재질 보다 구체적으로는 티타늄(Ti) 재질을 갖는 생체 이식용 임플란트 몸체(110) 즉 상기 매식체에 결합시키는 과정을 통해 제조될 수 있으며, 상기 골드 입자(G)들이 황(S)과의 화학결합에 의해 상기 임플란트 몸체의 표면 즉 상기 임플란트 표면층(120)에 고정된다.

이를 위하여, 상기 임플란트(100)의 표면에 메르캅토기(SH기; Mercapto Group)가 형성되도록 상기 임플란트 몸체의 표면이 개질된다. 보다 구체적으로 설명하면, 상기 임플란트의 표면에 수산기(OH기)가 형성되도록 상기 임플란트 몸체의 표면이 1차 개질된 후 상기 임플란트의 표면에 상기 메르팝토기(SH기)가 형성되도록 상기 임플란트 몸체의 표면이 2차 개질된다.

예를 들면, 상기 임플란트 표면층(120)은 상기 임플란트 몸체(110)의 표면 산화막이 알칼리(Alkali)와 실란(Silane)에 의해 순차적으로 개질된 구조를 갖는다. 보다 구체적으로 설명하면, 상기 임플란트 몸체(110)의 표면은 공기 중이나 수중에서 산화되어 산화막을 형성하며, 상기 임플란트 몸체(110)의 표면은 상술한 알칼리 및 실란과 순차적으로 반응해서 상기 골드 입자(G)들이 잘 결합될 수 있는 구조로 개질된다.

즉 상기 임플란트 몸체(110)의 표면이 알칼리와 반응한 후에 다시 실란(Silane)과 반응해서 표면 개질 과정을 거친다. 상기 알칼리는 산화막(O₂)과 반응해서 상기 임플란트 몸체(110)의 표면에 수산기(OH기)를 형성하며, 상기 실란은 수산기와 반응해서 상기 임플란트 몸체(110)의 표면에 메르캅토기(SH기)를 형성한다.

본 실시 예에서는 상기 알칼리로 수산화나트륨(NaOH)이 개시되고, 상기 실란으로는 메르캅토기(SH기)를 갖는 티올실란(Thiol-Silane; SH-Silane)이 개시된다. 그리고 상기 골드 입자(G)는 두개의 황(S) 원자와 화학결합해서 상기 임플란트 몸체(110)의 표면에 고정된다.

상기 임플란트의 표면에 메르캅토기(SH기)를 형성하는 다른 물질의 예로는 12-Mercaptododecylphosphonic acid(MDPA)를 들 수 있다. 즉, 상기 임플란트 몸체의 표면을 알칼리로 1차 개질해서 수산기를 형성한 후, 1차 개질된 표면을 상기 MDPA(#745855, 시그마 알드리치)과 반응시켜서 2차 개질하면 상기 임플란트의 표면에 메르캅토기(SH기)가 형성될 수 있으므로, 상기 임플란트(100)의 표면에 메르캅토기(SH기; Mercapto Group)를 형성하는 물질이 실란 즉 상기 티올실란에 한정되는 것은 아니다.

이하에서는, 본 발명에 따른 임플란트를 제조하는 방법의 구체적인 일 실시 예가 설명된다.

도 6을 참조하면, 상술한 구조 즉 표면에 골드 입자(G)들이 결합되어 있는 구조의 임플란트를 제조하기 위하여, 먼저 표면이 산화된 임플란트(매식체-임플란트 몸체)를 준비하고, 상기 임플란트의 표면을 알칼리 처리해서 상기 임플란트의 표면에 수산기(OH기)를 형성한다.

그리고 상기 임플란트의 표면을 실란 보다 구체적으로는 티올실란으로 개질 처리해서 상기 임플란트의 표면에 메르캅토기(SH기; Mercapto Group)를 형성한 후, 상기 골드 입자(G)들을 상기 임플란트의 표면에 고정(화학결합)시킨다.

