KR20150126354A

KR20150126354A - Tnfr 길항제와 최소 한 가지 테오레독신 저해제를 포함하는, 암종 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150126354A
Application number: KR1020157024224A
Authority: KR
Inventors: 니콜라오스 게오르고폴로스
Original assignee: 유니버시티 오브 허더스필드
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2014-02-04
Publication date: 2015-11-11
Also published as: US20150366844A1; EP2950788A1; CA2904260A1; AU2014210908A1; AU2014210908B2; US10561639B2; KR102217499B1; WO2014118578A1; CA2904260C; EP2950788B1

Abstract

최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제와 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합이 포함된, 암을 가진 세포들을 치료하기 위한 조성물. 이러한 조합 접근법은 상기 티오레독신 분자 (그리고 Trx 환원효소 효소가 아닌)의 직접적인 저해가 관련된다.

Description

TNFR 길항제와 최소 한 가지 테오레독신 저해제를 포함하는, 암종 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING A TNFR AGONIST AND AT LEAST ONE THIOREDOXIN INHIBITOR FOR USE IN THE TREATMENT OF CARCINOMA}

[발명의 분야]

본 발명은 암종 치료법(carcinoma therapy)에 사용하기에 적합한 조성물의 생산 및 이용에 관계한다.

다음의 설명들은 티오레독신(Thioredoxin) 단백질 패밀리에 대하여 독점적으로 언급되지만, 당업자는 활성 산소 종 (ROS) 신호생성 경로에 관련된 다른 단백질 및 단백질 패밀리에 또한 이용될 수 있음을 인지할 것이다.

"사멸 수용체들(death receptors)"로도 흔히 알려진, 종양 괴사 인사 수용체 (TNFR) 패밀리는 항암 치료법의 가장 일반적인 치료방법을 제공한다. 전형적(classical) 사멸 수용체들, 이를 테면 TNF-RI, Fas 및 TRAIL-R, 그리고 비-전형적 TNFRs, 이를 테면 CD40 및 림프톡신-수용체 (LT-R)는 이들의 동족 리간드들의 결합 및/또는 가교(cross-linking)에 의한 활성화로 다양한 조직 기원의 암종 세포에서 아팝토시스(apoptosis)가 유도될 수 있다.

그러나, 재조합 가용성 삼합체성 TNFR 항진제들은 종양 세포들을 죽이는데 비효과적이라는 것은 이미 밝혀졌는데, 그 이유는 세포내 자가사멸성 신호생성 경로에 참여하기 위하여 충분하게 TNFRs과 가교하지 않기 때문이다. 이와 같이, 이들 리간드는 단지 세포정지제(cytostatic)이며, 단지 단백질 합성의 약리학적 저해제들과 복합되어 강력한 사전-자가사멸성일 수 있고, 이들은 상피 세포에 상당히 독성이 있다. 대조적으로, 상당히 가교된 TNFR 리간드들, 항진제들 또는 세포 표면 (막에 존재하는)-전달된 리간드들의 다합체 응집물은 암종 세포들에서 방대한 사멸을 유도할 수 있다.

그러나, 일부 경우들에서 이러한 상당히 가교된 항진제들은 종양 세포들에 대해 비-특이적이며, 정상 세포들에서 심각한 세포 독성이 설명되었다 (예를 들면, TNF-관련된 아팝토시스 유도 리간드(TRAIL)-R 항진제).

TNFR 패밀리 멤버에서 이에 대하여 한 가지 예외가 CD40인데, 이것은 유일하게 종양 특이적인데, 그 이유는 정상 상피 세포가 아닌 악성 세포들 안에서 상당한 아팝토시스를 유도하는 것으로 확인되었기 때문이다. 그러나, 이들의 특별한 능력에도 불구하고, CD40-사멸은 방대한 수용체 가교를 필요로 하며, 따라서 이의 활성화를 위하여 세포 표면-전달된 리간드 운반이 요구되는데, 표면 고정된 리간드의 수성 시스템 안에서 불용성으로 인하여 심각한 치료요법적 장애가 된다.

