KR20150112385A - A New Antibody Fragment Derived from Cetuximab - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a novel protein capable of specifically binding to an epidermal growth factor receptor (EGFR) and to a nucleic acid molecule encoding the same. Also, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer or a composition for cancer diagnosis, containing the protein of the present invention. The nucleic acid molecule encoding an antibody fragment of the present invention shows protein expression rate greater than or equal to two to three times, in spite of opposition of arrangement sequence of a domain within an existing single chain variable fragment (scFv). In addition, the antibody fragment of the present invention enhances binding abilities for antigens and cell lines.

Description

세툭시맙 유래 신규한 항체 단편{A New Antibody Fragment Derived from Cetuximab}A new antibody fragment derived from Cetuximab {A New Antibody Fragment Derived from Cetuximab}

본 발명은 암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물로 사용될 수 있는 세툭시맙 유래 신규한 항체 단편에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel antibody fragment derived from cetuximab which can be used as a pharmaceutical composition for cancer therapy or a cancer diagnostic composition.

Epidermal growth factor receptor(EGFR) 즉 HER1은 세포표면에 존재하는 수용체 HER 패밀리의 하나로 EGF, TGF-alpha, Epiregulin 등의 리간드들과 결합하여 세포의 성장과 사멸을 조절하는 중추적인 역할을 담당하는 세포관통 티로신 인산화효소 수용체(transmembrane tyrosine kinase receptor)로서 세포표면에서 모노머 형태로 존재하다가 EGF와 결합하게 되면 다이머를 형성하여 kinase가 활성화되어 하위 단계로 신호를 전달한다. 이러한 EGFR은 다양한 고형암세포에서 널리 분포되어 발현되는 특성이 있으며, 이런 EGFR의 증가가 암 발생 예후와도 밀접한 관련성이 있다는 보고들이 있다. 이에 따라 EGFR 신호전달을 억제하여 암을 치료하려는 시도로 EGFR blocking antibody인 Cetuximab과 저분자 EGFR tyrosine kinase inhibitor(EGFR-TK1)인 Gefitinib(Iressa)과 Erlotinib(Tarceva) 등이 개발되어 임상에 사용되고 있다. Epidermal growth factor receptor (EGFR), or HER1, is one of the HER family receptors on the cell surface. It binds to ligands such as EGF, TGF-alpha and Epiregulin and plays a pivotal role in cell growth and death. As a transmembrane tyrosine kinase receptor, it exists as a monomer on the cell surface, and when it binds to EGF, it forms a dimer to activate the kinase and transmit signals at a lower level. These EGFRs are widely distributed and expressed in various solid cancer cells, and there is a report that the increase of EGFR is closely related to the cancer development prognosis. Therefore, EFCR blocking antibody Cetuximab and EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TK1) such as Gefitinib (Iressa) and Erlotinib (Tarceva) have been developed and used in clinical trials to treat cancer by inhibiting EGFR signaling.

치료용 항체 Cetuximab의 경우 리간드와 경쟁하여 EGFR에 결합함으로써 kinase 활성을 억제하고 그에 따른 하위 단계로의 신호전달의 억제를 야기하여 세포성장이 억제됨으로써 암세포의 사멸이 유도되는 것으로 알려져 있다. 이러한 Cetuximab과 EGFR의 결합은 암세포 내 수용체의 활성화 및 신호전달 통로의 억제로 인하여 종양세포의 정상조직 침투 및 새로운 부위로의 확산이 감소되어 전반적인 종양증식 억제효과가 나타나는 것으로 판단된다. Therapeutic antibody Cetuximab competes with ligand and binds to EGFR, thereby inhibiting kinase activity, thereby inhibiting signal transduction to a lower level, thereby inhibiting cell growth and inducing the death of cancer cells. The binding of Cetuximab to EGFR is thought to result in suppression of tumor growth and suppression of tumor proliferation due to decreased penetration of tumor cells into normal tissues and the spread of new sites due to activation of receptor in tumor cells and inhibition of signal transduction pathway.

치료용 항체 Cetuximab과 Panitumumab의 경우 EGFR의 하위 신호 전달 물질인 KRAS의 유전자 돌연변이에 의해 치료효과가 영향을 받는다는 보고들로부터 EGFR을 타겟으로 하는 항체 치료기작이 EGFR의 신호전달을 억제함으로써 나타나는 효과라는 것을 알 수 있다. 이러한 KRAS 돌연변이는 대장암의 40~45％에서 발견되는데 암 환자의 생체지표(바이오마커) 검사를 통해 KRAS 유전자의 변이여부를 확인하여 돌연변이가 없는 경우에만 치료용 항체를 사용하고 있다. Therapeutic antibodies Cetuximab and Panitumumab are reported to be affected by the mutation of the KRAS gene, a sub-signaling substance of EGFR, suggesting that EGFR-targeting antibody therapy is an effect of inhibiting EGFR signaling Able to know. These KRAS mutations are found in 40 ~ 45% of colorectal cancer. By checking biomarkers of cancer patients, mutation of KRAS gene is confirmed and therapeutic antibody is used only when there is no mutation.

EGFR-TK1는 Cetuximab과 마찬가지로 EGFR을 타겟으로 하지만, EGFR 발현이 예후와 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려진 암들에서는 효과가 별로 없고 관련성이 아주 미약한 폐암에서 효과를 나타내고 있다. 이는 EGFR 발현량에 따른 신호전달과는 다른 작용기전이 존재함을 시사하고 있다. 치료용 항체가 암세포에 cytotoxic effect를 나타내기 위해서는 몇 가지 작용기전이 복합적으로 이용되는데, 대부분은 ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)를 통한 면역 체계를 통해 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. EGFR-TK1 targets EGFR as well as Cetuximab, but it has been shown to be effective in lung cancer with little or no relevance in cancer, where EGFR expression is known to be closely associated with prognosis. This suggests that there is a mechanism of action different from signal transduction depending on the amount of EGFR expression. Several therapeutic mechanisms are used in combination for therapeutic cytotoxic effects in cancer cells, most of which are effected through antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) It is known.

