KR20160001789A - The manufacture method of osteogenic enhancing membrane and osteogenic enhancing membrane using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 골조직 형성 촉진용 차폐막의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 차폐막에 관한 것으로서, 특히 뛰어난 항균성, 우수한 골조직 형성 촉진효과를 갖는 차폐막의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 골조직 형성 촉진용 차폐막에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a shielding film for promoting bone formation and a shielding film produced using the method, and more particularly, to a method for producing a shielding film having excellent antimicrobial activity and an effect of promoting formation of an excellent bone structure and a shielding film for promoting bone formation will be.
차폐막은 골이식재는 아니지만 골결손부의 치유 단계에서 조기에 증식하는 섬유아세포나 상피세포의 침투를 막아서 결손부가 연조직으로 재생되는 것을 막고 뼈로 재생되는 것을 도와주는 보조 재료이다. The shielding membrane is not a bone graft material but it is an auxiliary material to prevent the early penetration of fibroblasts or epithelial cells that proliferate in the healing step of bone defects, thereby preventing the defective part from regenerating into soft tissues and regenerating into bone.
이러한 차폐막에 사용될 수 있는 재료는 이종 동물에서 기원한 교원섬유(콜라겐) 소재나 합성 수지 소재의 제품들이 개발되어 있다. The material that can be used for this shielding film is a collagen material or a synthetic resin material originating from a different animal.
현재 가장 널리 사용되는 차폐막의 소재는 교원 섬유 소재로서 가격은 비싸지만 생체 내에서 분해되어 사라지므로 제거를 위한 2차 수술을 요하지 않는 것이 가장 큰 장점이다. 다른 천연물 소재의 차폐막으로는 키토산 소재의 차폐막이나 곤충 기원 단백질 소재로 실크 기원의 차폐막이 개발되어 왔다. Currently, the most widely used shielding material is collagen fiber material, but its cost is high, but the most important advantage is that it does not require a second operation for removal since it is decomposed and disappears in vivo. Shielding films of chitosan material and insect origin protein materials have been developed as shielding films for other natural materials.
하지만 이러한 소재의 차폐막들은 상주균이 다양하고 많은 구강 내에서 사용됨에도 불구하고 항균성을 가지고 있지 않다. However, shielding membranes of these materials do not have antimicrobial properties in spite of being used in many oral cavity.
특히 치아의 경우 치아를 발치하는 가장 많은 이유 중에 하나가 감염과 관련된 합병증이라는 사실을 감안하면 차폐막들이 가지고 있지 못한 항균성은 차폐막의 적용에 심각한 장애요인이라 할 수 있다. Considering that one of the most common reasons for tooth extraction is complication related to infection, the antimicrobial properties of shields are a serious obstacle to the application of shields.
그리고 기존의 차폐막이 가지고 있는 특징은 세포의 이동 차단이 가장 중요한데 이는 적절한 생분해 속도와 알맞은 크기의 기공으로 획득될 수 있는 성질이다. And the characteristic of the existing shielding membranes is that the blocking of the cell movement is most important because it is a property that can be obtained with the appropriate biodegradation rate and a suitable size of pores.
만약에 세포의 이동 차폐와 더불어 조골세포의 활성을 일으킬 수 있는 성분이 차폐막에 포함될 수 있다면 기존의 차폐막에 비하여 훨씬 빠른 속도로 많은 양의 골 형성을 획득할 수 있으리라 사료된다.If the shielding membrane could contain a component capable of activating osteoblast cells in addition to the cell movement shielding, it would be possible to obtain a large amount of bone formation at a much faster rate than the conventional shielding membrane.
관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-0762928호(등록일: 2007년 09월 21일, 명칭: 견 피브로인 나노섬유로 이루어진 부직포 형태의 골조직유도 재생용 차폐막 및 그 제조방법)과 대한민국등록특허 제10-1183961호(등록일: 2012년 09월 12일, 명칭: 실크 피브로인을 이용한 치주 골조직유도 재생용 차폐막 및 그 제조방법)이 있다.
Related prior art is Korean Patent No. 10-0762928 (filed on September 21, 2007, entitled: Shielding film for induction and regeneration of bone tissue in nonwoven fabric made of silk fibroin nanofiber and its manufacturing method) and Korean Patent No. 10 -1183961 (registered on September 12, 2012, titled: shielding film for regenerating periodontal bone tissue using silk fibroin and its manufacturing method).
본 발명의 목적은 항균효과를 갖으면서 우수한 골조직 형성 촉진효과를 갖는 차폐막의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 차폐막을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method of manufacturing a shielding film having an antimicrobial effect and promoting an excellent bone formation, and a shielding film manufactured using the method.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not intended to limit the invention to the particular embodiments that are described. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not restrictive of the invention, There will be.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물의 제조방법은 누에고치로부터 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 얻는 제1단계, 상기 실크 피브로인에 염 에탄올 수용액을 넣고 혼합하여 상기 실크 피브로인을 용해시켜 용해물을 제조하는 제2단계, 상기 용해물에 함유된 염과 에탄올을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 제조하는 제3단계 및, 상기 실크 피브로인 수용액에 차폐막 조성물 전체 중량대비 5중량%~10중량%의 테트라사이클린을 함유하도록 넣고 혼합하여 차폐막 조성물을 제조하는 제4단계를 포함하는 것이 특징이며, 바람직하게는 상기 제4단계에서의 테트라사이클린은 차폐막 조성물 전체 중량대비 5중량%인 것이 특징이다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for preparing a shielding film composition for promoting bone formation, comprising the steps of: removing sericin from a silkworm cocoons to obtain silk fibroin; adding a salt aqueous ethanol solution to the silk fibroin to dissolve the silk fibroin A third step of preparing an aqueous solution of silk fibroin by removing salt and ethanol contained in the melt, and a third step of preparing an aqueous solution of silk fibroin by adding 5% by weight to 10% by weight, based on the total weight of the shielding film composition, Of tetracycline, and mixing the mixture to prepare a shielding film composition. Preferably, the tetracycline in the fourth step is 5 wt% based on the total weight of the shielding film composition.
상기 제2단계에서 상기 용해물은 상기 염 에탄올 수용액에 상기 염 에탄올 수용액 중량대비 상기 실크 피브로인 1~10중량%를 넣고 혼합하여 제조되는 것이 특징이다.In the second step, the melt is prepared by adding 1 to 10% by weight of the silk fibroin to the salt aqueous ethanol solution, based on the weight of the aqueous ethanol solution.
상기 제2단계에서 염은 브롬화리튬염, 염화리튬, 염화아연, 염화칼슘, 질산아연, 질산칼슘 중 어느 하나인 것이 특징이다.In the second step, the salt is any one of a lithium bromide salt, lithium chloride, zinc chloride, calcium chloride, zinc nitrate, and calcium nitrate.
본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물은 상기 본 발명의 차폐막 조성물의 제조방법을 통해 제조되어, 테트라사이클린은 조성물 총 중량을 기준으로 5중량%~10중량%과 실크 피브로인을 포함하는 것을 특징으로, 바람직하게는 차폐막 조성물 총 중량을 기준으로 5중량%의 테트라사이클린과 실크 피브로인을 포함하는 것이 특징이다.The shielding membrane composition for promoting bone formation of the present invention is prepared through the above-described method for producing a shielding film composition of the present invention, wherein the tetracycline comprises 5 wt% to 10 wt% of silk fibroin based on the total weight of the composition, And preferably 5% by weight, based on the total weight of the shielding film composition, of tetracycline and silk fibroin.
