KR20150123098A

KR20150123098A - 야생화 추출물을 주성분으로 하는 항산화 활성 및 대사증후군 예방용 조성물

Info

Publication number: KR20150123098A
Application number: KR1020140049584A
Authority: KR
Inventors: 권지웅; 채규서; 손락호; 이태범; 최혜란; 이민정; 이정현; 정종태
Original assignee: 재단법인 베리앤바이오식품연구소
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2015-11-03

Abstract

본 발명은 야생화인 해당화, 매화, 목련, 산국화의 추출물을 주성분으로 하는 항산화 활성 및 대사증후군에 해당하는 항산화, 혈중지질개선, 혈압 개선 및 항당뇨 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

야생화 추출물을 주성분으로 하는 항산화 활성 및 대사증후군 예방용 조성물{Composition for Antioxidant Activity and Anti-metabolic syndrome Using Main Component with Extract of Wild Plants}

본 발명은 야생화 추출물을 주성분으로 하는 항산화 활성 및 대사증후군 예방용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 야생화인 해당화, 매화, 목련, 산국화의 추출물을 주성분으로 하는 대사증후군에 해당하는 항산화, 혈중지질개선, 혈압 개선 및 항당뇨 예방용 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라는 식습관의 변화로 인하여 비만인구 증가 및 심장병, 당뇨, 고혈압 등의 만성질환인 대사증후군 환자가 증가하고 있는 추세이다(1). 대사증후군(metabolic syndrome, 代謝症候群)이란 만성적인 대사 장애로 인하여 내당능 장애, 고혈압, 고지혈증, 비만, 심혈관계 죽상동맥 경화증 등의 여러 가지 질환이 한 개인에게서 한꺼번에 나타나는 것을 말한다. 즉, 포도당을 분해해 간·근육 등으로 보내는 역할을 하는 인슐린이 제대로 만들어지지 않거나, 제기능을 하지 못할 경우 당뇨병·고혈압·뇌졸중·심장병 등 각종 성인병이 생긴다는 사실이 밝혀졌다. 대사증후군의 원인은 체내에 인슐린이 있더라도 제대로 운반하지 못하는 저항성으로 인해 고혈당은 개선되지 않은 채, 인슐린 농도만 높아지는 데 있다. 주요 증상은 혈당 대사이상으로 인한 당뇨병, 지질대사 이상으로 인한 중성지방 증가, 고밀도 콜레스테롤, 나트륨 성분 증가로 인한 고혈압, 요산 증가로 인한 통풍 등이다. 그러나 보통 복부비만, 당뇨, 고밀도 콜레스테롤, 고혈압, 고중성지방 등 5가지 지표 가운데 3가지 이상이 기준치를 넘으면 대사증후군으로 본다.

인체내에서 산화적 스트레스를 유발시키는 프리라디칼(free radical)은 활성산소를 말하며 자유기 또는 유리기라고 불린다. 활성산소는 동식물의 체내 세포들의 대사과정에서 생성되는 산소화합물로 노화나 동맥경화, 암 등의 원인과 관계가 있는 것으로 알려지고 있다. free radical은 수많은 화합물의 화학적 반응 및 여러 가지 산화, 환원 반응 등 내적 요인과 흡연, 음주, 스트레스, 대기오염 등 외적요인에 의해 생성되며, 생체 내에서 free radical 반응에 의해 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 DNA 분절과 단백질의 불활성화 및 과산화 반응을 일으켜 생체기능을 저하시킴으로서 여러 질환을 유발하는 원인이 된다(2-4). 체내에서 생성되는 활성산소종은 세포내 항산화효소에 의해 조절되거나 식품으로부터 섭취되는 항산화성분(항산화비타민 및 폴리페놀성분)에 의해 소거되는 것으로 알려져 있다(5). 이러한 활성산소종이 야기하는 손상을 억제하기 위해 사용되어 왔던 BHA(butylated hydroxy anisol)와 BHT(butylated hydroxy toluene) 등의 합성항산화제들은 우수한 항산화효과 및 경제성에도 불구하고 안전성의 문제로 사용이 제한되어 있어 이들 합성항산화제를 대체할 수 있는 천연 항산화제에 대한 개발이 요구되어지고 있다(6). 따라서 최근 식물류에 들어있는 생리활성 성분에 대한 관심이 높아져 이들 천연식물 소재들을 기능성식품 원료로 이용하고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다(7).

