KR20150117697A

KR20150117697A - 샘플 제조용 페이퍼 카트리지

Info

Publication number: KR20150117697A
Application number: KR1020157024187A
Authority: KR
Inventors: 벤자민 데이빗 코브
Original assignee: 에피스템 리미티드
Priority date: 2013-02-11
Filing date: 2014-02-11
Publication date: 2015-10-20
Also published as: EP2953721B1; WO2014122486A1; EP2953721A1; CN105073261A; GB201302346D0; US20160030939A1; US9604216B2; JP2016507237A

Abstract

본 발명은 일체형의 리프 스프링 (leaf spring) 4개와 상기 리프 스프링의 높이 보다 약간 낮은 하부 기저부의 융기부를 구비한 샘플 제조용 카트리지를 기술한다. 카트리지의 상부는 상부와 하부에 형성된 4개의 페어드 핀과 홀을 통해 하부와 결합된다. 상부는 상부의 중앙부에 형성된 3개의 웰 형상의 개구부를 포함한다. 상부와 하부 사이에는, 리프 스프링 위에 놓이는, 샘플 제조용 페이퍼 시트가 배치되며, 리프 스프링은 페이퍼의 뒷면을 하부 기저부의 융기부로부터 위로 들어 올려, 기저부와 페이퍼 사이에는 작은 공기 갭이 형성된다. 페이퍼의 앞면은 상부의 웰 형상의 개구부와 접촉한다. 사용자가 액체 샘플을 개구부로 주입하면, 페이퍼는 액체 샘플을 흡수하여 주입 위치로부터 멀리 이동시키고, 적용 부위에는 세포 파편만 남게 된다. 카트리지의 상부에 압력이 인가되면, 페이퍼는 기저부의 융기부와 접촉하게 되어, 사용자는 추가적인 처리를 위해 예를 들어 바이옵시 니들을 이용해 페이퍼의 단편을 취할 수 있는 고정된 기저부가 제공된다.

Description

샘플 제조용 페이퍼 카트리지 {SAMPLE PREPARATION PAPER CARTRIDGE}

본 발명은 예를 들어 핵산 증폭 및/또는 검출과 같은 분자 생물학적 처리 기법을 위한 샘플 제조시 사용되는 샘플 제조용 페이퍼 카트리지에 관한 것이다.

PCR은 생물학적 샘플에서 특정 표적 핵산 서열을 증폭하는 편리한 방법이다. PCR은 예를 들어 DNA 샘플의 주인을 확인하거나, 또는 특정 병원체가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 마커를 검출하기 위해, 법의학적 목적 또는 진단 목적으로 종종 사용된다. 이러한 목적을 위해서는, 상대적으로 신속한 분석법을 확보하는 것이 유용하며, 이는 광범위한 샘플의 준비와 클린업(clean up)을 행할 수 없다는 것을 의미할 수 있다.

대부분의 임상 샘플은, PCR에 적합한 샘플로 만들기 위해 어느 정도 가공되어야 한다. PCR 반응을 위해 저해 물질을 제거하고 순수한 샘플을 제공하기 위해서 페이퍼-타입의 필터를 사용하는 것이 알려져 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 생물학적 분석용 샘플을 위한 편리한 샘플 제조 수단을 제공하는 것이며, 보다 상세하게는 페이퍼 타입의 필터를 사용하는 샘플 제조 수단을 제공하는 것이다. 이는, 부분적으로는 샘플 제조용 페이퍼가 샘플 제조를 위해 내부에 배치될 수 있는 하우징을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 하기 구성 요소를 포함하는 샘플 제조용 카트리지가 제공되며:

기저부 (base)를 구비한 하부 (lower portion),

상기 하부와 결합 및 분리가능하며, 하나 이상의 웰 (well) 형상의 개구부를 포함하는, 상부; 및

상기 상부가 상기 하부와 결합하였을 때 상기 하부와 상부 사이에 위치되는, 하나 이상의 스프링 구조 부재,

상기 카트리지는, 샘플 제조용 페이퍼가 상기 웰 형상의 개구부에 인접하게 상기 상부와 상기 하부 사이에 수용될 수 있고, 상기 페이퍼가 상기 하부의 기저부와 떨어져 있도록 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재 위에 놓이게, 구성되며,

상기 상부에 압력이 인가되면, 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재가 압축됨으로써, 상기 페이퍼는 상기 기저부의 적어도 일부분과 접촉하게 된다.

