KR20160005407A - 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant from Haemophilus influenzae Rd KW20 - Google Patents

2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant from Haemophilus influenzae Rd KW20 Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a mutant of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase and, more specifically, to a mutant of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase derived from a Haemophilus influenza Rd KW20 strain, to a gene for coding the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant, or to a recombinant microorganism induced with the gene and a manufacturing method of a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant for culturing the recombinant microorganism. According to the present invention, the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant is useful for the manufacture of lactol or the like, comprising antiviral nucleoside, an anticancer drug, and a statin-based anti-hyperlipidemic drug, with excellent activation and low substrate inhibition with respect to acetaldehyde.

Description

헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체{2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant from Haemophilus influenzae Rd KW20}2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain derived from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체와 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 코딩하는 유전자, 또는 상기 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
More particularly, the present invention relates to a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant derived from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain and a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant derived from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain. Or a recombinant microorganism into which the gene is introduced and a recombinant microorganism are cultured in a culture medium containing the same, or a method for producing the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant.

알돌라아제는 알돌축합 반응에 의해 탄소-탄소 결합을 촉매하는 효소로 알려져 있으며 생리활성을 가진 다양한 화합물을 합성하는 과정에 이용될 수 있다. 알돌라아제 중에서 특히, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(2-deoxyribose 5-phosphate aldolase, DERA)는 다양한 알돌라아제 중의 하나로써 아세트알데히드 의존적인 알돌라아제이며 탄소-탄소 결합에 있어 가장 유용한 효소로 알려져 있다 (Jennewein et al., Biotechnol. J., 1:537-548, 2006). 일반적으로 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 아세트알데히드와 D-글리세르알데히드-3-포스페이트의 알돌반응을 촉매하여 가역적으로 디옥시리보오스 5-포스페이트를 합성하는 과정에 관여한다. Aldolase is known as an enzyme which catalyzes carbon-carbon bond by aldol condensation reaction and can be used in the synthesis of various compounds having physiological activity. Among the aldolases, 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (DERA) is one of the various aldolases and is an acetaldehyde-dependent aldolase and the most abundant in carbon-carbon bonds Are known to be useful enzymes (Jennewein et al ., Biotechnol. J. , 1: 537-548, 2006). In general, 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase catalyzes the aldol reaction of acetaldehyde and D-glyceraldehyde-3-phosphate to react reversibly in the process of synthesizing deoxyribose 5-phosphate.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 다양한 억셉터(acceptor)기질 특히, 프로파날(propanal), 아세톤(acetone), 플루오르아세톤(fluoroacetone) 등을 다양하게 이용할 수 있어 생리활성을 가진 다양한 슈가(sugar)를 합성할 수 있다(Jennewein et al., Biotechnol. J., 1:537-548, 2006)는 장점이 있는 반면, 300 mM 농도 이상의 아세트알데하이드(acetaldehyde)에 대한 기질저해를 받기 때문에 높은 농도의 아세트알데하이드에서 사용할 수 없다는 단점이 있다.The 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase can be used in various acceptor substrates, in particular, propanal, acetone, fluoroacetone, and the like, (Jennewein et al., Biotechnol. J., 1: 537-548, 2006) . However, since the substrate is inhibited by acetaldehyde over a concentration of 300 mM, Acetaldehyde can not be used.

이전 발명에서 본 발명자들은 헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체가 기존의 효소에 비해 아세트알데하이드(acetaldehyde)에 대한 기질저해가 낮고, 활성이 뛰어난 것을 확인하였다.In the previous invention, the present inventors confirmed that the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant derived from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain had lower substrate inhibition against acetaldehyde and superior activity than the existing enzyme.

지난 수 년 동안 산업용 효소의 상업적 연구가 증가함에 따라 각 분야에 필요한 고활성 효소를 고생산하는 연구가 필수적으로 대두되었다. 분자진화법은 다수의 유전자원으로부터 원하는 특성만을 조합하여 combinatorial chimera를 제조할 수 있는 기술로써 단백질의 개량, 산업용효소의 개량 및 역가 향상 등에 광범위하게 사용된다(Stemmer, W.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751, 1994).Over the past several years, as industrial commercial enzymes have been increasingly studied, researches on high production of high activity enzymes in various fields have become essential. Molecular evolution is a technique that can produce combinatorial chimera by combining only desired characteristics from a large number of genetic resources, and is widely used for protein modification, industrial enzyme modification and potency enhancement (Stemmer, WP Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 10747-10751, 1994).

이에 본 발명자들은 분자진화방법에 의해 활성이 증가된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 헤모필루스 인플루엔자 Rd KW균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 random mutation을 가하여 변이체 라이브러리를 구축하고, 이중에서 아세트알데하이드에 대한 기질저해가 낮고 활성이 우수한 변이체를 선별하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Therefore, the present inventors have made intensive efforts to develop a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant whose activity has been increased by the molecular evolution method. As a result, the inventors have found that the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase derived from Haemophilus influenzae Rd KW strain mutants were added to construct a mutant library, and mutants with low substrate inhibition and excellent activity against acetaldehyde were selected to complete the present invention.

본 발명의 목적은 기질저해가 낮고, 활성이 우수한 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant having low substrate inhibition and excellent activity.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이효소를 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주미생물에 도입되어 있는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a gene encoding said mutant enzyme; A recombinant vector comprising the gene, and a recombinant microorganism having the ability to produce 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase in which the gene or the recombinant vector is introduced into the host microorganism.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 이용한 락톨의 제조방법을 제공하는데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing lactol using the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 113번째 글루타민이 알기닌으로 치환된 Q113R 변이를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant comprising the Q113R mutation in which the 113th glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an alkyne.

본 발명은 또한, 상기 변이체를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the mutant and a recombinant vector comprising the gene.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주미생물에 도입되어 있는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.The present invention also provides a recombinant microorganism having the ability to produce the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant in which the gene or the recombinant vector is introduced into the host microorganism.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant comprising: (a) culturing the recombinant microorganism to produce a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant; And (b) recovering the resulting 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant. The present invention also provides a method for producing a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant.

본 발명은 또한, (a) 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체 또는 상기 변이체가 발현되어 있는 미생물을 이용하여 아세트알데하이드 유도체를 축합시켜 락톨을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 락톨을 회수하는 단계를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 이용한 락톨의 제조방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for producing lactol, comprising: (a) condensing an acetaldehyde derivative using the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant or a microorganism expressing the mutant to produce lactol; And (b) recovering the produced lactol. The present invention also provides a method for producing lactol using the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant.

본 발명에 따른 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체는 아세트알데하이드에 대한 기질저해가 낮고, 활성이 뛰어나므로 항바이러스성 뉴클레오사이드, 항암제 및 스타틴계 고지혈증 치료제를 포함하는 락톨의 제조 등에 유용하다.
The 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant according to the present invention is low in substrate inhibition against acetaldehyde and excellent in activity, so it is useful for the production of lactol including an antiviral nucleoside, an anticancer agent and a statin-based hyperlipemia therapeutic agent Do.