최근 항체공학(Antibody engineering) 분야는 다른 약물동력학(약물동력학적 특이성을 가지는 항체절편)과 항원에 대한 선택적 결합능을 갖는 다양한 항체 절편의 개발에 주력하고 있다. 항체절편은 전체 항체분자(IgG)에서 작용 기능(effector function)을 나타내는 효과기 즉 Fc 영역을 제외한 항원결합 도메인들을 지칭하며, 주로 Fab, single-chain antibody fragment(scFv) 및 3세대 항체 절편(single domain과 minibody 등)이 포함되는데, 이러한 항체 절편들은 주로 인간화 항체 또는 인간 항체의 서열을 갖는다. 특히, minibody는 항원에 대한 이가결합(bivalent binding)특성을 유지하면서 전체 IgG 보다 작은 분자량을 갖는 특성 있다. Minibody는 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 생체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하게 사용 될 수 있다(Wu et al 2005). Minibody는 CEA(carcinoembryonic antigen)에 대한 minibody가 처음 발견된 이후, 유방암 표지인자 human epidermal growth factor receptor-2 (HER2)와 비호지킨림프종 표지인자 B-lymphocyte antigen CD20와 전립선암 표지인자 prostate stem cell antigen(PSCA) 등에 대한 생체 진단을 위해 개발되고 있다 (Hu et al 1996, Leyton et al 2008, Olafsen et al 2004, Olafsen et al 2009). 그 예로, 123I-labeled CEA minibody는 직장결장암 환자의 진단에 시도된바 있다(Wong et a., 2004). 또한 Minibody는 PEGylation 등의 방법을 이용하여 생체 내 반감기를 증가시켜 치료용 항체로 개발하고 있으며, 박테리아의 독소를 결합(conjugation)시켜 약물 전달용으로 개발하거나, cytotoxic T 세포에 결합하는 항체 절편과의 이중특이성(bispecific) 항체를 제조하여 암치료제로 개발하는 등 다양하게 이용되고 있다. Recently, the field of Antibody engineering has focused on the development of various antibody fragments with different pharmacokinetics (antibody fragment with pharmacokinetic specificity) and selective binding ability to the antigen. Antibody fragments refer to antigen-binding domains except for the Fc region, which is an effector exhibiting an effector function on the whole antibody molecule (IgG), and mainly include Fab, single-chain antibody fragment (scFv) And minibodies, etc.), these antibody fragments having sequences of primarily humanized antibodies or human antibodies. In particular, the minibody has a molecular weight smaller than that of the whole IgG while retaining the bivalent binding property to the antigen. Because of its small size, the minibody has a good penetration rate into tissues and tumors and has a short half-life in vivo, making it suitable for use in biopsy (Wu et al 2005). After minibody detection for carcinoembryonic antigen (CEA), the minibody has been shown to induce the expression of the human epidermal growth factor receptor-2 (HER2), the non-Hodgkin's lymphoma marker B-lymphocyte antigen CD20 and the prostate stem cell antigen (Leyton et al., 2008; Olafsen et al., 2004; Olafsen et al. For example, a 123 I-labeled CEA minibody has been attempted in the diagnosis of rectal colon cancer patients (Wong et al., 2004). In addition, Minibody has been developed as a therapeutic antibody by increasing the half-life in vivo using methods such as PEGylation. It can be used for drug delivery by conjugating the toxin of bacteria, or by antibody fragments binding to cytotoxic T cells Bispecific antibodies have been prepared and developed as cancer therapeutic agents.

Minibody는 scFv-Hinge-CH3의 구조를 가지며, 특히 scFv는 중쇄가변 도메인 VH(heavy chain variable region)와 경쇄가변 도메인 VL(light chain variable region)로 구성되어 있다. "Hinge"는 전체 IgG1 아미노산 서열에서 유래된 힌지 부위(hinge region)를, "CH3"는 중쇄불변 도메인(heavy chain constant domain)의 CH3를 지칭한다. Hinge의 아미노산 배열과 길이는 Minibody의 homogeneity와 안정성에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 scFv를 구성하는 VL과 VH의 배열순서 (VL-VH 또는 VH-VL)는 scFv 항체절편의 homogeneity와 Fab 및 scFv-Fc fusion protein의 결합능에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다 (Dolezal et al., 2000; Geng et al., 2006; Scheer et al., 2012). 하지만 이들 VL과 VH의 배열 순서에 따른 Minibody의 특성변화에 대한 연구는 보고된바 없다.
The minibody has the structure of scFv-Hinge-C H 3, and in particular scFv is composed of a heavy chain variable region (V H ) and a light chain variable region (V L ). "Hinge" refers to the hinge region derived from the entire IgG1 amino acid sequence, and "C H 3" refers to C H 3 for the heavy chain constant domain. The amino acid sequence and length of the hinge are well known to affect the homogeneity and stability of the minibody. In addition, the order of arrangement of V L and V H constituting the scFv (V L -V H or V H -V L ) has been reported to affect the homogeneity of scFv antibody fragments and the binding capacity of Fab and scFv-Fc fusion proteins (Dolezal et al., 2000; Geng et al., 2006; Scheer et al., 2012). However, no study has been reported on the changes in the minibody characteristics according to the arrangement order of V L and V H.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