목련(Magnolia denudata)은 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 낙엽관목으로서 제주도에 자생하고 주로 관상용으로 심고 있으며, 국외로는 주로 일본에 분포하고 있다(7). 목련과 식물의 대표적인 식물인 목련의 꽃봉오리는 한방에서 신이(辛夷)라 불리며 두통, 비색, 치통, 축농중에 쓰이고 있으며, 수피 추출성분에는 항균활성(8) 및 항염증활성(9) 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

해당화(Rosa rugosa Thunb.)는 장미과 장미과속으로 해안가에 자생하는 낙엽관목이며, 한국, 중국을 포함한 동아시아이의 온대지역부터 아한대지역까지 넓게 분포하고 있다(10). 해당화에는 vitamin C가 풍부하며, terpenoid 및 quercetin, rutin 등의 flavonoid와 rugosin 등의 가수분해형 탄닌 및 catechin, catechin 유도체의 축합형 탄닌 등이 보고되어 있다(11-14). 이러한 성분들은 항산화, 항염증, 항고지혈증, 피부노화예방 등(15-18)의 기능성을 가지는 것으로 보고되고 있어 해당화의 기능성식품으로서의 이용 및 의약품소재로서의 연구가 활발히 진행되고 있다.

매화(梅花)나무의 원산지는 중국으로 우리나라에서는 삼국시대부터 꽃을 관상할 목적으로 정원에 심었고 열매를 이용한 것은 한의학이 도입된 고려중엽 때부터라고 알려져 있다. 매화는 간을 편안하게 하며, 담을 삭이고, 뭉치고 막힌 것을 풀어주고, 해독하며, 마음의 안정을 도우며 머리와 눈을 맑게 하는 효능이 있는 약재로 사용되어져 왔다. 뿐만 아니라 단아한 색채와 부드러우면서 넓게 퍼지는 향기로 예로부터 선비들이 즐겨하는 사군자의 하나를 이루었던 식물로 사람들의 마음을 맑고 깨끗하게 해주는 은은한 향을 지닌 꽃으로 표현해 왔다. 이처럼 꽃은 은은한 향기와 화색으로 자연을 아름답게 꾸며주고 인간의 심신을 맑게 해주는 역할을 하여 동양에서는 질병 치료로 현대 의학에서는 정신치료와 원예치료약으로 활용되어지고 있다(19-21). 매화의 열매인 매실(梅實)은 한방에서 수렴(收斂), 지사(止瀉), 생진(生津), 진해(鎭咳), 구충(驅蟲)의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

국화(菊花)는 우리나라 중부 이남 지역의 산간지에 주로 분포하여 자생하며 신라 중엽 성덕왕 때부터 국화 꽃잎을 이용하여 국화주를 담아 마셨다는 중국 유래의 중양절 고사가 있다. 국화과 식물들은 관상식물로서 가치가 높으며, 우수한 약리효과로 식약용식물로 사용되어 왔다. 국화과 Chrysanthemum속 식물의 대표적인 약리효과로는 항에이즈, 항균, 항진균 및 항산화효과 등이 있으며, 주로 산국(C. boreale)과 감국(C. indicum Linne)에서 기능성 생리활성 연구가 보고되었다. 국화(C. morifolium Ramat.)는 전통적으로 위장, 감기, 두통, 현기증, 고혈압 등에 효과적인 것으로 알려져 있고, 항바이러스, 항균 및 항암 활성 등이 있는 것으로 보고되어 있다(22-28). 따라서 본 발명에서는 다양한 생리활성이 알려진 해당화, 매화, 목련, 산국화 꽃의 항산화 활성 및 HepG2 세포를 이용한 콜레스테롤 생성 억제 활성, HUVEC 세포를 이용한 Nitric Oxide 생성에 미치는 효과, NIT 세포를 이용한 인슐린 생성 효과를 비교하여 이에 대한 이용가능성을 확인하고자 하였다.