이러한 배치는 샘플 가공에 있어 여러가지 이점을 가진다. 특히, 웰 형상의 개구부는 액체 샘플을 샘플 페이퍼로 보내는데 (channeling) 사용됨으로써, 샘플은 페이퍼 상에 작은 "스팟"으로 전달 및 집중될 수 있을 것이다. 카트리지의 처음 형태는, 페이퍼가 하부의 기저부와 분리되어 있는 구조로, 페이퍼 아래에는 공기가 순환가능하여, 샘플이 페이퍼로 스며들 (wicking)어 건조되는 것을 돕는다. 압축된 형태, 즉 샘플 페이퍼가 기저부와 접촉된 형태는, 추가적인 처리 및 분석을 위해, 카트리지를 분해하여 페이퍼 전체를 꺼내지 않고도, 예를 들어 바이옵시 펀치를 사용해 사용자가 샘플 페이퍼의 일부를 쉽게 절단할 수 있다.

바람직하게는, 기저부는, 웰 형상의 개구부에 맞게 정렬되고 스프링 구조 부재가 압축되었을 때 페이퍼와 접촉될 수 있는, 융기부 (raised portion)를 포함한다.

스프링 구조 부재는, 바람직하게는, 하부의 요소이며, 일부 구현예에서, 스프링 부재는 상부 및 하부 둘다와 모두 분리되어 있을 수 있다. 바람직하게는, 카트리지는 스프링 구조 부재를 2개, 더 바람직하게는 4개 포함한다. 스프링 구조 부재는 리프 스프링 (leaf spring)일 수 있다. 스프링 구조 부재는 바람직하게는 하부와 일체형으로 형성되며, 예를 들어, 전체가 성형된 플라스틱 소재로 된 하나의 조각으로 형성될 수 있다.

바람직하게는, 상부는 웰 형상의 개구부를 복수개 포함하며, 바람직한 구현예에서, 그러한 개구부가 3개 존재한다.

상부는 플라스틱 소재로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상부는 반투명 (translucent) 및/또는 투명 (clear)하다. 이로써, 샘플 페이퍼가 카트리지 안에 존재하는지 여부를 시각적으로 확인할 수 있다. 바람직하게는, 플라스틱 소재는 소수성이며, 예를 들어, 이것은 Makrolon (RTM)과 같은 폴리카보네이트일 수 있다. 플라스틱 소재는 유체 샘플을 밀어내 웰 쪽으로 유도함으로써 샘플 페이퍼와 접촉시키는데 도움이 된다. 플라스틱 소재는 관능화될 수 있다. 예를 들어, 이 소재는 샘플내 세포성 물질의 세포 용혈 (lysis)을 보조하기 위한 관능기들로 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이 소재는 유도체화된 샘플 페이퍼에 대해서 후술한 바와 같이, 1종 이상의 살생물성 물질, 바람직하게는 SiQAC로 관능화될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 카트리지는 상부와 하부 사이에 위치하는 샘플 페이퍼를 더 포함할 수 있다. 페이퍼는, 바람직하게는, 셀룰로스 물질이며, 예를 들어, 셀룰로스 필터 페이퍼 또는 셀룰로스 매트릭스이다. 셀룰로스 매트릭스는 복합 페이퍼 (composite paper)일 수 있으며, 예를 들어, 복합 셀룰로스 페이퍼는 페이퍼의 표면 상에 놓여지는 샘플로부터 액체와 저분자량의 오염물 및 저해 물질을 제거하기 위해, 측방 유동 층 (lateral flow layer)을 포함할 수 있다. 셀룰로스는, 살생물성 물질이 부착될 수 있는 노출된 하이드록시 기를 다수개 가지는 이점을 가진다. 바람직한 구현예에서, 샘플 페이퍼는, i) 샘플 중의 생물학적 물질의 세포막, 세포벽, 바이로스 외막 또는 바이러스 캡시드를 약화시킬 수 있거나, 또는 ii) 샘플 중의 세포 또는 바이러스 물질을 세포 용혈시킬 수 있는, 1종 이상의 살생물성 물질로 관능화된다.

살생물성 물질은, 바람직하게는, 복수의 관능기를 포함한다. 관능기는, 바람직하게는, 물질을 기판에 결합시키는데 관여하는, 결합 모이어티; 소수성 모이어티; 및 하전된 모이어티를 포함한다. 소수성 모이어티는 세포벽 또는 세포막과 상호작용하여 침투할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 소수성 모이어티는 알킬 쇄, 예를 들어 C5-C30 알킬, 바람직하게는 C10-C20 알킬일 수 있다. 알킬 쇄가 정교한 세포벽을 침투함에 따라, 세포벽은 약화되고, 구멍이 발생된다. 하전된 모이어티는 바람직하게는 양으로 하전되며, 하전된 세포벽을 끌어당길 수 있으며, 세포막에 접촉하여 이온 흐름과 항상성을 파괴함으로써, 세포벽 파괴와 핵산 방출을 도울 수 있다. 하전된 모이어티는 바람직하게는 4급 암모늄 기이다. 결합 모이어티는 하이드록시 기를 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 관능기는 바람직하게는 알킬 쇄 (소수성 모이어티), 실릴 기 (결합 모이어티) 및 암모늄 클로라이드 기 (하전된 모이어티)이다.

