KR20150132006A - 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각종 질환 치료를 촉진하는 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 연골 질환 치료용 섬유 패치 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 생체분자 및/또는 약물이 고정된 섬유 패치를 이용하여 치료되는 부위세포의 활동 기작 순서에 따라 적합한 생체분자 및/또는 약물을 방출하여 지속적이며, 뛰어난 치료 효과를 나타내어 각종 치료에 대한 약물 시스템 활용이 가능하다.
본 발명에 따르면, 생체분자 및/또는 약물이 고정된 섬유 패치를 이용하여 치료되는 부위세포의 활동 기작 순서에 따라 적합한 생체분자 및/또는 약물을 방출하여 지속적이며, 뛰어난 치료 효과를 나타내어 각종 치료에 대한 약물 시스템 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각종 질환 치료를 촉진하는 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 연골 질환 치료용 섬유 패치 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 생체 내에 여러 경로로 투여되는 약물은 작용부위에 도달한 약물에 의하여 약효가 발휘되고 질병 부위가 아닌 다른 부위로 운반된 약물은 주로 부작용의 원인이 된다. 일반 약물의 약효는 혈중 약물농도에 비례하여 나타나므로 다양한 제제학적 기술을 이용하여 혈중농도 곡선의 모양을 조절한 필요가 있다.
약물전달시스템(drug delivery system) 기술은 치료 부위에 질병 치료 약물을 효율적으로 전달함으로써 약물의 부작용을 줄이고, 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며, 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형을 설계하고 약물치료를 최적화하는 기술을 총칭한다. 최근 개발이 활발한 약물전달 시스템 기술은 전통적으로 이용되는 정제, 캡슐, 주사제 등의 단순한 제형으로는 성취될 수 없는 다양한 형태의 성능을 발휘하기 위하여 특별히 고안된 제형 설계를 띠며, 대상으로 하는 치료 약물의 범위는 일반적인 화학적 합성 약물을 비롯하여 펩티드, 단백질, DNA를 비롯한 유전자, 세포 등 다양한 형태의 물질을 포함한다.
특히, 복용 등 투여 후 흡수 부위에서 신속히 녹으며, 투여부위로부터 이행 속도가 큰 약물은 체내로부터의 손실이 크기 때문에 반복 투여하지 않으면 유효혈중농도를 유지하기 힘들어서 약효가 오래가지 못하는 문제점이 있다. 따라서 이런 약물들을 제제학적으로 디자인하여 약물이 체내에 투여된 후 제제로부터 서서히 방출되게 하여 약물의 혈중 농도를 유효 농도 이상으로 지속적으로 유지하게 하는 서방성 약물전달 시스템이 개발되었다. 이와 같은 서방성 약물전달 시스템은 초기에는 주로 경구 투여에 한정되었으나 이후 경피투여, 경점막투여 및 기타 제제에 이르는 다양한 경로에 대하여 시도되고 있다.
약물전달 시스템은 크게 리포좀, 에멀젼/유성 코어 및 나노/마이크로스피어 제제를 포함하는 미립자 제제; 하이드로겔이나 임플란트를 포함하는 고형 제제; 및 페길레이션 제제 같은 수용성 제제로 나눌 수 있다.
최근 이러한 약물전달시스템을 이용한 치료 방법이 개발되고 있다. 한 예로 관절연골 치료를 위한 조직 공학적 접근 방법으로는 생체재료로 만든 지지체를 이용한 치료 방법이다. 관절연골 조직공학을 위해 사용된 최초의 생체재료로는 천연 생분해성 고분자 및 합성 생분해성 고분자가 있으며, 천연 생분해성 고분자로는 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 젤라틴, 키토산, 피브린 등이 있고, 합성 생분해성 고분자로는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤 (PCL)과 이들의 유도체 및 공중합체 등이 있다. 하지만 생체치료에 대해서 천연 생분해성 고분자 물질이 합성 고분자 물질보다 더욱 뛰어난 효과가 있다고 보고되고 있다(Jin et al., Biomaterials, 25:1039-1047, 2004).
