KR20150114077A - ｍｉＲ-192, ｍｉＲ-215 또는 ｍｉＲ-194를 포함하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물 - Google Patents

ｍｉＲ-192, ｍｉＲ-215 또는 ｍｉＲ-194를 포함하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

miRNA 마이크로어레이 분석을 이용하여 비 다낭신과 다낭신 신장조직에서 miRNA 발현 패턴을 스크리닝한 결과, miR-192/215와 miR-194는 비 다낭신 신장에 비하여 다낭신 신장에서 현저히 하향조절되었다. 이 miRNA들은 중간엽 유전자로 잘 알려진 ZEB2와 N-카데린의 3'UTR을 직접적으로 타겟으로 하여 다낭신에서 상피-중간엽 전이 (epithelial to mesenchymal transition; EMT) 단계에 관여하였다. 뿐만 아니라, miR-192/215와 miR-194 과발현은 낭포 성장 저하를 유도하는 반면, miR-192/215와 miR-194 녹다운은 MDCK 세포 3차원 배양 시스템 내에서 낭포 성장을 촉진하였다. 더 흥미로운 것은 miR-192/215와 miR-194의 하향조절이 상염색체 우성 다낭신에서 DNA 과메틸화에서 기인하는 것으로 보인다는 점이다. 실제로, MIRA-seq에 의한 전체 유전체의 DNA 메틸화 분석 결과, 다낭신에서 많은 과메틸화 miRNA가 관찰되었다. MIR192 -194-2의 과메틸화 패턴은 파이로시퀀싱을 통해 상염색체 우성 다낭신 신장조직에서 입증되었다. CpG 탈메틸화에 이용되는 5-aza-dC를 처리하면 miR-192/miR-194와 EMT 관련 타겟 유전자들의 발현 수준이 모두 회복되었다. 이 데이타들은 miR-192, miR205, miR-194가 중간엽 마커 유전자를 타겟으로 하여 낭포 발달을 감소시키며, MIR192 -194-2의 DNA 과메틸화가 상염색체 우성 다낭신에서 그들의 발현수준을 감소시킴을 말해준다.

Description

ｍｉＲ-192, ｍｉＲ-215 또는 ｍｉＲ-194를 포함하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating Autosomal dominant polycystic kidney disease containing miR-192, miR-215 or miR-194}
본 발명은 miR-192, miR-215 또는 miR-194를 포함하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상염색체 우성 다낭신 (Autosomal dominant polycystic kidney disease; ADPKD)은 1/1,000 꼴로 발생하는 흔한 단성 신장질환이다1. 상염색체 우성 다낭신은 좌우대칭으로 액체로 가득 찬 수많은 낭포들이 발생하는 것으로 특징지어지는데, 이것은 최후에는 말기 신부전증 (end-stage renal failure)이 된다2 ,3. 인간 상염색체 우성 다낭신에서 낭포 형성 개시와 증대는 비정상적으로 증가한 세포증식과 낭포 라이닝 상피세포 (cystic lining epithelial cell)의 자기사멸 (apoptosis), 사구체 주머니 (tubular lumen) 내로 액체 분비, 평면세포 극성 (planar cell polarity)의 결함 및 세포외 기질 상호작용의 손상에 의한 것이다 4-6. 좌우 대칭의 신장 낭포의 공격적 형성은 신장 간질 섬유화 (renal interstitial fibrosis)가 수반된다7.
최근, 상피-간엽 전환 (epithelial-mesenchymal transition; EMT)이 낭포 상피세포를 생성할 수 있는데, 이것은 간질 (interstitium)로 이동하여 세포외 기질 단백질 (extracellular matrix protein)을 생성할 수 있다8. 많은 증거들은 상피-간엽 전환이 말기 신부전증으로 이끄는 최종 공통경로인 신장 섬유화의 주요 작용인자임을 지지하고 있다9. 그럼에도 불구하고, 상피-간엽 전환이 인간 상염색체 우성 다낭신에서 기능을 수행한다는 가설은 소수의 데이타에 의해서만 지지되고 있다. 뿐만 아니라, 낭포 형성 및 상피-간엽 전환 모두의 조절에 관여하는 후성적 인자들은 여전히 알려져 있지 않다.
miRNAs (MicroRNAs)는 세포 내에서 생성되는 길이 약 22 뉴클레오타이드의 비암호화 RNA들이며, 타겟 mRNA 분해 또는 번역 저해를 유도함으로써 많은 유전자의 발현을 억제한다 10,11. 단일 miRNA가 광범위한 타겟 mRNA 전사체를 조절하는 능력을 보유하며12 miRNA들은 60% 이상의 단백질 코딩 유전자의 번역을 조절하는 것으로 예측되어 왔다13. 그러므로, miRNA들은 상염색체 우성 다낭신의 중요한 표현형인 세포 증식, 분화 및 자기사멸11 ,14과 같은 다양한 세포 과정에 밀접하게 관여한다4. miRNA들은 복수 개의 타겟 유전자 또는 다낭신 유전자 발현을 직접적으로 조절함으로써 상염색체 우성 다낭신의 낭포형성에 영향을 미칠 수 있다. 예컨대 낭포 조직에서 miR-15a의 하향조절은 세포 주기 조절자로 알려진 타겟 유전자 Cdc25A의 상향조절과 관련이 있고, 세포 증식 및 낭포 성장의 촉진에 영향을 미친다15. 뿐만 아니라, Pandeay 등은 대조군과 비교할 때 상염색체 우성 다낭신 랫트 모델 PKD/mhm (cy/+)의 신장에서 miR-21이 상향조절되었음을 밝혔다16.