Lin et al., 2010, Carcinogenesis, 32: 154에서는 2-텔레리움-다리연결된 베타-시클로덱스트린 (TeCD) 화합물들과 TRAIL 리간드의 조합을 이용하여 NF-kappaB와 관련된 해독(detoxifying) 기전에 영향을 주는 다른 효소들(글루타티온 경로와 관련된)과 함께 Trx 환원효소의 저해에 의해 TRAIL-저항성 종양 세포를 사멸한다고 개시하고 있다. 이와 같이, 이 문헌은 보호성, NF-kappaB 전사 인자-구동된 항-자가사멸성 경로를 표적으로 함으로써(저해함으로써) TRAIL에 대하여 종양 세포들이 민감해지도록 하는 방법들을 교시한다. 이러한 방법에서 주요 문제점은 효소를 표적으로 하면, 돌연변이에 의해 이러한 저해제들에 대하여 종양의 저항성이 발생될 추가 위험이 있다는 점이며, 그 이유는 이미 이용된 몇 가지 약물, 이를 테면 티로신 키나제 저해제들을 이용한 경우들이 있었기 때문이다.

따라서, 본 발명의 목적은 전술한 문제점들을 해결하는 개선된 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 암을 가진(cancerous) 세포들 및/또는 종양들의 치료 방법으로 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 가용성 TNFR 항진제들의 세포독성 가능성을 임의선택적으로 최대 활용하는 복합 방법에 의해 가용성 TNFR 항진제들의 사전-자가사멸 능력을 증가시키는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 1 측면에 따르면, 암을 가진 세포들을 치료하기 위한 조성물이 제공되는데, 전술한 조성물은 최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제와 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합을 포함한다.

이러한 조합 접근법은 상기 티오레독신 분자 (그리고 Trx 환원효소 효소가 아닌)의 직접적인 저해가 관련된다. 전형적으로 티오레독신은 티오레독신 분자와 최소한 한 가지 다른 화합물과의 반응에 의해 저해된다. 더욱이 전형적으로 상기 반응은 티오레독신 분자의 구조를 변경시킨다.

따라서, 본 발명은 TNFR 항진제와 티오레독신 저해제의 복합 치료가 기능적으로 (세포내 신호생성 기전) 및 사전-자가사멸성 잠재력 모두에서 불용성 상당히 가교된 TNFR 항진제에 의해 촉발되는 것과 대등한 과정에 관여하는 장점을 가진다. 이러한 복합 접근방식은 최대의, 사전-자가사멸성, TNFR 항진제-구동된 시그날을 얻고, 복합적인 그리고 불용성 시그날 전달 전략을 이용하는 필요성을 경감시킨다.

바람직하게는, 전술한 TNFR 항진제는 수성 매질 및/또는 벌크 상(bulk phase) 용액에서 가용성이다. 전형적으로 상기 TNFR 항진제는 하나 또는 그 이상의 TNFR의 리간드이다.

한 구체예에서 상기 TNFR 항진제는 비-전형적 항진제이다. 전형적으로 전형적 사멸 수용체들은 수용체들의 세포질(세포내) 꼬리 안에 사멸 도메인을 포함하며, 이 도메인을 통하여 수용체는 이들의 자가사멸성 시그날 ( 예를 들면 전형적, FADD/TRADD, 카스파제-8 그리고 카스파제-3 경로)을 전달하는 수용체들이다. 더욱이 비-전형적 수용체들은 동일한 하류 신호생성 경로에 참여없이 아팝토시스를 유도한다.

전형적으로 상기 TNFR 항진제는 재조합 가용성 삼합체성 리간드들, 재조합 가용성 다합체의 리간드들, 항진성 TNFR 항체들 (단독 또는 적절한 면역글로블린을 이용하여 가교된), 세포 표면-존재하는 또는 막-존재하는 TNFR 항진제들(보통 삼합체성 리간드들 또는 항체들), TNFR 나노입자들상의 항진제들, 바이러스 발현 벡터에 의해 전달된 TNFR 리간드들중 임의의 하나 또는 임의의 조합이다.