상술한 알칼리 처리에 의해 상기 임플란트의 표면에 형성되는 수산기(OH기)는 티올실란 예를 들면 (3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilane과 반응하며, 이에 따라 상기 임플란트의 표면에 골드 입자의 결합을 용이하게 하는 메르캅토기(SH기; Mercapto Group)가 형성될 수 있다.

그리고 상기 골드 입자들이 포함된 용액에 상기 임플란트를 침지함으로써 탈수소 반응을 통해 상기 골드 입자가 상기 임플란트 표면에 화학결합되어서 코팅된다.

도 7a는 상술한 알칼리 처리 과정을 보여주는 도면으로서, 티타늄 임플란트(Ti)의 표면 산화막(O₂)이 수산화나트륨(NaOH)과 반응하여 상기 임플란트가 1차적으로 표면개질됨으로써, 임플란트의 표면에 수산기(OH기)가 형성된다.

다음으로, 도 7b는 알칼리에 의해 1차 개질된 임플란트의 표면dl 다시 실란으로 2차 개질되는 과정을 보여주는 도면으로서, 1차 표면개질에 의해 티타늄 임플란트(Ti)의 표면에 형성되는 수산화나트륨(NaOH)이 티올실란(SH-Silane)이 반응하여 상기 임플란트의 2차 표면개질이 수행됨으로써, 임플란트의 표면에 메르캅토기(SH기; Mercapto Group)가 형성된다.

그리고, 도 7c는 임플란트 표면에 골드 입자(G) 보다 구체적으로는 골드 나노입자(Gold Nanoparticle)를 결합시키는 과정을 보여주는 도면으로서, 2차 표면개질에 의해 티타늄 임플란트(Ti)의 표면에 형성되는 메르캅토기(SH기; Mercapto Group)가 골드 나노입자와 반응하여 골드 나노입자가 두개의 황 원자와 결합된다.

이하에서는 본 발명의 일 실시 예에 따른 임플란트의 구체적 제조과정 및 실험 예가 설명된다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 예시한 것에 불과하며, 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 : 골드 입자가 결합된 티타늄 디스크 시편의 제조

(1) 산화 티타늄 디스크(TiO₂) 준비

티타늄(Titanium; Ti) 원재료(ASTM F67 Grade 4, TNS 코리아, 한국)을 지름 10mm/두께 1mm로 절단 후에 세척해서 표면이 산화된 티타늄 디스크 즉 산화 티타늄 디스크(TiO₂)를 얻는다.

(2) 1차 표면개질 - 수산화 티타늄 디스크(TiOH) 제조 - 도 7a 참조

상기 산화 티타늄 디스크(TiO₂)를 2.5N 농도의 NaOH 수용액과 마그네틱 바(Magnetic Bar)가 들어있는 용기(Two Neck Round Flask)에 담그고, 80℃ 전열기(Hot plate)에서 350~500RPM으로 24시간 동안 반응시켜 1차 표면개질함으로써 표면에 수산기가 형성된 티타늄 디스크(이하 수산화 티타늄 디스크(TiOH)라 칭함)를 얻고, 상기 수산화 티타늄 디스크를 세척/건조한다.

예를 들면, 상기 수산화 티타늄 디스크를 멸륜 증류수(Distilled Water, DW)에 담근 후 초음파를 이용하여 세척하고, 세척이 끝나면 60℃ 오븐(Oven)에서 24시간동안 건조한다. 세척시 10분마다 DW를 갈아서 총 6회 세척한다.

(3) 2차 표면개질 - 티올 티타늄 디스크 제조(TiOH -> TiSH) - 도 7b 참조

호일로 감싼 70mL 바이얼(Bial)에 99.8%의 무수 톨루엔(Anhydrous Toluene, #244511, 시그마 알드리치) 10㎖와 티올실란((3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilane 95%, #175617, 시그마 알드리치)을 200㎕ 넣고 혼합(Vortex)해서 실란-톨루엔 용액을 얻는다.