도 1은 본 발명에 따른 pHSG298/HINdeoC 재조합 플라스미드를 대장균(E. coli) XL1-Blue에 도입하여 배양한 후 배양액의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(DERA) 발현을 SDS-PAGE상에서 확인한 것이다.
도 2는 변이효소 탐색을 위한 형광기질인 4-muthylumbelliferyl deoxyribose(MUDR)의 반응 스텝에 따른 TLC 분석을 나타낸 것이다. TLC plate는 TLC Silica gel 60 F254 을 사용했으며 "S"는 반응 전 "P"는 반응 후를 나타낸 것이다.
도 3은 합성한 4-methylumbelliferyl deoxyribose(MUDR)의 NMR 분석을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 pHSG298/HINdeoC가 삽입된 대장균의 배양배지와 반응시간에 따른 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(DERA) 효소의 활성을 나타낸 데이타이다.
도 5는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type과 본 발명에 따른 변이체들의 아미노산 alignment를 나타낸 것이다.
도 6은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type과 본 발명에 따른 변이체들의 DERA 효소활성을 나타낸 것이다.
도 7은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type과 본 발명에 따른 변이체들의 아세트알데하이드(acetaldehyde)에 의한 DERA 효소활성저해를 나타낸 것이다.
도 8은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type과 site directed mutants의 아미노산 alignment를 나타낸 것이다.
도 9는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type, 본 발명에 따른 변이체 및 site directed mutants의 단백질 발현을 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 10은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type, 본 발명에 따른 변이체 및 site directed mutants의 DERA 효소활성을 비교한 데이타이다.
도 11은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type, 본 발명에 따른 변이체 및 site directed mutants의 DERA 효소활성저해를 비교한 데이타이다.
도 12는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type 또는 본 발명에 따른 변이체들이 제조한 락톨의 생산량을 나타낸 것이다.
도 13은 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(HINdeoC)의 wild type 또는 본 발명에 따른 변이체들이 생산한 락톨 추출물을 TLC로 확인한 것이다.1 shows the results of SDS-PAGE analysis of the expression of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (DERA) in the culture after the pHSG298 / HIN deoC recombinant plasmid according to the present invention was introduced into E. coli XL1- It is confirmed.
FIG. 2 shows a TLC analysis of 4-muthylumbelliferyl deoxyribose (MUDR) as a fluorescent substrate for the detection of mutant enzymes according to reaction steps. The TLC plate used TLC Silica gel 60 F254, "S" indicating the reaction "P" after the reaction.
3 is a graph showing NMR analysis of synthesized 4-methylumbelliferyl deoxyribose (MUDR).
FIG. 4 shows the activity of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (DERA) according to the culture medium and Escherichia coli incubated with pHSG298 / HINdeoC according to the present invention.
FIG. 5 shows wild type of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC) and amino acid alignment of mutants according to the present invention.
6 shows the wild type of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC) and the DERA enzyme activity of the mutants according to the present invention.
FIG. 7 shows the wild type of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC) and the inhibition of DERA enzyme activity by acetaldehyde of the mutants according to the present invention.
Figure 8 shows the amino acid alignment of wild type and site directed mutants of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC).
Figure 9 shows SDS-PAGE of wild-type, mutant and site directed mutants of the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC) protein expression.
FIG. 10 is a data comparing the wild-type, 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC) mutant according to the present invention and DERA enzyme activity of site directed mutants.
FIG. 11 is a data comparing the inhibition of DERA enzyme activity of wild-type, mutant and site directed mutants according to the present invention of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC).
FIG. 12 shows the amount of lactol produced by wild-type or mutants according to the present invention of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC).
FIG. 13 shows TLC analysis of the wild type of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (HINdeoC) or the lactol extract produced by the mutants according to the present invention.

본 발명에서는 이전 발명에서 개발된 아세트알데하이드에 대한 기질저해가 낮고 활성이 뛰어난 헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(서열번호 1)를 기반으로 random mutation을 가하여 mutant library를 확보하고, 효소활성측정을 통해 효소적 특성이 개선된 변이체를 선별하였다.In the present invention, a random mutation is applied based on the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase (SEQ ID NO: 1) derived from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain having low substrate inhibition against acetaldehyde developed in the previous invention, And enzyme variants with improved enzymatic properties were selected by enzyme activity assay.

본 발명에 있어서, mutant library는 DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech)를 이용하여 구축하였다. pHSG298/HINdeoC를 template로 하고 M13F와 M13R universal primer를 사용하여 Error-prone PCR을 수행하였다. In the present invention, the mutant library was constructed using the Diversify ™ PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech). Error-prone PCR was performed using pHSG298 / HINdeoC as a template and M13F and M13R universal primers.

Error-prone PCR은 특정 유전자의 염기서열을 PCR로 증폭시킬 때 생길 수 있는 점돌연변이를 인위적으로 많이 일으킴으로써, 특정 단백질의 아미노산 서열을 무작위로 변경시키는 돌연변이 기법이다. PCR 과정에서 유발되는 돌연변이의 빈도는 첨가해주는 염의 농도를 변화시켜 조절 가능하다. 반응 혼합액에 망간의 농도를 조절함으로써 0.11~0.49%까지 돌연변이 빈도를 조절할 수 있다.Error-prone PCR is a mutation technique that randomly changes the amino acid sequence of a specific protein by artificially inducing a point mutation that can occur when amplifying the base sequence of a specific gene by PCR. The frequency of mutations induced in the PCR process can be controlled by varying the concentration of the added salt. By controlling the concentration of manganese in the reaction mixture, the mutation frequency can be adjusted from 0.11 to 0.49%.

본 발명에서는 상기 mutant library를 함유하는 재조합 pHSG298/HINdeoC 벡터를 대장균(E. coli) XL1-Blue에 도입하여 재조합 대장균 라이브러리를 구축한 다음, 이들을 각각 배양하고, 4-methylumbelliferyl deoxyribose(MUDR)을 이용하여 변이효소 탐색한 결과, 첫 번째 변이에서 wild type보다 형광 값이 높은 7개의 변이체를 선별하였고, 그 중에서 가장 활성이 높은 변이체를 수득하였다.In the present invention, the recombinant pHSG298 / HINdeoC vector containing the above mutant library was introduced into E. coli XL1-Blue to construct a recombinant E. coli library. Then, the mutant library was cultured, and 4-methylumbelliferyl deoxyribose (MUDR) As a result of mutagenesis, seven mutants with higher fluorescence values than the wild type were selected in the first mutation, and the mutant having the highest activity among them was obtained.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 113번째 글루타민이 알기닌으로 치환된 Q113R 변이를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체에 관한 것이다.Thus, in one aspect, the present invention relates to a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant comprising the Q113R mutant in which the 113th glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an arginine.

본 발명의 일 양태에서는, 헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제로부터 분자진화법을 이용하여 첫 번째 변이에서 2000개의 변이체 라이브러리를 얻었으며, 이 중 형광 값이 높은 7개의 변이체를 선별하였다. 이들의 활성을 측정한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 113번째 글루타민이 알기닌으로 치환된 Q113R 변이체가 가장 활성이 높다는 것을 확인하였고, 이를 이용하여 두 번째 변이를 진행하였다. 그 결과, 1000개의 변이체 중 Q113R보다 형광 값이 높은 6개의 변이체를 선별하였고, 이들의 sequence를 확인한 결과, Q113R에서 추가 변형된 변이체임을 확인하였다(D136Y, L48Q, I112F 및 I179T). In one embodiment of the present invention, 2,000 deoxyribose 5-phosphate aldolases derived from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain were used to obtain 2000 mutant libraries in the first mutation using molecular evolution, and among them, 7 Were selected. As a result of measuring their activities, it was confirmed that the Q113R mutant in which the 113th glutamine was substituted with arginine was the most active in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the second mutation proceeded using this. As a result, 6 mutants with higher fluorescence value than Q113R among 1,000 mutants were selected and confirmed as mutants further modified in Q113R (D136Y, L48Q, I112F, and I179T).

본 발명에서는 분자진화를 통하여 확보된 mutant library를 제작하기 위해서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 획득하고, 상기 유전자를 재조합 벡터를 통해 숙주미생물에 도입하여 배양하였다. In the present invention, in order to prepare a mutant library obtained through molecular evolution, a gene encoding a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is obtained, and the gene is introduced into a recombinant vector Introduced into host microorganisms and cultured.

본 발명에서는 mutant library 탐색을 위한 조건을 확립하고자 예비실험한 결과, 기 확보한 Yersinia sp. EA015 유래의 DeoC 유전자가 삽입된 pET302를 이용하여 MUDR을 사용한 screening 방법을 구축하였다. In the present invention, a preliminary experiment was carried out to establish the conditions for the mutant library search. As a result, it was confirmed that the Yersinia sp. Screening method using MUDR was constructed using pET302 with DeoC gene inserted from EA015.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터; 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주미생물에 도입되어 있는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.Thus, in another aspect, the present invention relates to a gene encoding the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant; A recombinant vector containing the gene; And a recombinant microorganism having the ability to produce the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant in which the gene or the recombinant vector is introduced into the host microorganism.

본 발명의 "2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제" 코딩하는 유전자를 "deoC"로 표기하였다.The gene coding for the "2-deoxyribose 5-phosphate aldolase" of the present invention is represented by " deoC & quot ;.

본 발명의 deoC 유전자는 대장균(E. coli)에서 발현이 효율적으로 되도록 하기 위해 코돈 최적화한 유전자를 합성한 바 있다(HINdeoC). 그리고 HINdeoC 유전자의 발현을 위하여 pET302/NT-His 벡터에 삽입하여 발현시키고 효소적 특성을 확인하였다.The deoC gene of the present invention has been synthesized a codon-optimized gene (HINdeoC) in order to make the expression efficiently in E. coli . For expression of HINdeoC gene, it was inserted into pET302 / NT-His vector for expression and its enzymatic properties were confirmed.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. In the present invention, "vector" means a DNA product containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in an appropriate host. The vector may be a plasmid, phage particle or simply a potential genome insert. Once transformed into the appropriate host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or, in some cases, integrate into the genome itself. Because the plasmid is the most commonly used form of the current vector, the terms "plasmid" and "vector" are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purpose of the present invention, it is preferable to use a plasmid vector. Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a cloning start point that allows replication to be efficiently made to include several hundred plasmid vectors per host cell, (b) a host cell transformed with the plasmid vector And (c) a restriction enzyme cleavage site into which the foreign DNA fragment can be inserted. Even if an appropriate restriction enzyme cleavage site is not present, using a synthetic oligonucleotide adapter or a linker according to a conventional method can easily ligate the vector and the foreign DNA.