한 구체예에서 상기 TNFRs는 CD40, 림프톡신 수용체, 헤르페스바이러스 진입 매개체 (HVEM), Fas, TNF-수용체들 I & II, TRAIL-수용체들, DcR3, TRAMP, TWEAK, RANK, BAFF-수용체, BCMA, CD30, OX40, GITR을 포함한다.

한 구체예에서 상기 TNFR 항진제는 최소한 한 가지 림프톡신 베타 수용체 (LTbR) 항진제이다. 전형적으로 상기 TNFR은 인간화된 사가(tetravalent) LTBR 항진성 항체다.

바람직하게는 상기 TNFR은 CD40이다.

한 구체예에서, 전술한 티오레독신 저해제는 산화환원(redox) 저해제다. 전형적으로 상기 티오레독신 저해제는 상기 티오레독신-1 경로의 저해제다. 더욱이 전형적으로 상기 티오레독신 저해제는 2-[(1-메틸프로필)디티오]-1H-이미다졸 (PX-12), PMX464, 전술한 것들의 유사체 및/또는 이와 유사한 것들중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 포함한다.

전형적으로 상기 TNFR 항진제 및/또는 티오레독신 저해제는 약리학적으로 상당한 양이 이용된다. 더욱이 전형적으로 이러한 조합 접근방법을 이용하여 상대적으로 더 적은 투여분량의 PX-12는 대략 2 μg/mL으로 이용된다.

PX-12는 Trx-특이적 저해제이며, Trx 단백질 상에 아미노산 Cys73에 결합함으로써 비가역적(irreversible) 저해제로 기능한다 전형적으로 PX-12의 농도는 2 μg/mL이거나 또는 이보다 적다. 이는 세포독성을 획득하기 위하여 통상적인 PX-12 치료에 요구되는 훨씬 더 많은 투여 분량(10 내지 25 μg/mL)과 유리하게 비교된다.

본 발명의 제 2 측면에서, 제 1 조성물은 인간 및/또는 동물에서 암종 치료를 위한 약물로써 이용되는데, 전술한 조성물은 최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제와 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합을 포함한다.

전형적으로 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제 및/또는 상기 티오레독신 저해제의 약제학적으로 수용가능한 염이 이용된다.

제 1 조성물을 이용한 인간 및/또는 동물 암종 세포들의 치료 방법, 전술한 조성물은 최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제와 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합을 포함한다.

본 발명의 구체예들은 첨부되는 도면을 참고하여 설명된다.

도 1은 가용성 CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5), 티오레독신 저해제 (PX-12), G28-5 및 PX-12의 조합으로 치료된 암종 세포와, 치료안된 세포들(대조군)에서 아팝토시스를 비교하는 그래프다;
도 2는 막 결합된 CD40 항진제 mCD40L, (항진성 항체 G28-5), 티오레독신 저해제 (PX-12)가 복합된 가용성 항진제 (항진성 항체 G28-5)로 치료된 암종 세포들, 그리고 치료안된 세포들(대조군)에서 아팝토시스를 비교하는 그래프다;
도 3은 가용성 CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5), 3 μM 티오레독신 저해제 (PX-12), CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5)와 3 μM의 티오레독신 저해제 (PX-12) 조합, 그리고 치료안된 세포들(대조군)에서 아팝토시스를 비교하는 그래프다;
도 4a-4d는 건강한 대조군 세포들 (가령 비이클 단독), 티오레독신 저해제 PX-12 단독, PX-12 + 항진성 항-CD40 항체 G28-5 및 PX-12 + 가교된 재조합 MegaCD40L™ 조제물 각각으로 처리된 암종 세포의 상 대비 영상을 나타낸다;
도 5는 방광암 세포들에서 아팝토시스와 mCD40L로 처리한 후 ASK-1 shRNA를 발현시키는 ASK-1 단백질 녹아웃(knock out) 유도체들을 비교한 그래프다;
도 6a 및 6b는 방광암 세포들에서 아팝토시스와 mCD40L로 처리한 후 ASK-1 shRNA를 발현시키는 ASK-1 단백질 녹아웃(knock out) 유도체들의 전기영동 결과 영상을 나타낸다;
도 7은 가용성 CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5)로 치료된 방광암 EJ 세포들에서 아팝토시스와 ASK-1 단백질 녹아웃 유도체 ('S18')를 비교하는 그래프이며, Trx 저해제 (PX-12), 또는 이들의 조합의 농도가 표시된다;
도 8은 5 microg/mL의 림프톡신 베타 수용체 (LTbR) 항진제 (인간화된 사가(tetravalent) LTBR 항진성 항체 BS-1), 4microM of Trx 저해제 (PX-12), 그리고 이들의 조합으로 치료된 결장직장 암종 SW480 세포들을 비교한 그래프다;
도 9는 25 microg/mL의 림프톡신 베타 수용체 (LTbR) 항진제 (인간화된 사가(tetravalent) LTBR 항진성 항체 BS-1), 8microM of Trx 저해제 (PX-12), 그리고 이들의 조합으로 치료된 방광 암종 EJ 세포들을 비교한 그래프다; 그리고
도 10a 및 10b는 치료하지 않은 방광 암종 EJ 세포들(대조군)과 PX-12 및 BS-1의 조합으로 치료된 방광 암종 EJ 세포들을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 충실성(solid) 종양들의 항암 치료법을 위하여 암종 세포들 안에서 세포독성 반응을 유도하지 위하여 TNFR 항진제와 티오레독신 (Trx) 저해제의 복합 사용한다.