상기 생체재료를 이용하여 다양한 구조의 지지체를 제조할 수 있다. 각종 질환 치료를 위해 하이드로겔, 나노섬유, 구슬형태, 스폰지형태 등의 지지체 유형이 꾸준히 연구되어 왔다. 그 중에서도 하이드로겔은 같이 이식되는 세포로부터 나오는 물질이나 외부의 영양분 및 산소의 공급을 원활하게 하며, 관절 연골 혹은 뼈의 손상부위 두께를 만족시킬 수 있다. 예를 들어, 연골의 주요 세포외기질 성분인 콜라겐 타입 Ⅱ로 제조된 하이드로겔은 생체적합적으로, 관절연골 부위에 적용할 수 있다. 그러나, 콜라겐 기반의 하이드로겔은 기계적 강도가 약하다는 단점이 있다.
따라서, 최근에는 하이드로겔에 기계적 특성을 제공하기 위해 글루타르알데히드와 같은 가교물질을 사용하여 이러한 문제점을 보완하려는 연구가 많이 진행되어 왔다. 그러나, 이러한 가교물질은 독성이 있어 기계적 강도를 높이는데 한계가 있다.
한편, 탄소나노튜브는 나노규모의 천연 세포외기질을 잘 반복할 수 있을 정도로 작은 직경(200 ~ 500㎚)을 가지며, 강도는 강철(~1 TPa)보다 100배 더 강하고, 무게는 강철의 1/6 정도이며, 유연성이 있고, 무독성이며, 천연 및 합성된 근골격 조직의 포유동물 세포와 조화될 수 있다고 알려져 있으나, 생분해성이 없는 단점이 있다.
또한, 전기방사법을 이용하여 일정한 방향성을 갖는 나노섬유 및 미세섬유 지지체를 제조하는 연구에 관하여 많이 진행되고 있다. 세포방향은 전기방사하여 배향성을 갖는 고분자 나노섬유를 이용하여 조절될 수 있고, 이에 의해 설계된 조직의 기능성을 최적화할 수 있다. 대부분의 천연 조직에 있는 세포 및 세포외기질 소섬유는 무작위적이지 않고 잘 패턴화된 공간 특이적 방향을 나타낸다. 또한, 세포유착 및 증식은 무작위로 배향된 나노섬유 지지체보다 배향된 나노섬유 지지체에서 유의하게 향상된다. 또한, 정렬된 나노섬유에서 배양된 배향 섬유 모세포가 무작위로 배향된 나노섬유에서 배양하는 것보다 콜라겐을 더 분비한다고 알려져 있다. 하지만 이러한 세포외기질이 액체 상태로 결합된 나노섬유 지지체를 이용하였을 경우, 치료를 돕는 생체 물질 및/또는 약물이 치료 부위에 부착 후 빠르게 방출되는 현상이 일어나, 오랜 시간에 걸쳐 지속적인 치료 효과를 나타내지 못하는 단점이 있다.
이러한 단점을 해결하고자, 치료에 도움을 주는 생체분자 및/또는 약물을 섬유의 원재료에 포함시키거나, 캡슐에 넣어 방출 속도를 늦추거나, 나노섬유에 물리적 혹은 화학적으로 고정화시키는 연구들이 진행되었다(Ankit A. et al., Biomaterials, 33:6783-6792, 2012; Zhiwei Xie et al., Acta Biomaterialia, 9:9351-9359, 2013). 이러한 지지체들은 치료 효과를 지속시키는 장점은 있으나, 연골 손상 부위의 손상에 따른 적합한 생체 분자의 방출 기능이 없어 치료 효과를 극대화하지 못하는 한계가 존재하였다.
이에, 본 발명자들은 치료되는 부위의 회복 단계에 따라 적합한 생체분자 및/또는 약물을 공급하는 천연 고분자 기반 섬유 패치를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 다양한 생체분자 및/또는 약물이 고정된 다층의 천연고분자 기반 섬유 패치를 개발하고, 상기 패치가 치료되는 부위의 회복 단계에 따라 적합한 성장 인자를 방출하여 지속적이며, 탁월한 치료 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 천연고분자를 전기방사시켜 섬유형태로 가교시키는 단계; (b) 상기 가교된 섬유형태의 천연고분자에 링커를 통해 생체물질 및/또는 약물을 고정시키는 단계; 및 (c) 상기 생체물질이 고정된 섬유형태의 천연고분자를 적층시키는 단계를 포함하는 생체분자가 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 연골 질환 치료용 섬유 패치의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 생체분자 및/또는 약물이 고정된 섬유 패치를 이용하여 치료되는 부위세포의 활동 기작 순서에 따라 적합한 생체분자 및/또는 약물을 방출하여 지속적이며, 뛰어난 치료 효과를 나타내어 각종 치료에 대한 약물 시스템 활용이 가능하다.