한편, 대사증후군 질환의 예방 및 치료에 대한 선행기술로는 한국특허공개번호 10-2014-0031080(복분자 미숙과 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 조성물)은 복분자 미숙과 추출물의 유효성분이 지질 대사 관여 유전인자 및 효소의 발현을 억제하고, 체중, 지방 및 당 내성도를 감소시키며, 중성지질(TG) 및 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤을 감소시키고, HDL-콜레스테롤을 증가시키며, 지방간을 억제하며, 혈액순환을 촉진하여 대사증후군 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

한국특허공개번호 1020110122158(대사성 증후군의 조절을 위한 스파란터스 인디커스 및 가르시니아 망고스타나 유래의 조성물)은 이로부터 유래된 추출물(들), 분획물(들), 활성 화합물(들) 및 식물화학물질 또는 이들의 혼합물로부터 조합된 조성물에 관한 것이다. 포유동물에 있어서, 비만, 대사성 증후군, 당뇨병 및 다른 대사성 장애의 조절, 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.

한국특허공개번호 10-2009-0077572(용암해수 탈염 미네랄수를 유효성분으로 포함하는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물)은 상기 용암해수 탈염 미네랄수를 사용하여 당뇨 및 비만을 억제함으로써 대사증후군 관련 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용할 수 있다.

한국특허등록번호 10-0892692(대사증후군의 예방치료용 조성물)는 벤젠환에 두 개의 수산화기가 치환되어 있고 트랜스형의 올레핀기에 케톤기와 메틸기가 붙어 있는 화합물과 상황버섯 및 차가버섯의 균사체 추출물 그리고 양파추출물을 혼합하여 조성한 대사증후군의 예방치료용 조성물에 관한 것이다.

한국특허공개번호 10-2014-0002410(문주란 추출물을 포함하는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물)은 혈당을 저하시키고, 혈중 콜레스테롤 및 LDL(low density lipoprotein) 함량을 낮추며, 증체량이나 지방 증가량을 낮추고, 지방세포의 크기와 복벽 지방 두께의 증가를 억제시킬 뿐만 아니라, 인체에 무해한 문주란 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한국특허공개번호 10-2012-0022085(콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제형)는 콩잎 주정 추출물을 유효성분으로 하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 및 치료용 제형의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 1) 콩잎 주정 추출물, 물 및 옥수수 전분을 각각 1:1:1의 함량으로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 단계 1)의 혼합물을 감압동결건조 하는 단계를 포함하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제형의 제조방법에 관한 것이다.

한국특허공개번호 10-2012-0120737(시네올을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 및 치료용 조성물)은 시네올은 HDL 기능을 강화시키고 콜레스테롤 역수송을 통해 항산화 활성과 지질 감소효과 등을 나타내어 비만, 당뇨, 동맥경화 및 고지혈을 포함한 대사증후군 예방 또는 치료에 효과를 나타냄으로, 본 발명의 시네올은 대사증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물, 건강식품 및 화장품 조성물에 활용가능할 것이다.

한국특허등록번호 10-1157028(호모이소플라바논을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사증후군 예방 및 치료용 조성물)은 지방세포의 분화를 저해하고, SIRT1을 높은 수준으로 유지시켜 체중, 복부지방 및 당내성도를 감소시키는 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 지방세포 분화를 억제하고 SIRT1을 높은 수준으로 유지하여 체중, 복부지방 및 당내성도를 감소시켜 비만, 비만 합병증 또는 대사증후군 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

한국특허공개번호 10-2012-0120736(정향 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 및 치료용 조성물)정향 추출물은 apoA-I의 당화를 강력하게 저해하고 강력한 환원력과 활성산소 제거력, 구리이온 매개된 LDL 산화에 대한 항산화력, 인간 CETP에 대한 저해활성, 체중감소, 항염증 활성 및 저지혈 활성을 나타내어 당뇨, 비만, 동맥경화, 고지혈증을 나타내는 대사증후군 예방 또는 치료에 효과적이므로, 본 발명의 정향 추출물은 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물 및 건강식품에 활용가능할 것이다.

한국특허등록번호 10-1349650(해송이 버섯 및 죽엽의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 하는 대사증후군 치료 또는 예방용 약학적 조성물)은 해송이 버섯 및 죽엽의 혼합 생약 추출물은 마우스 배아 섬유아세포 유래 지방세포인 3T3-L1에서 지방분화를 억제시켜주는 효과와 L6 의 근육세포에서 지방산의 합성 억제 및 지방산의 산화를 촉진시키며, 해당 및 산화적 인산화 뿐만 아니라 탄수화물의 세포 내 유입을 촉진시키며, 렙틴 수용체가 유전적으로 결여되어 비만과 고혈당인 유지되는 제2형 당뇨병 모델 db/db 생쥐에서 체중 감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 뿐만 아니라 당화혈색소 및 혈당을 감소시키므로 대사증후군의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 이용 가능하다. 그러나 이들 종래기술은 본 발명과 기술적구성이 다른 것이다.