본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다. The recombinant microorganism according to the present invention can be prepared by inserting the gene on a chromosome of a microorganism according to a conventional method, or introducing the recombinant vector onto a plasmid of a microorganism.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli DH5α E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E.coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.After ligation, the vector should be transformed into the appropriate host cell. In the present invention, the preferred host cells are prokaryotic cells. Suitable prokaryotic host cells include E. coli XL-1 Blue (Stratagene), E. coli DH5 alpha E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli BL21 and the like. However , E. coli strains such as FMB101, NM522, NM538 and NM539 , as well as the speices and genera of other prokaryotes, and the like, can also be used. In addition to the above E. coli , Agrobacterium sp. Strain such as Agrobacterium A4, bacilli such as Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium or Serratia marcescens ) is another variety of enteric bacteria and Pseudomonas (Pseudomonas) in the strain, such as may be used as host cells.

본 발명에서 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.As a method for inserting the gene encoding the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant into the chromosome of the host cell in the present invention, a commonly known gene manipulation method can be used. For example, microinjection (direct insertion of DNA into cells), liposome, directed DNA uptake, receptor ~ mediated DNA transfer, or DNA transport using Ca ++ . Is widely used. Examples include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, herpes simplex virus vectors, poxvirus vectors, or lentiviral vectors. Particularly, retroviruses have a high gene transfer efficiency, gross deletion It can be used in a wide range of cells without binding by host DNA and rearrangement (resulting in alteration of host DNA function by altering the region of the host DNA similar to that of the host DNA).

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으며, 대장균(E. coli)인 것이 바람직하다.In the present invention, the microorganism is selected from the group consisting of Agrobacterium genus, Aspergillus genus, Acetobacter genus, Aminobacter genus, Agromonas genus, Acidphilium genus, Bulleromyces genus, Buller genus, Brevundimonas genus, Cryptococcus genus, Chionosphaera genus, Candida genus, Cerinosterus genus, Escherichia genus, Exisophiala in, Exobasidium in, Fellomyces in, Filobasidium in, Geotrichum genus, Graphiola genus, Gluconobacter genus, Kockovaella in, Curtzmanomyces in, Lalaria in, Leucospoidium genus, Legionella genus, Psedozyma in, Paracoccus genus, Petromyc genus, Rhodotorula genus, Rhodosporidium in , Rhizomonas in, Rhodobium in, Rhodoplanes in, Rhodopseudomonas in, Rhodobacter genus, Sporobolomyces in, Spridobolus in, Saitoella in, Schizosaccharomyces genus, Sphingomonas genus, Sporotrichum genus, Sympodiomycopsis in, Sterigmatosporidium in, Tapharina in, Tremella genus, Trichosporon genus, Tilletiaria genus, genus Tilletia, Tolyposporium genus, genus Tilletiposis, Ustilago genus, genus Udenlomyce, Xanthophilomyces genus, genus Xanthobacter, P aceylomyces sp., Acremonium sp., Hyhomon sp., Rhizobium sp. It is preferably E. coli .

본 발명에 있어서, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 pET302/NT-His 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 다음, 각각 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 도입하였고, 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린 (ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에 진탕배양하여 효소의 과발현을 유도하였다. 배양액에서 수득한 균체를 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 활성 측정에 앞서 효소의 발현 여부와 정도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행한 결과, 가용성(soluble) 형태로 발현이 유도되어 대량의 단백질을 얻을 수 있었다 (도 9).In the present invention, a recombinant vector was prepared by inserting a gene encoding a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant into a pET302 / NT-His vector and then introduced into E. coli BL21 (DE3) , And the obtained transformant was cultured in LB liquid medium supplemented with ampicillin at 100 μg / ml to induce overexpression of the enzyme. The cells obtained in the culture broth were disrupted by ultrasonication and then centrifuged to recover the supernatant. SDS-PAGE was performed to confirm the expression and degree of the enzyme prior to the activity measurement, and as a result, expression was induced in a soluble form to obtain a large amount of protein (FIG. 9).

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 상기 알돌라아제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides a method for producing a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant, comprising: (a) culturing the recombinant microorganism to produce a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant; And (b) recovering the resulting aldolase mutant. The present invention also relates to a method for producing a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물로부터 생산된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 종래에 알려진 여러 가지 방법을 통해 정제될 수 있으며, 예컨대, 친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 등을 이용하여 정제될 수 있다.In the present invention, the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase produced from the recombinant microorganism can be purified through various methods known in the art, and examples thereof include affinity chromatography, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography And the like.

본 발명의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 생산하기 위한 재조합 미생물의 배양 및 회수과정은 당업계에 통상적으로 알려진 배양 방법 및 재조합 단백질의 분리 정제 방법이라면 특별한 제한 없이 모두 적용 가능하다.The culturing and recovery of the recombinant microorganism for producing the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant of the present invention can be applied to any culture method and separation and purification method of recombinant proteins conventionally known in the art without any particular limitation.

본 발명에 따른 효소 변이체 또는 효소 변이체 생산능을 가지는 재조합 미생물은 스타틴 합성공정의 중간체인 락톨(lactol)를 효율적으로 제조할 수 있다.The recombinant microorganism having the enzyme mutant or enzyme mutant producing ability according to the present invention can efficiently produce lactol, which is an intermediate of the statin synthesis process.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체 또는 상기 변이체가 발현되어 있는 미생물을 이용하여 아세트알데하이드 유도체를 축합시켜 락톨을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 락톨을 회수하는 단계를 포함하는 락톨의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides a method for producing lactol, comprising: (a) condensing an acetaldehyde derivative using the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant or a microorganism expressing the mutant to produce lactol; And (b) recovering the produced lactol.

본 발명에 있어서, 상기 아세트알데하이드 유도체는 아세트알데하이드(acetaldehyde), 2-하이드록시아세트알데하이드(2-hydroxyacetaldeyhde) 및 클로로아세트알데하이드(chloroacetaldehyde)로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서는 어셉터 기질로 한 분자의 클로로아세트알데하이드, 도너기질로 두 분자의 아세트알데하이드를 이용해 락톨을 합성할 수 있다. 이렇게 합성된 락톨(lactol)은 스타틴 (statin) 계열의 8-하이드로섹사노에이트 곁 사슬(8-hydroxyhexanoate side chain)을 구성하게 된다 (Greenberg et al,. PNAS., 101:5788-5793, 2004; Sukumaran et al., Soc. Rev., 34:530-542, 2005; Horinouchi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 71:615-621, 2006).In the present invention, the acetaldehyde derivative may be selected from the group consisting of acetaldehyde, 2-hydroxyacetaldehyde, and chloroacetaldehyde. In the invention, lactol can be synthesized using one molecule of chloroacetaldehyde as the acceptor substrate and two molecules of acetaldehyde as the donor substrate. The thus synthesized raktol (lactol) is a statin (statin) 8- dihydro-section Sano Eight side chains (8-hydroxyhexanoate side chain) is to be configured (Greenberg et al ,. PNAS the series, 101: 5788-5793, 2004; Sukumaran et al., Soc. Rev., 34: 530-542, 2005; Horinouchi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 71: 615-621, 2006).

본 발명에서 합성된 락톨(lactol)은 스타틴계 합성공정의 중간체로, 스타틴 (statin) 계열의 8-하이드로섹사노에이트 곁 사슬(8-hydroxyhexanoate side chain)을 구성한다.The lactol synthesized in the present invention is an intermediate of the statin synthesis process and constitutes a statin-based 8-hydroxyhexanoate side chain.

본 발명의 재조합 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 아세트알데히드 유도체와 같이 탄소 2개를 가진 작용기(2탄소 유닛)을 억셉터(acceptor) 분자에 연속적으로 축합시켜 항바이러스성 뉴클레오사이드, 에포틸론 A 및 스타틴계 고지혈증 치료제 등과 같은 생리활성 물질을 제조할 수 있으며, 상기 스타틴계 고지혈증 치료제는 아토바스타틴(atovasstatin), 로수바스타틴(rosuvastatin)일 수 있다.
The recombinant 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase of the present invention can be produced by continuously condensing a functional group (two carbon units) having two carbon atoms with an acceptor molecule such as an acetaldehyde derivative to form an antiviral nucleoside, Epothilone A and a statin-based hyperlipemia therapeutic agent. The statin-based antihyperlipidemic agent may be atovasstatin or rosuvastatin.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: 헤모필루수 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 제작Example 1: Production of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase derived from strain H. pneumoniae Rd KW20

헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20(Haemophilus influenzae Rd KW20 ; NC_000907) 균주 유래의 deoC 유전자가 대장균(E. coli)에서 발현이 효율적으로 되도록 하기 위해 코돈 최적화(codon optimization)한 유전자를 합성하였다 (Genscript, 미국).Haemophilus Influenza Rd KW20 ( Haemophilus influenzae Rd KW20; NC_000907) A codon optimized gene was synthesized to make the deoC gene derived from the strain efficiently expressed in E. coli ( Genscript , USA).