도 1은 젤라틴 기반 섬유에 아비딘과 바이오틴 결합을 이용하여 성장인자를 고정화시킨 섬유 패치 제조 과정을 도시하고 있다.
도 2는 FGF-2를 첨가하지 않은 배지와 젤라틴 나노섬유를 이용한 컨트롤(Control) 그룹, 25와 100 ng/ml의 농도로 FGF-2를 녹인 세포 배양액과 젤라틴 나노섬유를 이용한 LS와 HS 그룹 및 25와 100ng/ml 농도의 FGF-2를 고정화시킨 젤라틴 나노섬유를 이용한 LC와 HC 그룹을 이용한 세포증식 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포이동 실험의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 4는 FGF-2를 첨가하지 않은 배지와 젤라틴 나노섬유를 이용한 컨트롤(Control) 그룹, 25와 100 ng/ml의 농도로 FGF-2를 녹인 세포 배양액과 젤라틴 나노섬유를 이용한 LS와 HS 그룹 및 25와 100ng/ml 농도의 FGF-2를 고정화시킨 젤라틴 나노섬유를 이용한 LC와 HC 그룹을 이용한 세포이동 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 골원성 분화(osteogenic differentiation)시킨 각 그룹의 세포의 골원성 유전자 ALP(a), RunX2(b), OCN(c) 및 COL1(d)를 RT-qPCR로 측정하여 얻은 그래프이다.
도 2는 FGF-2를 첨가하지 않은 배지와 젤라틴 나노섬유를 이용한 컨트롤(Control) 그룹, 25와 100 ng/ml의 농도로 FGF-2를 녹인 세포 배양액과 젤라틴 나노섬유를 이용한 LS와 HS 그룹 및 25와 100ng/ml 농도의 FGF-2를 고정화시킨 젤라틴 나노섬유를 이용한 LC와 HC 그룹을 이용한 세포증식 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포이동 실험의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 4는 FGF-2를 첨가하지 않은 배지와 젤라틴 나노섬유를 이용한 컨트롤(Control) 그룹, 25와 100 ng/ml의 농도로 FGF-2를 녹인 세포 배양액과 젤라틴 나노섬유를 이용한 LS와 HS 그룹 및 25와 100ng/ml 농도의 FGF-2를 고정화시킨 젤라틴 나노섬유를 이용한 LC와 HC 그룹을 이용한 세포이동 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 골원성 분화(osteogenic differentiation)시킨 각 그룹의 세포의 골원성 유전자 ALP(a), RunX2(b), OCN(c) 및 COL1(d)를 RT-qPCR로 측정하여 얻은 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 다양한 생체분자 및/또는 약물을 고정시킨 천연고분자 기반 섬유 패치를 개발함으로써, 수분 함유량과 기계적 강도를 유지 및 조절할 수 있고, 줄기세포의 증식과 분화를 촉진하며, 세포 활동 기작의 순서에 따라 적합한 생체분자를 전달할 수 있는 지지체 시스템을 제조할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치를 이용한 세포증식 실험 및 생체분자 및/또는 약물을 고정시킨 나노섬유를 이용한 세포이동 실험을 수행하였다. 그 결과 아비딘과 바이오틴 결합을 이용하여 생체분자 및/또는 약물을 젤라틴 기반 나노섬유에 고정화시킬 수 있으며, 상기 생체분자 및/또는 약물을 고정시킨 젤라틴 기반 나노섬유를 이용하여 세포 증식과 이동을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생체분자 및/또는 약물은 링커를 통해 천연고분자에 고정되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 링크 물질은 아비딘(avidin)과 바이오틴(biotin)일 수 있다.