바람직한 살생물성 물질은 실릴화 4급 암모늄 화합물 (SiQAC), 특히 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드 (3-TPAC)를 포함한다. 다른 살생물성 물질로는 벤질 암모늄 클로라이드를 포함한다. SiQAC의 치사 작동 방식은 음으로 하전된 세포벽 상에 양으로 하전된 분자의 흡착, SiQAC 분자의 친지성 쇄에 의한 세포막 파괴 및 막을 통과한 확산에 의한 세포 용혈로 진행되는 것으로 일반적으로 인정된다.

당업자는 사용될 수 있는 다른 적절한 살생물성 물질을 인지할 것이다. 특정 물질의 선택은 전술한 바람직한 관능기의 존재, 의도한 생물학적 샘플의 특성에 의해 이루어진다 - 예를 들어, 처리할 샘플이 포유류의 세포성 샘플인 경우, 침투해야 할 세포벽이 없어 다른 관능기가 적합할 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 다른 살생물성 물질의 예로는 하기 성분을 포함한다:

a) 텔레켈릭 (telechelic) 폴리(2-알킬-1,3-옥사졸린);

b) 접촉시 접근하는 미생물 세포를 사멸시키는 항미생물성 DDA 기가 PEtOx를 통해 그래프팅된 셀룰로스 (Bieser et al (2011), Contact-Active Antimicrobial and Potentially Self-Polishing Coatings Based on Cellulose. Macromol. Biosci., 11, 111-121);

c) 사포닌계 화합물은 다수의 식물들에서 공통되는 스테로이드 또는 트리테르페노이드 글리코시드이며, 적혈구 막에 세포 용혈 작용을 가진다는 것이 오랫동안 알려져 왔으며, 다수의 사포닌계 화합물이 항미생물인 것으로 알려져 있다 (Francis et al, British Journal of Nutrition (2002), 88, 587-605). 광범위한 연구들이 사포닌계 화합물의 막-투과성 특성에 대해 수행되고 있다. 이러한 구조적으로 다양한 화합물들 역시 원생 동물을 사멸시키고 항-진균 및 항-바이러스 물질로서 작용하는 것으로 관찰되고 있다. 사포닌 처리시 인간 적혈구에서 분리된 세포막에는, 인공 막의 경우 80 Å 크기의 구멍이 형성되는 것에 비해, 40-50 Å 직경의 구멍이 형성되었다 (Seeman et al. 1973 Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis. Journal of Cell Biology 56, 519-527).

용액 및 표면에서의 기타 항미생물성 폴리머에 대한 리뷰는 Siedenbiedel and Tiller (2012) Polymers, 4, 46-71을 참조한다.

전술한 바와 같이, 카트리지의 상부는 1종 이상의 살생물성 물질을 틀림없이 포함할 수 있다. 이들 물질은 샘플 페이퍼에 존재하는 살생물성 물질과 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 카트리지와 페이퍼 모두 SiQAC로 관능화된다.

샘플 페이퍼는, 샘플이 페이퍼에 적용된 시기 및/또는 장소를 확인하기 위해, 변색 시약 (colour change reagent)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 시약은, 젖거나 및/또는 건조 후 색이 바뀔 수 있다. 샘플 페이퍼는 샘플을 적용할 부위를 표시하는 표지, 예를 들어, 인쇄된 마킹 (printed marking)을 포함할 수 있다.

소정의 구현예에서, 샘플 페이퍼는 원하는 반응을 수행하기 위한 1종 이상의 시약을 더 포함할 수 있으며; 예를 들어, 페이퍼는 동결건조된 PCR 시약들 및/또는 동결건조된 효소를 포함할 수 있다. 이들 시약은, 이후, 샘플 페이퍼가 반응 용기 안에서 액체와 접촉되었을 때, 재구성될 것이다. 이러한 방식으로, 시약들은, 반응을 수행하기 위해 활성화될 준비가 될 때까지, 서로 별도 보관될 수 있다. 페이퍼는 복수의 시약들을 포함할 수 있으며; 이들 시약은 페이퍼 내에서 조합되거나 또는 예를 들어 복합 페이퍼의 다른 층에 병합되어 분리되어 유지될 수 있다. 시약들은 복합 페이퍼의 추가적인 층에 병합될 수 있다.