그리고, 상기 실란-톨루엔 용액이 들어있는 바이얼(Bial)에 1차 표면개질에서 얻어진 수산화 티타늄 디스크(TiOH)를 넣고, 37℃ 인큐베이터(Incubator)에서 100 RPM으로 24시간 동안 반응시켜 2차 표면개질함으로써 표면에 메르캅토기(SH기)가 형성된 티타늄 디스크(이하 티올 티타늄 디스크(TiSH)라 칭함)를 얻은 후, 상기 티올 티타늄 디스크를 세척/건조한다.

예를 들면, 상기 티올 티타늄 디스크를 무수 톨루엔(Anhydrous Toluene)에 넣고 상온에서 10분간 3번 세척한 후, 다시 멸균 증류수에 넣고 상온에서 10분간 3번 세척하고, 세척이 끝나면 60℃ 오븐(Oven)에서 24시간동안 건조한다.

(4) 골드 나노입자(GNP) 준비

15㎚~100㎚의 GNP 특히 구형의(Spherical) GNP를 합성하는 방법은 그 자체는 공지된 것으로서, 기공지된 논문(Gold Nanoparticles Used in Cancer Cell Diagnostics, Selective Photothermal Therapy and Catalysis of NADH Oxidation Reaction, 저자: Huang, Xiaohua, 2006-04-12)에 자세히 게재되어 있다.

본 실험에서 사용한 GNP 크기는 30㎚이며, 30㎚ 크기의 GNP를 제조하는 방법을 개략적으로 설명하면 다음과 같다.

250㎖의 용기(Two Neck Flask - 110℃ Hot Plate위에서 350RPM)에 100㎖의 증류수(DW)와 40㎎의 Gold(Ⅲ) chloride hydrate(HAuCl₄.3H₂O 99.999%, #254169, 시그마 알드리치-Sigma Aldrich)를 넣는다. 1시간 후, 38.8mM 의 시트르산삼나트륨 용액(trisodium citrate solution, #S4641, 시그마 알드리치)을 상기 용기에 600㎕ 넣고, 15분 후 온도를 상온으로 맞추면서 천천히 식혀준다. 상온까지 온도가 떨어진 GNP 용액을 미세 여과기(0.22㎛ Millipore filter)로 여과해서 30㎚ 크기의 GNP를 포함하는 용액(이하 '30㎚ GNP 용액'이라 칭함)을 완성하고 냉장보관한다.

(5) 3차 표면개질 - GNP 티타늄 디스크 제조(TiSH -> TiGNP) - 도 7c 참조

10㎖ 바이얼(Bial)에 상기 티올 티타늄 디스크와 상기 30㎚ GNP 용액(100μM)을 2㎖ 넣고, 37℃ 인큐베이터(Incubator)에서 100 RPM으로 24시간 반응시켜 3차 표면개질함으로써 표면에 골드 입자 특히 골드 나노입자(GNP)들이 결합된 티타늄 디스크(GNP 티타늄 디스크 - TiGNP)를 얻은 후 세척한다. 예를 들면, GNP 티타늄 디스크를 상온에서 셰이커(Shaker)를 이용하여 10분간 3번 세척한다.

본 실시 예에서는 각 단계별로 여러가지 세척 방식이 설명되어 있으나, 각 단계별 티타늄 디스크의 세척 방식이나 조건이 상술한 것이 한정되지 않음은 물론이다.

그리고, 각 단계별 표면처리 과정에서 만들어지는 산화 티타늄 디스크와 수산화 티타늄 디스크와 GNP 티타늄 디스크의 표면을 주사전자현미경(SEM)를 이용하여 확인하였다. 도 8a는 산화 티타늄 디스크의 표면 사진이고, 도 8b는 수산화 티타늄 디스크의 표면 사진이며, 도 8c는 티올 티타늄 디스크의 표면 사진이고, 도 8d는 GNP 티타늄 디스크의 표면이다.

그리고 아래 [표 1]은 XPS(X선 광전자 분광법)으로 분석한 산화 티타늄 디스크의 표면 성분과 GNP 티타늄 디스크의 표면 성분으로서 표면 개질에 따른 성분변화를 알 수 있다.