또한, 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막은 상기 실크 피브로인 차폐막 조성물을 성형하여 제조되어, 테트라사이클린 5중량%~10중량%과 나머지 실크 피브로인으로 이루어지는 것을 특징으로, 바람직하게는 5중량%의 테트라사이클린과 나머지 실크 피브로인으로 이루어지는 것이 특징이다.In addition, the shielding film for promoting bone formation of the present invention is prepared by molding the silk fibroin shielding film composition, and is composed of 5% by weight to 10% by weight of tetracycline and the rest of silk fibroin, preferably 5% by weight of tetracycline And the remaining silk fibroin.
또한, 상기 골조직 형성 촉진용 차폐막은 실크 피브로인 단독 차폐막의 골조직 형성능 대비 더 촉진된 골조직 형성능을 나타내며, 대장균 또는 화농균에 대하여 항균효과를 나타내는 것이 특징이다.
In addition, the shielding film for promoting bone formation is characterized in that the silk fibroin alone shielding film exhibits enhanced bone tissue-forming ability as compared to the bone-forming ability, and exhibits an antibacterial effect against Escherichia coli or avian bacteria.
본 발명에 의해, 뛰어난 항균활성을 통해 체내에 안정된 형태로 존재할 수 있으면서 동시에 약리활성을 부여하여 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진함으로 인해 최종적으로 골조직 형성을 극대화시킬 수 있는 골조직 형성 촉진용 차폐막의 제조방법이 제공된다.According to the present invention, it is possible to exist in a stable form in the body through excellent antimicrobial activity, and at the same time to impart pharmacological activity, thereby promoting cell migration, proliferation and differentiation related to regeneration, thereby promoting formation of bone tissue which can ultimately maximize bone formation There is provided a method of manufacturing a shielding film for a display device.
또한, 차폐막 적용부위에 잘 달라 붙는 특성이 있으면서 시술시 용이하게 사용하도록 고안되어 있어 약효의 지속화가 가능함으로써 골조직 형성 촉진효과를 갖는 차폐막이 제공된다.
The shielding film has a characteristic of sticking well to the shielding film application site, and is designed to be easily used in the procedure, so that the shielding film having the effect of promoting the formation of bone tissue can be provided.
도 1은 본 발명의 차폐막의 고체 상태의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 차폐막 조성물이 농도별로 항균활성을 나타낸 도면이다.
도 3은 골 결손부에서 8주 경과시 신생골 형성정도를 나타낸 도면이다.
도 4는 골 결손부 신생골의 단층 촬영 도면이다.
A: 무처리 4주
B: 실크 피브로인 단독처리 4주
C: 본 발명의 차폐막처리 4주
D: 무처리 8주
E: 실크 피브로인 단독처리 8주
F: 본 발명의 차폐막처리 8주
도 5는 골 결손부 신생골의 조직 소견을 나타낸 도면이다.
A: 무처리 4주
B: 실크 피브로인 단독처리 4주
C: 본 발명의 차폐막처리 4주
D: 무처리 8주
E: 실크 피브로인 단독처리 8주
F: 본 발명의 차폐막처리 8주
도 6은 본 발명의 차폐막에서 테트라사이클린 함량별 골 형성 정도를 나타낸 도면이다.
A: 실크 피브로인 단독처리
B: 1%의 테트라사이클린 함유 실크 피브로인막 처리
C: 5% 테트라사이클린 함유 실크 피브로인막 처리
D: 10% 테트라사이클린 함유 실크 피브로인막 처리BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a view showing a solid state structure of a shielding film of the present invention. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the antibacterial activity of the shielding film composition according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the degree of new bone formation at the time of 8 weeks in the bone defect portion.
4 is a tomographic view of a new bone of a bone defect part.
A: No
B: Silk Fibroin
C: shielding film treatment of the
D: No
E: Silk Fibroin alone 8 weeks
F: shielding film treatment of the
5 is a view showing the histological features of the new bone of the bone defect part.
A: No
B: Silk Fibroin
C: shielding film treatment of the
D: No
E: Silk Fibroin alone 8 weeks
F: shielding film treatment of the
6 is a graph showing the degree of bone formation by tetracycline content in the shielding film of the present invention.
A: Silk Fibroin alone processing
B: 1% tetracycline containing silk fibroin film treatment
C: Silk fibroin film treatment with 5% tetracycline
D: Silk fibroin film treatment containing 10% tetracycline
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.The terms, techniques, and the like described in this specification are used in the meaning commonly used in the technical field to which the present invention belongs, unless otherwise specified.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들은 종래 차폐막의 문제점을 보완하며, 실크 피브로인 단독사용에 비하여 골조직 형성 촉진 효과가 더 우수함과 동시에 대장균 또는 화농균에 대하여 우수한 항균활성을 나타내는 차폐막을 알아낸 것이다.The inventors of the present invention have solved the problems of the conventional shielding film and found out a shielding film showing superior antimicrobial activity against Escherichia coli or Escherichia coli, while improving the effect of promoting the formation of bone tissue as compared with the use of silk fibroin alone.
여기서 사용되는 용어 '차폐막'은 다양한 질환에 의해 골조직의 결손부가 생긴 경우, 골 조직의 재생기간 동안 주변 연조직 세포가 골 결손부로 이동하여 들어오는 것을 차단하여 골 형성을 위한 공간을 유지하는 목적으로 사용하는 재료를 의미한다.
As used herein, the term 'shielding membrane' is used for the purpose of maintaining a space for bone formation by blocking the migration of soft tissue cells to the bone defect during the regeneration period of the bone tissue when a defect of bone tissue is formed by various diseases Material.
본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The method for manufacturing a shielding film for promoting bone formation of the present invention will be described in detail as follows.
1. 제1단계: 실크 피브로인을 얻는 단계1. Stage 1: Steps to obtain silk fibroin
누에고치로부터 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 얻는다.Sericin is removed from cocoon to obtain silk fibroin.
상기 실크 피브로인은 누에고치로부터 뽑아낸 천연 실크 피브로인로부터 유래된 것으로써, 상기 실크 피브로인은 자연계에 존재하는 수많은 종류의 단백질 중에서 가장 순도(97% 이상)가 높은 단백질인 것으로, 두 가닥의 실크 피브로인이 75%로 함유되어 있으며, 나머지는 세리신으로 이루어져 있다.The silk fibroin is derived from natural silk fibroin extracted from cocoon. The silk fibroin is a protein having the highest purity (97% or more) among many kinds of proteins present in the natural world. Two silk fibroin 75%, and the rest is composed of sericin.
이에, 본 발명에서는 실크 피브로인을 정련공정(세리신을 제거하는 공정으로써 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지된 기술임)을 거쳐 세리신을 제거하고 얻은 실크 피브로인을 주요 소재로 사용한다. Accordingly, in the present invention, silk fibroin obtained by removing sericin through a refining process (a process well known to those skilled in the art as a process for removing sericin) is used as a main material.
즉, 상기 실크 피브로인에는 18종의 아미노산으로 구성되어 있으나, 양모섬유의 케라틴 단백질과는 달리 글리신과 알라닌의 함량이 매우 높다. 글리신과 알라닌은 인체 피부를 구성하고 있는 주요 단백질인 콜라겐 단백질에 가장 많이 함유하고 있는 아미노산 성분 중의 하나이다.That is, although the silk fibroin is composed of 18 amino acids, glycine and alanine are very high, unlike keratin proteins of wool fibers. Glycine and alanine are one of the amino acid components that are most abundant in collagen protein, the main protein that constitutes human skin.