miR-192/215와 miR-194는 다른 기관에 비하여 신장에서 매우 풍부하다는 사실이 보고된바 있다17 ,18. miR-192와 miR-215는 동일한 성숙 miRNAs를 코딩하는 이웃하는 유전자 (각각 MIR194 -2와 MIR194 -1)와 무리를 이룬 다른 염색체 상에 코딩된 패럴로그 (paralogs)이다17. 편측성 요관 폐색 (unilateral ureteral obstruction) 마우스 모델19과 TGF-β로 처리된 당뇨 마우스 신사구체 (glomeruli)와 혈관사이세포 (mesangial)20에서 miR-192 발현이 증가하였다. 대조적으로, miR-192의 발현 감소는 사람의 당뇨성 신장장애 (diabetic nephropathy)에서 섬유화의 증가와 관련이 있다21. 그러나, 상염색체 우성 다낭신의 발병에서 이들 miRNA들의 관계에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
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본 발명은 상염색체 우성 다낭신을 효과적으로 치료할 수 있는 치료용 약학 조성물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 miRNA 마이크로어레이 분석을 통해 상염색체 우성 다낭신에서 변화하는 miRNA 발현 패턴을 조사하였다. 흥미롭게도, 다낭신에 걸리지 않은 대조군과 비교하여 상염색체 우성 다낭신의 신장 조직에서 miR-192/215와 miR-194 패밀리의 하향 조절이 관찰되었고, 이들은 상염색체 우성 다낭신에서 EMT와 낭포형성의 조절에 중요한 기능을 수행하는 것으로 보인다.
최근 EMT의 한 가지 기능이 상염색체 우성 다낭신 발병과 관련이 있음이 밝혀졌다. 예를 들면, 13 개의 인간 다낭신 신장을 이용한 cDNA 마이크로어레이 분석에서 EMT 마커의 증가가 관찰되었다28. 뿐만 아니라, EMT에 수반되는 상피세포 탈분화는 PKD1 낭포 성장과 질병의 진행에 중요하다고 보고된바 있다29. 비록 이 데이타들은 EMT가 상염색체 우성 다낭신의 진행에서 중요한 역할을 한다고 제시하였지만, 정확한 메카니즘은 아직 알려져 있지 않다.
비정상적 E-카데린 발현수준이 상염색체 우성 다낭신에서 낭포 팽창과 병행하여 관찰되었다30. 상염색체 우성 다낭신의 주요 원인 유전자로 잘 알려진 PKD1의 산물인 PC-1은 E-카데린 및 β-카테닌(catenin)과 복합체를 구성하며31, 이 복합체 형성은 상염색체 우성 다낭신 낭포 상피세포에서 E-카데린 발현 저하에 의해 방해를 받는다32. 관상 상피세포에서, E-카데린의 억제는 EMT 동안 다른 변화를 유도하는 초기 사건이다33. E-카데린의 저하 이외에도, N-카데린 및 비멘틴과 같은 중간엽 유전자들은 상염색체 우성 다낭신 신장의 낭포 라이닝 상피세포에서 새롭게 발현된다34. 낭포 상피세포에서 낭포 팽창에 대응하여 중간엽의 특징을 획득하면 PC-1 다중복합체 (multicomplex)에서 증가된 N-카데린은 E-카데린 대신 β-카테닌을 분명히 안정화한다32. 이것은 본 발명의 데이타들과 일치하며 (도 4), 카데린 관련 기능들이 상염색체 우성 다낭신 발명에서 중요한 역할을 수행함을 말해준다.
본 발명에서는 miR-192/215와 miR-194 패밀리가 상염색체 우성 다낭신 신장에서 상당히 하향조절되었고, ZEB2 및 N- 카데린과 같은 EMT 관련 유전자들을 타겟으로 함으로써 낭포 형성에 영향을 미쳤음을 밝혔다. 중요한 것은 miR-192/215와 miR-194가 정상 신장 피질에는 풍부하게 존재하지만18, 신장 섬유화 (renal fibrosis)가 된 상염색체 우성 다낭신에서는 현저히 감소하였다는 점이다. miR-192/215는 ZEB2의 전사 감소를 유도함으로써 E- 카데린의 전사를 증대시켰다. 뿐만 아니라, ZEB2는 인간 유방암 상피 세포에서 비멘틴 발현을 조절한다35. 따라서, miR-192/215와 miR-194 패밀리는 '상피'로부터 '중간엽'으로 관상 상피세포 형질의 변화에 결정적인 원인이며, 궁극적으로 이들은 상염색체 우성 다낭신에서 낭포 팽창에 영향을 미친다.
비록 miR-192가 ZEB2를 타겟으로 함으로써 신장 섬유화 (renal fibrosis)에 관여하는 것으로 보이지만19 -21, miR-192 발현 조절 메카니즘은 거의 밝혀지지 않았다. miR-192가 TGF-β1에 의해 유도된다고 보고된바 있다. 반대로, 최근의 연구결과는 TGF-β1이 인간 관상 상피세포에서 miR-192의 발현을 억제한다고 보고된 바도 있었다. 그러므로, 무엇이 miR-192 발현수준을 조절하는지에 대한 명확한 증거가 필요하다.