상기 아비딘은 젤라틴 섬유와 결합되고, 상기 바이오틴은 보통 생체분자 및/또는 약물과 결합된다. 그 후 생성된 물질들이 상기 아비딘 및 바이오틴과 결합을 통해 최종적으로 생체분자 및/또는 약물이 고정된 천연고분자 기반 섬유 패치를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체분자는 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α), 형질전환성장인자-β1(transforming growth factor-β1), 표피생장인자(epidermal growth factor), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor), 에나멜 단백질(enamel protein), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
대표적인 성장인자 중 하나인 섬유아세포성장인자는 산성 섬유아세포성장인자(acidic fibroblast growth factor, a-FGF)와 염기성 섬유아세포성장인자(b-FGF, basic fibroblast growth factor)나뉘며, 염기성 섬유아세포성장인자는 혈관 신생, 여러 가지 세포증식 촉진, 분화 유도 등 다양한 기능을 가지며, 뇌하수체, 뇌, 신장, 부신, 태반, 골기질, 연골, 내피세포, 섬유아세포 등에 분포한다. 반면 산성 섬유모세포성장인자(a-FGF)는 시상하부, 뇌, 망막, 눈, 신장 등의 조직이나 기관에 분포한다. 또한 상기 표피생장인자(epidermal growth factor)는 섬유아세포의 증식을 촉진한다.
본 발명에 있어서, 상기 천연고분자는 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans), 알긴산나트륨(poly sodium alginate), 알지네이트(alginate), 히알루로난(hyaluronan), 아가로스(agarose), 폴리하이드록시뷰틸레이트(polyhydroxy butyrate), 피브린(fibrin), 글루텐(gluten), 알부민(albumin), 엘라스틴(elastin), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch) 및 키토산(chitosan)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 다층(multilayer)인 것을 특징으로 한다. 상기 다층의 섬유 패치는 치료부와 결합되는 곳의 가교가 덜 되어서 생분해가 더 빠르게 일어나며, 치료부와 멀어질수록 가교 결합이 점점 더 많이 되도록 하여 생분해의 속도를 조절하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않으며, 치료 부위의 상황 및 환자의 상태 등에 따라 다양하게 가교 정도를 조절하여 다층 구조의 패치를 제조할 수 있다.
또한 상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 다양한 크기를 가진다. 팽윤(swelling)을 이용하여 생체분자 및/또는 약물을 천연고분자 기반 섬유에 담지할 때, 나노 크기의 섬유를 이용한 패치는 마이크로 크기의 섬유보다 표면적이 더 넓어 마이크로 크기의 섬유보다 더 빠르게 담지할 수 있으며, 또한 더 많은 양의 생체분자 및/또는 약물을 함유할 수 있다. 하지만, 표면적이 더 넓은 나노 크기의 섬유의 경우 더 빠른 생분해가 일어날 수 있으며, 연골 손상 부분과 가까이 결합되는 다층 섬유 패치 부분에 사용하여 마이크로 크기의 섬유보다 더 빠르게 생체분자 및/또는 약물을 방출할 수 있다. 한편 천연고분자 기반 섬유의 생분해 속도를 느리게 할 경우. 섬유의 크기를 더욱 크게 할 때 효과적일 수 있다.
또한 상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 세포 활동 기작에 따른 적합한 생체분자 및/또는 약물을 전달할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 상처, 욕창, 수술 후 상처, 화상, 당뇨병성 궤양 등에 의한 피부 상처에 사용되는 창상 치료제나 화상치료제로 적용할 때, 세포의 증식이 필요한 상황에서는 치료 부위에 FGF가 주로 전달될 수 있도록 하며, 세포 증식 이후 세포 분화가 필요한 상황에서는 치료 부위에 TGF가 주로 전달될 수 있도록 하고, 분화된 세포의 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)생성을 위해 치료 부위에 IGF-1이 주로 전달될 수 있도록 하는 구조로 되어 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 생체분자 및/또는 약물이 담지되는 것을 특징으로 한다. 상기 섬유 패치는 전기 방사 후 가교를 마친 상태에서는 보통 수분이 제거된 상태를 유지한다. 그래서, 섬유 패치를 적층하기 전에 생체분자 및/또는 약물이 담지되어 있는 용액을 섬유 패치에 떨어뜨려 팽윤(swelling)시킴을 통해 생체분자 및/또는 약물이 상기 섬유 패치에 담지될 수 있으며, 이렇게 담지하여 분산(diffusion)한 생체분자 및/또는 약물의 방출 속도는 아비딘과 바이오틴을 이용하여 고정화시킨 생체분자 및/또는 약물의 방출 속도보다 빠르게 일어날 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 생체분자 및/또는 약물의 함유 이온 성질에 따라 방출을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다. 천연고분자 중 하나인 젤라틴의 표면 차지를 음이온 혹은 양이온을 띠도록 제조하여 젤라틴 표면에 존재하는 전하와 반대의 전하를 가지는 생체분자 및/또는 약물의 방출 속도를 늦출 수 있다. 이 전하의 성질에 따른 결합으로 생체분자 및/또는 약물을 고정시킬 때, 생체 분자 및/또는 약물의 방출 속도는 담지된 생체분자 및/또는 약물보다 느리고, 고정화시킨 생체분자보다는 빠를 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서, (a) 천연고분자를 전기방사시켜 섬유형태로 가교시키는 단계; (b) 상기 가교된 섬유형태의 천연고분자에 링커를 통해 생체물질 및/또는 약물을 고정시키는 단계; 및 (c) 상기 생체물질 및/또는 약물이 고정된 섬유형태의 천연고분자를 적층시키는 단계를 포함하는 생체분자가 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치의 제조방법에 관한 것이다.