원 소	TiO2(%)	TiGNP
Ti	16.1	10.7
S	0.8	2.0
O	52.6	41.0
N	1.6	2.9
C	28.9	31.0
Si	-	4.4
Au	-	8.0
Total	100	100

실험예 1: 친수성 평가

생체 재료에서 표면의 젖음성은 세포의 거동에 많은 영향을 준다. 표면의 친수성이 높을수록 재료 표면에서의 세포 거동에 더 좋은 영향을 준다. 본 실험에서 친수성 평가는 물방울과 재료 표면간의 접촉각을 측정하는 방법으로 평가하였다. 물방울과 재료 표면의 접촉각이 작을수록 친수성이 높음을 나타낸다.

도 9의 (a)는 산화 티나늄 디스크의 친수성을 실험한 사진으로서 접촉각이 65.1°±4.2°이고, 도 9의 (b)는 GNP 티나늄 디스크의 친수성을 실험한 사진으로서 접촉각이 54.0°±5.8°로 나타났다. 친수성은 세포의 부착과 관계가 있는 성질로 생체 적합성에 영향을 주는 요인이 된다. 실험 결과에 따르면, GNP 티나늄 디스크가 산화 티나늄 디스크보다 친수성이 향상되었음을 알 수 있다.

실험예 2 : 세포 실험(In Vitro)

후술되는 증식 실험과 골분화 실험에서는 골분화 세포로의 분화가 용이한 지방유래 줄기세포(Human Adipose Derived Stem Cell, ADSC)를 Invitrogen에서 구입하여 계대배양한 세포(#3)가 시료 세포로 사용되었다.

(1) 증식 실험

골드 입자 즉 골드 나노입자(GNP)를 이용하여 표면처리된 티타늄 표면에 독성이 있는지 확인하기 위해 아래 3가지 그룹에 대하여 실험을 진행하였다.

그룹 1-1: Falcon사(社)의 전용 배양 플레이트인 TCP(Tissue Culture Plate, Nunc)에서 증식 미디어만을 사용하여 시료 세포를 증식함. 그룹 1-1의 배양 환경을 비교예 1-1이라 하고 'TCP'라고 표기함.

그룹 1-2: TCP에 TiO₂(산화 티타늄 디스크 - ASTM F67 Grade 4(TNS 코리아) 티타늄 원재료를 지름 10mm/두께 1mm로 절단 후에 세척/건조한 것)를 넣고, 증식 미디어를 사용하여 시료 세포를 증식함. 그룹 1-2의 배양 환경을 비교예 1-2라 하고 'Ti'라고 표기함.

그룹 1-3: TCP에 상술한 실시예에 의해 제조된 TiGNP(GNP 티타늄 디스크)를 넣고 증식 미디어를 사용하여 시료 세포를 증식함. 그룹 1-3의 배양 환경을 실시예 1-1이라 하고 'GNP'라고 표기함.

그룹 1-1 내지 그룹 1-3에 의한 증식 실험은 각 그룹당 3N개(N은 자연수) 예를 들면 3개의 웰(Well)에서 진행되었고, 비교예 1-1(TCP)과 비교예 1-2(Ti) 및 실시예 1-1(GNP)에서 각각 세포를 증식시킨 후 Live and dead kit(Invitrogen)를 이용하여 Live cell(Green으로 염색)과 Dead cell(Red로 염색)을 구별하였으며, 형광 현미경(X40, X100)으로 관찰한 결과 도 10에서 보여지는 바와 같이 독성이 없음을 확인하였다.

그리고, CCK KIT-8(Cell counting kit-8, Dojindo)을 사용한 정량적 분석에서도 도 11의 세포 생존능(Cell Viability)에서 나타난 바와 같이 독성이 없었음을 확인하였다. 도 11의 세포 생존능 그래프는 1일(Day)차에서 비교예 1-1(TCP)의 세포 생존능을 기준으로 다른 그룹들을 비교하여 비율적으로 나타낸 것이다. 실험 결과에 따르면 도 11에 나타난 바와 같이 Ti(그룹 1-2)와 GNP(그룹 1-3) 모두 독성이 없는 것으로 확인되었으며, 그룹 1-3(실시예 1-1)의 증식률이 그룹 1-2(비교예 1-2)보다 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

증식 실험은 48 well TCP(Nunc)에 well당 세포를 2 x 10⁴ 씩 Seeding 후 시간별/그룹별로 분석하였고, Invitrogen에서 구입한 증식 전용 미디어인 MesenPRO RS™ Medium Kit(M, 증식 미디어)을 사용하였다. 실시예 1-1(GNP)과 비교예 1-2(Ti)는 실험에 사용되는 웰(well)마다 한 개씩의 GNP 티타늄 디스크와 산화 티타늄 디스크가 투입되었다.