Wu A M and Senter P D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nat Biotechnol, 2005. 23(9):1137-46. Wu A M and Senter P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nat Biotechnol, 2005. 23 (9): 1137-46. Wu A M and Olafsen T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer J, 2008. 14(3):191-7. Wu A M and Olafsen T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer J, 2008. 14 (3): 191-7. Wu A M. Antibodies and Antimatter: The resurgence of ImmunoPET. J Nucl Med, 2009. 50(1):2-5. Wue M. Antibodies and Antimatter: The resurgence of ImmunoPET. J Nucl Med, 2009. 50 (1): 2-5. Hu S, Shively L, Wu A M. Minibody: A novel engineered anti-carcinoembryonic antigen antibody fragment (single-chain Fv-CH3) which exhibits rapid, high-level targeting of xenografts. Cancer Res, 1996. 56(13):3055-61. Hu S, Shively L, Wu A M. Minibody: A novel engineered anti-carcinoembryonic antigen antibody fragment (single-chain Fv-CH3) which exhibits rapid, high-level targeting of xenografts. Cancer Res, 1996. 56 (13): 3055-61. Leyton J V, Wu A M. Humanized radioiodinated minibody for imaging of prostate stem cell antigen-expressing tumors. Clin Cancer Res, 2008. 14(22):7488-96. Leyton J V, Wu A M. Humanized radioiodinated minibody for imaging of prostate stem cell antigen-expressing tumors. Clin Cancer Res, 2008. 14 (22): 7488-96. Olafsen T, Tan G J, Cheung C W, Yazaki P J, Park J M, Shively J E, Williams L E, Raubitschek A A, Press M F, Wu A M. Characterization of engineered anti-p185HER-2 (scFv-CH3)2 antibody fragments (minibodies) for tumor targeting. Protein Eng Des Sel, 2004. 17(4):315-23. (ScFv-CH3) 2 antibody fragments (minibodies) were obtained from Olafsen T, Tan GJ, Cheung CW, Yazaki PJ, Park JM, Shively JE, Williams LE, Raubitschek AA, Press MF, for tumor targeting. Protein Eng Des Sel, 2004. 17 (4): 315-23. Olafsen T, Betting D, Kenanova V E, Salazar F B, Clarke P, Said J, Raubitschek A A, Timmerman J M, Wu A M. Recombinant Anti-CD20 Antibody Fragments for Small-Animal PET Imaging of B-Cell Lymphomas. J Nuc Med, 2009. 50(9):1500-1508. Olafsen T, Betting D, Kenanova V E, Salazar F B, Clarke P, Said J, Raubitschek A, Timmerman J M, Wue M. Recombinant anti-CD20 Antibody Fragments for Small-Animal PET Imaging of B-Cell Lymphomas. J Nuc Med, 2009. 50 (9): 1500-1508. Wong J Y, Chu D Z, Williams L E, Yamauchi D M, Ikle D N, Kwok C S, Liu A, Wilczynski S, Colcher D, Yazaki P J, Shively J E, Wu A M, Raubitschek A A. Pilot trial evaluating an 123I-labeled 80-kilodalton engineered anticarcinoembryonic antigen antibody fragment (cT84.66 minibody) in patients with colorectal cancer. Clin Cancer Res, 2004. 10(15):5014-21. Wong JY, Chu DZ, Williams LE, Yamauchi DM, Ikle DN, Kwok CS, Liu A, Wilczynski S, Colcher D, Yazaki PJ, Shively JE, Wu AM, Raubitscheke A. Pilot trial evaluating an 123 I-labeled 80-kilodalton engineered anticarcinoembryonic antigen antibody fragment (cT84.66 minibody) in patients with colorectal cancer. Clin Cancer Res, 2004. 10 (15): 5014-21. Geng S, Feng J, Li Y, Sun Y, Gu X, Huang Y, Wang Y, Kang X, Chang H, Shen B. Binding activity difference of anti-CD20 scFv-Fc fusion protein derived from variable domain exchange. Cell. Mol. Immunol. 2006. 3(6):439-443.Binding activity difference of anti-CD20 scFv-Fc fusion protein is derived from the variable domain exchange. Cell. Mol. Immunol. 2006. 3 (6): 439-443. Scheer J M, Sandoval W, Elliot J M, Shao L, Luis E, Lewin-Koh S C, Schaefer G, Vandlen R. Reorienting the Fab domains of Trastuzumab results in potent HER2 activators. PLOS one. 2012. 7(12):1-13.Scheer J M, Sandoval W, Elliot J M, Shao L, Luis E, Lewin-Koh S C, Schaefer G. Vandlen R. Reorienting the HER2 activators. PLOS one. December 7 (12): 1-13. Dolezal O, Pearce L A, Lawrence L J, McCoy A J, Hudson P J, Kortt A A. ScFv mulitimers of the anti-neuraminidase antibody NC10: shortening of the linker in single-chain Fv fragment assembled in VL to VH orientation drives the formation of dimers, trimers, tetramers and higher molecular mass multimers. Protein Eng. 2000. 13(8):565-574.Dolezal O, Pearce LA, Lawrence LJ, McCoy AJ, Hudson PJ, Kortte A. ScFv mulitimers of the anti-neuraminidase antibody NC10: shortening of the linker in single chain Fv fragment assembled in VL to VH orientation drives the formation of dimers , trimers, tetramers and higher molecular mass multimers. Protein Eng. 2000, 13 (8): 565-574.

본 발명자들은 EGFR에 효과적으로 결합하여 암 질환을 치료 및 진단할 수 있는 항체 절편을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, EGFR 항체 절편인 미니바디의 scFv 내 도메인의 배열순서를 바꿀 경우 숙주세포 내 발현량 증가, 항원 결합능 및 세포주 결합능이 현저히 향상된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have sought to develop antibody fragments capable of effectively treating EGFR and treating and diagnosing cancer diseases. As a result, the present inventors completed the present invention by confirming that when the order of domains in the scFv of the mini-body, which is an EGFR antibody fragment, is changed, the expression level of the host cell, the antigen binding ability and the cell line binding ability are remarkably improved.