소정의 구현예에서, 페이퍼는 Whatman Ltd 사에서 구입가능한 Whatman FTA (RTM) 카드, 예를 들어 FTA 클래식 카드, 카다로그 번호 WB120305일 수 있다. FTA 카드는 세포를 용혈시키고, 단백질을 변성시키고, 핵산을 뉴클레아제, 산화 및 UV 손상으로부터 보호하는, 화학제들을 함유한다.

샘플 페이퍼는 복합 페이퍼일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 복합 페이퍼는 상부 흡착층과 측방 유동 층을 포함한다. 페이퍼는 또한 상부 층과 측방 유동 층 사이에 배치된 반투과성 층을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상부 흡착층은 수많은 최상의 특징들을 가진다. 소재는 친수성이어야 하며, 비가역적으로 핵산과 결합하지 않아야 한다. 흡착 소재는 PCR 저해 물질을 방출하지 않아야 하거나 및/또는 PCR을 방해할 수 있는 표백 공정에 사용되는 물질 또는 킬레이트 물질을 방출하지 않아야 한다. (폴리에스테르와 같은 다공성 폴리머도 동일한 효과를 나타낼 수 있지만) 흡착 소재는 바람직하게는 셀룰로스로 제조된다. 주요 특징은 액체 여과 속도 및 밀도, 평량 (Basis Weight) 및 흡수도이다. 예를 들어, 바람직한 소재로는 Shleicher & Schuell Inc. 903을 포함한다. 대체제로는 Schelicher & Schuell "GB002", "GB003" and "GB004", Fairfield N.J. "BFC1" 및 Whatmann "3MM" (최종 하나는 계면활성제 혼합물로의 함침이 되어야 함)을 포함한다.

주요 특징들에 대한 바람직한 값은 하기를 포함한다:

액체 여과 속도	덴소미터 (Densometer)	잔류 침전물
TAPPI T471 u.m. 572 ASTM E832-9.3 (7.3초)	TAPPI T471 u.m. 572 ASTM 726 (20초)	ASTM D981-56 (입자 8 - 30 um)
표면	평량	캘리퍼
부드러움, 단단하지 않음	TAPPI T471 u.m. 572 TAPPI T410 ASTM 646 (179 g/m2)	TAPPI T471 u.m. 572 TAPPI T411 ASTM 643 (0.52 mm thick)
흡수도	Klemm	습윤 강도 - 시트 5장
TAPPI T441 ASTM 3285 (4.5 g/ 100 cc)	TAPPI T441 ASTM 3285 (34/16 deg / min)	TAPPI T471 ASTM 774 (7.0 psi)

바람직한 상층은 이들 값들 모두 또는 일부를 단독으로 또는 임의 조합으로 가질 수 있다.

측방 유동 층은 니트로셀룰로스일 수 있다.

흡착 층은 두께가 바람직하게는 0.5 - 1 mm이고; 측방 유동 층은 두께가 0.1 - 0.2 mm일 수 있다.

샘플 페이퍼는 측방 유동 층에 인접하게 배치되는 지지층; 예를 들어, 폴리에스테르와 같은 플라스틱 지지체를 더 포함할 수 있다. 이는 측방 유동 층과 동일한 또는 유사한 수준의 두께일 수 있으며, 예를 들어 약 0.1 mm일 수 있다.

페이퍼의 특징들은, 액체가 페이퍼로 신속하게 스며들게 하여 표면에 타겟 유기체만 남기며, 표면 상의 세포성 물질을 탈수시켜 세포벽을 약화시키고, 열 처리에 의해 이를 세포 용혈가능하게 만들 수 있게 한다. 페이퍼는 또한 저해 물질을 페이퍼 내부에 가두거나/내부로 제거한다.