이처럼 사람의 피부와 유사한 아미노산 구조를 갖는 실크 피브로인 단백질은 생체적합성이 우수하고 염증 반응이 없는 효과를 나타내며, 생체 조직과의 생분해성, 투과성 등 골조직의 결손부위의 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화능도 나타내어 골조직을 형성하는 차폐막으로서의 요구 조건을 만족한다.
As described above, the silk fibroin protein having an amino acid structure similar to that of human skin has excellent biocompatibility and exhibits no inflammation reaction, and is useful for the transplantation, proliferation, and proliferation of cells involved in the regeneration of bone defect sites such as biodegradability, permeability, It also satisfies the requirement as a shielding film which shows the differentiation ability and forms the bone tissue.
2. 제2단계: 용해물을 제조하는 단계2. Step 2: The step of preparing the melt
상기 실크 피브로인에 염 에탄올 수용액을 넣고 혼합하여 상기 실크 피브로인을 용해시켜 용해물을 제조한다.An aqueous ethanol solution of salt is added to the silk fibroin and mixed to dissolve the silk fibroin to prepare a melt.
상기 실크 피브로인은 물에 불용성이다. 이에, 이를 용해시키기 위해서는 염이 포함된 염 에탄올 수용액을 사용한다. The silk fibroin is insoluble in water. To dissolve it, a salt aqueous ethanol solution containing a salt is used.
예를 들면, 브롬화리튬염, 염화리튬, 염화아연, 염화칼슘, 질산아연, 질산칼슘 등과 같은 중성염을 함유하는 에탄올 수용액에 상기 실크 피브로인을 넣고 용해시킨다. For example, the silk fibroin is dissolved in an aqueous ethanol solution containing a neutral salt such as a lithium salt of a bromide, lithium chloride, zinc chloride, calcium chloride, zinc nitrate, calcium nitrate and the like.
이때, 상기 실크 피브로인은 상기 염 에탄올 수용액 중량대비 1~10중량%를 넣고 용해시키는 것이 바람직하다. 이는 상대적으로 상기 실크 피브로인의 함량의 범위가 상기 중량%보다 적은 경우 상대적으로 용해물에 용해되어 잔존하는 실크 피브로인의 함량이 적어 목적하는 골조직 형성능을 나타내기 위해서는 많은 양의 용해물이 필요하게 되며, 상기 중량%를 초과할 경우에는 상기 실크 피브로인의 용해율이 떨어지게 되어 용해되지 않고 남는 실크 피브로인이 발생되어 목적하는 골조직 형성능을 제대로 나타내기 어려워 차폐막으로 사용하기 부적합한 상태가 되기 때문이다.
Preferably, the silk fibroin is dissolved by adding 1 to 10% by weight based on the weight of the aqueous solution of the salt ethanol. This is because when the content of the silk fibroin is less than the above-mentioned range, the amount of silk fibroin remaining in the melt is relatively low, so that a large amount of melt is required to exhibit the desired bone- If the weight% is exceeded, the dissolution rate of the silk fibroin drops, so that silk fibroin that is not dissolved is generated, so that it is difficult to exhibit the desired bone tissue forming ability properly, and thus it becomes unsuitable for use as a shielding film.
3. 제3단계: 실크 피브로인 수용액을 제조하는 단계3. Step 3: Step of preparing aqueous solution of silk fibroin
상기 용해물에 함유된 염과 에탄올을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 제조한다.The salt contained in the melt and ethanol are removed to prepare a silk fibroin aqueous solution.
다시 말해, 세포에 독성이 없으며, 인체에 유해하지 않는 차폐막을 형성하기 위해 염과 에탄올을 제거한 실크 피브로인 수용액을 제조한다. 예를 들어 상기 용해물을 투석막에 넣고 4일정도 증류수에 투석하여 염과 에탄올을 완전히 제거한 실크 피브로인 수용액을 제조한다.
In other words, an aqueous solution of silk fibroin is prepared by removing salts and ethanol to form a shielding film that is not toxic to cells and is not harmful to human body. For example, the lysate is put into a dialysis membrane and dialyzed against distilled water four times to prepare a silk fibroin aqueous solution in which salts and ethanol are completely removed.
4. 제4단계: 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물을 제조하는 단계4. Step 4: Preparation of a shielding film composition for promoting bone formation
상기 실크 피브로인 수용액에 차폐막 조성물 전체 중량대비 5중량%~10중량%의 테트라사이클린을 함유하도록 넣고 혼합하여 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물을 제조한다.The silk fibroin aqueous solution is mixed with 5% by weight to 10% by weight of tetracycline based on the total weight of the shielding film composition and mixed to prepare a shielding film composition for promoting bone formation of the present invention.
상기 테트라사이클린(tetracycline)은 방선균의 일종인 스트렙토마이세스 비리디페이션스(Streptomyces viridifaciens)에 의해 생산되는 항생제로서 병원성 세균의 성장을 억제하는 물질로서 인체에 무해한 물질로 알려져 있다.The tetracycline is an antibiotic produced by Streptomyces viridifaciens , a kind of actinomycetes, and is known as a substance which inhibits the growth of pathogenic bacteria and is harmless to the human body.
이러한 상기 테트라사이클린은 본 발명의 효능을 갖기 위해서는 차폐막 조성물 전체 중량대비 5중량%~10중량%을 함유하며, 더욱 바람직하게는 5중량%로 함유되는 것이 좋다.The tetracycline preferably contains 5% by weight to 10% by weight, more preferably 5% by weight, based on the total weight of the shielding film composition to have the effect of the present invention.
이는, 상기 테트라사이클린의 중량이 5중량% 미만일 때는 항균 효과를 기대하기가 어려워 감염과 관련된 합병증을 일으킬 우려가 여전히 남아 있게 되며 동시에 실크피브로인 단독 사용효과와 대비해 볼때 골조직 형성효과가 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 정도의 상승된 골조직 형성효과를 나타내지 않으며, 10 중량% 초과일 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약함과 동시에 제형상의 안정성이 확보되지 않아 차폐막으로 성형시 차폐막의 형태적 안정성이 유지되지 않으며 밀착력 또한 현저히 저하되는 문제점이 있기 때문이다.
When the weight of the tetracycline is less than 5% by weight, it is difficult to expect an antimicrobial effect. Therefore, there is still a risk of causing complications related to infection. In contrast, when the tetracycline is used alone, If the content is more than 10% by weight, the increase of the effect is not so significant and the stability of the shape is not secured. Therefore, the shape of the shielding film The stability is not maintained and adhesion is significantly lowered.
이와 같이 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물은 상기와 같은 제조과정을 통해 제조되는 것으로서, 상기 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물은 차폐막 조성물 총 중량을 기준으로 5중량%~10중량%의 테트라사이클린과 실크 피브로인을 포함하여 구성됨으로써, 실크 피브로인을 단독으로 사용한 차폐막보다 더 우수한 골조직 형성 촉진능을 나타낼 뿐만 아니라 대장균 또는 화농균에 대하여 항균효과도 갖게 된다.As described above, the shielding membrane composition for promoting bone tissue formation according to the present invention is prepared through the above-described manufacturing process, wherein the shielding membrane composition for promoting bone tissue formation comprises 5 to 10% by weight of tetracycline and silk Fibroin, it not only exhibits better bone tissue formation promoting ability than a shielding film using silk fibroin alone, but also has an antibacterial effect against Escherichia coli or avian bacteria.