따라서, 본 발명의 목적은 EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 신규한 단백질을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a novel protein capable of binding to epidermal growth factor receptor (EGFR).

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a nucleic acid molecule encoding the protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a transformant transformed with the recombinant vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a protein by culturing the transformant.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the protein as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a composition for diagnosing cancer comprising the protein as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 서열식(I)을 포함하는, EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질을 제공한다:According to one aspect of the present invention, there is provided a protein capable of binding to epidermal growth factor receptor (EGFR), comprising the following sequence formula (I):

서열식 (I)Sequence formula (I)

VH-X-VL-Hinge-CH3V H -XV L -Hinge-C H 3

상기 식에서,In this formula,

VL은 서열목록 제2서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인이고;V L is a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 2;

VH는 서열목록 제4서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인이고;V H is a heavy chain variable domain comprising SEQ ID NO: 4;

X는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커이고;X is a linker having an amino acid sequence of 1 to 50;

Hinge는 서열목록 제8서열을 포함하는 힌지부위(hinge region)이고;The hinge is a hinge region comprising the sequence of SEQ ID NO: 8;

CH3은 서열목록 제10서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 나타낸다.
C H 3 represents a heavy chain constant domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 10.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 서열식(Ⅱ)을 포함하는, EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질을 코딩하는 핵산분자를 제공한다:According to another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid molecule encoding a protein capable of binding to EGFR (Epidermal Growth Factor receptor) comprising the following sequence formula (II): < EMI ID =

서열식 (Ⅱ)Sequence formula (II)

nVH-nX-nVL-nHinge-nCH3nV H -nX-nV L -nHinge-nC H 3

상기 식에서,In this formula,

nVL은 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열목록 제1서열을 포함하는 핵산분자이고;nV L is a nucleic acid molecule comprising a first sequence listing sequence encoding a light chain variable domain;

nVH는 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열목록 제3서열을 포함하는 핵산분자이고;nV H is a nucleic acid molecule comprising a third sequence of Sequence Listing that codes for a heavy chain variable domain;

nX는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커를 코딩하는 핵산분자이고;nX is a nucleic acid molecule encoding a linker having an amino acid sequence of 1 to 50;

nHinge는 힌지부위(hinge region)를 코딩하는 서열목록 제7서열을 포함하는 핵산분자이고;nHinge is a nucleic acid molecule comprising a sequence of SEQ ID NO: 7 that codes for a hinge region;

nCH3은 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열목록 제9서열을 포함하는 핵산분자를 나타낸다.
nC H 3 represents a nucleic acid molecule comprising SEQ ID NO: 9 sequence encoding a heavy chain constant domain.

본 발명자들은 EGFR에 효과적으로 결합하여 암 질환을 치료 및 진단할 수 있는 항체 절편을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, EGFR 항체 절편인 미니바디의 scFv 내 도메인의 배열순서를 바꿀 경우 숙주세포 내 발현량 증가, 항원 결합능 및 세포주 결합능이 현저히 향상된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have sought to develop antibody fragments capable of effectively treating EGFR and treating and diagnosing cancer diseases. As a result, the present inventors completed the present invention by confirming that when the order of domains in the scFv of the mini-body, which is an EGFR antibody fragment, is changed, the expression level of the host cell, the antigen binding ability and the cell line binding ability are remarkably improved.

본 명세서에서 미니바디(minibody)는 Fc 부분 일부를 제거한 항체 절편을 의미하며, VL-X-VH-Hinge-CH3 또는 VH-X-VL-Hinge-CH3로 통용된다.As used herein, a minibody refers to an antibody fragment from which a portion of the Fc portion has been removed and is commonly referred to as V L -XV H -Hinge-C H 3 or V H -XV L -Hinge-C H 3.

본 명세서에서 용어 “VH”는 세툭시맙의 항 EGFR 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain)을, “VL”는 항 EGFR 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain)을 나타낸다. “X”는 링커(linker)를 나타내며, “Hinge”는 상기 중쇄로부터 유래된 힌지 부위(hinge region)를, “CH3”는 중쇄 불변 도메인(heavy chain constant domain)의 CH3를 나타낸다.As used herein, the term "V H " refers to the anti-EGFR heavy chain variable domain of cetuximab and "V L " refers to the anti-EGFR light chain variable domain. "X" represents a linker, "Hinge" represents a hinge region derived from the heavy chain, and "C H 3" represents C H 3 for a heavy chain constant domain.

본 명세서에서 용어 “nVH”는 상기 항 EGFR 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산분자를, “nVL”는 상기 항 EGFR 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산분자를 나타낸다. “nX”는 링커를 코딩하는 핵산분자를, “nHinge”는 상기 힌지 부위를 코딩하는 핵산분자를, “nCH3”는 상기 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 핵산분자를 나타낸다.
As used herein, the term " nV H " refers to a nucleic acid molecule encoding the anti-EGFR heavy chain variable domain, and " nV L " refers to a nucleic acid molecule encoding the anti-EGFR light chain variable domain. "NX" denotes a nucleic acid molecule encoding a linker, "nHinge" denotes a nucleic acid molecule encoding the hinge region, and "nC H 3" denotes a nucleic acid molecule encoding the heavy chain constant domain.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 VH 및 VL은 링커(X)로 연결된다. According to a preferred embodiment of the present invention, the V H and V L of the present invention are connected to a linker (X).