상기 합성된 5종류의 deoC 유전자를 발현시키기 위하여 유전자를 합성할 때 deoC 유전자의 개시코돈(ATG)앞에 삽입한 EcoRI (Takara) 제한효소 부위와 정지코돈 뒤에 삽입한 BamHI(Takara) 제한효소 부위를 사용하여 발현벡터인 pET302/NT-His 벡터(Invitrogen, cat. No. K6302-03)의 동일한 부위에 삽입하였다. 이렇게 제조된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조한 다음, 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환시켰다. In order to express the synthesized five kinds of deoC genes, Eco RI (Takara) restriction enzyme site inserted before the start codon (ATG) of the deoC gene and Bam HI (Takara) restriction enzyme site inserted after the stop codon Was inserted into the same site of the pET302 / NT-His vector (Invitrogen, cat. No. K6302-03), an expression vector. A recombinant vector containing the gene encoding the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase thus prepared was prepared and then transformed into E. coli BL21 (DE3).

클로닝된 DNA 단편은 EcoRI과 BamHI 제한효소를 처리한 다음, pET302/NT-His 벡터(Invitrogen, cat. No. K6302-03)에 삽입하여, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조한 다음, 대장균(E. coli) BL21(DE3)에 형질전환시켰다.
The cloned DNA fragment was digested with Eco RI and Bam HI restriction enzymes and then inserted into pET302 / NT-His vector (Invitrogen, cat. No. K6302-03) to encode 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase , And then transformed into E. coli BL21 (DE3).

실시예 2: Mutant library 탐색을 위한 벡터 제작Example 2: Construction of vector for searching mutant library

분자진화를 통하여 확보된 mutant library를 탐색하기 위해서 고속탐색시스템(HTS)를 사용하였다. pET302/NT-His 벡터에 경우 단백질 발현을 위해서 IPTG첨가하여야 하는 번거러움이 있기 때문에 본 발명에서는 cloning과 발현을 동시에 할 수 있는 상시 발현벡터 pHSG298(TAKARA, Japan)을 사용하였다. pET302/HINdeoC를 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 처리하여 HINdeoC 유전자만 정제한 후 같은 효소로 처리한 pHSG298에 cloning하여 pHSG298/HINdeoC 재조합 플라스미드를 얻을 수 있었다. DERA의 발현을 위해서 대장균(E. coli) XL1-Blue에 도입하여 형질전환체 라이브러리를 구축하였다. 형질전환체 라이브러리 각각을 IPTG induction 없이 37℃에서 16시간 동안 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양액의 DERA 발현을 SDS-PAGE상에서 확인하였다(도 1).
A fast search system (HTS) was used to search mutant libraries obtained through molecular evolution. In the present invention, the constant expression vector pHSG298 (TAKARA, Japan), which can simultaneously perform cloning and expression, was used because it is troublesome to add IPTG to the pET302 / NT-His vector in order to express the protein. pET302 / HINdeoC was treated with restriction enzymes Eco RI and Bam HI to purify only the HINdeoC gene and then cloned into pHSG298 treated with the same enzyme to obtain a recombinant plasmid pHSG298 / HINdeoC. For expression of DERA, a transformant library was constructed by introducing into E. coli XL1-Blue. Each of the transformant libraries was shake-cultured at 37 [deg.] C for 16 hours without IPTG induction at 200 rpm. DERA expression of the culture was confirmed on SDS-PAGE (Fig. 1).

실시예 3: 변이효소 탐색을 위한 형광기질인 4-methylumbelliferyl deoxyribose(MUDR)의 유기합성Example 3: Organic synthesis of fluorescent substrate 4-methylumbelliferyl deoxyribose (MUDR) for mutant enzyme screening

Random mutation을 통하여 확보한 mutant library의 활성을 탐색하기 위해서 고속탐색시스템(HTS)을 사용하였다. 이때 사용하는 기질은 인공 합성한 4-methylumbelliferyl deoxyribose(MUDR)을 사용하여 빠른 시간에 효율적으로 활성이 높은 DERA mutant 효소를 선별할 수 있다. MUDR은 형광을 내지 않지만 DERA효소에 의해서 방출된 4-methylumbelliferone은 형광을 나타낸다. MUDR 합성 방법은 아래와 같다.
A fast search system (HTS) was used to detect the activity of the mutant library obtained through random mutation. At this time, 4-methylumbelliferyl deoxyribose (MUDR), which is an artificial synthesized substrate, can be used to efficiently select DERA mutant enzymes in a short time. MUDR does not fluoresce, but 4-methylumbelliferone released by DERA enzyme shows fluorescence. The MUDR synthesis method is as follows.

① 2-Deoxy-D-ribose 10g을 메탄올 100ml에 녹이고, 0℃에서 10분간 교반 후 H2SO4 solution 64ml를 넣었다. 교반한 후 TLC (Methylene chloride : MeOH = 9 : 1)를 확인하여 반응을 끝내고 반응액을 pH paper를 이용하여 pH 7에 맞추고 Rotary evaporator로 농축하였다. Sillica column(5 * 30 cm)을 이용하여 용매 methylene chloride와 MeOH의 비율를 바꾸면서 elution시켜 product를 정제하였다(7.7g) (도 2A). ① 10 g of 2-Deoxy-D-ribose was dissolved in 100 ml of methanol, stirred at 0 ° C for 10 minutes, and 64 ml of H 2 SO 4 solution was added. After stirring, TLC (Methylene chloride: MeOH = 9: 1) was confirmed. After completion of the reaction, the reaction solution was adjusted to pH 7 using pH paper and concentrated using a rotary evaporator. The product was purified (7.7 g) by elution using a Sillica column (5 * 30 cm) with varying ratios of methylene chloride and MeOH in the solvent (Figure 2A).

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② 7.7g을 pyridine anh.150ml에 녹인 후, toluenesulfonylchloride 11.9g을 넣었다. 교반 후 TLC (Hex : EA = 1 : 2 )를 확인하여 반응을 끝내고 Rotary evaporator로 농축하였다. Methylene chloride로 녹인 후 물을 넣고 separating funnel을 이용해 층분리해서 MC층을 rotary evaporator를 이용하여 농축하였다. Sillica column(5 * 30 cm)을 이용하여 용매 Hexane 과 Ethylacetate의 비율을 바꾸면서 elution시켜 product를 정제하였다(8.93g) (도 2B).
② 7.7 g was dissolved in pyridine anhydrous 150 ml, and then 11.9 g of toluenesulfonylchloride was added. After stirring, TLC (Hex: EA = 1: 2) was confirmed, and the reaction was completed and concentrated using a rotary evaporator. After dissolving in methylene chloride, water was added, layer separation was carried out using a separating funnel, and the MC layer was concentrated using a rotary evaporator. The product was purified (8.93 g) by elution with varying ratios of solvent hexane and ethylacetate using a sillica column (5 * 30 cm) (Fig. 2B).

③ 8.93g을 DMF anh. 51ml에 녹인 후 K2CO3 8.16g과 4-methylumbeliferone 6.5g을 넣었다. 16시간 교반 후 Rotary evaporator로 농축한다. EA로 녹인 후 물을 넣고 separating funnel을 이용하여 층분리한 후 Ethylacetate층을 Rotary evaporator로 농축하였다(8.7g).③ 8.93 g was dissolved in DMF anh. And then 8.16 g of K 2 CO 3 and 6.5 g of 4-methylumbeliferone were added thereto. After stirring for 16 hours, concentrate with a rotary evaporator. After dissolving in EA, water was added, layer separation was performed using a separating funnel, and the Ethylacetate layer was concentrated on a rotary evaporator (8.7 g).

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④ 8.7g을 증류수 100ml에 녹인 후 교반하였다. Dowex 50wx 8 2.37g을 넣고 overnight 교반한 후 TLC (Hexane : Ethylacetate = 1 : 2 )를 이용하여 반응정도를 확인하고(도 2C), 필터 후 Rotary evaporator로 농축하였다. Sillica column(5 * 15 cm)을 이용하여 용매 Hexane과 Ethylacetate의 비율를 바꾸면서 elution시켜 product를 정제하였다(800mg). 정제된 화합물은 1H NMR을 통하여 확인하였다(도 3).④ (8.7 g) was dissolved in distilled water (100 ml) and stirred. 2.34 g of Dowex 50wx 8 was added and stirred overnight. The degree of reaction was confirmed by using TLC (Hexane: Ethylacetate = 1: 2) (FIG. 2C), and the solution was concentrated using a rotary evaporator. The product was purified (800 mg) using a Sillica column (5 * 15 cm) eluting with a gradient of solvent hexane and ethylacetate. The purified compound was confirmed by 1 H NMR (Fig. 3).