또한, 상기와 같이 구성된 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물은 테트라사이클린과 실크 피브로인이 전체 구성량이 100중량%가 되도록 제조할 수 있으나, 상기 차폐막의 투명성과 물성을 해하지 않는 범위에서 생체 적합성 조직공학용 재료인 생체적용물질을 추가로 차폐막 조성물 총 중량에 대해 0중량부초과~30중량부이하로 더 첨가하여 제조할 수도 있다. 이는 30중량부를 초과하는 경우 투명성 등이 저하되는 문제가 발생할 수 있기 때문이다.In addition, the shielding film composition for promoting bone tissue formation as described above can be produced so that the total amount of tetracycline and silk fibroin is 100% by weight. However, in view of the transparency and physical properties of the shielding film, It may be prepared by further adding the applied material in an amount of 0 to 30 parts by weight based on the total weight of the shielding film composition. This is because when it exceeds 30 parts by weight, transparency and the like may be deteriorated.
본 발명에서 "투명", "투명성"이라는 용어는 완전한 투명 상태 외에도 막의 내부를 관찰할 수 있는 정도의 투명 상태를 포함하는 의미로 사용한다.In the present invention, the terms "transparent" and "transparency" are used to mean a transparent state in which the inside of the film can be observed in addition to the completely transparent state.
상기 생체적용물질로는 어떠한 생체적용물질을 첨가하여도 무방하나, 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 케라틴, 셀룰로오스, 피브로넥틴, 엘라스틴, 피브리노겐, 피브로모듈린, 라미닌, 테나신, 비트로넥틴, 알지네이트, 히알루론산, 실크 프로테인 및 그들의 유도체, 아가로스, 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{polyortho ester; POE}, 플루로닉(pluronic), 글리세린, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{polyethylene glycol diacrylate; PEG-DA} 중 어느 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하다.The biocompatible material may be any of a biocompatible material, but it may be any of a collagen, gelatin, chitin, chitosan, keratin, cellulosic, fibronectin, elastin, fibrinogen, pibromodulin, laminin, tenacin, Polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), copolymer of polylactic acid and polyglycolic acid (PLGA), polycaprolactone (polycaprolactone), polylactic acid PCL), poly {poly (ethylene oxide) terephthalate-co-butylene terephthalate} (PEOT / PBT), polyphosphoester (PPE), polyphosphazene (PPA), polyanhydride PA), polyortho ester {polyortho ester; POE}, pluronic, glycerin, poly (propylene fumarate) -diacrylate; PPF-DA} and polyethylene glycol diacrylate; PEG-DA} is preferably added.
또한, 본 발명의 차폐막의 구조 및 기능에 부정적인 영향을 미치지 않는 한에서 상기 차폐막 조성물에는 항생제, 항바이러스제, 항균제, 핵산, 펩타이드 및 단백질 중 선택된 1종 이상으로 구성된 다양한 첨가제를 부가하여 제조할 수도 있다. 여기서 항생제, 항바이러스제, 항균제 등은 시술시 차폐막의 감염을 막아주는 역할을 준다. 단백질로는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질로 이루어진 그룹 중 선택된 어느 하나임을 특징으로 한다.In addition, the shielding film composition may be prepared by adding various additives composed of at least one selected from antibiotics, antivirals, antibacterials, nucleic acids, peptides and proteins to the shielding film composition as far as the structure and function of the shielding film of the present invention do not adversely affect . Here, antibiotics, antivirals, and antimicrobial agents play a role in preventing infection of the shielding membrane during surgery. The protein is preferably selected from the group consisting of a hormone, a cytokine, an enzyme, an antibody, a growth factor, a transcription factor, a vaccine, a structural protein, a ligand protein, a receptor, a cell surface antigen and a receptor antagonist.
이러한 상기 본 발명의 차폐막 조성물은 성형과정을 거쳐 차폐막을 제조한다. 예를 들어 막의 구조로 성형하기 위해 평평한 용기에 부어 이를 건조과정을 거쳐 차폐막을 제조한다. 상기 본 발명의 차폐막은 테트라사이클린 5중량%~10중량%와 나머지 실크 피브로인으로 이루어지며, 이는 증강된 골조직 형성 촉진능을 갖으면서 대장균 또는 화농균에 대하여 항균효과를 갖게 된다.The shielding film composition of the present invention is formed through a molding process. For example, in order to form a membrane structure, the membrane is poured into a flat container and dried to prepare a shielding film. The shielding membrane of the present invention is composed of 5% to 10% by weight of tetracycline and the rest of silk fibroin, which has enhanced antimicrobial activity against Escherichia coli or avian bacteria while promoting enhanced bone tissue formation.
특히, 상기 본 발명의 차폐막은 치과용 소재로써의 활용가치가 있는 것으로써, 골 결손부의 표면에 상기 차폐막을 처리한 후, 임플란트를 시술할 경우 차폐막 적용부위에 잘 달라 붙어 시술이 용이하며 약효의 지속화가 가능하며 병원균에 대한 감염확률도 낮아 최종적으로 골조직 형성을 극대화시킬 수 있게 된다.Particularly, since the shielding film of the present invention has utility value as a dental material, when the shielding film is treated on the surface of the bone defect portion, the implants are stuck to the shielding application portion easily, It is possible to sustain and the infection probability to pathogens is low, so that ultimately the bone formation can be maximized.
여기서 용어 '임플란트(implant)'는 상실된 자연치아의 대체물 자체를 의미하거나 또는 나사 형상의 임플란트 매식체(fixture)를 치조골에 체결하여 일정 기간동안 뼈와 융합하도록 한 후 그 위에 교각치(abutment)와 인공치아인 치관(crown)등의 보철물을 고정시킴으로써 치아의 본래 기능을 회복시켜주는 치과시술을 의미하나, 본 명세서에서는 상실된 자연치아의 대체물 자체를 의미한다.
The term 'implant' refers to the replacement of a missing natural tooth, or a screw-like implant fixture is fastened to the alveolar bone to be fused with the bone for a certain period of time, and then an abutment Refers to a dental procedure for restoring the original function of a tooth by fixing a prosthesis such as an artificial tooth, a crown, etc. However, in the present specification, it means a replacement of a lost natural tooth.
하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples, but the scope of protection is not limited to the following examples and experimental examples.
<실시예 1> 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물 제조<Example 1> Preparation of shielding film composition for promoting bone formation of the present invention
시료로 누에고치를 사용하였으며 세리신을 제거하기 위하여 마리세유 비누(marseilles soap)와 탄산나트륨 용액(sodium carbonate solution)으로 100℃에서 1시간동안 정련하였다.Cocoon cocoa was used as a sample, and marlyilles soap and sodium carbonate solution were refined at 100 ° C for 1 hour to remove sericin.
정련하여 생성된 실크 피브로인 70g에 염화칼슘, 에탄올, 물 1:2:8 (몰비율)로 제작한 염화칼슘-에탄올-수용액 1ℓ를 넣고 상기 실크 피브로인을 80℃에서 20분 동안 용해한 후, 이를 투석막에 넣고 4일 동안 증류수에 투석하여 염과 에탄올을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 제조하였다.1 g of a calcium chloride-ethanol-aqueous solution prepared in a weight ratio of 1: 2: 8 (molar ratio) of calcium chloride, ethanol and water was added to 70 g of silk fibroin obtained by refining, and the silk fibroin was dissolved at 80 DEG C for 20 minutes. The solution was dialyzed against distilled water for 4 days to remove salts and ethanol to prepare a silk fibroin aqueous solution.
테트라사이클린을 에탄올로 용해하여 테트라사이클린 에탄올용액을 제조하였다.Tetracycline was dissolved in ethanol to prepare a tetracycline ethanol solution.