본 발명자들은 다낭신 환자의 신장 조직과 비 다낭신 신장 조직에서 유전체 전체의 메틸화 상태와 miRNA 발현 프로파일링을 비교하였다. 대부분의 miRNA 유전자들은 상염색체 우성 다낭신에서 과메틸화 패턴을 나타내었고, 이는 최근의 연구결과들과 일치한다. 최근의 몇몇 연구 결과들은 인간 종양에서 miR-124a, miR-145, miR-335 및 miR-199a와 같은 종양 억제 miRNA들의 감소가 프로모터 CpG 아일랜드의 과메틸화에 의한 일차 전사체의 침묵화 (scilencing)와 관련되어 있음을 확인하였다36 -38. CpG 아일랜드에서 전사된 miRNA들은 MBD (methyl-CpG-binding domain) 단백질의 전사 억제자와 비활성 히스톤 변형 마크들을 강화하여 DNA 메틸화 관련 침묵화를 진행한다36 ,39,40. 흥미롭게도, MIR192/MIR194-2의 잘못된 과메틸화는 그들의 발현 수준 저하를 유도하였다.
또한, MIR192/MIR194-2의 프로모터 (promoter) 상류 (upstream)에 Ets-1 전사인자의 결합부위가 존재하고 있음이 보고된 바 있다. 암 원인 유전자 Ets-1에 대한 공통 결합부위 (consensus binding site)를 포함하는 보존된 비암호화 서열이 MIR192 / MIR194 -2 클러스터의 2158 bp 상류에서 확인되었다41. Ets-1은 신장 발달과 기능에 관여한다42.
결론적으로, miR-192/215와 miR-194의 감소는 상염색체 우성 다낭신에서 중간엽 마커 유전자의 증대 및 낭포형성과 섬유화의 진행과 관련이 있다. 이러한 miRNA 발현 수준의 비정상적인 감소는 상염색체 우성 다낭신에서 miRNA의 잘못된 DNA 과메틸화에서 기인하는 것으로 판단된다.
본 발명은 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상을 포함하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA가 ZEB2 또는 N- 카데린의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상을 포함하는 유전자 전달체(gene carrier) 또는 세포를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 유전자 전달체는 벡터 또는 재조합 바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 재조합 바이러스는 레트로바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 또는 렌티 바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 ZEB2 또는 N- 카데린의 발현을 억제하는 이들 유전자에 대한 siRNA 또는 안티센스뉴클레오타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA가 E- 카데린의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA에 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 1000 ㎎/㎏이고, 구체적으로 0.001 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유하고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유하며, miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 103~1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하고, 좀 더 구체적으로는 105 내지 1010 IU를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 세포의 경우, 구체적으로 103 내지 108개를 함유하고, 좀 더 구체적으로 104 내지 107개를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 일일 2 내지 3회 투여할 수 있다. 상기 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
상기 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 진단용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) 피검체에서 분리된 시료에서 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 대조군에 비하여 상기 a)에서 선택된 miRNA의 발현 수준이 감소되면 상염색체 우성 다낭신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 시료가 신장 조직임을 특징으로 하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 miRNA 발현 수준 측정이 인 시투 혼성화 또는 실시간 RT-PCR에 의하여 수행함을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명은
a) 피검 물질을 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 세포에 처리하는 단계;
b) 대조군에 비하여 상기 a) 단계에서 선택된 miRNA의 발현 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 치료제 후보물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, miR-192, miR-215와 miR-194 과발현은 낭포 성장 저하를 유도하여 상염색체 우성 다낭신에 대하여 치료 효과를 나타내었다. 따라서, miR-192, miR-215와 miR-194 중 1종 이상을 포함하는 약제를 상염색체 우성 다낭신의 치료제로 이용할 수 있다.
본 발명에 의하면, miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 진단용 킷트를 이용하여 상염색체 우성 다낭신을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 피검체에서 분리된 시료에서 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 하여 대조군에 비하여 선택된 miRNA의 발현 수준이 감소되면 상염색체 우성 다낭신인 것으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 피검 물질을 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 세포에 처리하고, 대조군에 비하여 선택된 miRNA의 발현 수준을 증가시키는 피검 물질이 있는 경우 이를 상염색체 우성 다낭신 치료제 후보물질로 스크리닝할 수 있다.
도 1은 miR-192 패밀리가 상염색체 우성 다낭신에서 현저히 하향조절됨을 보여준다. (A) 임상시료를 이용한 miRNA 마이크로어레이의 열지도 (heatmap), (B) 임상시료에서 hsa-miR-192 패밀리를 이용한 Taqman qRT-PCR 결과, (C)는 세포주에서 hsa-miR-192 패밀리를 이용한 Taqman qRT-PCR 결과.
도 2는 ZEB2가 miR-192/215 타겟 유전자임을 나타내는 결과이다. (A-B) miR-192/215 전구체가 WT9-12에서 ZEB2 발현을 감소시키고 E-카데린의 발현을 증가시킴을 보여준다. (C-D) ZEB2가 E-카데린의 음성 조절자임을 보여준다. (E) miR-192/215의 시드 서열은 ZEB2 3’UTR에서 보존된다. (F) miR-192/215는 루시퍼레이즈 분석을 이용하여 ZEB2 3’UTR에 결합함으로써 ZEB2를 직접 억제한다.
도 3은 N-카데린이 miR-194의 타겟 유전자임을 말해준다. (A-B) miR-194 전구체는 WT9-12에서 N-카데린 발현을 감소시킨다. (C) miR-194의 시드 서열은 N-카데린 3’UTR에서 보존된다. (D) 루시퍼레이즈 분석 결과, miR-194는 N-카데린 3’UTR에 결합함으로써 N-카데린을 직접 억제한다.
도 4는 상염색체 우성 다낭신에서 EMT 관련 유전자들이 다른 발현 수준을 나타냄을 보여준다. (A-B) 상염색체 우성 다낭신에서는 EMT 관련 유전자 발현 수준이 변화한다. (C-E) 임상시료의 낭포 라이닝 세포에서는 중간엽 마커 유전자가 증가하고, 상피 마커 유전자가 감소한다.