(2) 골분화 실험

골드 입자 즉 골드 나노입자(GNP)를 이용하여 표면처리된 티타늄 표면의 골 분화능을 확인하기 위해 아래 6가지 그룹에 대하여 실험을 진행하며, 골분화 실험용 세포는 증식 실험에 사용된 세포와 동일한 것이 사용되었다.

그룹 2-1: Falcon사(社)의 전용 배양 플레이트인 TCP(Tissue Culture Plate, Nunc)에서 증식 미디어를 사용하여 시료 세포를 배양함. 그룹 2-1의 배양 환경을 비교예 2-1이라 하고 'TCP(M)'으로 표기함.

그룹 2-2: 그룹 2-1과 동종의 TCP에 TiO₂(산화 티타늄 디스크 - 증식 실험에서와 같음)를 넣고, 증식 미디어를 사용하여 시료 세포를 배양함. 그룹 2-2의 배양 환경을 비교예 2-2라 하고 'Ti(M)'으로 표기함.

그룹 2-3: TCP에 TiGNP(GNP 티타늄 디스크 - 증식 실험에서와 같음)를 넣고 증식 미디어를 사용하여 시료 세포를 배양함. 그룹 2-3의 배양 환경을 실시예 2-1이라 하고 'GNP(M)'으로 표기함.

그룹 2-4: TCP에서 골분화 유도 미디어를 사용하여 시료 세포를 배양함. 그룹 2-3의 배양 환경을 비교예 2-3이라 하고 'TCP(OM)'으로 표기함.

그룹 2-5: TCP에 TiO₂(산화 티타늄 디스크 - 증식 실험에서와 같음)를 넣고, 골분화 유도 미디어를 사용하여 시료 세포를 배양함. 그룹 2-5의 배양 환경을 비교예 2-4라 하고 'Ti(OM)'으로 표기함.

그룹 2-6: TCP에 TiGNP(GNP 티타늄 디스크 - 증식 실험에서와 같음)를 넣고 골분화 유도 미디어를 사용하여 시료 세포를 배양함. 그룹 2-6의 배양 환경을 실시예 2-2이라 하고 'GNP(OM)'으로 표기함.

골분화 실험은 상술한 6가지 그룹(Group)을 대상으로 진행되었으며, 48 well TCP(Nunc)에 웰(Well)당 2 x 10⁴ 씩 seeding 후 시간별(1주, 2주, 3주) 및 그룹별(2-1 ~ 2-6)로 분석하였고, 골분화 유도 미디어(OM)는 Dulbecco's Modified eagle Medium(DMEM, GIBCO)에 Fetal Bovine Serum(FBS, GIBCO), Penicillin(GIBCO), Streptomycin (GIBCO), β-glycerol phosphate disodium salt hydrate(시그마 알드리치), Ascorbic acid (시그마 알드리치), 및 Dexamethasone(시그마 알드리치)를 더한 것이다.

상기 골분화 미디어의 성분 혼합 자체에 대해서는 아래 논문1과 논문2 등에 개시되어 있으므로, 혼합 비율 등에 대한 부가적인 설명은 생략된다.

논문1: Electrospun fibers immobilized with bone forming peptide-1 derived from BMP7 for guided bone regeneration. Biomaterials. 2013 Jul;34(21):5059-69. doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.03.051. Epub 2013 Apr 8. Lee YJ1, Lee JH, Cho HJ, Kim HK, Yoon TR, Shin H.