본 발명에 이용되는 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 펩타이드 링커도 가능하며, 본 발명의 경우 “중쇄 가변 도메인(VH)-링커-경쇄 가변 도메인(VL)” 구조를 갖는다. 이 구조에서, 링커는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.The linker used in the present invention may be any peptide linker used in the art as a linker, and in the present invention has a "heavy chain variable domain (V H ) -linker-light chain variable domain (V L )" structure. In this structure, the linker means a constant-length amino acid sequence operative to artificially link the variable domains of the heavy and light chains.

상기 링커로서 이용되는 것은 당업계에 공지된 어떠한 펩타이드 링커도 포함한다. 이 펩타이드 링커는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 충분한 거리로 이격시켜 각각의 가변 도메인이 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩 되도록 한다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션을 가질 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Glu, Asn, Lys, Ser 및 Pro 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46(1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기, 바람직하게는 10-20 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 바람작한 링커 서열은, “Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser”, “Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser”, “Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly” 또는 “Gly Ser Thr Ser Gly Lys Pro Ser Glu Gly Lys Gly”이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제6서열의 아미노산 서열을 갖는다.The peptide linker used as the linker includes any peptide linkers known in the art. The peptide linker separates the heavy chain variable domain and the light chain variable domain to a sufficient distance so that each variable domain is folded into suitable secondary and tertiary structures. The sequence of a suitable peptide linker can be selected in view of the following factors: (a) the ability to have a flexible extended conformation; (b) the ability to not create a secondary structure that interacts with the epitope; And (c) the absence of a hydrophobic moiety or moiety having charge capable of reacting with the epitope. Preferred peptide linkers include Gly, Glu, Asn, Lys, Ser and Pro residues. Other neutral amino acids such as Thr and Ala may also be included in the linker sequence. Suitable amino acid sequences for linkers are described in Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci. USA 83: 8258-8562 (1986); U.S. Patent Nos. 4,935,233, 4,751,180, and 5,990,275. Linker sequences may consist of 1-50 amino acid residues, preferably 10-20 amino acid residues. Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser "," Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser & Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly "or" Gly Ser Thr Ser Gly Lys Pro Ser Glu Gly Lys Gly ", and more preferably the amino acid sequence of SEQ ID No. 6.

본 발명의 Hinge는 바람직하게는 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 가지며, CH3는 서열목록 제10서열의 아미노산 서열을 갖는다.The hinge of the present invention preferably has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and the C H 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

본 발명의 미니바디는 상기 기술된 VH, VL, 링커, Hinge 및 CH3의 특성을 갖는 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.The mini-bodies of the present invention may comprise variants of the amino acid sequences having the characteristics of V H , V L , linker, hinge and C H 3 as described above. For example, the amino acid sequence of an antibody may be altered to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody. Such modifications include, for example, deletion, insertion and / or substitution of the amino acid sequence residues of the antibody. Such amino acid variations are made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like. By analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substituents, arginine, lysine and histidine are both positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Thus, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchange in proteins that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 배열 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 배열에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman(1981), Adv . Appl . Math . 2:482; Needleman and Wunsch(1970), J. Mol . Bio . 48:443-53; Pearson and Lipman(1988), Methods in Mol . Biol . 24: 307-31; Higgins and Sharp(1988), Gene 73:237-44; Higgins and Sharp(1989), CABIOS 5:151-3; Corpet et al.(1988), Nuc . Acids Res. 16:10881-90; Huang et al.(1992), Comp . Appl . BioSci . 8:155-65 and Pearson et al.(1994), Meth. Mol . Biol . 24:307-31에 개시되어 있다.
Considering a mutation having the above-mentioned biological equivalent activity, the protein of the present invention or the nucleic acid molecule encoding the protein of the present invention is interpreted as including a sequence showing substantial identity with the sequence described in the sequence listing. The above-mentioned substantial identity is determined by aligning the sequence of the present invention with any other sequence as much as possible and analyzing sequences arranged using algorithms commonly used in the art. Homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Arrangement methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for sequence alignment are described by Smith and Waterman (1981), Adv . Appl . Math . 2: 482; Needleman and Wunsch (1970), J. Mol . Bio . 48: 443-53; Pearson and Lipman (1988), Methods in Mol . Biol . 24: 307-31; Higgins and Sharp (1988), Gene 73: 237-44; Higgins and Sharp (1989), CABIOS 5: 151-3; Corpet et al. (1988), Nuc . Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al. (1992), Comp . Appl . BioSci . 8: 155-65 and Pearson et al. (1994), Meth. Mol . Biol . 24: 307-31.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding said protein.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit(1980), Nucleotide Analogs, John Wiley, New York; Uhlman 및 Peyman(1990), ChemicalReviews, 90:543-584).As used herein, the term " nucleic acid molecule " is intended to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules encompassing nucleotides. Nucleotides, which are basic constituent units in nucleic acid molecules, include not only natural nucleotides, Also included are analogues (Scheit (1980), Nucleotide Analogs , John Wiley, New York; Uhlman and Peyman (1990), Chemical Reviews, 90: 543-584).

본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
The nucleic acid molecule of the present invention is also interpreted to include a nucleotide sequence that exhibits substantial identity to the nucleotide sequence described above. The above-mentioned substantial identity is determined by arranging the nucleotide sequence of the present invention and any other sequence to correspond to each other as much as possible, and analyzing sequences arranged using algorithms conventionally used in the art, at least 80% Homology, more preferably at least 90% homology, and most preferably at least 95% homology.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule of the present invention.

본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 파아지미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.As used herein, the term " vector " refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Phage mid vector; Cosmeptide vector; And viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated viral vectors, and are preferably plasmid vectors.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule encoding the protein in the vector of the present invention is operatively linked to a promoter.