상기와 같이 제조된 실크 피브로인 수용액에 상기 제조된 테트라사이클린 에탄올용액을 넣고 혼합하되, 전체 중량을 기준으로 5중량%는 테트라사이클린 에탄올용액이고 나머지 실크 피브로인 수용액으로 이루어지도록 혼합하여 본 발명의 골 조직 형성 촉진용 차폐막 조성물을 제조하였다.
The tetracycline ethanol solution prepared above was added to the prepared silk fibroin aqueous solution and mixed with 5% by weight based on the total weight of tetracycline ethanol solution and the remaining silk fibroin aqueous solution to prepare the bone tissue of the present invention To thereby prepare a shielding film composition for promoting.
<실시예 2> 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막 제조Example 2 Production of shielding film for promoting bone formation of the present invention
상기 실시예 1에서 제조된 골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물을 준비하고 이를 평평한 폴리스틸렌 용기에 붓고난 뒤, 37 ℃에서 건조시켜 본 발명인 골조직 형성 촉진용 차폐막을 제조하였다.
The shielding membrane composition for promoting bone formation prepared in Example 1 was prepared, poured into a flat polystyrene container, and dried at 37 ° C. to prepare a shielding film for promoting bone formation, which is the present invention.
<실험예 1> 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막의 표면 형태 및 구조 관찰<Experimental Example 1> Observation of the surface morphology and structure of the shielding film for promoting bone formation of the present invention
일반적으로 적외선 분광분석법은 실크 피브로인의 구조 분석에 널리 이용되는 분석 방법이다. 이에 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막(실시예 2)의 구조 분석을 시행하였다.In general, infrared spectroscopy is a widely used analytical method for structural analysis of silk fibroin. Thus, the structure of the shielding film for promoting bone formation of the present invention (Example 2) was analyzed.
1) 실험방법 및 재료1) Experimental methods and materials
상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막을 대상으로 상기 차폐막의 표면 형태를 확인하기 위해 전자현미경으로 관찰하였으며, 제조된 차폐막의 결정구조를 관찰하기 위하여 적외선 분광분석을 행하였다.The shielding film for promoting bone formation of the present invention prepared in Example 2 was observed with an electron microscope in order to confirm the surface morphology of the shielding film. Infrared spectroscopy was performed to observe the crystal structure of the shielding film.
비교대상으로는 SF(실크 피브로인)과 테트라사이클린(tetracycline)을 각각 단독으로 포함된 막을 사용하였다.
As a comparative example, a film containing SF (silk fibroin) and tetracycline alone was used.
2) 시험결과2) Test result
상기 실험결과, 도시되어 있지는 않지만 SFT(본 발명의 실크 피브로인과 테트라사이클린의 혼합, 실시예 2) 차폐막은 SF(실크 피브로인 단독사용) 차폐막보다 표면이 치밀하고 매끈한 형태를 나타내었다. As a result of the above experiment, although not shown, the SFT (mixing of silk fibroin and tetracycline of the present invention, Example 2) shielding film showed a more dense and smooth surface than SF (silk fibroin sole use) shielding film.
또한, 도 1에 나타나있듯이 적외선 분광분석기를 통해서도 SFT(실시예 2)가 더 안정적인 구조로 전이됨을 확인하였다. 다시 말해, 실크 피브로인 단독사용(SF)은 1233 cm-1에서 램덤 구조에 기인한 흡수대를 보였으며, 테트라사이클린은 1515, 1455, 1398, 1256, 1229 cm-1의 파장에서 흡수대를 나타내었다. 이에 반면, SFT(실시예 2)는 β-구조에 기인한 1265 cm-1의 흡광대를 나타내어 구조적인 변화를 나타내어 보였다.Also, as shown in FIG. 1, it was confirmed that the SFT (Example 2) was transferred to a more stable structure through an infrared spectrometer. In other words, the silk fibroin single use (SF) showed absorption bands due to the random structure at 1233 cm -1 , and tetracyclines exhibited absorption bands at the wavelengths of 1515, 1455, 1398, 1256 and 1229 cm -1 . On the other hand, the SFT (Example 2) showed an absorption band of 1265 cm -1 due to the β-structure and showed a structural change.
이는 테트라사이클린에 의하여 실크 피브로인의 구조가 랜덤 구조에서 β-구조로 전이됨을 나타내는 것으로써 실크 피브로인 단독사용(SF)보다 SFT(실시예 2) 차폐막이 더안정적으로 사용가능함을 의미한다.
This indicates that the structure of silk fibroin is shifted from the random structure to the beta structure by tetracycline, which means that the SFT (Example 2) shielding film can be used more stably than silk fibroin alone (SF).
<실험예 2> 항균활성 확인<Experimental Example 2> Confirmation of antibacterial activity
1) 실험방법1) Experimental method
항균실험을 위하여 테트라사이클린의 함량이 188 ~ 9,460 ppm을 포함하고 있는 본 발명의 실시예 1의 차폐막 조성물을 농도별로 준비하여 재료로 사용하였다.For the antimicrobial test, the shielding film composition of Example 1 of the present invention containing tetracycline in an amount of 188 to 9,460 ppm was prepared for each concentration and used as a material.
항균 효과를 확인하기 위하여 대장균(E. coli), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 구입하였으며, 37oC에서 24 시간 동안 호기성 조건하의 한천배지(nutrient agar)상에서 배양하였다. 항균활성은 일정 기간 경화 후 최대 억제환(inhibition zone) 지름을 측정하여 표현하였다.
To confirm the antimicrobial effect, E. coli , Staphylococcus epidermis), a Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) were purchased from the Korea Culture Center of Microorganisms (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM ), they were cultured on a 37 o C aerobic agar (nutrient agar) under the conditions for 24 hours. The antimicrobial activity was expressed by measuring the inhibition zone diameter after curing for a certain period of time.
2) 실험결과2) Experimental results
도 2에 나타나 있듯이, 테트라사이클린의 함량과 무관하게 대장균(E. coli)의 억제환은 10 mm 정도로 거의 동일하게 나타났다. As shown in FIG. 2, regardless of the content of tetracycline, the inhibitory ring of E. coli was almost equal to 10 mm.
반면, 표피포도상구균(S. epidermis)는 188 ppm의 실크막에서는 5 mm 이하의 억제환을 나타내었으나 548 ppm 이상에서는 12 mm 정도의 억제환 지름을 보였다. On the other hand, S. epidermis showed inhibitory ring of less than 5 mm in silk membrane at 188 ppm, but inhibitory ring diameter of about 12 mm in more than 548 ppm.
가장 효과가 있는 것으로 나타난 황색포도상구균(S. aureus)에서도 표피포도상구균과 비슷한 형태의 항균활성을 나타내었다. 억제환의 지름은 188 ppm에서는 13 mm 정도로 나타났으나 548 ppm 이상에서는 18 mm의 억제환을 나타내었다. Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus ), which appeared to be the most effective, showed similar antimicrobial activity to Staphylococcus epidermidis. The diameter of the inhibition ring was 13 mm at 188 ppm, but 18 mm at inhibition above 548 ppm.
상기와 같은 효과는 테트라사이클린이 실크막으로부터 방출되어 항균효과를 나타내는 것임을 예측할 수 있다.
It can be predicted that the above-mentioned effect is that tetracycline is released from the silk film and exhibits an antibacterial effect.
<실험예 3> 신생뼈 형성 촉진 효과 확인<Experimental Example 3> Confirmation of promoting effect of new bone formation
차폐막은 골 재생 기간 동안 골 형성을 위한 공간을 유지할 수 있어야 하며, 주변 연조직 세포가 골결손부로 이동하여 들어오는 것을 차단할 수 있어야 한다. 이에 하기와 같이 신생뼈 형성 정도를 확인하였다. Shielding membranes should be able to maintain space for bone formation during bone regeneration and should be able to block the migration of surrounding soft tissue cells into bone defect sites. The degree of new bone formation was confirmed as follows.