적합한 페이퍼의 이러한 특징들과 기타 바람직한 특징들은 계류중인 특허 출원 PCT/GB2012/052847 (복합 페이퍼에 대한 것임)과 GB 1209229.2 (관능화된 살생물성 페이퍼에 대한 것임)에서 찾아볼 수 있다. 이들 특허 출원들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, 독자는 적합한 페이퍼에 대한 추가적인 상세 내용은 이를 참조한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 하기 구성 성분을 포함하는 키트를 제공하며:

a) 샘플 제조용 카트리지, 및

b) 샘플 제조용 페이퍼를 포함하며,

상기 샘플 제조용 카트리지는,

기저부를 가진 하부;

상기 하부와 결합 및 분리가능하며, 하나 이상의 웰 형상의 개구부를 포함하는, 상부; 및

상기 상부가 상기 하부와 결합하였을 때 상기 하부와 상부 사이에 위치되는, 하나 이상의 스프링 구조 부재를 포함하며,

상기 카트리지는, 샘플 제조용 페이퍼가 상기 웰 형상의 개구부에 인접하게 상기 상부와 상기 하부 사이에 수용될 수 있고, 상기 페이퍼가 상기 하부의 기저부로부터 분리되어 있도록 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재 위에 놓이게, 구성되며,

카트리지 및 페이퍼에 대한 추가적인 특징들은 전술한 바와 같을 수 있다.

본 발명에 대한 이러한 측면과 기타 측면들은 첨부된 도면을 참조하여 기술될 것이다:
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 카트리지의 분해도이다.
도 2는 SiQAC 분자의 구조를 나타낸다.
도 3은 SiQAC 분자, 3-TPAC를 이용한 셀룰로스의 관능화를 예시한 것이다.
도 4는 카트리지에 사용될 수 있는 샘플 제조용 페이퍼를 예시한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 카트리지의 분해도는 도 1에 나타낸다. 카트리지는 4개의 일체형으로 형성된 리프 스프링을 구비한 하부와, 상기 리프 스프링의 높이 보다 약간 낮은 하부 기저부의 융기부를 포함한다. 카트리지의 상부는, 상부 및 하부에 형성된 4개의 페어드 핀과 홀을 통해, 하부와 결합된다. 상부는 상부의 중앙부에 형성된 3개의 웰 형상의 개구부를 포함한다.

상부와 하부 사이에는 샘플 제조용 페이퍼 시트가 배치된다. 이 페이퍼는 리프 스프링 위에 놓이며, 리프 스프링은 페이퍼의 뒷면을 하부 기저부의 융기부로부터 떨어지게 들어 올려, 기저부와 페이퍼 사이에 작은 공기 갭이 형성된다. 페이퍼의 앞면은 상부의 웰 형상의 개구부와 접촉한다.

상부는 폴리카보네이트(예, Makrolon (RTM))와 같은 소수성 플라스틱 소재로 형성된다. 이는 후술한 바와 같이 유도체화될 수 있다.

사용시, 카트리지가 조립되면, 사용자는 액체 샘플 (예, 세포성 물질이 포함된 샘플)을 웰 형상의 개구부에 주입할 수 있다. 이들 개구부는 샘플을 샘플 페이퍼에 인접한 위치로 전달 및 집중시키는데 사용된다. 이들 상부의 소수성 특성은 카트리지 상에 잔류되는 샘플 유체의 양을 줄여주며, 이는 대신 웰로 흐르게 한다. 페이퍼는 주입 위치로부터 멀리 액체 샘플을 빨아들임으로써, 적용 부위에는 세포성 파편만 남게 된다. 페이퍼와 웰 형상의 개구부 모두, 핵산 또는 기타 세포 내용물을 페이퍼로 방출시키기 위해, 후술한 바와 같이, 세포성 세포 용혈을 촉진시키도록 의도된 활성 기들로 관능화될 수 있다. 페이퍼는 기저부로부터 들어 올려져 있어 공기가 페이퍼 아래에서 순환할 수 있기 때문에, 이러한 구조는 페이퍼 상에서의 샘플 건조를 돕는다.

그런 후, 사용자가 카트리지의 상부에 압력을 가하면, 페이퍼는 눌리고 리프 스프링은 압축된다. 이로써, 페이퍼는 기저부의 융기부와 접촉하게 되며, 추가적인 처리를 위해, 예를 들어 바이옵시 니들을 사용하여 사용자가 페이퍼 단편을 취할 수 있는 고정된 기저부 (firm base)가 형성된다.

그런 후, 카트리지는 폐기하거나, 또는 사용한 페이퍼는 제거하고, 카트리지를 향후 사용을 위해 세척하여 준비해 둘 수 있다.

또한, 카트리지는, 샘플 추적 및 모니터링을 위해 특수 카트리지를 식별할 수 있거나 또는 주입되는 샘플의 특성을 사용자에게 고지할 수 있는, 라벨을 포함할 수 있다. 라벨은 기계로 판독가능한 테그, 예를 들어 바코드 또는 RFID 테그를 포함할 수 있다. 이는 샘플을 추적할 수 있게 할 수 있으며, 샘플의 상세한 사항을 필요에 따라 용이하게 기록할 수 있다.