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Figure pat00003

실시예 4: Mutant library 탐색을 위한 조건확립Example 4 Establishment of Condition for Mutant Library Search

합성한 MUDR 기질을 이용하여 mutant library를 탐색하는 방법은 다양한 예비실험을 통하여 확립하였다. 기 확보한 Yersinia sp. EA015유래의 DeoC 유전자가 삽입된 pET302 (Protein Expression and Purification 68 (2009) 196-200)를 이용하여 MUDR을 사용한 screening 방법을 구축 하였다. single colony를 1/2 LB배지, LB배지, M9배에서 각각 37℃, 16시간 진탕배양한 배양체에 0.01X lysis buffer를 첨가하여 상온에서 30분간 방치 후 30uM MUDR 를 첨가하여 최종 부피 200㎕가 되도록 하여 37℃에서 반응 시키고, 반응물을 시간별로 그 형광값을 측정하였다. 그 결과, 상기의 조건으로 1/2 LB배지에서 배양하는 것이 다른 배지보다 8시간까지 가장 높은 형광값을 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 3시간을 반응하여 최대의 형광값에 도달하는 활성이 증가된 DERA 효소를 선별하는데 사용하였다(도 4). 또한 이 결과를 pHSG298/HINdeoC가 삽입된 대장균에서 발현한 단백질에 적용하여 동일 하게 재현됨을 확인하였다.
The method of searching the mutant library using the synthesized MUDR substrate was established through various preliminary experiments. Yersinia sp. A screening method using MUDR was constructed using pET302 (Protein Expression and Purification 68 (2009) 196-200) into which the DeoC gene derived from EA015 was inserted. Single colony was cultured in 1/2 LB medium, LB medium and M9 magnification at 37 ° C for 16 hours with shaking, and 0.01X lysis buffer was added. After incubation at room temperature for 30 minutes, 30 μM MUDR was added to the final volume of 200 μl And the reaction was allowed to proceed at 37 DEG C, and the fluorescence value of the reaction product was measured over time. As a result, under the above-mentioned conditions, culturing in a 1/2 LB medium showed the highest fluorescence value up to 8 hours compared with the other medium. Therefore, this study was used to select DERA enzymes with increased activity to reach the maximum fluorescence value by reacting for 3 hours (Fig. 4). This result was confirmed to be reproducibly applied to proteins expressed in Escherichia coli containing pHSG298 / HINdeoC.

실시예 5: HINdeoC의 random mutation을 통한 분자진화Example 5: Molecular evolution through random mutation of HINdeoC

Mutant library는 DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech)를 이용하여 구축하였다. pHSG298/HINdeoC를 template로 하고 M13F와 M13R universal primer를 사용하여 Error-prone PCR을 수행하였다. PCR 조건은 10 μM primer를 각각 0.5 ㎕, 10X TITANIUM Taq Buffer 5 ㎕, 8 mM MnSO4 2 ㎕, 2 mM dGTP 1 ㎕, 50X Diversify dNTP Mix 1 ㎕, 2 U TITANIUM Taq Polymerase 와 template를 넣어 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 한다. PCR program은 첫 번째 단계에서 94℃ 30초를 1회 수행 후, 두 번째 단계 (94℃ 30초, 46℃ 30초, 68℃ 1분)를 25회 반복 수행하고, 마지막으로 68℃ 1분을 한차례 수행하였다. PCR product는 EcoRI과 BamHI으로 잘라주고 같은 효소로 처리한 pHSG298 vector에 T4 ligase를 이용하여 ligation한 후, 대장균 [XL1-Blue]에 형질전환시켜 mutant library를 얻는다. 1회 PCR 수행 결과, 50 ㎍/ml의 kanamycin이 포함된 LB agar배지에서 약 3000여개의 colony를 얻을 수 있었다. 여기서 얻은 colony를 50 ㎍/ml의 kanamycin이 포함된 1/2 LB배지가 담긴 96well plate에 하나씩 접종하여 mutant를 배양하였다. 이들 mutant들은 앞서 확보한 최적반응 조건으로 반응시켰다. The mutant library was constructed using the Diversify TM PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech). Error-prone PCR was performed using pHSG298 / HINdeoC as a template and M13F and M13R universal primers. For PCR conditions, add 0.5 μl of 10 μM primer, 5 μl of 10 × TITANIUM Taq Buffer, 2 μl of 8 mM MnSO 4, 1 μl of 2 mM dGTP, 1 μl of 50 × Diversify dNTP Mix, 2 μl TITANIUM Taq Polymerase and template, 50 < / RTI > The PCR program was carried out at 94 ° C for 30 seconds in the first step and then 25 times in the second step (94 ° C for 30 seconds, 46 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute), and finally 68 ° C for 1 minute . The PCR product is ligated to pHSG298 vector cut with Eco RI and Bam HI, treated with the same enzyme, and ligated with T4 ligase, and then transformed into E. coli [XL1-Blue] to obtain a mutant library. As a result of PCR, about 3000 colonies were obtained from LB agar medium containing kanamycin at 50 ㎍ / ml. The colonies were inoculated into a 96-well plate containing 50 μg / ml of kanamycin in a 1/2 LB medium, and the mutants were cultured. These mutants were reacted with the optimal reaction conditions previously obtained.

첫 번째 mutation에서 2000개의 mutants 중 wild type보다 형광값이 높은 것을 7개 선별하였다. 이들의 활성을 측정한 결과 Q113R로 변형된 C1-10G가 가장 활성이 높아진 mutant임을 확인하였고 이를 이용하여 두 번째 mutation을 진행하였다. 1000개의 mutant 중 C1-10G보다 형광값이 높은 6개를 선별하였고, 이들의 sequence 확인 결과 1차 선별 균주인 C1-10G에 D136Y가 추가 변형된 C2-3G와 L48Q가 추가 변형된 C2-8G를 얻을 수 있었다(도 5).
In the first mutation, 7 mutants with higher fluorescence value than the wild type among 2000 mutants were selected. As a result of measuring their activity, it was confirmed that C1-10G modified with Q113R was the most active mutant, and a second mutation was performed using this. Among the 1,000 mutants, 6 were selected with higher fluorescence values than C1-10G. As a result of their sequence confirmation, C2-13G was added to C1-10G, and C2-8G was further modified with L48Q (Fig. 5).

실시예 6: 변이체의 활성측정Example 6: Measurement of mutant activity

Mutant들의 활성을 측정하기 위하여 pET302/NT-his 발현벡터를 사용하여 효소를 과발현 하였다. EcoR I과 BamH I site를 이용하여 pET302dp 크로닝하여 pET302/C1-10G, pET302/C2-3G, pET302/C2-8G를 구축하였다. 발현 플라스미드를 대장균 [BL21(DE3)]에 도입하여 형질전환체를 발현하였다. To determine the activity of the mutants, the pET302 / NT-his expression vector was used to overexpress the enzyme. PET302 / C1-10G, pET302 / C2-3G, and pET302 / C2-8G were constructed by pET302dp cloning using EcoRI and BamHI sites. The expression plasmid was introduced into E. coli [BL21 (DE3)] to express a transformant.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 활성은 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DR5P, 0.5 mM NADH, 효소상등 10 μg을 넣어 총 100 μl가 되도록 하여, 30℃에서 10분간 반응시켰다. 이후 상기 반응액에 10 U 알코올 디하이드로게네이즈(Alcohol dehydrogenase, ADH)를 넣고, 흡광도 측정기를 통해 340 nm에서 NADH의 OD값 감소를 확인함으로써 효소의 활성을 측정하였다. 효소의 유닛(U)은 2-deoxyribose 5-phosphate (DR5P)가 분해되어 분당 생성되는 acetaldehyde의 μmole수를 나타낸다. The activity of 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase was determined by adding 10 μg of 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DR5P, 0.5 mM NADH and enzyme supernatant to a total volume of 100 μl. . Then, 10 U of alcohol dehydrogenase (ADH) was added to the reaction solution, and the activity of the enzyme was measured by confirming the reduction of the OD value of NADH at 340 nm through an absorbance meter. Unit (U) of the enzyme represents the number of μmoles of acetaldehyde produced per minute by decomposition of 2-deoxyribose 5-phosphate (DR5P).