도 5a~5f는 miR-192 패밀리가 낭포 성장을 저해함을 나타낸다. (5a-5b) miR-192/215와 194 전구체는 MDCK 3D 배양에서 낭포 성장을 저해한다. (5c) miR-192 패밀리 전구체의 트랜스펙션 후 타겟 유전자 발현 수준. (5d-5e) miR-192/215와 194 저해제는 MDCK 3D 배양에서 낭포 성장을 촉진한다. (5f) miR-192 패밀리 저해제의 트랜스펙션 후 타겟 유전자 발현 수준.
도 6a~6e는 DNA 메틸화에 의하여 miR-192/194 전사가 조절됨을 나타낸다. (6a) miR192-194-2 코딩 유전자는 상염색체 우성 다낭신에서 과메틸화되며 (파이로시퀀싱), 발현 저하와 음성관계 (negative correlation)를 나타낸다. (6b) WT9-12에 5-aza-dC를 처리하면 pri-miR-192 패밀리 발현 수준 회복이 유도된다. (6c) WT9-12에서 5-aza-dC 처리는 성숙한 miR-192/194 발현수준 회복을 유도한다. (6d-6e) WT9-12에서 5-aza-dC 처리는 EMT 관련 타겟 유전자 발현 수준 회복을 유도한다.
도 7은 상염색체 우성 다낭신 마우스 모델에서 miR-192 패밀리의 발현 수준을 나타낸다. (A) Pkd1 f/f:HoxB7-Cre 마우스, (B) Pkd2 f/f:HoxB7-Cre 마우스.
도 8은 상염색체 우성 다낭신의 낭포형성에서 miR-192 패밀리에 의한 조절을 제안한 모델이다.
도 9a ~ 9d는 상염색체 우성 다낭신에서 miR-192/194가 과메틸화된 것을 나타낸다 (MIRA 서열분석). (9a) 상염색체 우성 다낭신에서 과메틸화된 miRNA 유전자에 대한 유전체 전체 분석 결과를 나타낸다. (9b) 상염색체 우성 다낭신에서 MIR192-194-2 코딩 유전자는 과메틸화되어 있으며, 발현이 감소한다 (MIRA-seq 및 miRNA 마이크로어레이 비교분석). (9c) 상염색체 우성 다낭신에서 MIR192-194-2 코딩 유전자는 과메틸화되어 있다 (UCSC 유전체 브라우저). (9d) MIR215-194-1 코딩 유전자의 메틸화 수준은 정상과 상염색체 우성 다낭신 간에 차이가 없다 (UCSC 유전체 브라우저).
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
<재료와 방법>
신장조직 시료와 유전체 DNA 분리
이 연구는 서울대학교 병원 임상시험심사위원회의 승인을 받았고 (H-0701-033-195), 모든 환자의 동의를 받았다. 신장 낭포 조직은 신장절제수술을 받은 상염색체 우성 다낭신 환자에게서 얻었다. 대조군으로서 상염색체 우성 다낭신에 걸리지 않은 신장 조직은 투명세포형 신세포암 (clear cell renal cell carcinoma) 수술을 받은 환자에게서 얻었으며, 악성 세포 침윤은 조직학적으로 배제하였다.
세포배양
MDCK 세포는 10%(v/v) 우태혈청과 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12 (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. HRCE 세포는 피질에서 분리한 인간 정상 신장 상피세포이며 Clonetics (San Diego, CA)에서 입수하였다. HRCE 세포는 0.5% 우태혈청, 10 mg/ml 인간 트랜스페린, 0.5 mg/ml 하이드로코르티손, 5 mg/ml 인슐린, 5×10-12 M 트리아이오도티로닌 (triiodothyronine), 0.5 mg/ml 에피네프린, 10 mg/ml 상피세포 성장인자 (EGF) 및 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 REGM 배지에서 배양하였다. 상염색체 우성 다낭신 낭포-내측 상피세포 (cyst-lining epithelial cells), WT9-12 22를 구입하여 10% (v/v) FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 이 세포들은 5% CO2와 95% 공기가 함유된 습한 분위기에서 37 ℃로 배양하였다.
RNA 분리 및 miRNA 마이크로어레이
총 RNA를 제조자 (Invitrogen Life Technologies)의 지시에 따라 Trizol 방법으로 비 다낭신 및 다낭신 환자의 신장 조직에서 분리하였다. 전체적인 miRNA 유전자 발현은 Agilent Human miRNA Microarray Version 3 (Agilent design IDs 021827)를 이용하여 프로토콜 (miRNA Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit protocol 2.1)에 따라 Agilent 방법에서 인풋으로 총 RNA 100 ng을 사용하여 수행하였다.
총 RNA 100 ng은 표지 반응 (labeling reaction)에서 인풋으로 이용하였고, 표지된 miRNA는 프로토콜에 따라 55 ℃, 20 rpm으로 20 시간 동안 어레이를 위해 혼성화시켰다. 혼성화 후 칩은 세척하고 Agilent DNA Microarray Scanner로 스캔하였다.
miRNA 발현 분석
총 RNA (500 ng)를 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 'TaqMan MicroRNA Assays' 프로토콜 (Applied Biosystems)에 따라 역전사하였다. cDNAs와 TaqMan 프로브를 마스터 믹스 (Applied Biosystems)에 가하였다. 실시간 PCR은 7500 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다. 이 데이타는 내부 대조군으로서 RNU48 (Applied Biosystems)를 이용하여 표준화하였다.