상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 창상 치료용, 연골질환 치료용, 심혈관계 질환 치료용, 뇌질환 치료 및 골 질환 치료용으로 사용이 가능하나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 천연고분자 기반 섬유 패치는 관련 질환 및 치료 필요부에 따라 치료를 촉진시키는 관련 생체분자 및/또는 약물을 고정시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 천연고분자는 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans), 알긴산나트륨(poly sodium alginate), 알지네이트(alginate), 히알루로난(hyaluronan), 아가로스(agarose), 폴리하이드록시뷰틸레이트(polyhydroxybutyrate), 피브린(fibrin), 글루텐(gluten), 알부민(albumin), 엘라스틴(elastin), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch) 및 키토산(chitosan)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 아비딘(avidin)과 바이오틴(biotin)일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 성장인자 고정화된 젤라틴 기반 섬유 패치 제조
5ml의 포름산(formic acid)과 함께 농도 12wt%의 젤라틴을 37℃, 1시간 동안 휘저어 젤라틴 용액을 준비시켰다. 그 후, 상기 용액에 1wt%의 GTA(glutaraldehyde)를 추가하고 10분간 더 휘저었다. 그리고, 상기 용액을 내부 지름이 0.25 mm이고, 용량이 10ml인 주사기를 사용해 전기방사기기에 옮겨 0.7 ml/hr, 15.5 kV, 니들(needle)과 알루미늄 호일(foil)이 싸여진 컬렉터(collector) 사이의 거리를 10 cm인 조건으로 2시간 30분 동안 방사하였다. 전기 방사 공정 후, GTA 가교 반응이 완전히 이루어지도록 제조된 젤라틴 섬유를 인큐베이터 안에 넣어서 24시간 동안 인큐베이팅(incubating)하였다. 인큐베이팅하는 이유는 GTA를 함유하는 천연고분자의 경우 방사 공정에서는 가교 반응이 잘 일어나지 않아 가교 반응이 방사된 섬유에서 충분히 일어날 수 있도록 하기 위해서이다.
인큐베이팅 후, 젤라틴 기반 섬유들을 하루 동안 말리고, 말린 나노섬유를 25wt% GTA용액으로 1시간 동안 가교시켰다. 그 후, 가교시킨 섬유들을 25 mM의 글라이신(glyine, SIGMA)용액으로 12시간 동안 세척하였다. 섬유의 모든 표면에 가교와 세척을 시키기 위해 모든 가교와 세척 공정은 쉐이커(SH30, FINEPCR)에서 진행되었다.
스캐폴드 셀의 경우, 나노섬유를 38℃, 4시간 동안 산화에틸렌 멸균장치(ethylene oxide sterilizer, ALOPS Corp., SE30)를 통해 멸균시키고, 동물세포배양 배지로 알려진 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지 안에서 바이옵시 펀치(biopsy punch, Miltex)를 이용하여, 8 mm 지름의 원 모양으로 잘라내서 젤라틴 기반 나노섬유로 구성된 스캐폴드 셀을 제조하였다.