PX-12는 TrxR (Trx 환원효소) 저해제가 아닌, Trx-특이적 저해제이며, Trx 단백질 상에 아미노산 Cys73에 결합함으로써 비가역적(irreversible) 저해제로 기능한다.

상기 TNFR 항진제는 생물학적 기능 농도(세포내 ROS 수준을 유도)로 이용되지만, 아팝토시스를 야기하지 않거나 또는 거의 야기하지 않았다. 그러나, 세포 사멸을 유도하지 않거나, 또는 거의 유도하지 않는 농도(준-세포독성)에서 제공되는 Trx 저해제와 복합될 때, 아팝토시스를 상당히 유도하였다.

우리의 생물학적 연구에서, 본 명세서에서 공개된 복합 치료가 기능적으로 (세포내 신호생성 기전) 및 사전-자가사멸성 잠재력 측면 모두에서 상당히 가교된 TNFR 항진제에 의해 촉발되는 것과 대등한 경로에 관여한다는 것을 보여주었다. 따라서 이러한 조합 접근방법은 최대의, 사전-자가사멸성, TNFR 항진제-구동된 시그날을 얻고, 복합적인 시그날 전달 전략을 무효화시킨다.

활성 산소 종 (ROS) 분자들은 만성적 발암성 자극 및 대사 활성의 증가로 인하여 암종 세포들 안에서 점진적으로 축적된다는 증가가 증가되고 있다. ROS는 종양 미세환경에서 세포 스트레스에 대한 암 세포들의 반응으로써 세포 성장을 지원하는데 중요한 것으로 보이며, 이들은 또한 만성 유전적 불안정성을 강화시킨다. 그러나, ROS의 증가된 기저 수준은 종양 세포들이 아팝토시스에 더 민감해지도록 만들 수 있다. 상기 TNFR 패밀리의 멤버, 이를 테면 CD40에 의해 촉발된 사전-자가사멸성 시그날은 세포 사멸을 유도하기 위하여 지속된 ROS 활성화를 이용한다. 이러한 시그날들은 세포내 ROS 수준을 특정 생물학적 임계치 이상으로 증가시키고, 이는 세포 성장보다는 아팝토시스를 유도하는 방향으로 신호생성 균형을 이동시키는 것으로 보인다.