논문2: The osteogenic differentiation improvement of human mesenchymal stem cells on titanium grafted with polyNaSS bioactive polymer. J Biomed Mater Res A. 2013 Feb;101(2):582-9. doi: 10.1002/jbm.a.34336. Epub 2012 Sep 8. Oughlis S1, Lessim S, Changotade S, Poirier F, Bollotte F, Peltzer J, Felgueiras H, Migonney V, Lataillade JJ, Lutomski D.

골분화 실험은 (ALP) activity(Alkaline phosphatase activity)와 A-red staining(Alizarin-red staining)과 RT PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)과 Calcium deposition Assay 실험으로 그룹간의 골 분화 차이를 비교/분석하였다.

모든 골분화 실험에서 알 수 있듯이, GNP가 흡착된 티타늄에서 최대의 골 분화 효율을 확인할 수 있었다. 그리고 증식 미디어(M)를 이용한 그룹(2-1 내지 2-3)보다는 골 분화 미디어(OM)을 이용한 그룹(2-4 내지 2-6)에서 골분화 효율이 더 높음을 확인하였다. 골분화 실험은 각각 1, 2, 3주가 되는 시점에 골 분화율을 그룹별로 비교한 것이다.

그리고, RT PCR은 여러 가지 골 분화 마커(Marker) 중에서 대표적인 분화 마커인 Runx2(Runt-related Transcription Factor 2), COL 1(Collagen Type 1), BSP(Bone Sialoprotein), 그리고 OCN(Osteocalcin)으로 정하였다. 골분화 실험에 따른 그래프는 기준을 1주차의 TCP(M)으로 정하였고, 기준값을 100 또는 1로 하고 다른 그룹들의 비율을 계산하여 그래프로 나타내었다.

참고로, ALP는 골분화 세포에서 발현되는 효소로서 대표적인 초기 인자이고, A-red staining은 침착된 칼슘(Calcium)을 붉은색으로 염색시켜서 관찰하는 것이며, Runx2는 골분화 세포의 분화시 대표적인 키(Key) 전사 인자이고, BSP와 OCN은후기 골분화 마커이다.

도 12를 참조하면, 3주간의 실험 결과 증식 미디어를 이용한 그룹(2-1 ~ 2-3) 중에서 그룹 2-3(GNP(M), 실시예 2-1)의 골 분화율이 가장 높고, 골분화 유도 미디어(OM)를 이용한 그룹(2-4 ~ 2-6) 중에서는 그룹 2-6(GNP(OM), 실시예 2-2)의 골 분화율이 가장 높음을 ALP 활성 그래프를 통해 알 수 있다.

도 13에서 보이는 바와 같이, A-red staining 실험(침착된 칼슘을 붉은색으로 염색)에서도 증식 미디어를 이용한 그룹(2-1 ~ 2-3) 중에서 그룹 2-3(GNP(M), 실시예 2-1)의 칼슘 침착이 가장 많고, 골분화 유도 미디어(OM)를 이용한 그룹(2-4 ~ 2-6) 중에서는 그룹 2-6(GNP(OM), 실시예 2-2)의 칼슘 침착이 가장 많아서 골 분화율이 높음을 확인할 수 있다.

또한, 도 14a 내지 도 14e에 도시된 바와 같이 RT-PCR 및 칼슘 침착 실험을 통해 도출된 그래프에서도, 그룹 2-1 내지 2-3 중에서 그룹 2-3의 골 분화율이 가장 높고, 그룹 2-4 내지 2-6 중에서는 그룹 2-6의 골 분화율이 가장 높음을 알 수 있다.

실험예 3: 토끼를 이용한 동물실험( In Vivo )

토끼를 이용한 동물실험을 위해, 대조군으로는 (주)바이오템의 BR System 제품(나사 타입 임플란트, 직경 3.5mm/길이 7.5mm)이 사용되었고, 실험군으로는 대조군과 동일한 제품에 골드 나노파티클이 코팅(상술한 실시예에서 설명된 방법으로 표면처리)된 제품이 사용되었다.