1) 실험방법1) Experimental method
실크 차폐막에 의한 신생골 형성 효과를 확인하기 위하여 생후 10~11주의 뉴질랜드산 백색 가토(체중 2.0~2.5kg) 10마리를 실온에서 고형 사료와 물을 공급하며 일정기간 사육한 뒤 사용하였다. Ten newborn white rabbits (2.0 ~ 2.5kg body weight) of 10 ~ 11 weeks of age were fed with solid feed and water at room temperature for a certain period of time to confirm the effect of silk shielding on new bone formation.
실험에 사용한 재료는 1% TC 함유 SFM을 사용하였다. 동물실험시 전신마취를 유도하기 위해 가토 대퇴부 근육에 0.5mL의 틸레타민(Tiletamine)과 125mg/mL의 졸라제팜(Zolazepam)과 0.5 mL의 자일라진(xylazine)을 주사하였다(10mg/kg body weight).SFM containing 1% TC was used for the experiment. To induce systemic anesthesia, 0.5 mL of tiletamine, 125 mg / mL of zolazepam and 0.5 mL of xylazine were injected into the rabbit femoral muscles (10 mg / kg body weight ).
코 부위부터 수술 부위인 두정골(parietal bone) 상부까지 제모를 시행 후 포비돈요드(povidone-iodine) 용액으로 소독한 다음 지혈 및 국소 마취 목적으로 1:100,000 에피네프린이 함유된 2% 리도카인(lidocaine)을 주사하였다. From the nose area to the upper part of the parietal bone, the hair was removed and sterilized with povidone-iodine solution, followed by injection of 2% lidocaine containing 1: 100,000 epinephrine for hemostasis and local anesthesia Respectively.
두피의 정중부에 시상방향으로 절개를 시행한 후 골막하 박리를 시행하여 피부 및 골막을 거상해 두정골을 노출시켰다. After the incision was made in the midline of the scalp in the direction of the thalamus, the subepithelial flap was removed to expose the skin and the periosteum.
토끼 두개골 정중봉합부에 대칭이 되도록 두정골 상에 trephine bur를 이용하여 좌, 우측에 각각 직경 8 mm, 깊이 2 mm의 골결손부를 형성하였다. Bone defects of 8 mm in diameter and 2 mm in depth were formed on the left and right sides, respectively, using a trephine bur on the pelvic bone to be symmetrical to the rabbit skull medial suture.
실험군인 우측 골결손부에는 실시에 2의 차폐막을 적용하였고, 대조군인 좌측 골결손부에는 특별한 처치를 시행하지 않았다. In the experimental group, the shield of the right side was applied to the right side of the defect and the left side of the bone defect was not treated.
골막과 근육 및 피부를 3-0 블랙실크(black silk)로 봉합하였다. 동물의 수술 감염을 방지하기 위하여 젠타마이신(gentamycin) 1mg/kg을 1일 3회 3일간 근육주사 하였다.The periosteum, muscle and skin were sutured with 3-0 black silk. Gentamycin (1 mg / kg) was injected intramuscularly three times a day for three days to prevent surgical infection of the animals.
수술 4주 후, 5마리의 토끼를 희생시킨 후, trephine bur를 이용해 실험군과 대조군을 포함한 두개골 부위 표본을 채취하였다. 표본은 10% 중성 포르말린(formalin) 용액에 담가 보관하였다. Four weeks after the operation, 5 rabbits were sacrificed and a specimen of the skull, including the experimental group and the control group, was taken using a trephine bur. Specimens were immersed in 10% formalin solution.
수술 8주 후 나머지 5마리의 토끼에 대하여 4주 후와 같은 과정을 시행하였다. 수술 후 4주 및 8주에 가토를 희생시킨 후, 채취한 표본을 μ-CT 장비를 이용하여 0.05 mm 두께 절편으로 단층 촬영을 시행하였다. After 8 weeks of operation, the remaining 5 rabbits underwent the
촬영된 이미지는 MicroView software를 사용해 삼차원적으로 재구성되었다.The photographed images were reconstructed three-dimensionally using MicroView software.
골결손부가 지름 8 mm, 깊이 약 2 mm의 원통형이므로 관심영역(ROI, region of interest)은 결손부의 크기와 형태에 맞게 설정이 되었다. Since the bone defect is cylindrical with a diameter of 8 mm and a depth of about 2 mm, the region of interest (ROI) is set to match the size and shape of the defect.
각 표본에서 관심영역 내의 신생골 부피(bone volume)를 컴퓨터 소프트웨어를 이용해 조사하였다.
The bone volume in the area of interest in each sample was examined using computer software.
3) 실험결과3) Experimental results
도 3에 나타나 있듯이, 수술 후 8주가 경과된 상태에서 차폐막을 설치하지 않은 대조군(control) 또는 실크 피브로인만(silk) 단독으로 포함된 차폐막에 비하여 1% TC 함유 SFM(실크피브로인+1%테트라사이클린이 함유된 차폐막)에서 더 높은 신생골 형성 촉진 효과를 나타냄을 관찰할 수 있었다. As shown in FIG. 3, SFM containing 1% TC (silk fibroin plus 1% tetracycline) was added to the shielding film containing no silk fibroin alone or silk fibroin silk, ) Showed a higher effect on promoting new bone formation.
또한, 도 4에 나타나 있듯이, μ-CT를 이용해 실험군과 대조군의 신생골 부피(bone volume)를 비교한 결과, 수술 4주 후 신생골 부피는 1% TC 함유 SFM(실크피브로인+1%테트라사이클린이 함유된 차폐막, 도 4C) 처리군에서 10.615.31 mm3, 차폐막을 설치하지 않은 대조군(도 4A)에서 8.245.07 mm3으로 측정되었으며, 수술 8주 후에는 신생골 부피가 1% TC 함유 SFM(실크피브로인+1%테트라사이클린이 함유된 차폐막, 도 4F)에서 22.918.81 mm3, 차폐막을 설치하지 않은 대조군(도 4D)에서 17.909.81 mm3으로 1% TC 함유 SFM(실크피브로인+1%테트라사이클린이 함유된 차폐막)에서 차폐막을 설치하지 않은 대조군에 비해 유의하게 높은 신생골 형성을 보여주었다. As shown in FIG. 4, the bone volume of the experimental group and the control group was compared using μ-CT. As a result, the new bone volume after 4 weeks of operation was found to be 1% TC-containing SFM (silk fibroin + 1% tetracycline a shielding film, and FIG. 4C) was measured in mm 3 in 8.245.07 10.615.31 mm 3, the control group (FIG. 4A) did not install the shielding film in the treated group, 8 weeks after surgery, the new bone volume containing 1% TC SFM (silk fibroin + 1% of the tetra-cyclin-containing shielding film, and FIG. 4F) 22.918.81 mm 3, in the control group (Fig. 4D) is not installed in the shielding film 3 17.909.81 mm TC containing 1% SFM (+ 1% silk fibroin in tetra Cyclin-containing shielding membrane) showed significantly higher new bone formation than the control group without shielding membrane.
따라서, 상기 결과를 토대로 본 발명의 차폐막(실시예 2)을 적용하더라도 골 재생기간 동안 공간유지 및 연조직 침투 방지 기능을 적절히 수행할 수 있음을 예측할 수 있다.
Therefore, it can be predicted that even if the shielding film of the present invention (Example 2) is applied based on the above results, the space maintenance and soft tissue penetration prevention function can be appropriately performed during the bone regeneration period.