본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.As used herein, the term " operably linked " means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., an array of promoter, signal sequence, or transcription factor binding site) and another nucleic acid sequence, The regulatory sequence will regulate transcription and / or translation of the other nucleic acid sequences.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this can be found in Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, which is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.

본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, BL21, HB101, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol ., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann . Rev . Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.When the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, a tac promoter, lac Promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, p L ? Promoter, p R ? Promoter, rac 5 promoter, amp promoter, rec A promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter), a ribosome binding site And a transcription / translation termination sequence. The promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C. (1984), J. Bacteriol ., 158: 1018-8), when E. coli (e.g., BL21, HB101, 1024) and the leftward promoter of phage λ (λ p L promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D. (1980), Ann Rev Genet, 14:... 399-445) that can be used as a control region.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈(pGEX-4T-1 등), pET 시리즈(pET28a, pET21a, pET26b(+) 등) 및 pUC19 등), 파아지미드(예: pComb3X), 파아지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.The vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, , pGEX series (pGEX-4T-1 and the like), pET series (pET28a, pET21a, pET26b (+) and the like) and pUC19), phagemids (e.g. pComb3X) ?? z1 and M13) or a virus (e.g., SV40 and the like).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell (for example, a metallothionein promoter) or a mammalian virus Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단백질의 아미노 말단부위 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The vector of the present invention may be fused with other sequences as necessary in order to facilitate purification of the amino terminal region protein of the protein expressed therefrom, and the fused sequence may be, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA) Maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.On the other hand, the expression vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker. Examples of the expression vector include ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, , Neomycin, and tetracycline.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transformant comprising said vector.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 형질전환체, 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이고 보다 바람직하게는 E. coli BL21(DE3), E. coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 가장 바람직하게는 숙주세포는 E. coli BL21(DE3)이다. 본 발명에서는 대장균을 이용하여 단백질을 발현시켜 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다.Any host cell known in the art can be used as a transformant or a host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner. Examples of the host cell include Escherichia coli), Bacillus sp, Streptomyces, such as Bacillus subtilis and Bacillus Chuo ringen sheath (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas) (e.g., Pseudomonas footage is (Pseudomonas putida ), Proteus mirabilis) or Staphylococcus (Staphylococcus) (for example, Staphylococcus Carnot Versus (Staphylocus carnosus )). < / RTI > The host cell is preferably E. coli and more preferably E. coli BL21 (DE3), E. coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli JM109, E. coli DH series, E. coli TOP10, E. coli TG1, and E. coli HB101. Most preferably, the host cell is E. coli BL21 (DE3). In the present invention, it is possible to mass-produce protein at a low cost by expressing the protein using E. coli.

본 발명의 벡터를 형질전환체 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al.(1973), Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114; 및 Hanahan, D.(1983), J. Mol . Biol ., 166:557-580) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al.(1988), Nucleic . AcidsRes ., 16:6127-6145) 등에 의해 실시될 수 있다. Methods of delivering a vector of the present invention into a transformant can be carried out using a CaCl 2 method (Cohen, SN et al. (1973), Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9: 2110-2114) , SN et al (1973), Proc Natl Acac Sci USA, 9: 2110-2114; and Hanahan, D. (1983), J. Mol Biol, 166:....... 557-580) and electroporation method (Dower, WJ et al (1988 ), Nucleic AcidsRes, 16:... 6127-6145) can be carried out by.

형질전환체 내로 주입된 벡터는 형질전환체 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 단백질을 얻게 된다.
The vector injected into the transformant can be expressed in the transformant, and in this case, a large amount of the protein of the present invention is obtained.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a protein comprising culturing a host cell transformed with a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule encoding the protein.

상기 단백질 제조에서 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.The cultivation of the transformed host cells in the production of the protein can be carried out according to a suitable culture medium and culture conditions known in the art. Such a culturing process can be easily adjusted according to the strain selected by those skilled in the art. Such various culturing methods are disclosed in various publications (e.g., James M. Lee, Biochemical Engineering , Prentice-Hall International Editions, 138-176). Cell culture can be classified into batch, infusion, and continuous culture depending on the suspension culture, adhesion culture, and culture method according to the cell growth method. The medium used for the culture should suitably satisfy the requirements of the specific strain.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. During the culture, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture. In addition, foaming can be suppressed by using a defoaming agent such as fatty acid polyglycol ester during the culture. In addition, oxygen or an oxygen-containing gas (e.g., air) is injected into the culture to maintain the aerobic state of the culture. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C.

형질전환 된 숙주세포를 배양하여 수득한 단백질은 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고 순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.
The protein obtained by culturing the transformed host cell can be used in an unpurified state and can be further purified by high purity using various conventional methods such as dialysis, salt precipitation and chromatography. Among them, methods using chromatography are most widely used. The types and order of the columns can be selected from ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography and the like depending on the characteristics of the antibody and the culture method.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the protein as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a cancer diagnostic composition comprising the protein as an active ingredient.