정량적 실시간 RT - PCR
총 RNA (2 ㎍, 위의 방법에 따라 분리함)는 M-MLV 역전사효소 (Promega), 100 nM 올리고-dT, 1 mM dNTP 혼합물 및 RNase 저해제를 이용하여 역전사하였다. PCR 프라이머 서열은 ZEB2, 정방향 5'-GCGCAGTGACACAGCCATTATTTA-3' 및 역방향 5'-GCAGTAGGGGCAGGTCAGCAGTTG-3'; E-카데린 (E-cadherin), 정방향 5'-CTTCGGAGGAGAGCGGTGGTCAA-3' 및 역방향 5'-CCCTGTGCAGCTGGCTCAAGTCA-3'; N-카데린, 정방향 5'-CCATCATTGCCATCCTGCTCTGC-3' 및 역방향 5'-TGTTTGGCC TGGCGTTCTTTATCC-3' 및 비멘틴 (vimentin), 정방향 5'-TGTATGCCA CGCGCTCCTCTGC-3' 및 역방향 5'-CCTTCTCGTTGGTGCGGG TGTTC-3'였다. 인간 18s rRNA, 정방향 5'-GTCGGCGTCCCCCAACTTCTT-3' 및 역방향 5'-CGTGCAGCCCCGGACATCTA-3'은 내부 대조군으로 이용하였다. 정량적 실시간 PCR은 제조자 (Quantance, London, UK)의 지시에 따라 실시간 SensiMixPlus SYBR kit 를 이용하여 수행하였다.
웨스턴 블랏 분석
동량의 단백질을 SDS-PAGE로 두 번 분석하였다. 다음의 단일클론항체를 이용하였다: 항-SIP1 (E-11, Santa Cruz Biotechnology, sc-271984), 항-E-카데린 (BD Biosciences, 610181), 항-N-카데린 (Abcam, ab12221), 항-비멘틴 (V9, Santa Cruz Biotechnology, sc-6260), 및 항 β-액틴 (Bethyl, A300-491A). 면역반응성 단백질은 호스래디쉬 퍼옥시데이즈가 결합된 이차 항체와 ECL (enhanced chemiluminescence)제 (GE Healthcare Bio-Sciences)를 이용하여 탐지하였다.
면역조직형광법 ( Immunohistofluorescence ; IHF )
인간 정상 신장조직과 상염색체 우성 다낭신 환자의 신장조직 파라핀-포매 절편들을 60 ℃ 오븐에서 녹여 자일렌을 세 번 교체하여 파라핀을 제거하였고, 일련의 에탄올로 재수화하였다. 절편은 항원을 회복하기 위하여 0.01 M 시트르산 (pH 6.0)에서 열을 가하였고, 실온에서 한 시간 동안 블로킹 용액에 두어 블로킹하였으며, 일차 항체와 함께 4 ℃에서 오버나잇 배양하였다. 사용된 항체는 항-SIP1 (E-11, Santa Cruz Biotechnology, sc-271984), 항-E-카데린 (BD Biosciences, 610181) 및 항-N-카데린 (Abcam, ab12221) 항체였다. 4'-6-다이아미디노-2-페닐인돌 (4'-6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) 염색은 핵을 표시하기 위하여 수행하였다. 형광 신호는 형광현미경 (Olympus IX-81)으로 관찰하였다.
miRNA 전구체 트랜스펙션
WT9-12 세포는 100 cm2 배양 접시에서 siPORT NeoFX 트랜스펙션제 (Ambion)를 이용하여 최종 농도 30 nM로 Pre-miR-192, 215 또는 194 (Ambion)로 역-트랜스펙션하였다. 대조군으로는 스크램블 (scramble) miRNA (Pre-miR miRNA Precursor Molecules, Negative Control #1, Ambion)로 트랜스펙션한 것을 이용하였다.
siRNA 트랜스펙션
ZEB2 (sc-38641)를 타겟으로 하는 siRNA와 대조군 siRNA (sc-37007)는 Santa Cruz Biotechnology에서 입수하였다. siRNA는 100 cm2 배양접시에 세포를 시딩한 다음 하루 후 제조자의 지시에 따라 LipofectamineTM RNAiMAX reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 WT9-12 세포 내로 48시간 동안 트랜스펙션하였다.
3' UTR 리포터 분석
ZEB2와 N-카데린의 3'UTR은 HEK293T 유전체 DNA로부터 PCR로 증폭하였고, pGL3-대조군 벡터 (Promega)의 XbaI 부위 내로 클론하였다. PCR 프라이머 서열은 야생형 ZEB2 3'UTR, 정방향 5'-tgctctagaAATTTTAGGTCAAATAACATT-3'; 변이형 ZEB2 3'UTR, 정방향 5'-tgctctagaAATTTCCGGGCAAAT AACATT-3'; 공통 ZEB2 3'UTR, 역방향 5'-tgctctaga AATGATCAACGTCATGTTCC-3'; 야생형 N-카데린 3'UTR, 정방향 5'-tgctctagaGCTTTTGTTACATTGCATTT-3'; 변이형 N-카데린 3'UTR, 정방향 5'-tgctctagaGCTTTTACCACATTGCATTT-3' 및 공통 N-카데린 3'UTR, 역방향 5'-tgctctaga TAATGTACATTTTCCAATCT-3'. 트랜스펙션을 위해 HEK293T 세포는 2 ×105 농도로 6-웰 플레이트에 깔고, 루시퍼레이즈 구조체 (luciferase constructs) (리포터 유전자 플라스미드 1.5 ㎍과 phRL-CMV 표준화 플라스미드 40 ng) 및 15 nM의 Pre-miRs (Ambion)를 제조자의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 이용하여 시딩한 후 하루가 지난 다음 세포에 코트랜스펙션하였다. 세포는 36시간 후 모아 분석에 이용하였고, 루시퍼레이즈 활성은 Dual Luciferase 분석 시스템 (Promega)으로 측정하였고, 루시퍼레이즈의 상대적 활성은 phRL-CMV 플라스미드 유래 Renilla 루시퍼레이즈 활성을 표준화하여 계산하였다. 모든 트랜스펙션 실험은 두 번씩 수행하였다.