증가된 ROS 수준과 세포 사멸 유도와 연계된 가장 특징적인 세포내 신호생성 경로는 아팝토시스 시그날-조절 키나제-1 (ASK-1)이다. ASK-1는 Jun-N-말단 키나제 (JNK)가 활성화되고, 다시 미토콘드리아-중개된 아팝토시스를 촉진시키는 세포내 신호생성 캐스캐이드를 유도할 수 있다. 이것은 생리학적 환경하에서 세포 사멸을 유도하기 위하여 이 경로의 중요한 능력이며, ASK-1은 비활성인 상태로 유지된다. 상기 티오레독신 (Trx) 단백질 패밀리의 멤버들은 효과적인 항산화제로 기능을 할 수 있다. 상기 패밀리의 가장 잘 특징화된 멤버인, 티오레독신-1은 ASK-1에 물리적 결합에 의해 ASK-1 활성의 저해를 담당하고, 따라서 생리학적 조건하에 상기 키나제를 비활성화된 상태로 유지시킨다. 여전히, CD40 활성화 이후, ROS의 지?적으로 증가된 수준 상태에서 Trx는 산화되기 시작하고, 더 이상 ASK-1에 결합하지 않으며, 이로 인하여 ASK-1의 방출이 허용되며, 세포 아팝토시스가 유도된다.

ROS의 증가된 기저 수준은 성장 장점을 제공하지만, 종양 세포들이 ROS-중개된 독성으로부터 보호된다는 것이 보장되어야 한다. 종양 세포들이 산화성 스트레스로부터 보호하기 위하여 발달시키는 기전중에 하나는 ROS-중개된 아팝토시스에 대항한 보호 기저의 유도다. 특히, 대개 종양 세포들은 ASK-1가 저해되도록 유지시키기 위한 시도로 Trx 패밀리 멤버를 상향 조절(up-regulate)할 수 있는 것으로 보인다.

따라서, a) 세포내 ROS의 균형을 세포보호성 임계치 이상으로 이동시키고, 그리고 b) Trx-매개된, 항-자가사멸성 세포보호를 차단시키는 섭생으로 암종 세포들의 치료는 치료목적으로 이용될 수 있는 새로운 경로를 제공한다.

가용성 CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5), 표시된 농도의 Trx 저해제 (PX-12), 또는 이들 조합으로 치료된 방광 암종 세포들(EJ)과 이들 결과는 치료안된 세포들(대조군)과 비교된 비교 결과를 나타낸 도 1을 우선 참고한다. 아팝토시스는 Cytotox-Glo 분석 (Promega)을 이용하여 48시간 후 평가된다. 가공안된 데이터(상대적 발광 단위)가 제시되며, 결과는 3가지 독립 실험을 대표하는 것으로 각 조건에서 6가지 기술적 복제가 실행되었다.

비록 가용성 CD40 항진제와 Trx 저해제 (사전-적정 실험후 최저 세포독성을 보이는 선택된 농도)는 단독으로는 세포독성이 없거나 거의 없지만, 복합되면, 이들은 암종 세포에서 방대한 아팝토시스를 유도한다는 것이 이 결과에서 나타난다.

도 2는 CD40-매개된 아팝토시스를 유도하기 위하여, 방광 암종 세포들 (EJ)은 막 CD40 리간드, mCD40L (mCD40L을 발현시키는 성장-중지된 제삼자 세포들과 공동-배양함으로써) 또는 with Trx 저해제 (PX-12)와 복합된 가용성 항진제 (항진성 항체 G28-5)로 처리된 결과를 나타낸다. 아팝토시스는 Cytotox-Glo 분석 (Promega)을 이용하여 48시간 후 평가된다. 결과는 음성 대조군과 비교하여 상대적인 루시퍼라제(luciferase)로 나타내며, 결과는 4가지 독립 실험을 대표하는 것으로 각 조건에서 6가지 기술적 복제가 실행되었다.

도 3에서 결장직장 암종 세포들(HCT116)은 가용성 CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5), 표시된 농도의 Trx 저해제 (PX-12), 또는 이들 조합으로 치료되었고, 결과는 치료안된 세포들(대조군)과 비교된 것을 나타낸다. 아팝토시스는 Sensolyte (Anaspec) 분석 (Cambridge Biosciences)을 이용한 처리 24시간 후 카스파제 활성 탐지에 근거하여 평가되었다. 결과는 음성 대조군과 비교하여 상대적인 형광(상대적 카스파제 활성)으로 나타내며, 결과는 2가지 독립 실험을 대표하는 것으로 각 조건에서 6가지 기술적 복제가 실행되었다.