아비딘(avidin)을 표면에 결합시키기 위해, 젤라틴 기반 나노섬유로 구성된 스캐폴드를 2mM의 DMAP 과 2mM의 EDC가 포함된 200 ul의 PBS 용액에 30분 동안 실온으로 프리인큐베이션(preincubation)하였고, 아비딘 용액을 상기 용액에 투입하고, 1시간 동안 쉐이커로 인큐베이션하였다(도 1). Atto-590 바이오틴(biotin) 1 mg을 200 ul의 에탄올에 희석하였고, 형광성의 Atto-590 바이오틴의 농도를 측정하였을 때 값은 8mM로 측정되었다. 200ul의 PBS에 상기 바이오틴 용액 2.5 ul를 주입시켰다. 그 후 아비딘이 결합된 스캐폴드를 PBS로 세척하여 잔여 아비딘을 제거하고, 스캐폴드를 Atto-590 용액에 빛을 차단한 조건에서 2시간 동안 담가 놓았다. 상기 고정화된 젤라틴 나노섬유 기반 스캐폴드를 PBS로 세척하여 젤라틴 기반 섬유 패치를 완성하였다.
실시예 2: 성장인자 고정화 젤라틴 기반 섬유 패치의 치료 효능
사람의 지방줄기세포(Human adipose stem cell)을 10%의 FBS(fatal bovine serum)과 1%의 페니실린이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5%의 이산화탄소와 함께, 습도 인큐베이터에서 배양하였다. 80~90%의 컨플로언스(confluence)에 도달한 후, 배양된 셀은 트립시나이즈(trypsinized)하였고, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 셀의 수를 측정하였다.
FGF-2를 첨가하지 않은 배지와 젤라틴 나노 섬유를 이용한 대조군 그룹, 25와 100 ng/ml 농도의 FGF-2를 녹인 세포 배양액과 젤라틴 나노 섬유를 이용한 LS와 HS 그룹, 그리고 실시예 1의 방법으로 25와 100ng/ml 농도의 FGF-2를 고정화시킨 젤라틴 나노 섬유를 이용한 LC와 HC 그룹에 상기 세포를 시딩(seeding)하고, 요구되는 시간까지 배양하였다. 각각 7일 동안 키우며 각 시간 간격마다 CCK-8 에세이 키트(CKK-8, Dojindo, Japan)를 사용하여 세포의 증식 정도를 측정하였다.
도 2는 시간 간격마다 각 그룹의 세포 개수를 도표로 만든 것이다. Day 0를 보면 대조군 그룹에서의 세포 점착이 가장 많았지만, 세포 배양 하루가 지나고 나자 LS 그룹을 제외한 모든 그룹이 대조군 그룹의 세포 개수를 넘어섰다. 세포 배양 5일 후에는 HC 그룹이 상당한 세포 개수 증가를 보였다.
실시예 3: 성장인자 고정화 젤라틴 기반 섬유 패치를 이용한 세포 이동
사람의 지방줄기세포(Human adipose stem cell)을 10%의 FBS(fatal bovine serum)과 1%dml 페니실린이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5%의 이산화탄소와 함께, 습도 인큐베이터에서 배양하였다. 80~90%의 컨플로언스(confluence)에 도달한 후, 배양된 셀은 트립시나이즈(trypsinized)하였고, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 셀의 수를 측정하였다.
실시예 2와 같은 스캐폴드 그룹을 상대로 FGF-2의 고정화가 젤라틴 나노 섬유와 hASC 사이의 친화력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Migration test를 실시했다. 도 3과 같이 세포 위에 젤라틴 나노 섬유를 고정한 후 일정 시간 간격 후에 젤라틴 나노 섬유로 옮겨간 세포를 calcein-AM으로 염색하여 형광현미경을 통해 관찰하였다. 도 4는 시간 간격마다 각 그룹의 젤라틴 나노 섬유로 옮겨간 세포를 촬영한 것이다.
Day 1부터 Day 5까지 HS와 HC그룹의 젤라틴 나노 섬유에 가장 많은 세포를 관찰할 수 있다. (1)의 결과와 (2)의 결과를 종합해 봤을 때, HS 그룹의 경우 세포 배양액의 FGF-2 농도를 일정하게 맞추기 위해서는 세포 배양액을 교체해 줄 때에 FGF-2의 양이 배로 드는 반면에 HC의 경우 FGF-2와 젤라틴 나노 섬유를 연결하고 있는 결합이 깨지지만 않는다면 지속적으로 기존 FGF-2의 이용할 수 있는 HC그룹이 더 효율적이라 할 수 있다.