5- aza - dC 처리
WT9-12 세포를 5 및 10 μM의 5-aza-2'-디옥시사이티딘 (5-aza-2'-deoxycytidine; 5-aza-dC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)으로 72시간 동안 처리하였다. 배지는 매일 교환하였고, 새로운 5-aza-dC를 가하였다.
MIRA -서열결정
MIRA는 종래 방법과 같이 수행하였다23.
중아황산염 ( Bisulfite ) 처리 및 파이로시퀀싱
유전체 DNA를 인간 신장 피질 조직, LONZA에서 입수한 HRCE 및 상염색체 우성 다낭신 낭포 라이닝 피질 상피세포로부터 제조자의 지시에 따라 NucleoSpin® TriPrep Extract kit (MACHEREY-NAGEL)를 이용하여 DNA 메틸트랜스퍼레이즈 (DNMT) 저히제 처리 전과 후에 분리하였다. 제조자의 지시에 따라 EZ DNA Methylation-Gold kit™ (ZYMO Research, USA)를 이용하여 유전체 DNA에 중아황산염을 처리하였다. 처리된 DNA는 HotStar Taq® Plus DNA polymerase (Qiagen)를 이용한 PCR 증폭에 사용하였다. 프라이머는 Pyrosequencing™ Assay Design Software version 1.0 (Biotage AB, Uppsala, Sweden)으로 디자인하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃로 5분; 94 ℃로 30초, 55 ℃로 1분 및 72 ℃로 45초를 44 싸이클; 그 다음에 72 ℃로 7분 처리. PCR 산물은 PyroMark™ MD (Biotage AB)를 이용하여 파이로시퀀싱하였다. PCR 프라이머 서열은 아래와 같다. MIR192, 정방향, 5'-GTTTTGGTGGTTGGTATTGAG-3', 역방향, 5'-바이오틴 표지-CCCCTATAACAACAACTCCATAT-3'; MIR194 -2, 정방향, 5'-AGTTTTGGTTGGTTTGTTGGTTAG-3', 역방향, 5'-바이오틴 표지-TAAAACACTCTCCAAAACCCTACC-3'; MIR192의 파이로시퀀싱 프라이머, 정방향 5'-ATAGGTTAGAGTTTTGTGTA-3'; MIR194 -2의 파이로시퀀싱 프라이머, 5'-TATGGAGTTGTTGTTATAGG-3'. 모든 CpG 부위에 대한 메틸화 추정은 증폭된 부위를 포함한다.
3차원 세포배양
3차원 콜라겐 I 젤은 랫트 꼬리 콜라겐 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)에 동일 부피의 재구성 완충액 (reconstitution buffer; 262 mM 중탄산나트륨, 20 mM HEPES pH 7.6)과 충분한 배양배지를 가하여 최종 젤 농도 3.8 mg/ml가 되도록 하여 제조하였다. Pre-miR로 트랜스펙션된 MDCK 세포를 2.5 X 105 내지 3 X 106 cells/ml 농도로 용액에 즉시 가하였다. 용액은 35-mm 접시로 옮겨 37 ℃로 올렸다. 24시간 후 젤이 형성되었을 때 1% (v/v) FBS를 함유한 DMEM/F12 (Welgene)를 가하였다. 배지는 매일 갈아주었다. 콜라겐 젤 내의 MDCK 낭포 구조의 위상차 이미지는 Olympus IX70 현미경을 이용하여 배지에서 1, 4, 및 7일 후 40배 대물렌즈로 촬영하였다. 개별 낭포의 크기는 종래 기술에 따라 평가하였다24.
통계학적 분석
각 실험은 최소한 세 번 반복하였다. 데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 중요도는 두 군을 비교할 때 Student's t tests를 이용하여 시험하였다. 아니면, GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA)의 Newman-Keuls 비교 프로그램과 함께 일방 ANOVA를 이용하였다. P < 0.05는 유의미한 것으로 판단하였다.
결과 1: 상염색체 우성 다낭신에서 miR -192/215 및 miR -194 발현감소
상염색체 우성 다낭신 발명과 관련된 miRNA의 발현 패턴 변화를 조사하기 위하여 다낭신 환자가 아닌 세 사람과 세 사람의 다낭신 환자의 신장 조직을 이용하여 miRNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 그 결과, 비 다낭신에 비하여 상염색체 우성 다낭신에서 총 19개의 miRNA가 현저히 변화하였다 (도 1A). 이 miRNA들 중 miR-192/215와 miR-194 발현 수준을 아홉 사람의 상염색체 우성 다낭신 환자 신장조직에서 TaqMan 실시간 RT-PCR로 확인한 결과, 이들 miRNA는 다낭신 신장조직과 낭포 신장 상피세포에서 극적으로 감소하였다 (도 1B와 1C). 이 데이타들은 miR-192/215 및 miR-194의 감소가 상염색체 우성 다낭신 발병과 관련이 있음을 말해준다.