가용성 CD40 항진제와 Trx 저해제는 단독으로 카스파제 활성화의 유도에 의해 증명되는 것과 같이, 대조군과 비교하여 어느 정도의 세포 독성을 나타낸다는 것이 상기 결과에서 나타난다. 그러나, 가용성 항진제와 Trx 저해제의 조합은 암종 세포들에서 방대한 아팝토시스를 유도하였다.

도 4는 a) 비이클 단독 (가령 대조군, 건강한 세포들), b) Trx 저해제 PX-12 단독, c) PX-12 + 항진성 항-CD40 항체 G28-5 그리고 d) PX-12 + 가교된 재조합 MegaCD40L™ 조제물 (Enzo Life Sciences)로 처리된 결장직장 암종 세포들 HCT116을 나타낸다.

항진성 항-CD40 항체 G28-5 단독 또는 가교된 재조합 MegaCD40L™ 조제물로 처리된 대조군 배양물은 생존력의 상실 징후를 나타내지 않았으며, 패널"a"와 유사하였다 (나타내지 않음).

96 웰 플레이트에서 성장 저해 및 아팝토시스의 시각적인 징후를 평가하기 위하여 x100 확대에서 상 대조 영상을 찍었다.

상기 결과는 가용성 항진제들과 Trx 저해제의 조합만이 암종 세포들에서 탐지가능한, 방대한 아팝토시스를 유도한다는 것을 보여주는 아팝토시스 탐지 분석과 일치한다(도 3).

상기 결과들은 암종 세포들을 가용성 항진제와 Trx 저해제의 복합 처리하면 상당히 가교된 막-존재하는 CD40 항진제 (mCD40L)와 동일한 수준의 아팝토시스가 유도된다는 것을 나타낸다.

전술한 결과들은 다음을 이용하여 획득되었다:

세포 배양:

암종 세포 계통 EJ 및 HCT116 (European Collection of Cell Cultures, ECACC에서 구함)은 5% 태아 송아지 혈청(FCS, Biosera) 및 1% (2mM) L-글루타민(Sigma)이 보충된 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma)와 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI, Sigma) (DR)의 50:50(v/v) 혼합물에서 유지된다. 세포들은 대기에서 5% CO2의 가습 대기하에서 37℃에서 배양되었다. 통상적인 계대 및 실험을 위하여 세포 단층은 칼슘 킬레이트를 위하여, 그리고 해리를 촉진시키기 위하여 37℃에서, 5분간 PBS에서 에틸렌디아민테트라-아세트산 이나트륨 염(EDTA)에서 0.1%(w/v)로 배양되었다. 그 다음 세포는 0.25% (w/v) 트립신과 0.02% (w/v) EDTA가 포함된 0.5mL 의 Hank 완충된 염 용액(HBSS; Invitrogen)에서 37℃, 1 분 미만으로 항온처리하였다. 세포들은 10mL의 DR 5%의 현탁액으로 제거되었고,"improved Neubauer" 혈액세포측정계 (VWR)를 이용하여 단일 세포 현탁액에서 카운트되었다.

아팝토시스 탐지 분석:

EJ 및 HT116 세포들은 백색 96-웰 플레이트 (웰당 각각 8 x 10³ 및 6 x 10³ 세포들 )에 접종되었고, 하룻밤동안 항온처리되도록 두었다. 다음날 세포들은 1시간동안 DR 5% 배지에서 PX-12의 표시된 농도로 사전-처리되었다. PX-12으로 처리후, 항진성 항-CD40 mAb G28-5 또는 MegaCD40L™ 조제물 (Enzo)은 배지에 각각 10ug/mL 또는 10ug/mL의 최종 농도로 추가되었다. 그 다음 세포는 48시간 동안 항온처리되었고, FLUOstar™ OPTIMA (BMG Labtech) 플레이트 판독기 상에서 CytoTox-Glo™ 세포 사멸 탐지 분석 (제조업자의 지시에 따라)을 이용하여 세포 사멸이 평가되었다. 대안으로, 24 또는 48 시간 후, 카스파제 활성은 SensoLyte® Homogenous AFC Caspase-3/7 Assay Kit (Anaspec)를 이용하여 결정되었다. 기질을 추가한 후, 세포들은 하룻밤 동안 방치한 후, 상대적 형광은 FLUOstar™ OPTIMA (BMG Labtech) 판독기 상에서 측정되었다(여기 355 및 방출 520 필터 이용).