상기 방법으로 제조한 단백질은 EGFR에 대하여 특이적으로 결합하므로 단백질 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 항암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물로 사용가능하다.Since the protein prepared by the above method specifically binds to EGFR, it can be used as a pharmaceutical composition for cancer chemotherapy or a cancer diagnostic composition together with protein alone or a conventional pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질환인 암은 직장암, 피부암, 담관암, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 다발성 골수종, AIDS-관련 백혈병 및 성인 T-세포 림프종/백혈병, 상피내암, 간암, 폐암, 림프종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 고환암, 갑상선암 또는 신세포암이고, 보다 바람직하게는 직장결장암 또는 두경부 편평세포암이다.According to a preferred embodiment of the present invention, cancer, which is a disease to which the composition of the present invention is applied, is at least one selected from the group consisting of rectal cancer, skin cancer, cholangiocarcinoma, bladder cancer, brain tumor, breast cancer, cervical cancer, villous cancer, colon cancer, endometrial cancer, Cancer, lymphoma, neuroblastoma, oral cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, sarcoma, testicular cancer, thyroid cancer, or renal cell carcinoma, and more preferably a myeloma, an AIDS-related leukemia and an adult T-cell lymphoma / leukemia, intraepithelial cancer, liver cancer, lung cancer, Colon cancer or squamous cell carcinoma of the head and neck.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's PharmaceuticalSciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations include, but are not limited to, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

용어, “약제학적 유효량”은 본 발명의 단백질을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.The term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to prevent or treat cancer using the protein of the present invention.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 암조직 주변의 동맥내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, intra-arterial injection around cancer tissue, have.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-100 mg / kg (body weight) per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 가글제, 오인트먼트제, 고형제, 카타플라스마제를 포함하는 외형제의 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in an oil or aqueous medium, or in the form of excipients, including excipients, powders, granules, tablets, capsules or wipes, ointments, coagulants, , Dispersants, or stabilizers.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여, 즉 상기 단백질에 다른 치료제를 혼합한 형태로 투여될 수 있다.The composition of the present invention may be administered in the form of an individual therapeutic agent or in combination with another therapeutic agent, that is, in a form mixed with another therapeutic agent.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 다른 치료제는 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 무기입자이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the other therapeutic agent is a chemical substance, a peptide, a polypeptide, a nucleic acid, a carbohydrate, a lipid or an inorganic particle.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 EGFR에 대한 본 발명의 단백질을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a cancer diagnostic kit comprising the protein of the present invention against EGFR described above.

EFGR에 대한 본 발명의 단백질은, 생물학적 시료에 적용되어 암의 발생 여부를 진단할 수 있다.The protein of the present invention for EFGR can be applied to a biological sample to diagnose whether or not cancer has occurred.

본 명세서에서 사용된 용어“생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 단백질과 반응시켜서 암의 발생 여부를 확인할 수 있다.
The term " biological sample " as used herein includes tissues, cells, whole blood, serum, plasma, tissue autopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spinal cord, etc.), cell culture supernatant, ruptured eukaryotic cells, It does not. These biological samples may be reacted with the protein of the present invention in a state of being manipulated or untreated so as to confirm the occurrence of cancer.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(i) 본 발명은 EGFR(Epidermal growth factor receptor)에 특이적으로 결합 가능한 신규 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 제공한다.(i) The present invention provides a novel protein capable of binding specifically to EGFR (Epidermal Growth Factor receptor) or a nucleic acid molecule encoding the same.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 항암 치료용 약제학적 조성물 또는 암 진단용 조성물을 제공한다.(Ii) In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for cancer chemotherapy or a composition for diagnosing cancer comprising the protein.

(ⅲ) 본 발명의 항체 단편을 코딩하는 핵산분자는 기존 scFv내 도메인의 배열순서가 반대됨에도 불구하고, 2 내지 3 배 이상의 단백질 발현율을 나타내며, 본 발명의 항체 단편은 항원 결합능 및 세포주 결합능이 현저히 향상되는 장점을 갖는다.
(Iii) The nucleic acid molecule encoding the antibody fragment of the present invention shows a protein expression ratio of 2 to 3 times or more, although the sequence of the domain in the conventional scFv is opposite, and the antibody fragment of the present invention has remarkably high antigen binding ability and cell line binding ability .

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 scFv(VL-X-VH)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 scFv(VH-X-VL)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Hinge-CH3의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 pET26b-scFv(VL-X-VH)-Hinge-CH3의 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 5는 pGEX-scFv(VL-X-VH)-Hinge-CH3의 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 6은 pET26b-scFv(VH-X-VL)-Hinge-CH3의 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 7은 pGEX-scFv(VH-X-VL)-Hinge-CH3의 클로닝 모식도를 나타낸다.
도 8은 pET26b-scFv(VL-X-VH)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 6X Histidine tag이 연결된 형태의 단백질 발현 및 순수 정제된 단백질이 목적 단백질임을 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 scFv(VH-X-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 6X Histidine tag이 연결된 형태의 단백질 발현 및 순수 정제된 단백질이 목적 단백질임을 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 scFv(VL-X-VH)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 6X Histidine tag이 연결된 형태(A) 및 GST tag이 연결된 형태(B)의 단백질 발현 결과를 나타낸다.
도 11은 scFv(VH-X-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 6X Histidine tag이 연결된 형태(A) 및 GST tag이 연결된 형태(B)의 단백질 발현 결과를 나타낸다.
도 12는 scFv(VL-X-VH)-Hinge-CH3 및 scFv(VH-X-VL)-Hinge-CH3의 항원 결합능을 비교한 결과를 나타낸다.
도 13은 scFv(VL-X-VH)-Hinge-CH3 및 scFv(VH-X-VL)-Hinge-CH3의 세포주 결합능을 비교한 결과를 나타낸다.1 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of scFv (V L -XV H ) according to an embodiment of the present invention.
2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of scFv (V H -XV L ) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of Hinge-C H 3 according to an embodiment of the present invention.
Fig. 4 shows a schematic diagram of cloning of pET26b-scFv (V L -XV H ) -Hinge-C H 3.
FIG. 5 shows a cloning scheme of pGEX-scFv (V L -XV H ) -Hinge-C H 3.
6 shows a schematic diagram of cloning of pET26b-scFv (V H -XV L ) -Hinge-C H 3.
FIG. 7 shows a schematic diagram of cloning of pGEX-scFv (V H -XV L ) -Hinge-C H 3.
FIG. 8 shows the result of confirming that the 6X Histidine tag of the pET26b-scFv (V L -XV H ) -Hinge-C H 3 construct is linked to the protein expression and that the pure purified protein is the target protein by Western blotting.
FIG. 9 shows the result of confirmation of Western blotting of a 6X Histidine tag-linked protein expression of scFv (V H -XV L ) -Hinge-C H 3 construct and a pure purified protein as a target protein.
FIG. 10 shows the results of protein expression of a form (A) in which a 6X Histidine tag of a scFv (V L -XV H ) -Hinge-C H 3 construct is linked and a form (B) in which a GST tag is linked.
FIG. 11 shows the results of protein expression of a form (A) in which the 6X Histidine tag of the scFv (V H -XV L ) -Hinge-C H 3 construct is linked and a form (B) in which the GST tag is linked.
FIG. 12 shows the results of comparing the antigen binding ability of scFv (V L -XV H ) -Hinge-C H 3 and scFv (V H -XV L ) -Hinge-C H 3.
FIG. 13 shows the results of comparing cell line binding ability of scFv (V L -XV H ) -Hinge-C H 3 and scFv (V H -XV L ) -Hinge-C H 3.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험재료 및 실험방법Materials and Experiments