전술한 바와 같이, 카트리지의 페이퍼 및/또는 상부는 세포성 물질의 세포용혈을 돕는 살생물제를 포함하도록 관능화될 수 있다. 바람직한 관능기는 SiQAC 모이어티이다.

SiQAC 분자 [3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드 (3-TPAC)]의 구조는 도 2에 도시된다. 3-TPAC는 1972년에 최초로 개시되었다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC380687/pdf/applmicro00052-0033.pdf).

기본 화합물에 대한 다수의 버전들 (예, 벤질 암모늄 클로라이드 BAC)이 존재하지만, 이들 모두 유사한 주요 성분들을 공유한다: 암모늄 클로라이드 변형체 (variant) (활성 항미생물), 결합제 (실릴 파트)로서 실리콘 및 알칸 쇄. 암모늄 클로라이드는 메틸 기 2개와 실질적으로 장쇄 알킬 기 2개가 부착되는 4급 암모늄 기이다. 이 양이온성 관능기는 세균, 진균 및 바이러스 막을 파괴하여 핵산 내용물을 방출시키는 항-미생물 특성을 부여한다. 소수성 알칸 쇄는 세포벽을 침투한다. 트리메톡시실릴 기는 분자를 활성 하이드록시 기를 통해 기질 (예, 셀룰로스)에 결합시킨다.

4급 암모늄 화합물은 세균, 진균 및 외막형 바이러스 등의 매우 다양한 유기체에 치명적이며, 내생 포자, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 비-외막성 바이러스에도 다소 치명적이다. 많은 살생물성 폴리머들이 4급 암모늄 기를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 4급 암모늄 (QA) 화합물은 의학적 및 공중 보건 용도로 가장 널리 사용되는 항세균제이며, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 모두에 효과적인 것으로 입증되어 있다 (Tashiro (2001) Macromol. Mater. Eng.; 286, 63-87).

QA 기를 가진 양이온성 폴리머는 일반적으로 이의 대응되는 저분자량 모노머에 비해 우수한 항미생물 활성을 나타낸다 (Ikeda and Tazuke, 1983, Makromol. Chem., Rapid Commun. 4 (1983) 459-461). 높은 활성은 폴리머의 높은 전하 밀도로 인한 세포와 폴리머 간의 보다 더 큰 정전기적 인력에 기인한 것이다.

SiQAC는 2단계 공정을 통해 작동한다. SiQAC 분자의 양으로 하전된 관능기는 미생물의 음으로 하전된 세포벽을 끌어당긴다. 먼저, 소수성 알킬 쇄가 유기체의 유사한 소수성 세포벽에 침투하여 유기체와 접촉한다. 알킬 쇄는 정교한 세포벽을 침투함에 따라, 세포벽이 약화되고, 구멍이 뚫린다. 이차로, 양이온성 4급 암모늄 기가 세포벽에 접촉함에 따라, 양이온성 4급 암모늄 기는 이온 흐름을 교란시키고, 세포벽의 외부 또는 내부로의 누출을 야기하여, 일반적으로 이온 상태에 따라 세포 내용물을 상실시키거나 터지게 한다. 하전된 4급 암모늄 알킬 기는 변화없이 유지되므로, 이를 이용하여 공정을 무한정 반복할 수 있다.

이러한 "물리적" 및 "전기적" 사멸 기전으로 인해, 미생물은 SiQAC에 대한 내성 또는 면역성을 발현할 기회를 얻지 못한다.

4급 암모늄 화합물은 소독제, 살균제, 약제학적 제품 및 화장품으로 널리 사용되며, 과채류 소독의 대체제일 수 있다. 4급 암모늄 화합물 (QAC)은 기본 구조 (NH4⁺)를 가진 양이온성 화합물이다. 이들 화합물은 세균 세포벽에 침투하여 세포막과 반응함으로써, 자가용해 효소에 의해 세포벽 용해를 유도한다 (McDonnell, G. & Russell, A. D. 1999 Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews 12, 147-179).

트리메톡시실릴 기는 유리 및 코튼 등의 표면의 하이드록시 기와 반응하여, 표면에 QA 화합물을 보유하는 공유 결합을 형성하며, 물에 용해되지 않게 한다. 트리메톡시실릴 기는 또한 서로 반응하여, 처리된 표면에 결합된 고도로 안정적인 가교된 실란 코팅을 형성할 수 있다. 이들 코팅물은 화학 물질을 주변 환경으로 방출하지 않으면서 다수의 용도에서 표면에 살생물 활성을 부여하는 것으로 알려져 있다 (Isquith et al, 1972 Appl. Microbiol. 24, 859; Isquith et al, 1973 U. S. Patent 3,730,701; Speier and Malek, 1982 J of Colloid and Interface Science 89, 68; Walters et al., 1973, J., Appl. Microbiol. 25, 253).