소득증가로 인하여 식습관이 변화되면서 비만인구 증가 및 심장병, 당뇨, 고혈압 등의 대사증후군성의 만성질환이 증가하고 있는 추세이다. 생체 내에서 free radical 반응에 의해 생성되는 활성산소종은 DNA 분절과 단백질의 불활성화 및 과산화 반응을 일으켜 생체기능을 저하시킴으로서 이러한 여러 질환을 유발하는 원인이 된다. 그러나 식습관으로 인한 이러한 질병은 고치기가 어려운 문제점이 있다.

생체 내에서 free radical 반응에 의해 생성되는 활성산소종으로 야기되는 손상을 억제하기 위해 사용되어 왔던 BHA와 BHT 등의 합성항산화제들은 우수한 항산화효과 및 경제성에도 불구하고 안전성의 문제로 사용이 제한되고 있다. 따라서 최근 식물류에 들어있는 생리활성 성분에 대한 관심이 높아져 이들 합성항산화제를 대체할 수 있는 천연 항산화제에 대한 개발이 요구되어지고 있다. 본 발명은 해당화, 매화, 목련, 산국화들이 가지고 있는 라디칼 소거활성, 항산화효과, 콜레스테롤 생성 억제 효과, NO 생성 효과 및 인슐린 분비 효과를 파악하여 이들 천연식물의 추출물을 유효성분으로 하여 항산화 활성과 대사성증후군의 예방 및 치료용의 기능성식품 또는 의약품조성물로 제공하는데 있다.

본 발명의 야생화 추출물은 라디칼 소거활성, 항산화효과, 콜레스테롤 생성 억제 효과, NO 생성 효과 및 인슐린 분비 효과를 파악하여 이들 천연식물의 추출물을 유효성분으로 하여 항산화 활성과 대사성증후군의 예방 및 치료용의 기능성식품 또는 의약품조성물로 제공할 수 있다.

도 1은 야생화 4종의 DPPH 라디칼 소거활성(%)이다.
도 2는 야생화 4종의 물 및 50% 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성(%)이다.
도 3. 야생화 4종의 물 및 50% 에탄올 추출물의 콜레스테롤 생성 억제 효과이다.
도 4는 야생화 4종의 물 및 50% 에탄올 추출물의 NO 생성 효과이다.
도 5는 야생화 4종의 물 및 50% 에탄올 추출물의 인슐린 분비에 미치는 영향이다.

본 발명은 실험재료인 해당화, 매화, 목련 및 산국화의 구입 및 이들 추출물의 제조 단계와, 이들 야생화 4종의 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, 콜레스테롤 생성 억제 효과, NO 생성 효과 및 인슐린 분비에 미치는 영향을 실험 및 측정하는 단계로 구성된다.

<제조예 1>; 재료의 구입 및 처리

본 발명에서 사용한 해당화, 매화, 목련 및 산국화는 2013년 4월 전북 고창군 관내에서 채취한 것으로 수세 후 건조하여 분쇄한 후 추출물 제조에 사용하였다.

<제조예 2>; 추출물의 제조

해당화, 매화, 목련 및 산국화를 건조하여 분쇄한 것을 10 g씩 정량하여 둥근 플라스크에 정제수 및 50% 에탄올(EtOH)을 각각 100 mL을 가한 다음 물은 100℃에서, 50% EtOH은 80℃에서 2시간 2회 환류 추출을 하였다. 추출액을 여과지(Whatman NO. 2, Whatman International Ltd.,Maidstone, England)로 여과하고 얻은 여액을 감압농축기(Buchi R210, Switzerland)를 이용하여 농축 후 동결 건조하여 70℃ deep freezer(CLN-71UWM, Nihon, Japan)에서 보관하여 시료로 사용하였다.