그리고 동물 실험에는 체중이 2 ~ 2.5kg이면서 11주 내지 14주 된 토끼(New Zealand White Rabbit)가 3마리 사용되었으며, 실험기간 동안 실험부위의 감염, 혈종, 염증 소견 등을 주기적으로 관찰하였다.

(1) 실험 방법

실험에 사용된 3마리의 토끼에 자일라진 하이드로클로라이드(Xylazine hydrochloride, Rompun 2mg/kg, Bayer, 독일)와 Tiletamine/Zolazepam(Zoletil 1.5mg/kg, Virbac, 프랑스)를 근육 주사하여 마취시키고, 마취후 토끼의 대퇴부 털을 제거하고 포비돈(Povidone, Huons, 한국) 용액으로 소독하였다.

그리고 1:100,000 에피네프린(Epinephrine)이 포함된 2% 리도카인(Lidocaine, Huons, 한국)을 이용하여 국소 침윤마취를 시행하였고, 왼쪽 대퇴부를 3cm 절개한 후 골막을 박리하여 넙다리뼈(대퇴골, Femur)을 노출시킨 후, 토끼 한마리당 왼쪽 넙다리뼈에만 대조군 1개와 실험군 1개를 1cm 간격으로 식립하고 층별 봉합하였으며, 3주 후 적출하여 단면 생성 및 골 형성을 평가/분석하였다.

따라서 대조군 3개와 실험군 3개를 대상으로 평가/분석이 수행되었으며, 상술한 마취과정은 동물실험에서 일반적으로 잘 알려진 것으로 실험 조건에 따라 변경될 수 있다.

동물 실험 분석은, 토끼의 넙다리뼈(Femur)에 식립된 임플란트(실험군과 대조군)의 표면에서 250㎛ 떨어진 편측 영역까지 설정하여 수행하였으며, 측정에 사용된 장비는 Micro-CT(Skyscan1173, Bruker, 벨기에, Resolution: 6.04㎛)로서 2240 X 2240 Pixels로 이미지를 얻은 후 단면 생성 및 골 형성을 평가하였다. 보다 구체적으로 설명하면, 실험군과 대조군 적출 후 조직내 골 부피 백분율(BV/TV, Percent Bone Volume, %)과 골 표면 밀도(BS/TV, Bone Surface Density, 1mm)를 측정하였으며, 대조군을 100%로 환산하고 실험군은 대조군을 기준으로 대조군에 비하여 얼마나 증가하였는가를 퍼센트(%)로 비교한 후, 평균과 표준편차와 함께 시그마 플랏(Sigma Plot) 프로그램을 이용하여 그래프로 나타내었다.

(2) 조직내 골 부피 백분율(BV/TV, Percent Bone Volume, %)

실험군과 대조군 적출 후 조직내 골 부피 백분율(Percent Bone Volume)은 아래 [표 2]와 같이 나타났으며, 도 15에 도시된 바와 같이 대조군보다 실험군에서 골의 생성이 더욱 촉진되었음을 확인할 수 있었다.

구 분	대조군 1	대조군 2	대조군 3	실험군 1	실험군 2	실험군 3
BV/TV	11.0643	7.4497	6.82172	44.10947	27.46058	21.12035

BV = Bone Volume 이고, TV = Tissue Volume 이다.

(3) 골 표면 밀도(BS/TV, Bone Surface Density, 1mm)

실험군과 대조군 적출 후 조직내 골 표면 밀도(Bone Surface Density)는 아래 [표 3]와 같이 나타났으며, 도 16에 도시된 바와 같이 골 표면 밀도 분석을 통해서도 대조군보다 실험군에서 골의 생성이 더욱 촉진되었음을 확인할 수 있었다.

구 분	대조군 1	대조군 2	대조군 3	실험군 1	실험군 2	실험군 3
BS/TV	10.54721	7.74718	7.68284	26.97915	23.29196	14.41224

BS = Bone Surface 이고, TV = Tissue Volume 이다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따르면 골 세포의 분화능이 크게 향상되어 생체 적합성이 우수한 임플란트를 얻을 수 있으며, 제조 역시 간단한 공정을 통해 가능하므로 제조 비용이 절감될 수 있다.