이들의 활성을 측정한 결과 wild type의 경우 33.5 U/mg인데 반해 C1-10G는 61.53 U/mg으로 활성이 1.8배 더 높아진 것을 확인하였다. C2-3G의 경우 55 U/mg으로 C1-10G보다는 활성이 감소하였고, C2-8G의 경우 68.5 U/mg으로 활성이 소량 더 증가한 것을 알 수 있었다(도 6). 이들의 acetaldehyde에 내성은 HINdeoC wild type이 300 mM 이상에서 저해가 일어나는 것을 확인한 반면 C1-10G의 경우 1 M 까지, C2-3G와 C2-8G는 2.5 M 까지도 acetaldehyde에 대한 저해없이 계속해서 DR5P를 생산하는 것을 확인하였다(도 7). 2차 mutation에서 C2-8G가 활성 및 기질저해도면에서 우수 하였기 때문에 이를 template로 하여 세 번째 mutation을 진행하였다. 그리하여 얻은 1000개의 mutant 중 C2-8G보다 형광값이 높아진 mutatnt를 10개 얻을 수 있었고, 이들의 amino acid alignment 결과 유효한 mutant 2종(C3-2A, C3-10D)을 얻을 수 있었다(표 1). 이들 3차 mutant의 발현벡터로의 클로닝과 활성측정, 기질 저해도에 관한 실험을 하였으나 더 개선된 점을 찾지 못하였다(도 6 및 도 7).The activity of the wild type was 33.5 U / mg, while the activity of C1-10G was 61.53 U / mg, which was 1.8 times higher. In the case of C2-3G, the activity was decreased to 55 U / mg compared with that of C1-10G, and in case of C2-8G, the activity was slightly increased to 68.5 U / mg (FIG. 6). Their acetaldehyde resistance showed that HINdeoC wild type inhibited more than 300 mM, while C1 - 10G up to 1 M and C2-3G and C2 - 8G up to 2.5 M produced DR5P continuously without inhibition of acetaldehyde (Fig. 7). In the second mutation, C2-8G was superior in activity and substrate inhibition, so the third mutation was performed as a template. Ten mutants with higher fluorescence values than C2-8G were obtained, and two amino acid alignment mutants (C3-2A, C3-10D) were obtained (Table 1). Cloning and activity measurement of these tertiary mutants into expression vectors, and substrate inhibition were conducted, but no further improvement was found (FIGS. 6 and 7).

MethodMethod MutantMutant Amino acid mutationAmino acid mutation First round random mutationFirst round random mutation C1-10GC1-10G Q113RQ113R Second round random mutation
Second round random mutation
C2-3GC2-3G Q113R D136YQ113R D136Y C2-8GC2-8G L48Q Q113RL48Q Q113R Third round random mutation
Third round random mutation
C3-2AC3-2A L48Q I112F Q113RL48Q I112F Q113R C3-10DC3-10D L48Q Q113R I179TL48Q Q113R I179T

실시예 7: Site directed mutation을 통한 mutation의 활성 확인Example 7: Identification of mutation activity by site directed mutation

변이체 중 활성이 개선된 C1-10G, C2-3G, C2-8G에서 확인된 아미노산 서열의 각각의 변화가 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 site directed mutagenesis를 사용하여 추가로 mutant들을 제작하였다. L48Q, Q113R, D136Y각의 mutant를 포함한 mutant의 조합을 아래 표 2에 나타내었다.
Additional mutants were constructed using site directed mutagenesis to investigate the effect of each of the amino acid sequences identified in C1-10G, C2-3G, and C2-8G with improved activity among mutants on activity. The combinations of mutants containing L48Q, Q113R and D136Y mutants are shown in Table 2 below.

Site directed mutationSite directed mutation MutantMutant Amino acid mutationAmino acid mutation
1 amino acid mutation
1 amino acid mutation
C1-48C1-48 L48QL48Q C1-10GC1-10G Q113RQ113R C1-136C1-136 D136YD136Y
2 amino acid mutation
2 amino acid mutation
C2-3GC2-3G Q113R-D136YQ113R-D136Y C2-8GC2-8G L48Q-Q113RL48Q-Q113R C2-46C2-46 L48Q-D136YL48Q-D136Y 3 amino acid mutation3 amino acid mutation C3-3C3-3 L48Q-Q113R-D136YL48Q-Q113R-D136Y

따라서 기존의 변이체 외에 L48Q, D136Y, L48Q-D136Y, L48Q-Q113R-D136Y mutant 4종이 더 필요하므로 서열번호 11 내지 16의 primer를 이용하여 site directed mutagenesis를 수행하였다. Therefore, in addition to the conventional mutants, four additional mutants of L48Q, D136Y, L48Q-D136Y, and L48Q-Q113R-D136Y were required, so site directed mutagenesis was performed using the primers of SEQ ID NOS: 11-16.

그리하며 L48Q로 변이된 C1-48, D136Y로 변이된 C1-136, L48Q-D136Y로 변이된 C2-46, L48Q-Q113R-D136Y로 변이된 C3-3 mutant를 더 얻을 수 있었다(도 8). 이들의 활성 측정을 통하여 각각의 아미노산의 변이가 어떠한 영향을 주는지 확인하는 실험을 하였다. 우선 단백질이 제대로 발현되는지를 확인한 결과 비슷한 수준의 soluble form으로 얻을 수 있었다(도 9). L48Q, Q113R, D136Y중 Q113R(C1-10G)이 효소의 활성을 크게 증가 시켰으며 double mutant와 비교 했을 때도 Q113R-D136Y(C2-3G)와 L48Q-Q113R(C2-8G)가 다른 어떤 mutant 보다도 높은 활성을 보였으며 triple mutant인 C3-3은 wild type과 유사한 활성을 나타내었다(도 10). 아래 표 3은 HINdeoC wild type과 site directed mutation을 포함하는 변이체들의 효소활성 수치를 나타낸 것이다.
Thus, C1-348 mutated to L48Q, C1-136 mutated to D136Y, C2-46 mutated to L48Q-D136Y, and C3-3 mutant mutated to L48Q-Q113R-D136Y were obtained (FIG. 8). Experiments were conducted to determine the effect of each amino acid variation on the activity measurement. First, it was confirmed that the protein was properly expressed, and a similar level of soluble form was obtained (FIG. 9). Q113R (C1-10G) of L48Q, Q113R and D136Y greatly increased the activity of the enzyme. Q113R-D136Y (C2-3G) and L48Q-Q113R (C2-8G) were higher than any other mutant C3-3, a triple mutant, showed similar activity to the wild type (Fig. 10). Table 3 below shows the enzyme activity levels of mutants including HINdeoC wild type and site directed mutation.

MutantMutant Specific activity (U/mg)Specific activity (U / mg) Wild typeWild type 33.5033.50 C1-10GC1-10G 61.5361.53 C1-136C1-136 33.3033.30 C1-48C1-48 34.5034.50 C2-3GC2-3G 55.0055.00 C2-8GC2-8G 68.5068.50 C2-46C2-46 40.2040.20 C3-3C3-3 34.0034.00

Acetaldehyde에 대한 저해도 실험에서는 C1-136의 경우 wild type 보다 안정성이 떨어졌고, C1-48의 경우 1 M까지 acetaldehyde에 대한 저해없이 DR5P를 생산하는 것을 확인하였다. C2-46(L48Q-D136Y)은 활성에서의 결과와 같이 D136Y로 변함에 따라 L48Q mutant보다 기질저해도가 낮지만, wild type보다는 높은 수준이였다. Triple mutant C3-3의 경우, C2-3G(Q113R-D136Y), C2-8G(L48Q-Q113R)과 비교하였을 때 기질저해도가 급격히 떨어지는 것을 알 수 있었다(도 11).Inhibition against acetaldehyde was also found to be less stable than that of wild type in C1-136, and DR5P was produced in C1-48 without inhibition of acetaldehyde up to 1 M in the experiment. C2-46 (L48Q-D136Y) was found to have higher substrate inhibition than L48Q mutant but higher than wild type as it changed to D136Y as the result of activity. In the case of the triple mutant C3-3, the substrate inhibition was drastically decreased when compared with C2-3G (Q113R-D136Y) and C2-8G (L48Q-Q113R) (FIG. 11).

이러한 결과들을 바탕으로 가장 활성이 뛰어나고 안정성이 높은 mutant는 L48Q-Q113R로 double mutation된 C2-8G인 것으로 확인되었다. 특히 아미노산 113번이 Glutamine에서 Arginine으로 바뀌면서 활성이 1.8배 증가하였고, 기질안정성 또한 크게 증가하였다. 여기에 48번 아미노산이 Leucine에서 Glutamine으로 바뀌거나, 136번 아미노산이 Aspartic acid에서 Tyrosine으로 각각 하나씩 바뀐 것은 활성과 기질저해도에서는 큰 영향을 미치지 않으나 Q113R과 함께 변이되면 기질안정성 실험에서 긍정적인 결과를 가져오는 것을 확인하였다. 하지만 L48Q와 D136Y가 함께 변이되었을때는 급격히 안정성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
Based on these results, it was confirmed that the most active and highly stable mutant was C2-8G double mutated with L48Q-Q113R. In particular, amino acid 113 was changed from glutamine to arginine, and the activity was increased 1.8 times, and the stability of the substrate was also greatly increased. The change in amino acid number 48 from Leucine to Glutamine and the change in amino acid number 136 from Aspartic acid to Tyrosine did not have a significant effect on activity and substrate inhibition, but mutations with Q113R gave positive results in substrate stability experiments . However, when L48Q and D136Y were mutated, the stability was rapidly deteriorated.