<시험예 1>; 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법(29)을 응용하여 측정하였다. 추출 방법별로 추출물을 농축한 후 시료 용액에 Folin-Ciocalteu’s 시약 1 mL를 가하고 3분 후 10% Na₂CO₃ 용액(w/v) 1 mL를 넣고 1시간 실온에서 방치한 후 700 nm에서 비색정량 하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 Davis 방법(30)을 이용하여 측정하였는데, 시료용액 1 mL에 diethylene glycol 2 mL, 1 N-NaOH 0.02 mL를 가한 다음 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 방치하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. Rutin을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

<시험예 2>; DPPH 라디칼 소거활성 측정

해당화, 매화, 목련 및 산국화의 항산화 활성을 측정하기 위하여 자유라디칼인 DPPH를 사용한 항산화활성 측정법(31)을 응용하였다. 10, 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도로 조제한 각각의 추출물 100 μL에 ethanol 200 μL를 가하고 2x10^-4M DPPH용액 300 μL를 가한 후 vortex mixer로 교반하였고, 실온에서 30분간 반응시키고 ELISA(Synergy HT, Biotec, Washington DC, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신에 ethanol을 첨가하였고, positive control은 a-tocopherol을 사용하였다.

<시험예 3>; ABTS radical assay에 의한 scavenging activity

ABTS assay는 Art 등(32)의 방법을 응용하였다. 10, 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도로 조제한 각각의 추출물 5 μL에 ABTS radical 용액 195 μL를 첨가하여 7 분간 반응시킨 후 ELISA(Synergy HT, Biotec, Washington DC, USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 시료 대신에 ethanol을 첨가하여 실험 하였으며, positive control은 a-tocopherol을 사용하였다.

<시험예 4>; 환원력

환원력은 Oyaizu(33)의 방법을 이용하여 측정하였다. 10, 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도로 조제한 각각의 추출물 1 mL에 0.2 M phosphate buffer (pH 6.6, 2.5 mL)와 1% K₂Fe(CN)₆ 2.5 mL를 첨가하고 water bath(50℃, 20 min)에서 반응시켰다. 반응액에 10% trichloroacetic acid 2.5 mL를 첨가하여 원심분리(3,000g, 5 min)한 후 상등액 2.5 mL를 취한 후 증류수 2.5 mL와 0.1% FeCl₃ 500 μL를 첨가하여 UV/VIS spectrophotometer(UV-2450, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<시험예 5>; 콜레스테롤 생성 억제 효과

HepG2 세포를 6 well에 3×10⁵cells/㎖로 분주하여 24시간 배양 후 산국화, 해당화, 매화, 목련의 물과 50% 에탄올 추출물을 처리하였다. 24시간 후 세포배양액을 centrifucal filter units (Vivaspin 4, Sartorius stedium, Goettingen, Germany)를 사용하여 농축시켰다. 콜레스테롤의 총 양은 콜레스테롤 정량 키트(Cholesterol/cholesterol ester quantitation kit, BioVision, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.시료와 reagent를 섞어 빛을 차단 후 37℃에서 1시간 동안 배양하여 microplate reader (Synergy HT, Bio-Tek, USA)를 이용하여 530/590 nm에서 측정하였다.

<시험예 6>; NO 생성 효과

인간 제대정맥 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 12 well culture dish에 1×10⁵cells/㎖의 농도로 희석하여 분주하였다. 24시간 뒤 산국화, 해당화, 매화, 목련 물 추출물 및 50% 에탄올 추출물과 양성대조군으로서 sodium nitroprusside (SNP)를 처리하였고, 처리 24시간 뒤 세포배양액을 획득하였다. 처리군의 세포 배양액을 원심분리하여 상층액을 획득한 후 상층액 150 , griess reagent 시약 20 , 그리고 130 의 H₂O를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 반응물의 흡광도는 microplate reader(Synergy HT, Bio-Tek, Winooski,VT,USA)을 사용하여 흡광도 548 nm에서 측정하였다.

<시험예 7>; 인슐린 분비능에 미치는 영향

마우스 췌장 세포인 NIT-1 세포를 6 well plate에 3×10⁵ cells/㎖가 되도록 분주하고, 48시간 배양한 다음 세포로부터 배지를 완전히 제거하고, 포도당이 없는 Krebs-ringer buffer (pH 7.4)로 washing을 한 후 배지에 있는 포도당을 완전히 제거하고, 이 buffer를 1 ml씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 전처리 하였다. 포도당 농도에 따른 인슐린 분비력을 측정하기 위해 2 mM 포도당과 11 mM 포도당조건에 세포를 노출시킨 다음, 시료는 산국화, 해당화, 매화, 목련 물 추출물 및 50% 에탄올 추출물 400 ㎍/㎖씩 각각 첨가하였다. 6시간 동안 반응했을 때, 분비된 인슐린양을 Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA kit (Crystalchem, Inc., Downers Grove, IL)를 사용하여 측정하였다.