이상과 같이 본 발명에 따른 실시 예들을 살펴보았으며, 앞서 설명된 실시 예들 이외에도 본 발명이 그 취지나 범주에서 벗어남이 없이 다른 특정 형태로 구체화 될 수 있다는 사실은 해당 기술에 통상의 지식을 가진 이들에게는 자명한 것이다.

그러므로, 상술한 실시 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 여겨져야 하고, 이에 따라 본 발명은 상술한 설명에 한정되지 않고 첨부된 청구항의 범주 및 그 동등 범위 내에서 변경될 수도 있다.

100: 임플란트(매식체) 110: 임플란트 몸체
120: 임플란트 표면층 G: 골드 입자
S: 황 Si: 규소
OH: 수산기 SH: 메르캅토기

Claims (14)

1. 생체 이식용 임플란트 몸체(Implant Body); 그리고
   상기 임플란트 몸체의 표면에 화학결합되는 골드 입자들(Gold Particles)을 포함하여 구성되는 임플란트(Implant).
2. 제1항에 있어서,
   상기 골드 입자들의 크기는 15㎚~100㎚인 것을 특징으로 하는 임플란트.
3. 제2항에 있어서,
   상기 골드 입자들의 크기는 30㎚~50㎚인 것을 특징으로 하는 임플란트.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 임플란트 몸체의 표면에는 황(S)을 원소로 포함하는 임플란트 표면층이 구비되며; 상기 골드 입자들은 상기 임플란트 표면층의 황(S)에 화학결합되는 것을 특징으로 하는 임플란트.
5. 제4항에 있어서,
   상기 임플란트 표면층은, 상기 임플란트 몸체의 표면 산화막이 알칼리(Alkali)와 실란(Silane)에 의해 순차적으로 개질된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 임플란트.
6. 제5항에 있어서,
   상기 알칼리는 수산화나트륨(NaOH)이며, 상기 실란은 메르캅토기(SH기; Mercapto group)을 갖는 티올실란(SH-Silane)인 것을 특징으로 하는 임플란트.
7. 제4항에 있어서,
   상기 골드 입자들 각각은 두개의 황 원자와 화학결합해서 상기 임플란트 표면층에 구비되는 것을 특징으로 하는 임플란트.
8. 산화막이 형성된 임플란트의 표면을 개질하여 상기 임플란트의 표면에 수산기(OH기)를 형성하는 (a)단계;
   상기 수산기를 갖는 임플란트의 표면을 개질하여 상기 임플란트 표면에 메르캅토기(SH기)을 형성하는 (b)단계; 그리고
   상기 메르캅토기를 갖는 임플란트 표면을 골드 입자들과 반응시켜서 상기 임플란트 표면에 상기 골드 입자들을 화학결합시키는 (c)단계를 포함하는 임플란트 제작방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 (a)단계는, 상기 산화막이 형성된 임플란트의 표면을 알칼리와 반응시켜서 상기 임플란트의 표면에 수산기(OH기)를 형성하는 단계를 포함하고;
   상기 (b)단계는, 상기 수산기를 갖는 임플란트의 표면을 메르캅토기(SH기)를 갖는 티올실란(SH-Silane)과 반응시켜서 상기 임플란트 표면에 상기 메르캅토기를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임플란트 제작방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 티올실란은, (3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilane인 것을 특징으로 하는 임플란트 제작방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 알칼리는, 수산화나트륨(NaOH)인 것을 특징으로 하는 임플란트 제작방법.
12. 제8항에 있어서,
    상기 (c)단계는 상기 골드 입자들이 포함된 용액에 상기 임플란트를 침지함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 임플란트 제작방법.
13. 제8항에 있어서,
    상기 골드 입자들은, 15㎚~100㎚ 크기의 골드 나노입자들인 것을 특징으로 하는 임플란트 제작방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 골드 입자들은, 30㎚~50㎚ 크기의 골드 나노입자들인 것을 특징으로 하는 임플란트 제작방법.

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