실시예 8: 헤모필루스 인플루엔자(Example 8: Hemophilus influenza ( Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae ) Rd KW20 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 이용한 락톨(lactol)의 합성Synthesis of Lactol Using 2-Deoxyribose 5-Phosphate Aldolase Mutant Derived from Rd KW20 Strain

헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 이용하여 락톨(lactol) 합성을 확인하기 위해, 두 분자의 아세트알데하이드(acetaldehyde) 및 한 분자의 클로로아세트알데하이드(chloroacetaldehyde)를 축합시키는 반응을 수행하였다. Two molecules of acetaldehyde and one molecule of chloroacetaldehyde were used to confirm lactol synthesis using the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant from Haemophilus influenzae Rd KW20 strain. The condensation reaction was carried out.

먼저, 1.5 M의 클로로아세트알데하이드와 3.1 M의 아세트알데하이드 혼합액 5㎖을 HINdeoC 효소상등액 7㎖에 16.66 ㎖/ｈ의 속도로 상온 120 rpm에서 3시간에 걸쳐 첨가하였다. 이때 시간 별로 생성되는 양을 확인하기 위하여 1, 2, 3, 6시간 반응시킨 후, 각각에 20㎖ 아세톤(acetone)을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 상기 반응액을 여과한 다음 증발기(evaporator)를 이용하여 감압 농축하여 2.5㎖으로 농축하였다. 이것을 에틸에세테이드(ethyl acetate) 7.5㎖로 3번 추출하여 이를 증발기로 감압 농축하면 최종적으로 밝은 노란색을 띄는 기름(light yellow oil) 형태의 락톨 추출액(crude lactol)을 수득하였다. First, 5 ml of a mixture of 1.5 M of chloroacetaldehyde and 3.1 M of acetaldehyde was added to 7 ml of the HINdeoC enzyme supernatant at a rate of 16.66 ml / h at room temperature of 120 rpm over 3 hours. In order to determine the amount of protein produced by time, the reaction was performed for 1, 2, 3, and 6 hours, followed by the addition of 20 ml of acetone to precipitate the proteins. The reaction solution was filtered, concentrated under reduced pressure using an evaporator, and concentrated to 2.5 ml. This was extracted three times with 7.5 ml of ethyl acetate and concentrated under reduced pressure using an evaporator to finally obtain a light yellow oil-like crude lactol.

HINdeoC 외에 그 변이체들 또한 상기와 같은 방법으로 반응을 수행하여 그 생성량을 비교한 결과 6시간 반응시켰을 때 wild type에 비해 C1-10G는 1.17배, C2-3G는 1.28배, C2-8G는 1.34배만큼 생성량이 증가하였음을 확인하였다(도 12). In addition to HINdeoC, the mutants were also reacted in the same manner as described above. As a result, when the reaction was carried out for 6 hours, C1-10G was 1.17 times, C2-3G was 1.28 times, C2-8G was 1.34 times (Fig. 12).

수득된 락톨 추출물을 박막크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)로 확인하였다. TLC방법은 락톨 추출액을 크로마토그래피를 위한 판 (TLC plate silica gel 60 F254, Merck co.)에 스폿팅 (spotting) 하여 말린 후 n-헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 1:2(v/v)의 비율로 혼합한 시약에 1회 전개하였다. 그 후, 아시딕 시어릭 암모늄말리브데이트(acidic ceric ammonium molybdate) 발색시약을 분사하여 100℃에서 5분간 열을 가하였다. The obtained lactol extract was confirmed by thin layer chromatography (TLC). The TLC method was carried out by spotting the lactol extract solution on a plate for chromatography (TLC plate silica gel 60 F254, Merck co.), Drying and then adding 1: 2 (hexane, ethyl acetate) v / v). Then, acidic ceric ammonium molybdate coloring reagent was sprayed thereon and heated at 100 ° C for 5 minutes.

그 결과, HINdeoC와 그 변이체 모두 고농도의 클로로아세트알데하이드와 아세트알데하이드에서 효율적으로 락톨이 합성된 것을 확인하였고, 상기 생성량측정 실험에서와 같이 변이체에서 보다 많은 lactol이 합성되는 것을 확인하였다 (도 13).As a result, it was confirmed that lactol was efficiently synthesized in high concentrations of chloroacetaldehyde and acetaldehyde in both of HINdeoC and its mutants, and it was confirmed that more lactol was synthesized in the mutant as in the above production amount measurement experiment (FIG. 13).