<실시예 1>; 야생화(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 항산화 활성

<실시예 1-1>; 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정

식물체에 존재하는 페놀화합물은 2차 대사산물로서 분자 내에 하나 이상의 hydroxyl기를 가지고 있어서 단백질 및 거대분자들과 결합하는 성질이 있고 2가 금속이온과의 결합력이 우수하며 수소 공여 작용을 통해 free radical을 제거함으로써 항산화 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(34, 35).

야생화(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 물 및 50% EtOH 추출물의 총 폴리페놀 함량은 표 1과 같다. 총 폴리페놀 함량은 해당화 > 목련 > 산국화 > 매화 순으로 나타났고, 모든 시료가 50% EtOH 추출물이 높은 함량을 보였다. 해당화 50% EtOH 추출물(RRE)은 379.60±21.44 mg/mL로 가장 높은 함량을 보였고, 목련 50% EtOH 추출물(MFE)은 190.44±21.82 mg/mL, 산국화 50% EtOH 추출물(WCE)이 176.52±0.86 mg/mL, 매화 50% EtOH 추출물(PME)이 133.33±7.40 mg/mL로 모든 시료가 매우 높은 총 폴리페놀 함량을 보였다. 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과도 모든 시료가 물 추출물 보다 50% EtOH 추출물이 높은 함량을 보였고, 목련 > 산국화 > 매화 > 해당화 순으로 MFE가 146.01±8.27 mg/mL, WCE가 176.52±0.86 mg/mL, PME가 67.77±4.10 mg/mL, RRE는 57.29±2.66 mg/mL로 모든 시료가 높은 총 플라보노이드 함량을 보였다.

<실시예 1-2>; DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성

DPPH는 아스코르빈산 및 토코페롤, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 전자나 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하여 환원되어짐에 따라 짙은 자색이 탈색되어지는 원리를 이용하여 다양한 천연소재로부터 항산화 물질을 탐색하기 위해 많이 이용되고 있다(36).

야생화(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 물 및 50% EtOH 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 도 1과 같다. 모든 시료에서 농도 의존적으로 활성이 증가하는 경향을 나타내었고, 해당화 > 매화 > 목련 > 산국화 순으로 높은 활성을 보였다. IC50 값을 측정한 결과는 표 2와 같으며, RRE의 값이 59.57 ㎍/mL로 가장 높은 활성을 보였고, WCD가 >500 ㎍/mL로 가장 낮은 활성을 보였다. 특히 해당화는 양성대조구로 사용한 a-tocopherol의 IC50 값인 84.88 ㎍/mL 보다도 우수한 항산화 활성을 보였다. ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과(도 2) 또한, DPPH 라디칼 소거활성과 마찬가지로 50% EtOH 추출물이 물 추출물보다 높은 활성을 보였고, 해당화 > 매화 > 목련 > 산국화 순으로 DPPH 라디칼 소거활성과 같은 경향을 보였다. 또한 양성대조구인 a-tocopherol보다 해당화, 매화 추출물이 높은 소거활성을 보였고, IC50 값(Table 2)은 RRE가 153.40 ㎍/mL, PME가 348.80 ㎍/mL, MFE가 483.80 ㎍/mL, WCE는 >500 ㎍/mL 순으로 활성을 보였다.

산화 활성이 우수한 것으로 판단된다.<실시예 1-3>; 환원력

환원력에서의 흡광도 수치는 그 자체가 시료의 환원력을 나타내며, 높은 항산화 활성을 가지는 물질은 흡광도의 수치가 높게 나타난다. 야생꽃(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 물 및 50% EtOH 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 모든 시료에서 농도 의존적으로 활성이 증가하는 경향을 나타내었고, 해당화 > 매화 > 목련 > 산국화 순으로 높은 환원력을 보였고, 해당화의 경우 물 및 50% EtOH 추출물 모두 양성대조구인 a-tocopherol보다 높은 환원력을 보였다. 총 폴리페놀 함량이 높은 시료에서 환원력이 높은 경향을 보였는데, 이는 페놀성분이 활성산소에 수소 및 전자를 공여함으로써 활성산소 사슬을 파괴하여 높은 환원력을 나타내는 것으로 판단되었다(37, 38).