<실험예 4> 골 결손부 신생골의 조직 소견 확인<Experimental Example 4> Histopathological examination of new bone of bone defect
1) 실험방법1) Experimental method
골 결손부에 형성된 신생골의 조직 표본을 수술 후 4주와 8주에 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정한 후, 5% 질산(nitric acid)를 이용하여 2주간 탈회를 시행하였다. 다음으로 에틸알콜(ethyl alcohol) 및 자일렌(xylene)을 이용하여 탈수 및 투명과정을 시행한 후, 파라핀을 이용하여 시편을 포매 하였다. The tissue specimens of new bone formed in bone defect were collected at 4 and 8 weeks postoperatively, fixed in 10% neutral formalin, and demineralized with 5% nitric acid for 2 weeks. Next, dehydration and transparency were carried out using ethyl alcohol and xylene, and the specimens were embedded in paraffin.
제작된 파라핀 블록을 4 두께로 세절한 후 Massons trichrome 염색을 시행하였다. 광학현미경을 이용하여 조직학적 소견을 관찰하였고, 디지털 현미경 카메라를 이용하여 현미경 상의 이미지를 촬영하였다.
The fabricated paraffin block was cut into four thicknesses and stained with Massons trichrome. Histologic findings were observed using an optical microscope and microscopic images were taken using a digital microscope camera.
3) 실험결과3) Experimental results
도 5에 나타나 있듯이, 수술 8주후 조직 소견에서 대조군(차폐막을 처리하지 않은 군, 도 5D)에서는 결체 조직, 근육 등이 골 결손부에 위치해 있는 것이 확인되는 반면, 1% TC 함유 SFM(실크피브로인+1%테트라사이클린이 함유된 차폐막, 도 5F)은 대조군(차폐막을 처리하지 않은 군, 도 5D) 및 실크 피브로인 단독처리군(도 5E)보다 좀 더 많은 신생골이 형성되며, 더 많은 연조직 세포들이 골 결손부 쪽으로 증식해 들어와 있는 것이 확인되었다.As shown in FIG. 5, in the histological findings after 8 weeks of operation, it was found that the connective tissues and muscles were located in the bone defect in the control group (the group not treated with the shielding film, FIG. 5D), whereas the SFM containing 1% TC 5F) showed more new bone formation than the control (no shielding film treated group, FIG. 5D) and silk fibroin treated group (FIG. 5E), and more soft tissue cells It has been confirmed that it has propagated toward the bone defect site.
다시말해, 대조군에서는 차폐막을 적용하지 않았기 때문에 골막이 직접 골결손부를 덮게 되는데, 골형성 잠재력이 있는 많은 세포들이 골막에 존재하며, 골막을 통한 혈액 공급이 추가된다는 점에서 대조군이 골 형성에 유리한 조건을 가지고 있다고 생각이 되지만, 골막이나 골막 주변에 존재하는 연조직 세포가 골결손부로 이동해 들어오는 것은 막지 못하기 때문에 실크피브로인+테트라사이클린이 함유된 차폐막보다 더 적은 골형성을 보인 것으로 사료된다. In contrast, in the control group, because of the absence of shielding, the periosteum directly covers the bone defect. Many cells with the potential for osteogenesis are present in the periosteum and the blood supply through the periosteum is added. However, it is considered that the soft tissue cells surrounding the periosteum or periosteum are less likely to migrate to the bone defect and thus have less bone formation than the shielding film containing silk fibroin + tetracycline.
또한, 도시되어 있지는 않지만, 본 발명의 차폐막의 경우에는 구강 내에 존재하는 세균의 감염을 방지하는 효과도 있다. 다시 말해, 골유도재생술 시행 후 차폐막이 구강 내로 노출되면서 세균에 의한 감염으로 충분한 골 재생을 얻지 못하는 것은 임상에서 흔히 접하는 문제이다. 이에, 본 발명의 차폐막을 골 결손부에 적용할 시, 본 발명의 차폐막이 물리적으로 상피 및 결체조직 세포의 유입을 차단하는 것 이 외에도 골 밀도 증가 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
In addition, although not shown, the shielding film of the present invention also has an effect of preventing infection of bacteria existing in the oral cavity. In other words, the inability to obtain sufficient bone regeneration due to bacterial infection due to the exposure of the shielding membrane to the oral cavity after bone induction regeneration is a common problem in clinical practice. Thus, when the shielding membrane of the present invention is applied to a bone defect, the shielding membrane of the present invention physically blocks the influx of epithelial and connective tissue cells, and has an effect of increasing bone density.
<실험예 5> 테트라사이클린 함량별 골 형성 정도 확인<Experimental Example 5> Determination of degree of bone formation by tetracycline content
1. 실험방법1. Experimental Method
테트라사이클린 함유량에 따른 차폐막의 신생골 형성 효과를 확인하기 위하여, 생후 12주령의 실험쥐(Sprague Dawley rat, 체중 300mg) 20 마리를 실온에서 고형 사료와 물을 공급하며 일정기간동안 사육한 뒤 사용하였다. To observe the effect of new bone formation on the shielding membrane according to the tetracycline content, twenty adult rats (Sprague Dawley rats, body weight: 300 mg) at the age of 12 weeks were fed with solid feed and water at room temperature for a certain period of time.
실험에 사용한 재료는 테트라사이클린(전체조성 중량대비 0, 1, 5, 10 중량%) 실크막들을 사용하였다. 동물실험시 전신마취를 유도하기위해 15mg/kg의 졸레틸(Zoletil) 50과 0.2mL/kg의 룸푼(Rumpun)을 주사하였다.Silicone films of tetracycline (0, 1, 5, 10 wt% based on the total composition weight) were used for the experiment. Zoletil (15mg / kg) and Rumpun (0.2mL / kg) were injected to induce general anesthesia.
두개골 부위의 제모를 시행한 후, 포비돈요드(povidone-iodine) 용액으로 소독한 다음 지혈 및 국소 마취 목적으로 1:100,000 에피네프린이 함유된 2% 리도카인(lidocaine)을 주사하였다. The skull was epilated, then disinfected with povidone-iodine solution and then injected with 2% lidocaine containing 1: 100,000 epinephrine for hemostasis and local anesthesia.
두피의 정중부에 시상방향으로 절개를 시행한 후 골막하 박리를 시행하여 피부 및 골막을 거상해 두정골을 노출시켰다. After the incision was made in the midline of the scalp in the direction of the thalamus, the subepithelial flap was removed to expose the skin and the periosteum.
두개골 정중봉합부에 대칭이 되도록 두정골 상에 trephine bur를 이용하여 좌, 우측에 각각 직경 8 mm, 깊이 2 mm의 골결손부를 형성하였다. A bone defect of 8 mm in diameter and 2 mm in depth was formed on the left and right sides using a trephine bur on the pelvic bone to be symmetrical to the median suture of the skull.
골결손부에는 테트라사이클린(전체조성 중량대비 0, 1, 5, 10 중량%) 실크막들을 각각 적용한 후 골막과 근육 및 피부를 3-0 블랙실크(black silk)로 봉합하였다. 동물의 수술 감염을 방지하기 위하여 젠타마이신(gentamycin) 1mg/kg을 근육주사 하였다.Silicone membranes of tetracycline (0, 1, 5, and 10 wt%, respectively) were applied to the bone defects, and the periosteum, muscle and skin were sutured with 3-0 black silk. Gentamycin (1 mg / kg) was injected intramuscularly to prevent surgical infection of the animals.