이들 코팅물은 살진균제 및 항세균제로서 매우 효과적이지만, 포자에는 효과가 없다.

도 3은 SiQAC 분자, 3-TPAC로 셀룰로스를 관능화하는 과정을 예시한다. 비변형된 천연 셀룰로스에서, X는 수소로서, 펜던트 하이드록시 (OH) 기를 다수 형성한다. 신속한 초기 단계에서, 결합은 분자와 하이드록시 기 간에 형성되어, 실릴 에테르가 형성된다. 느린 이차 단계에서, 인접한 다이메톡시실릴 기들 간에 가교가 형성되어, 기질 표면과 평행하게 배치된 랜덤 실리콘 에테르 폴리머가 형성된다.

양이온성 모이어티는 표면 결합에 참여하지 않지만, 여전히 기질 표면과의 결합에 이용가능하다. 이의 구조는 다이데실다이메틸암모늄 클로라이드 (DDAC)가 전형적인 예인 국소 소독제로서 인식되는 4급 암모늄 화합물과 비슷하다.

SiQAC 분자가 기질 표면에 결합되는 기전은 폴리텐이 가교되어 PEX를 형성하는 경우와 화학적으로 비슷하다.

실시예: 페이퍼의 관능화

페이퍼 관능화 방법 3가지를 기술한다:

공정 A

페이퍼를 SiQAC (3-TPAC) 용액 20㎕로 관능화하고, 24시간 건조 후, 20㎕ 5mM　TRIS-Cl [pH 9.0], 0.2mM MgCl₂로 세척하고 건조한 다음,

i. 샘플을 적용하여, 20분 건조 후 디스크를 취하여 PCR용 miliQ 워터　20㎕를 가하거나, 또는

ii. 샘플을 적용하여, 20분 건조 후 디스크를 취하여 miliQ 워터　20㎕로 부드럽게 파이펫팅하면서 헹구고, PCR에서　20㎕를 사용한다.

공정 B

페이퍼를 SiQAC (3-TPAC) 용액 20㎕로 관능화하고, 30분 건조 후, 5mM　TRIS-Cl [pH 9.0], 0.2mM MgCl₂로 세척하고 건조한 다음,

공정 C

페이퍼를 SiQAC (3-TPAC) 용액 20㎕로 관능화하고, 30분 건조 후,

i. 샘플을 적용하여, 20분 건조 후 디스크를 취하여 miliQ 워터　20㎕로 부드럽게 파이펫팅하면서 헹구고, PCR에서　20㎕를 사용하거나, 또는

ii. 샘플을 적용하여, 20분 건조 후 디스크를 취하여 5mM　TRIS-Cl [pH 9.0], 0.2mM MgCl₂ 20㎕로 부드럽게 파이펫팅하면서 헹구고, PCR에서　20㎕를 사용한다.

다른 복합 샘플 페이퍼를 도 4에 나타낸다. 샘플 페이퍼는 셀룰로스 섬유로 된 제1 층과, 니트로셀룰로스 섬유로 된 제2 층을 포함한다. 이것은 또한 지지 층을 포함할 수도 있다.

분석할 샘플 (예, 객담)을 샘플 페이퍼에 스팟팅한다. 페이퍼에는, 샘플 적용시 색 변화를 일으키는 시약이 포함될 수 있으며, 예를 들어 이 시약은 젖었을 때 색 변화를 일으킬 수 있다. 제1 셀룰로스 층은 흡착층으로 작용하여, 세포 내용물을 포획하며, 수평적 및 수직적 유체 흐름을 제공한다. 제2 니트로셀룰로스 층은 측방 유동을 통해 물을 신속하게 제거하며, 페이퍼에 적용된 샘플의 건조 속도를 개선시키며; 건조는 카트리지가 사용 중일 때 페이퍼를 기저부로부터 분리시키는 공기 갭에 의해 더욱 강화된다. 이러한 작동은 샘플을 수분 이내에 추가적으로 분석하기 위해 건조 및 준비시킬 수 있다. 또한, 페이퍼는 필요한 경우, 세포를 세포용혈시키고 핵산을 방출시키기 위한 시약으로 함침될 수 있으며; 예를 들어, 전술한 바와 같이 페이퍼는 관능화될 수 있다. 다른 예로 또는 부가적으로, 페이퍼는 원하는 반응을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 페이퍼는 PCR 반응에 사용하기 위한 동결건조된 효소와 뉴클레오티드를 함유할 수도 있다.