이러한 결과를 종합적으로 해당화의 경우 양성대조구인 a-tocopherol보다도 높은 활성을 보여 강력한 항산화제로서의 이용이 가능할 것으로 판단되었고, 매화, 목련, 산국화 추출물도 양성대조구인 a-tocopherol보다는 낮았으나, 높은 수준의 활성을 보여 모든 시료가 항

<실시예 2>; 야생화(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 콜레스테롤 생성 억제 효과 Ⅲ-2-1. 콜레스테롤 생성 억제 효과

해당화, 매화, 목련, 산국화의 물과 50% 에탄올 추출물을 100 ㎍/㎖로 처리하였다. 콜레스테롤 생성 억제 효과를 비교하기 위하여 간세포주인 HepG2 세포를 이용하여 실험하였다. (도 3) 실험결과, 매화의 물과 50% 에탄올 추출물에서 각각 49%, 47%의 콜레스테롤 감소율을 보여 가장 높은 콜레스테롤 합성 억제효과를 보였으며, 추출 용매 조건에 있어서는 에탄올 추출물 보다 물 추출물이 보다 높은 억제 효과를 보였다. 제조공정상의 재료비 절감과 추출수율을 고려하였을 때도 물 추출물이 유용한데, 4가지 꽃 모두 물 추출물이 에탄올 추출물 보다 효과가 뛰어났다. 향후 수행될 연구에도 물 추출물을 사용이 유용할 것으로 밝혀졌다. 해당화, 매화, 목련, 산국화 중 해당화가 물 추출물, 50% 에탄올 추출물에서 33%로 가장 낮은 콜레스테롤 억제 효과를 보였으며, 50% 에탄올 추출물에서는 유의성이 나타나지 않았다. 목련의 50% 에탄올 추출물에서도 마찬가지로 유의성을 보이지 않았다. 콜레스테롤 합성 억제 효과는 매화 > 산국화 > 목련 > 해당화 순으로 확인 할 수 있었다.

<실시예 3>; 야생화(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 NO 생성 효과

Ⅲ-3-1. NO 생성 효과

산국화, 해당화, 매화, 목련 각 추출물에 대한 NO의 생성에 미치는 영향을 비교하였다(도 4). HUVEC 세포를 이용하여 꽃차 물 추출물 및 50% 에탄올 추출물을 각각 200 ㎍/㎖의 농도로 처리를 하였고 그 결과 해당화의 NO 생성 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며 해당화 물 추출물과 50% 에탄올 추출물을 비교하였을 때 물 추출물이 3.7배, 50% 에탄올 추출물이 2.9배 증가하여 에탄올 추출물 보다는 물 추출물에서 효과가 더 좋은 것으로 나타났다. 해당화 이외의 산국화, 매화 및 목련에서는 CTL과 비교하였을 때 NO생성에 유의적인 차이가 없어 NO의 생성에 영향을 미치지 않는 것으로 사료되어진다. NO는 혈관평활근세포 내의 guanylate cyclase (GC)를 자극하여 3', 5'-cyclic guanosine monophosphate (cGMP)를 증가시킴으로서 혈관이완을 일으킨다고 알려져 있다. 이와 유사한 결과로 국내산 복분자를 농도별로 처리하였을 때 NO의 생성이 농도 의존적으로 증가하였고, 또한 국내산 복분자의 이러한 NO의 생성은 eNOS의 활성과 관련이 깊다고 보고한 바 있다. 양성대조군으로 사용되어진 SNP는 oxyhemoglobin과의 상호작용을 통하여 cyanide과 NO로 분리되며, 분리된 NO가 평활근의 GC를 자극시켜 cGMP의 생성을 증가시킴으로써 혈관이완을 야기하는 것으로 알려져 있다.