현미경 검사:

투명한 96-웰 플레이트에 접종된 HCT116 세포들을 표시된 농도의 항진제들과 PX-12 (상기에서 설명된 바와 같이)로 표시된 시간 동안 처리한 후 성장 저해/아팝토시스와 관련된 형태학적 변화는 상 대비 현미경 EVOS XL Core 디지탈 역 현미경 (Peqlab)에서 x200 확대에서 시각화되었다.

도 5는 레트로바이러스 형질유도 후 방광암 EJ 세포들과 ASK-1 shRNA를 발현시키는 ASK-1 단백질 녹-아웃 EJ 세포 유도체('S18') 의 비교 그래프를 나타낸다. 상기 세포들은 mCD40L로 처리되었으며, 아팝토시스는 48시간 후 Cytotox-Glo 분석 (Promega)을 이용하여 그리고 면역-블랏팅을 이용한 포스포-JNK 및 Bax의 수준을 측정함으로써 평가된다. 블랏팅의 영상은 도 6a 및 6b에서 볼 수 있다.

이 테스트는 ASK-1 녹다운 세포 안에서 p-JNK 및 Bax의 결핍을 통하여 세포 사멸에서 ROS-ASK1 신호생성 경로의 중요성과 Cytotox Glo를 이용하여 평가된 ASK-1의 상실로 인한 아팝토시스의 저해를 설명한다.

도 7은 가용성 CD40 항진제 (항진성 항체 G28-5), 표시된 농도의 Trx 저해제 (PX-12), 또는 이의 조합으로 처리된 방광암 EJ 세포들과 ASK-1 단백질 녹아웃 유도체 ('S18') 의 비교를 나타낸다. 아팝토시스는 Sensolyte (Anaspec) 분석 (Cambridge Biosciences)을 이용한 처리 24시간 후 카스파제 활성 탐지에 근거하여 평가되었다.

복합 치료법 (가용성 항진제 G28-5 및 Trx 저해제 PX-12)은 J 세포들에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 볼 수 있다. 또한, EJ 세포(S18 세포들)에서 ASK-1의 상실로 아팝토시스는 실효되고, 이는 카스파제 탐지에 의해 평가되었다.

이들 결과는 ROS-ASK1 신호생성 경로가 mCD40L에 의한 아팝토시스의 유도에 필수적이며, 그리고 Trx/TNF 항진제 복합 치료법에 의한 아팝토시스 유도에도 필수적임을 설명한다. 이는 복합 치료법이 암종 세포들에서 사멸을 유도하는데 대등하게 효과적이며, 세포에서 동일한 신호생성 경로에 관여한다는 증거를 제공한다.

도 8을 참고하면, 도 8은 결장직장 암종 SW480 세포들을 5microg/mL의 림프톡신 베타 수용체 (LTbR) 항진제 (인간화된 사가(tetravalent) LTBR 항진성 항체 BS-1, Biogen Idec Inc ), 4microM의 Trx 저해제 (PX-12), 그리고 이들의 조합으로 처리한 후 결과(세포 사멸 %)를 나타낸다. 아팝토시스는 Cytotox-Glo 분석 (Promega)을 이용하여 12시간 후에 평가된다. 결과는 음성 대조와 비교하여 상대적인 루시퍼라제 활성으로 나타내며, 세포 사멸의 후속 비율(%)은 제조업자의 지시에 따라 각 조건에서 추론된다. 결과는 2가지 독립 실험을 대표하는 것으로 각 조건에서 6가지 기술적 복제가 실행되었다.