수술 4주 후, 실험동물을 희생시킨 후, 10% 중성 포르말린(formalin) 용액으로 시료를 고정한 후에 조직학적 분석을 시행하였다.After 4 weeks of operation, the animals were sacrificed and the specimens were fixed with 10% formalin solution before histological analysis.
골 결손부에 형성된 신생골의 조직 표본을 수술 후 4주에 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정한 후, 5% 질산(nitric acid)를 이용하여 2주간 탈회를 시행하였다.The tissue specimens of the new bone formed in the bone defect were collected at 4 weeks postoperatively, fixed in 10% neutral formalin, and demineralized for 2 weeks using 5% nitric acid.
다음으로 에틸알콜(ethyl alcohol) 및 자일렌(xylene)을 이용하여 탈수 및 투명과정을 시행한 후, 파라핀을 이용하여 시편을 포매 하였다.Next, dehydration and transparency were carried out using ethyl alcohol and xylene, and the specimens were embedded in paraffin.
제작된 파라핀 블록을 4 두께로 세절한 후 Massons trichrome 염색을 시행하였다. 광학현미경을 이용하여 조직학적 소견을 관찰하였고, 디지털 현미경 카메라를 이용하여 현미경 상의 이미지를 촬영하였다.
The fabricated paraffin block was cut into four thicknesses and stained with Massons trichrome. Histologic findings were observed using an optical microscope and microscopic images were taken using a digital microscope camera.
2) 실험결과2) Experimental results
도 6에 나타나 있듯이, 테트라사이클린 0중량%인 차폐막(도 6A, 실크 피브로인 단독처리)을 사용한 경우에는 14.38±1.39 %, 1 중량%의 테트라사이클린이 함유된 차폐막(도 6B)의 경우에는 19.07 ± 9.58%, 5 중량%의 테트라사이클린이 함유된 차폐막(도 6C)의 경우에는 37.65 ± 13.80%, 10 중량%의 테트라사이클린이 함유된 차폐막의 경우에는 28.40 ± 7.01%의 신생 뼈가 생성됨을 확인하였다. 특히 테트라사이클린 0중량%인 차폐막(도 6A)에 비하여 5 중량%의 테트라사이클린이 함유된 차폐막 처리군은 신생뼈에 의하여 골 결손부가 모두 재생됨이 확인되었다.
As shown in FIG. 6, 14.38 ± 1.39% of tetracycline shielding film (FIG. 6A, silk fibroin alone treatment) was used and 19.07 ± 1.39% of shielding film containing tetracycline 1% It was confirmed that a new bone was formed at 37.65 ± 13.80% for the shielding film containing 9.58%, 5% by weight of tetracycline (FIG. 6C) and 28.40 ± 7.01% for the shielding film containing 10% by weight of tetracycline . In particular, it was confirmed that the shielding membrane-treated group containing 5% by weight of tetracycline in comparison with the shielding membrane (FIG. 6A) containing 0% by weight of tetracycline regenerated all bone defects by the new bone.
상기와 같은 실험결과들을 통해, 본 발명의 차폐막은 뛰어난 항균활성을 통해 체내에 안정한 형태로 존재할 수 있으면서 동시에 약리활성을 부여하여 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진함으로 인해 최종적으로 골조직 형성을 극대화시킴을 확인되었기에 본 발명의 골조직 형성 촉진용 차폐막의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 차폐막을 제공할 수 있게 된다.
Through the above experimental results, the shielding membrane of the present invention can exist in a stable form in the body through excellent antimicrobial activity and at the same time provide pharmacological activity to promote cell migration, proliferation and differentiation related to regeneration, It is possible to provide a method for manufacturing a shielding film for promoting bone formation of the present invention and a shielding film manufactured using the same.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the inventions. Examples and experiments may be implemented. The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all differences within the scope of the claims are to be construed as being included in the present invention.
Claims (10)
상기 실크 피브로인을 염 에탄올 수용액에 넣고 혼합하여 상기 실크 피브로인을 용해시켜 용해물을 제조하는 제2단계;
상기 용해물에 함유된 염과 에탄올을 제거하여 실크 피브로인 수용액을 제조하는 제3단계 및,
상기 실크 피브로인 수용액에 차폐막 조성물 전체 중량대비 5중량%~10중량%의 테트라사이클린을 함유하도록 넣고 혼합하여 차폐막 조성물을 제조하는 제4단계를 포함하는,
골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물의 제조방법.
A first step of removing sericin from the cocoon to obtain silk fibroin;
A second step of dissolving the silk fibroin in a salt aqueous ethanol solution to prepare a melt;
A third step of preparing an aqueous solution of silk fibroin by removing the salt and ethanol contained in the melt,
And a fourth step of mixing the silk fibroin aqueous solution with tetracycline in an amount of 5 wt% to 10 wt% based on the total weight of the shielding film composition to prepare a shielding film composition.
A method for manufacturing a shielding film composition for promoting bone tissue formation.
상기 제4단계에서의 테트라사이클린은 차폐막 조성물 전체 중량대비 5중량%인 것을 특징으로 하는,
골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the tetracycline in the fourth step is 5 wt% based on the total weight of the shielding film composition.
A method for manufacturing a shielding film composition for promoting bone tissue formation.
상기 제2단계에서 상기 용해물은 상기 염 에탄올 수용액에 상기 염 에탄올 수용액 중량대비 상기 실크 피브로인 1~10중량%를 넣고 혼합하여 제조되는,
골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the lysate is prepared by adding 1 to 10% by weight of the silk fibroin to the salt aqueous ethanol solution in the second step,
A method for manufacturing a shielding film composition for promoting bone tissue formation.
상기 제2단계에서 염은 브롬화리튬염, 염화리튬, 염화아연, 염화칼슘, 질산아연, 질산칼슘 중 어느 하나인 것이 특징인,
골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the salt in the second step is any one of a lithium bromide salt, lithium chloride, zinc chloride, calcium chloride, zinc nitrate, and calcium nitrate.
A method for manufacturing a shielding film composition for promoting bone tissue formation.
골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물.
A composition according to claim 1, which is prepared through a process for the preparation of a shielding film composition, comprising 5% to 10% by weight of tetracycline and silk fibroin, based on the total weight of the shielding film composition.
Shielding film composition for promoting bone formation.
골조직 형성 촉진용 차폐막 조성물.
A composition according to claim 2, which is prepared through a process for the preparation of a shielding film composition, comprising 5% by weight of tetracycline and silk fibroin based on the total weight of the shielding film composition,
Shielding film composition for promoting bone formation.
골조직 형성 촉진용 차폐막.
5. A composition according to claim 5, which is prepared by molding the shielding film composition and comprises 5% to 10% by weight of tetracycline and the remaining silk fibroin.
Shielding membrane to promote bone formation.
골조직 형성 촉진용 차폐막.
A composition comprising the 5% by weight tetracycline and the remaining silk fibroin, which is prepared by molding the shielding film composition of claim 6,
Shielding membrane to promote bone formation.
실크 피브로인 단독 차폐막의 골조직 형성능 대비 더 촉진된 골조직 형성능을 나타내는 것이 특징인,
골조직 형성 촉진용 차폐막.
The shielding film according to any one of claims 7 to 8,
Characterized in that the silk fibroin sole shielding film exhibits a more enhanced bone tissue forming ability as compared to the bone forming ability,
Shielding membrane to promote bone formation.
대장균 또는 화농균에 대하여 항균효과를 나타내는 것이 특징인,
골조직 형성 촉진용 차폐막.
The shielding film according to any one of claims 7 to 8,
Which exhibits an antibacterial effect against Escherichia coli or Escherichia coli,
Shielding membrane to promote bone formation.
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|---|
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