결과 2: 상염색체 우성 다낭신에서 miR -192/215 및 miR -194 패밀리의 감소에 의한 ZEB2 와 N- 카데린 의 상향 조절
최근의 보고들은 E- 카데린의 억제제로 잘 알려진 ZEB2의 발현이 miR-192 및 miR-215에 의해 조절됨을 제시하였다25. 뿐만 아니라, miR-194는 N- 카데린 3'UTR의 결합 가능부위를 갖고 있으며, 이는 루시퍼레이즈 분석으로 입증되었다26. miR-192와 miR-215 과발현은 mRNA와 단백질 수준 모두에서 ZEB2 발현 감소를 유도하였다 (도 2A와 2B). 대조적으로, E- 카데린 발현 수준은 miR-192/215 전구체로 트랜스펙션된 WT9-12 세포에서 증가하였다 (도 2A와 2B). ZEB2 녹다운은 mRNA와 단백질 수준 모두에서 E- 카데린 발현수준 증가를 유도하였다 (도 2C와 2D). 뿐만 아니라, miR-194는 그것의 잠재적 타겟 유전자인 N- 카데린 발현을 현저히 억제하였다 (도 3A와 3B). 주목할 것은 ZEB2와 N- 카데린은 각각 miR-192/215 및 miR-194의 타겟 유전자들이며 EMT 과정과 관련이 있다는 것이다. 이들 타겟 유전자의 3'UTR은 매우 보존적인 시드 서열을 보유하고 있으며, 이들 miRNA들과 서열 특이적으로 매치되어 직접적으로 상호작용하고 있음이 증명되었다 (도 2E와 3C). 실제로, 루시퍼레이즈 리포터 분석방법은 miR-192/215와 miR-194가 그들의 타겟인 ZEB2와 N- 카데린의 전사를 돌연변이 시드 서열이 아닌 3'UTR 내의 시드 서열로 직접적으로 억제하였음을 제시하였다 (도 2F와 3D). 이들 데이타는 ZEB2와 N-카데린이 직접적인 타겟 유전자로서 miR-192/215와 miR-194에 의해 조절됨을 말해준다.
결과 3: 상염색체 우성 다낭신 낭포 라이닝 상피세포에서 EMT 관련 유전자의 변화된 발현 패턴
ZEB2와 N-카데린은 EMT 단계 동안 중간엽 마커 (mesenchymal marker)로 알려져 있다27. ZEB2, N-카데린 및 비멘틴을 포함하는 이러한 중간엽 마커들은 인간 신장 피질 상피세포 HRCE에 비해 인간 낭포 라이닝 상피세포 WT9-12에서 현저히 증가되어 있었으며, 반대로 상피 마커 (epithelial marker)인 E-카데린의 발현은 현저히 감소하였다 (도 4A와 4B). 이러한 발현 패턴은 비 다낭신과 비교할 때 다낭신 신장 조직에서 유사하게 관찰되었다 (도 4B). 이들 타겟 유전자의 분포를 확인하기 위하여 다낭신 및 비다낭신 신장 조직을 이용하여 면역형광법을 수행하였다. 흥미롭게도, 중간엽 마커 유전자인 ZEB2와 N-카데린은 다낭신의 정상 세관 또는 비 다낭신과 비교할 때 낭포 라이닝 상피세포 및 다낭신 신장 조직의 팽창된 관에서 특히 증가하였다 (도 4C와 4D). 대조적으로, E-카데린의 발현 수준은 정상 관상세포와 비교하여 낭포 라이닝 상피세포에서 현저히 약해졌다 (도 4E). 이 데이타들은 EMT가 상피세포 마커 유전자 및 중간엽 마커 유전자들 모두의 발현을 변화시킴으로써 상염색체 우성 다낭신에 관여함을 말해준다.
결과 4: miR -192/215와 miR -194에 의해 낭포 성장이 조절된다.
miR-194가 낭포 형성에 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 3D 배양 시스템을 이용하여 인비트로 낭포형성을 수행하였다. miR-192/215 또는 miR-194 전구체가 MDCK 세포 내로 트랜스펙션되었을 때 스크램블 음성 대조군 miR 전구체로 트랜스펙션된 세포와 비교하여 낭포의 성장이 억제되었다 (도 5A와 5B). 대조적으로, miR-192/215 또는 miR-194의 저해는 스크램블 음성 대조군 mirVana 저해제로 트랜스펙션된 세포와 비교하여 낭포 크기의 증대를 유도하였다 (도 5D와 5E). 이들은 miR-192/215와 miR-194 발현 수준에 의존적인 ZEB2, E-카데린과 N-카데린 등의 타겟 유전자 수준의 변화와 일치하였다 (도 5C와 5F). 이 데이타들은 miR-192/215와 miR-194가 상염색체 우성 다낭신의 낭포 발달의 억제에서 EMT와 관련된 유전자를 타겟으로 함으로써 중요한 기능을 수행할 수 있음을 말해준다.
결과 5: miR -192와 miR -194의 DNA 메틸화와 발현 감소 간의 관계
상염색체 우성 다낭신에서 무엇이 miR-192와 miR-194 발현을 현저히 억제하는 구동체인지를 알아보기 위하여 세 사람의 다낭신 환자와 비 다낭신 세 사람에서 각각 MIRA-seq와 miRNA 마이크로어레이 데이타에서 얻은 miRNA의 유전체 전체 메틸화 상태와 발현 프로파일링을 얻었다. 비 다낭신과 비교할 때 상염색체 우성 다낭신에서는 miRNA를 포함하여 약 3,800개의 비코딩 RNA (small transcript, ~100 bp)가 현저히 과메틸화되어 있었다 (도 9a). 흥미롭게도, MIR192/MIR-194-2 클러스터는 발현 수준은 급격히 감소하는 반면 11번 염색체에서 과메틸화되어 있었고 (도 9b와 9c), 반면 1번 염색체의 MIR215 / MIR194 -1은 그렇지 않았다 (도 9d). 실제로, 비 다낭신과 비교하여 다낭신의 miR-192/miR-194-2 클러스터의 CpG 부위들은 현저히 과메틸화되어 있었으며, 이는 그들의 발현 수준과 반대의 상관관계를 보여준다 (도 6a). 뿐만 아니라, miR -192/194-2의 과메틸화는 HRCE와 WT9-12 세포에서도 관찰되었다. DNA 디메틸화 제제인 5-aza-dC를 WT9-12 세포에 처리하면 pri-miR-192/miR-194 및 성숙한 miR-192/miR-194의 발현 수준이 모두 투여량 의존적으로 회복되었다 (도 6b와 6c). 뿐만 아니라, DNA 메틸화 회복은 중간엽 마커 유전자의 감소를 유도하는데, 이것은 정상 신장세포 HRCE와 거의 유사한 정도이다 (도 6d와 6e). 이 데이타들은 miR-192와 miR-194의 잘못된 과메틸화가 상염색체 우성 다낭신 발현 수준 감소를 유도함을 간접적으로 제시하였다.