<실시예 4>; 야생화(해당화, 매화, 목련, 산국화)의 인슐린 분비능에 미치는 영향 Ⅲ-4-1. 인슐린 분비능에 미치는 영향

NIT-1 세포는 mouse에서 유래된 정상 췌장 ß-cell로써 인간 췌장 조직과 가장 유사한 기전을 가지며, 포도당 농도에 비례하여 인슐린 분비가 촉진되며, 사람과 마찬가지로 proinsulin gene을 가지고 있기 때문에 인슐린 분비 조절능력이 인간과 비슷한 조건을 가질 것으로 보고 있어 베타 세포의 생리 연구를 하는데 적합한 세포주로 알려져 있다. 산국화, 해당화, 매화, 목련 물 추출물 및 50% 에탄올로 추출하여 NIT-1세포의 인슐린 분비능에 미치는 영향은 다음과 같다(도 5). 2 mM 포도당과 11 mM 포도당 두 가지 조건에서 측정한 결과, 산국화, 매화, 목련 그룹에서 효과적으로 인슐린 분비를 촉진시켰다. 2 mM 포도당 농도에서 인슐린 분비를 확인한 결과, 산국화, 매화 물 추출물 그룹에서 각각 33.2%, 16.5%의 인슐린이 증가됨을 확인하였고, 50% 에탄올 추출물에서는 산국화, 매화, 목련이 각각 50%, 48.1%, 44.1%로 유의성 있게 증가됨을 확인하였다.

한편, 11 mM 포도당 농도에 시료의 인슐린 분비에 미치는 영향을 측정한 결과, 해당화를 제외한 모든 그룹에서 인슐린 분비를 촉진 시켰으나, 저농도 포도당과 비교하였을 때, 50% 에탄올 추출물 그룹에서 인슐린 분비가 감소되는 경향을 나타내었다. 특히, 산국화, 매화, 목련 물 추출물 그룹에서 포도당 농도에 의존하여 인슐린 분비를 자극하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 야생화추출물(해당화, 산국화, 매화, 목련)을 약사법, 건강기능식품법 및 식품위생법에서 허용하는 부형제와 담체를 섞어 제제 또는 식품을 제조하였다.

<적용예 1>; 제제

제제는 야생화추출물에 약사법에서 허용하는 부형제 또는 담체를 섞어 제제로서 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립을 제조하였다.

<산제>

야생화 추출물 2 g 및 유당 1 g을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<정제>

야생화 추출물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유 당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네 2 ㎎을 혼합한 후, 타정하여 정제를 제조하였다.

<캡슐제>

야생화 추출물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유 당 100 ㎎, 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후, 젤라틴 캡슐에 충전하여 제조하였다.

<환>

야생화 추출물 1 g, 유당 1.5 g, 글리세린 1 g, 자일리톨 0.5 g을 혼합한 후, 4 g 크기로 환을 제조하였다.

<과립>

야생화 추출물 150 ㎎, 대두추출물 50 ㎎, 포도당 200 ㎎, 전분 600 ㎎을 프리믹스한 후, 30% 에탄올용액 100 ㎎을 첨가하여 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<적용예 2>; 식품

식품은 야생화 추출물에 식품위생법 또는 건강기능식품법에서 허용하는 부형제 또는 담체를 섞어 건강식품, 음료, 주스, 선식을 제조하였다.

<건강식품>

야생화 추출물 1g, 초산비타민 A 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 0.13 ㎎, 비타민 B2 0.15 ㎎, 비타민 B6 0.5 ㎎, 비타민 B12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎를 섞어 건강식품을 제조하였다.

상기에서 야생화 추출물에 비타민 및 미네랄을 혼합한 비율은 제형이나 수요자층에 따라 다양하게 변형할 수 있다.

<음료>

야생화 추출물 1%, 액상과당 0.5%, 올리고당 2%, 설탕 2%, 식염 0.5% 및 잔부의 정제수와 부재료를 배합하여 살균한 후 포장하여 음료를 제조하였다.

<야채 주스>

야생화 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.

<선식>

야생화 추출물 13 중량부, 선식용으로 전처리한 현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부, 들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부를 배합하여 선식을 제조하였다.

Claims

야생화 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 활성과 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 야생화 추출물은 해당화, 산국화, 매화 또는 목련인 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 야생화 추출물은 물 또는 C1-C2의 저급알콜 또는 이들을 혼합하여 용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 대사증후군 질환은 항산화활성의 저하, 인슐린분비능력 저하, 혈액 순환 저해 또는 고콜레스테롤에 의해 기인하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
야생화 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 활성과 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 식품 조성물.
제5항에 있어서, 야생화 추출물을 유효성분으로 함유하고, 건강기능식품법에서 허용하는 부형제 또는 담체를 포함하는 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 항산화 활성과 대사증후군 질환의 예방 및 치료용 식품 조성물.