실시예 4: 골원성 분화 테스트(Osteogenic differentiation test)
BMP-2를 처리하지 않는 젤라틴 나노 섬유와 BMP-2를 첨가하지 않은 배지를 이용한 음성 대조군(negative control) 그룹, BMP-2를 각각 25와 100ng/ml 농도로 녹인 용액을 100% 흡수시켜 넣은 젤라틴 나노 섬유와 BMP-2를 첨가하지 않은 세포 배양액을 이용한 LL와 HL그룹, 25와 100ng/ml 농도의 BMP-2를 고정화 시킨 젤라틴 나노 섬유를 이용한 LC와 HC그룹, 그리고 BMP-2를 처리하지 않은 젤라틴 나노 섬유와 25ng의 BMP-2가 들어가있는 세포 배양액을 이용한 양성 대조군(positive control) 그룹을 각각 5일 동안 키우며 RT-qPCR를 통하여 골원성 분화(osteogenic differentiation) 정도를 측정하였다.
도 5a 내지 도 5d는 5일 동안 골원성 분화(osteogenic differentiation)시킨 각 그룹의 세포의 골원성 유전자(osteogenic gene, ALP, RunX2, OCN, COL1)를 RT-qPCR로 측정하여 얻은 결과이다. 각 그룹의 Day 5의 세포가 가진 골원성 유전자에 대하여 HC 그룹이 가장 많은 양을 보이는 것으로 나타났다. 또한 BMP-2가 녹아 있는 세포 배양액을 사용한 양성 대조군보다 더 많은 골원성 분화 정도를 보였다. OCN 유전자에서는 Day 0보다 Day 5에서 더 적은 양의 유전자가 발현되었는데, OCN은 분화 마지막 단계에서 나타나는 유전자로서, 현재 골원성 분화가 진행되고 있는 상태이기 때문에 늦게 발현되는 것으로 보인다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치.
- 제1항에 있어서, 상기 생체분자 및/또는 약물은 링커를 통해 천연고분자에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 천연고분자 기반 섬유 패치.
- 제2항에 있어서, 상기 링커는 아비딘(avidin) 또는 바이오틴(biotin)인 것을 특징으로 하는 천연고분자 기반 섬유 패치.
- 제1항에 있어서, 상기 생체분자는 형질전환성장인자α(transforming growth factor-α), 형질전환성장인자β1(transforming growth factor-β1), 표피생장인자(epidermal growth factor), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor), 에나멜 단백질(enamel protein), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor) 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 천연고분자 기반 섬유 패치.
- 제1항에 있어서, 상기 천연고분자는 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans), 알긴산나트륨(poly sodium alginate), 알지네이트(alginate), 히알루로난(hyaluronan), 아가로스(agarose), 폴리하이드록시뷰틸레이트(polyhydroxybutyrate), 피브린(fibrin), 글루텐(gluten), 알부민(albumin), 엘라스틴(Elastin), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch) 및 키토산(chitosan)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 천연고분자 기반 섬유 패치.
- 다음 단계를 포함하는 생체분자 및/또는 약물이 고정되어 있는 섬유형태의 천연고분자가 적층되어 있는 천연고분자 기반 섬유 패치의 제조방법:
(a) 천연고분자를 전기방사시켜 섬유형태로 가교시키는 단계;
(b) 상기 가교된 섬유형태의 천연고분자에 링커를 통해 생체물질 및/또는 약물을 고정시키는 단계; 및
(c) 상기 생체물질이 고정된 섬유형태의 천연고분자를 적층시키는 단계.
- 제6항에 있어서, 상기 천연고분자는 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans), 알긴산나트륨(poly sodium alginate), 알지네이트(alginate), 히알루로난(hyaluronan), 아가로스(agarose), 폴리하이드록시뷰틸레이트(polyhydroxybutyrate), 피브린(fibrin), 글루텐(gluten), 알부민(albumin), 엘라스틴(Elastin), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch) 및 키토산(chitosan)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 천연고분자 기반 섬유 패치의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 링커는 아비딘(avidin) 또는 바이오틴(biotin)인 것을 특징으로 하는 천연고분자 기반 섬유 패치의 제조방법.
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