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments, It will be obvious. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant from Haemophilus influenzae Rd KW20 <130> P14-B190 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1-10G (Q113R) <400> 1 Met Thr Ser Asn Gln Leu Ala Gln Tyr Ile Asp His Thr Ala Leu Thr 1 5 10 15 Ala Glu Lys Asn Glu Gln Asp Ile Ser Thr Leu Cys Asn Glu Ala Ile 20 25 30 Glu His Gly Phe Tyr Ser Val Cys Ile Asn Ser Ala Tyr Ile Pro Leu 35 40 45 Ala Lys Glu Lys Leu Ala Gly Ser Asn Val Lys Ile Cys Thr Val Val 50 55 60 Gly Phe Pro Leu Gly Ala Asn Leu Thr Ser Val Lys Ala Phe Glu Thr 65 70 75 80 Gln Glu Ser Ile Lys Ala Gly Ala Asn Glu Ile Asp Met Val Ile Asn 85 90 95 Val Gly Trp Ile Lys Ser Gln Lys Trp Asp Glu Val Lys Gln Asp Ile 100 105 110 Arg Ala Val Phe Asn Ala Cys Asn Gly Thr Pro Leu Lys Val Ile Leu 115 120 125 Glu Thr Cys Leu Leu Thr Lys Asp Glu Ile Val Lys Ala Cys Glu Ile 130 135 140 Cys Lys Glu Ile Gly Val Ala Phe Val Lys Thr Ser Thr Gly Phe Asn 145 150 155 160 Lys Gly Gly Ala Thr Val Glu Asp Val Ala Leu Met Lys Asn Thr Val 165 170 175 Gly Asn Ile Gly Val Lys Ala Ser Gly Gly Val Arg Asp Thr Glu Thr 180 185 190 Ala Leu Ala Met Ile Lys Ala Gly Ala Thr Arg Ile Gly Ala Ser Ala 195 200 205 Gly Ile Ala Ile Ile Ser Gly Thr Gln Asp Thr Gln Ser Thr Tyr 210 215 220 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C2-3G (Q113R, D136Y) <400> 2 Met Thr Ser Asn Gln Leu Ala Gln Tyr Ile Asp His Thr Ala Leu Thr 1 5 10 15 Ala Glu Lys Asn Glu Gln Asp Ile Ser Thr Leu Cys Asn Glu Ala Ile 20 25 30 Glu His Gly Phe Tyr Ser Val Cys Ile Asn Ser Ala Tyr Ile Pro Leu 35 40 45 Ala Lys Glu Lys Leu Ala Gly Ser Asn Val Lys Ile Cys Thr Val Val 50 55 60 Gly Phe Pro Leu Gly Ala Asn Leu Thr Ser Val Lys Ala Phe Glu Thr 65 70 75 80 Gln Glu Ser Ile Lys Ala Gly Ala Asn Glu Ile Asp Met Val Ile Asn 85 90 95 Val Gly Trp Ile Lys Ser Gln Lys Trp Asp Glu Val Lys Gln Asp Ile 100 105 110 Arg Ala Val Phe Asn Ala Cys Asn Gly Thr Pro Leu Lys Val Ile Leu 115 120 125 Glu Thr Cys Leu Leu Thr Lys Tyr Glu Ile Val Lys Ala Cys Glu Ile 130 135 140 Cys Lys Glu Ile Gly Val Ala Phe Val Lys Thr Ser Thr Gly Phe Asn 145 150 155 160 Lys Gly Gly Ala Thr Val Glu Asp Val Ala Leu Met Lys Asn Thr Val 165 170 175 Gly Asn Ile Gly Val Lys Ala Ser Gly Gly Val Arg Asp Thr Glu Thr 180 185 190 Ala Leu Ala Met Ile Lys Ala Gly Ala Thr Arg Ile Gly Ala Ser Ala 195 200 205 Gly Ile Ala Ile Ile Ser Gly Thr Gln Asp Thr Gln Ser Thr Tyr 210 215 220 <210> 3 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C2-8G (L48Q, Q113R) <400> 3 Met Thr Ser Asn Gln Leu Ala Gln Tyr Ile Asp His Thr Ala Leu Thr 1 5 10 15 Ala Glu Lys Asn Glu Gln Asp Ile Ser Thr Leu Cys Asn Glu Ala Ile 20 25 30 Glu His Gly Phe Tyr Ser Val Cys Ile Asn Ser Ala Tyr Ile Pro Gln 35 40 45 Ala Lys Glu Lys Leu Ala Gly Ser Asn Val Lys Ile Cys Thr Val Val 50 55 60 Gly Phe Pro Leu Gly Ala Asn Leu Thr Ser Val Lys Ala Phe Glu Thr 65 70 75 80 Gln Glu Ser Ile Lys Ala Gly Ala Asn Glu Ile Asp Met Val Ile 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agtgggatga agttaagcag gacatccgag cggtcttcaa cgcctgcaat 360 ggcaccccgc tgaaagtgat tctggaaacg tgtctgctga ccaaagacga aatcgttaag 420 gcctgcgaaa tttgtaaaga aatcggcgtt gcatttgtca aaacctctac gggtttcaat 480 aagggcggtg ccacggtgga agatgttgca ctgatgaaaa acaccgtcgg caatattggt 540 gtgaaggctt ccggcggtgt tcgtgacacc gaaacggcac tggctatgat caaagcaggt 600 gcaacccgta ttggtgcaag tgctggtatc gcaattatct ccggtaccca ggatacgcaa 660 tcaacctatt aa 672 <210> 7 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > C2-3G (Q113R, D136Y) <400> 7 atgacgagca atcaactggc gcaatacatc gaccatacgg cactgacggc tgaaaagaac 60 gaacaagaca tctccacgct gtgtaacgaa gccattgaac atggctttta tagcgtgtgc 120 attaactctg catacatccc gctggctaaa gaaaagctgg cgggtagcaa cgtcaaaatt 180 tgtacggtgg ttggctttcc gctgggtgct aatctgacgt cggttaaagc gttcgaaacc 240 caggaaagca tcaaggcggg cgccaacgaa attgatatgg tcatcaatgt gggatggatc 300 aagagtcaaa agtgggatga agttaagcag gacatccgag cggtcttcaa cgcctgcaat 360 ggcaccccgc tgaaagtgat tctggaaacg tgtctgctga ccaaatacga aatcgttaag 420 gcctgcgaaa tttgtaaaga aatcggcgtt gcatttgtca aaacctctac gggtttcaat 480 aagggcggtg ccacggtgga agatgttgca ctgatgaaaa acaccgtcgg caatattggt 540 gtgaaggctt ccggcggtgt tcgtgacacc gaaacggcac tggctatgat caaagcaggt 600 gcaacccgta ttggtgcaag tgctggtatc gcaattatct ccggtaccca ggatacgcaa 660 tcaacctatt aa 672 <210> 8 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > C2-8G (L48Q, Q113R) <400> 8 atgacgagca atcaactggc gcaatacatc gaccatacgg cactgacggc tgaaaagaac 60 gaacaagaca tctccacgct gtgtaacgaa gccattgaac atggctttta tagcgtgtgc 120 attaactctg catacatccc gcaggctaaa gaaaagctgg cgggtagcaa cgtcaaaatt 180 tgtacggtgg ttggctttcc gctgggtgct aatctgacgt cggttaaagc gttcgaaacc 240 caggaaagca tcaaggcggg cgccaacgaa attgatatgg tcatcaatgt gggatggatc 300 aagagtcaaa agtgggatga agttaagcag gacatccgag cggtcttcaa cgcctgcaat 360 ggcaccccgc tgaaagtgat tctggaaacg tgtctgctga ccaaagacga aatcgttaag 420 gcctgcgaaa tttgtaaaga aatcggcgtt gcatttgtca aaacctctac gggtttcaat 480 aagggcggtg ccacggtgga agatgttgca ctgatgaaaa acaccgtcgg caatattggt 540 gtgaaggctt ccggcggtgt tcgtgacacc gaaacggcac tggctatgat caaagcaggt 600 gcaacccgta ttggtgcaag tgctggtatc gcaattatct ccggtaccca ggatacgcaa 660 tcaacctatt aa 672 <210> 9 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > C3-2A (L48Q, I112F, Q113R) <400> 9 atgacgagca atcaactggc gcaatacatc gaccatacgg cactgacggc tgaaaagaac 60 gaacaagaca tctccacgct gtgtaacgaa gccattgaac atggctttta tagcgtgtgc 120 attaactctg catacatccc gcaggctaaa gaaaagctgg cgggtagcaa cgtcaaaatt 180 tgtacggtgg ttggctttcc gctgggtgct aatctgacgt cggttaaagc gttcgaaacc 240 caggaaagca tcaaggcggg cgccaacgaa attgatatgg tcatcaatgt gggatggatc 300 aagagtcaaa agtgggatga agttaagcag gacttccgag cggtcttcaa cgcctgcaat 360 ggcaccccgc tgaaagtgat tctggaaacg tgtctgctga ccaaagacga aatcgttaag 420 gcctgcgaaa tttgtaaaga aatcggcgtt gcatttgtca aaacctctac gggtttcaat 480 aagggcggtg ccacggtgga agatgttgca ctgatgaaaa acaccgtcgg caatattggt 540 gtgaaggctt ccggcggtgt tcgtgacacc gaaacggcac tggctatgat caaagcaggt 600 gcaacccgta ttggtgcaag tgctggtatc gcaattatct ccggtaccca ggatacgcaa 660 tcaacctatt aa 672 <210> 10 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > C3-10D (L48Q, Q113R, I179T) <400> 10 atgacgagca atcaactggc gcaatacatc gaccatacgg cactgacggc tgaaaagaac 60 gaacaagaca tctccacgct gtgtaacgaa gccattgaac atggctttta tagcgtgtgc 120 attaactctg catacatccc gcaggctaaa gaaaagctgg cgggtagcaa cgtcaaaatt 180 tgtacggtgg ttggctttcc gctgggtgct aatctgacgt cggttaaagc gttcgaaacc 240 caggaaagca tcaaggcggg cgccaacgaa attgatatgg tcatcaatgt gggatggatc 300 aagagtcaaa agtgggatga agttaagcag gacatccgag cggtcttcaa cgcctgcaat 360 ggcaccccgc tgaaagtgat tctggaaacg tgtctgctga ccaaagacga aatcgttaag 420 gcctgcgaaa tttgtaaaga aatcggcgtt gcatttgtca aaacctctac gggtttcaat 480 aagggcggtg ccacggtgga agatgttgca ctgatgaaaa acaccgtcgg caatactggt 540 gtgaaggctt ccggcggtgt tcgtgacacc gaaacggcac tggctatgat caaagcaggt 600 gcaacccgta ttggtgcaag tgctggtatc gcaattatct ccggtaccca ggatacgcaa 660 tcaacctatt aa 672 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HINdeoC-F (EcoRI), <400> 11 cgtggattcc atgacgagca a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HINdeoC-R <400> 12 cgcggatcct taataggttg at 22 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HINL48Q-F <400> 13 cccgcaggct aaagaaa 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HINL48Q-R <400> 14 tagcctgcgg gatgtat 17 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIND136Y-F <400> 15 ccaaatacga aatcgttaag 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIND136Y-R <400> 16 tttcgtattt ggtcagcag 19

Claims (9)

서열번호 1의 아미노산 서열에서 113번째 글루타민(Glutamine)이 알기닌(Arginine)으로 치환된 Q113R 변이를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체.
A 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant comprising a Q113R mutation in which the 113th glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
제1항에 있어서, D136Y, L48Q, I112F 및 I179T 변이를 추가로 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체.
The 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant according to claim 1, further comprising a D136Y, L48Q, I112F and I179T mutation.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 1 ~ 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체.
The 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant according to claim 1 or 2, which has an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 5.
제1항의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 코딩하는 유전자.
A gene encoding the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant of claim 1.
제4항에 있어서, 서열번호 6 ~ 10 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
The gene according to claim 4, which is represented by the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 6 to 10.
제4항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
A recombinant vector containing the gene of claim 4.
제4항의 유전자 또는 제6항의 재조합 벡터가 숙주미생물에 도입되어 있는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체 생산능을 가지는 재조합 미생물.
A recombinant microorganism having the ability to produce a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant in which the gene of claim 4 or the recombinant vector of claim 6 is introduced into a host microorganism.
다음 단계를 포함하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체의 제조방법:
(a) 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 생성하는 단계; 및
(b) 생성된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체를 회수하는 단계.
A method for producing a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant comprising the steps of:
(a) culturing the recombinant microorganism of claim 7 to produce a 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant; And
(b) recovering the resulting 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant.
다음 단계를 포함하는 락톨(lactol)의 제조방법:
(a) 제1항 또는 제2항의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체 또는 상기 변이체가 발현되어 있는 미생물을 이용하여 아세트알데하이드 유도체를 축합시켜 락톨을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 락톨을 회수하는 단계.A process for preparing lactol comprising the steps of:
(a) condensing an acetaldehyde derivative using the 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase mutant of claim 1 or 2 or a microorganism expressing the mutant to produce lactol; And
(b) recovering the produced lactol.
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