LTbR 항진제 단독은 암종 세포들에서 사전-자가사멸성 활성이 거의 없고, Trx 저해제 단독은 방대한 수준은 아니지만 어느 정도의 세포독성이 있으나, Trx 저해제/수용체 항진제 복합 치료법은 이들 세포에서 신속하고 방대한 아팝토시스를 공조적으로 유도한다는 것이 이들 결과에서 설명된다. 더욱이, 복합 접근 방법의 효과는 CD40-특이적이 아니며, Trx 저해제/TNFR 항진제는 상기 TNFR 패밀리의 다른 멤버에 영향을 미친다는 것이 설명된다.

도 9 및 10은 복합 접근 방법의 개선된 효과의 증거를 더 제공하는데, 96-웰 플레이트에서 배양된 방광 암종 EJ 세포들은 25microg/mL의 림프톡신 베타 수용체 (LTbR) 항진제 (인간화된 사가(tetravalent) LTBR 항진성 항체 BS-1, Biogen Idec Inc), 8microM of Trx 저해제 (PX-12), 및 이의 조합으로 처리되었다.

세포 생존성은 Cell Titre Aqueous One Solution 분석 (Promega)이용하여 48 시간 후에 평가되었다. 결과는 492nm에서 흡수도로 나타내며, 값은 세포 생존력을 대표한다. 결과는 2가지 독립 실험을 대표하는 것으로 각 조건에서 6 내지 8가지 기술적 복제가 실행되었다.

상기에서 실행한 대표적인 실험의 배양물은 상 대비 현미경에 의해 평가되었으며, 영상은 대조군과 처리된 세포들에서 세포 사멸의 시각적 신호와 생존력 상실을 정량적으로 확인하기 위하여 x100 확대에서 취한 것이다. 이 결과들은 도 10에서 볼 수 있다.

이 결과는 도 8의 발견과 일치되며, LTbR 항진제 단독은 암종 세포들에서 사전-자가사멸성 활성이 거의 없고, Trx 저해제/수용체 항진제 복합 치료법은 이들 세포에서 신속하고 방대한 아팝토시스를 공조적으로 유도한다는 것이 이들 결과에서 설명된다. 이러한 발견은 상기 TNFR 패밀리의 다른 멤버 (CD40이외의), 구체적으로 LTbR의 복합 접근방법의 효과와, 상이한 유형의 암 세포들(가령, 방광 및 결장직장)은 상당히 민감하다는 것을 확인시킨다.

Claims

A 최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제와 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합이 포함된, 암을 가진 세포들을 치료하기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 TNFR 항진제는 수성 매질 및/또는 벌크 상(bulk phase) 용액에서 가용성인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 TNFR 항진제는 하나 또는 그 이상의 종양 괴사 인자 수용체들에 대한 리간드인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 상기 TNFR 항진제는 비-전형적 항진제인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 상기 TNFR 항진제는 재조합 가용성 삼합체성 리간드들, 재조합 가용성 다합체의 리간드들, 항진성 TNFR 항체들 (단독 또는 적절한 면역글로블린을 이용하여 가교된), 세포 표면-존재하는 또는 막-존재하는 TNFR 항진제들, TNFR 나노입자들상의 항진제들, 바이러스 발현 벡터에 의해 전달된 TNFR 리간드들중 임의의 하나 또는 임의의 조합인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 상기 TNFR 항진제는 최소한 한 가지 림프톡신 베타 수용체 (LTbR) 항진제인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 티오레독신 저해제는 산화환원 저해제인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 티오레독신 저해제는 상기 티오레독신-1 경로의 저해제인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 티오레독신 저해제는 2-[(1-메틸프로필)디티오]-1H-이미다졸 (PX-12), PMX464, 전술한 것들의 유사체둘중 임의의 하나 또는 임의의 조합인, 조성물.
인간 및/또는 동물에서 암종 치료를 위한 약물로써 이용되는데, 전술한 조성물은 최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제와 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합을 포함하는, 인간 및/또는 동물에서 암종 치료를 위한 약물로써 이용되는 용도의 제 1 조성물.
청구항 10에 있어서, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제 및/또는 상기 티오레독신 저해제의 약제학적으로 수용가능한 염이 이용되는, 제1조성물.
암종 세포들의 치료 용도의 최소한 한 가지 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 항진제 그리고 최소한 한 가지 티오레독신 저해제의 조합이 포함된, 조성물.