Claims

샘플 제조용 카트리지 (sample preparation cartridge)로서,
기저부 (base)를 가진 하부;
상기 하부와 결합 및 분리가능하며, 하나 이상의 웰 (well) 형상의 개구부를 포함하는, 상부; 및
상기 상부가 상기 하부와 결합하였을 때 상기 하부와 상부 사이에 위치되는, 하나 이상의 스프링 구조 부재를 포함하며,
상기 카트리지는, 샘플 제조용 페이퍼가 상기 웰 형상의 개구부에 인접하게 상기 상부와 상기 하부 사이에 수용될 수 있고, 상기 페이퍼가 상기 하부의 기저부로부터 분리되어 있도록 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재 위에 놓이게, 구성되며,
상기 상부에 압력이 인가되면, 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재가 압축됨으로써, 상기 페이퍼는 상기 기저부의 적어도 일부분과 접촉하게 되는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제1항에 있어서, 상기 기저부는, 상기 웰 형상의 개구부에 맞추어 정렬되고 상기 스프링 구조 부재가 압축되었을 때 상기 페이퍼와 접촉될 수 있는, 융기부 (raised portion)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스프링 구조 부재를 2개, 바람직하게는 4개 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재는 상기 하부와 일체형으로 형성되는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 상부는 플라스틱 소재로 제조된 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 상부는 반투명 및/또는 투명한 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제5항에 있어서, 상기 플라스틱 소재가 소수성인 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제5항 또는 제7항에 있어서,
상기 플라스틱 소재는 관능화된 (functionalised) 것이며,
바람직하게는, 상기 소재는 샘플내 세포 물질의 세포 용혈 (lysis)을 돕는 관능기들로 변형되며;
더 바람직하게는, 상기 플라스틱 소재는 실릴화 4급 암모늄 화합물 (SiQAC), 바람직하게는 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드 (3-TPAC)로 관능화된 것임을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 상부와 상기 하부 사이에 위치되는 샘플 페이퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제9항에 있어서, 상기 페이퍼는 복합 페이퍼 (composite paper), 바람직하게는 측방 유동 층 (lateral flow layer)을 포함하는 복합 셀룰로스 페이퍼인 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 샘플 페이퍼는, i) 샘플 중의 생물 물질의 세포막, 세포벽, 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드를 약화시킬 수 있거나, 또는 ii) 샘플 중의 세포 또는 바이러스 물질을 세포 용혈시킬 수 있는, 1종 이상의 살생물성 물질로 관능화된 것임을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제11항에 있어서, 상기 살생물성 물질은 결합 모이어티, 소수성 모이어티 및 하전된 모이어티를 포함하는 복수의 관능기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제12항에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 알킬 쇄, 예를 들어 C5-C30 알킬, 바람직하게는 C10-C20 알킬인 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 하전된 모이어티는 양으로 하전된 것이며, 바람직하게는 4급 암모늄 기인 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제12항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 하이드록시 기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
제11항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살생물성 물질은 실릴화 4급 암모늄 화합물 (SiQAC); 바람직하게는 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드 (3-TPAC)인 것을 특징으로 하는, 샘플 제조용 카트리지.
키트로서,
a) 샘플 제조용 카트리지, 및
b) 샘플 제조용 페이퍼를 포함하며,
상기 샘플 제조용 카트리지는,
기저부를 가진 하부;
상기 하부와 결합 및 분리가능하며, 하나 이상의 웰 형상의 개구부를 포함하는, 상부; 및
상기 상부가 상기 하부와 결합하였을 때 상기 하부와 상부 사이에 위치되는, 하나 이상의 스프링 구조 부재를 포함하며,
상기 카트리지는, 샘플 제조용 페이퍼가 상기 웰 형상의 개구부에 인접하게 상기 상부와 상기 하부 사이에 수용될 수 있고, 상기 페이퍼가 상기 하부의 기저부로부터 분리되어 있도록 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재 위에 놓이게, 구성되며,
상기 상부에 압력이 인가되면, 상기 하나 이상의 스프링 구조 부재가 압축됨으로써, 상기 페이퍼는 상기 기저부의 적어도 일부분과 접촉하게 되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제17항에 있어서, 상기 샘플 제조용 페이퍼는 제9항 내지 제16항 중 어느 한항에 따른 것인 키트.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 샘플 제조용 카트리지는 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 것인 키트.