결과 6: Pkd1 또는 Pkd2 조건부 녹아웃 마우스의 최종 단계에서 감소된 miR-192와 miR -194 발현수준
인비보에서 낭포 발생의 정도에 의존하는 발현 패턴을 확인하기 위하여 대표적인 상염색체 우성 다낭신 마우스 모델인 Pkd1 f/f:HoxB7-Cre와 Pkd2 f/f:HoxB7-Cre의 신장조직을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 출생 후 하루가 지난 (P1) Pkd1 또는 Pkd2 f/f:HoxB7-Cre 마우스의 신장조직에서 몇 개의 확장된 관이 관찰되었지만, 대조군 마우스인 Pkd1 또는 Pkd2 f/f에서는 관찰되지 않았다. Pkd1 또는 Pkd2 f/f:HoxB7-Cre 마우스 모델에서, 출생 7일 후(P7) 액체가 든 다수의 큰 낭포들이 양쪽 신장에서 관찰되었고, 신장 기능은 저하되었다 (데이타 나타내지 않음). 흥미롭게도, 양 마우스 모델의 P7에서 모두 miR-192와 miR-194 발현수준 하향조절이 관찰되었지만, 초기 단계인 P1과 P3에서는 변화가 없었다 (도 7A와 B). 이 데이타들은 miR-192와 miR-194가 EMT 관련 타겟 유전자를 억제함으로써 낭포 형성 개시보다는 낭포 성장에 영향을 미친다는 것을 말해준다.
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Claims (8)

  1. miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상을 포함하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상은 ZEB2 또는 N-카데린 중 1종 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상은 E-카데린의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 인간 상염색체 우성 다낭신 치료용 약학 조성물.
  4. miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 검출을 위한 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 진단용 킷트.
  5. a) 피검체에서 분리된 시료에서 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 대조군에 비하여 상기 a)에서 선택된 miRNA의 발현 수준이 감소되면 상염색체 우성 다낭신인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 시료는 신장 조직임을 특징으로 하는, 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 miRNA 발현 수준 측정은 인 시투 혼성화 또는 실시간 RT-PCR에 의하여 수행함을 특징으로 하는 상염색체 우성 다낭신 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
  8. a) 피검 물질을 miR-192, miR-215 및 miR-194 중 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 세포에 처리하는 단계;
    b) 대조군에 비하여 상기 a) 단계에서 선택된 miRNA의 발현 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 상염색체 우성 다낭신 치료제 후보물질 스크리닝 방법.
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Sun et al. Characterization of function and regulation of miR-24-1 and miR-31
Li et al. Downregulation of microRNAs miR-1,-206 and-29 stabilizes PAX3 and CCND2 expression in rhabdomyosarcoma
Chiyomaru et al. Functional role of LASP1 in cell viability and its regulation by microRNAs in bladder cancer
Liu et al. Overexpressed miR-494 down-regulates PTEN gene expression in cells transformed by anti-benzo (a) pyrene-trans-7, 8-dihydrodiol-9, 10-epoxide
Qin et al. MicroRNA-221 promotes colorectal cancer cell invasion and metastasis by targeting RECK
Wu et al. miR-17-5p promotes proliferation by targeting SOCS6 in gastric cancer cells
Wang et al. The QKI-5 and QKI-6 RNA binding proteins regulate the expression of microRNA 7 in glial cells
Tao et al. A novel lncRNA, Lnc-OC1, promotes ovarian cancer cell proliferation and migration by sponging miR-34a and miR-34c
Liu et al. AEG-1 3′-untranslated region functions as a ceRNA in inducing epithelial–mesenchymal transition of human non-small cell lung cancer by regulating miR-30a activity
Ding et al. MiR-145 suppresses cell proliferation and motility by inhibiting ROCK1 in hepatocellular carcinoma
Mziaut et al. MiR-132 controls pancreatic beta cell proliferation and survival through Pten/Akt/Foxo3 signaling
Jin et al. MicroRNA-376c inhibits cell proliferation and invasion in osteosarcoma by targeting to transforming growth factor-alpha
Niu et al. MiR-205 promotes motility of ovarian cancer cells via targeting ZEB1
Wang et al. LncRNA GAS5 exacerbates renal tubular epithelial fibrosis by acting as a competing endogenous RNA of miR-96-5p
Dai et al. MicroRNA-200b is overexpressed in endometrial adenocarcinomas and enhances MMP2 activity by downregulating TIMP2 in human endometrial cancer cell line HEC-1A cells
Bi et al. MicroRNA-181a-5p suppresses cell proliferation by targeting Egr1 and inhibiting Egr1/TGF-β/Smad pathway in hepatocellular carcinoma
Yamamoto et al. Uncovering direct targets of MiR-19a involved in lung cancer progression
Kim et al. Impact of miR‐192 and miR‐194 on cyst enlargement through EMT in autosomal dominant polycystic kidney disease

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