1. Minibody 컨스트럭트 제작1. Made Minibody Construct

본 발명에서는 Minibody 제작을 위한 scFv 부위를 클로닝하기 위해서 세툭시맙(Cetuximab)의 아미노산 서열(도 1 및 도 2)을 근거로 하여 DNA 염기서열을 Genescript에 의뢰하여 합성하였다(VL 서열: 서열목록 제2서열, VH 서열: 서열목록 제4서열, 링커 서열: 서열목록 제6서열). 합성된 scFv(VL-VH) 유전자 단편 및 scFv(VH-VL) 유전자 단편은 5‘-쪽에 BamHI을, 3’-쪽에 HindIII 제한효소 사이트를 포함하고 있다. scFv 부위에 연결하기 위한 Hinge-CH3 도메인은 해당 염기서열을 Bioneer에 의뢰하여 합성하였다(도 3, Hinge 서열: 서열목록 제8서열, CH3 서열: 서열목록 제10서열). 합성된 Hinge-CH3 유전자 단편은 5‘-쪽에 HindIII를, 3’-쪽에 XhoI 제한효소 사이트를 포함하고 있다. 최종 제작된 발현벡터는 제한효소 절단 및 콜로니 PCR법을 이용하여 확인하였다.
In the present invention, on the basis of amino acid sequence (Fig. 1 and 2) when the setuk Thank (Cetuximab) In order to clone the scFv site for Minibody produced were synthesized by the DNA sequences referred to Genescript (V L Sequence: Sequence Listing 2nd sequence, V H SEQ ID NO: 4 sequence, linker sequence: SEQ ID NO: 6 sequence). The synthesized scFv (V L -V H ) and scFv (V H -V L ) gene fragments contain BamHI at the 5'-end and HindIII restriction site at the 3'-end. The Hinge-C H 3 domain to be ligated to the scFv site was synthesized by requesting the corresponding nucleotide sequence from Bioneer (FIG. 3, Hinge sequence: Sequence Listing 8, C H 3 sequence: Sequence Listing 10). The synthesized hinge-C H 3 gene fragment contains HindIII at the 5'-end and XhoI restriction endonuclease at the 3'-end. The final expression vector was confirmed by restriction enzyme digestion and colony PCR.

두 종류의 Minibody 컨스트럭트는 C-말단에 6개의 Histidine 잔기가 연결된 형태로 대장균내에서 발현된 단백질이 periplasmic 부위로 이동할 수 있도록 대장균 발현 벡터 pET26b(+)의 pelB leader sequence 하류에 연결하여 제작되었다. 또한 N-말단에 Glutathione S-transferase fusion 단백질이 연결된 형태로 cytoplasmic 부위에서 발현되도록 pGEX-4T-1 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 제작하였다. 따라서, 두 종류의 벡터 (pET26b(+)와 pGEX-4T-1)를 이용하여 최종 4 종류의 발현벡터가 완성되었다.
Two types of minibody constructs were constructed by connecting six histidine residues at the C-terminus and connecting to the downstream of the pelB leader sequence of the E. coli expression vector pET26b (+) so that proteins expressed in E. coli could migrate to the periplasmic region. An expression vector was constructed by cloning into the pGEX-4T-1 vector so that it was expressed at the cytoplasmic site in the form of a Glutathione S-transferase fusion protein linked to the N-terminus. Thus, the final four kinds of expression vectors were completed using two kinds of vectors (pET26b (+) and pGEX-4T-1).

(1) scFv(V(1) scFv (V LL -V-V HH )-Hinge-C) -Hinge-C HH 3 컨스트럭트 제작3 Constructed production

① pET26b-scFv(V① pET26b-scFv (V LL -V-V HH )-Hinge-C) -Hinge-C HH 33

합성된 scFv(VL-VH) 유전자 단편은 제한효소 BamHI 및 HindIII을 처리하여 agarose gel 전기영동 후 회수하였다. 합성된 Hinge-CH3 유전자 단편은 제한효소 HindIII 및 XhoI으로 처리하여 아가로스 겔 전기영동 후 회수하여 준비하였다. 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 처리된 대장균 발현 벡터 pET26b 벡터에 클로닝 하였다(도 4).
The synthesized scFv (V L -V H ) gene fragment was digested with restriction enzymes BamHI and HindIII and recovered by agarose gel electrophoresis. The synthesized hinge-C H 3 gene fragment was digested with restriction enzymes HindIII and XhoI and recovered after agarose gel electrophoresis. And cloned into an E. coli expression vector pET26b vector treated with restriction enzymes BamHI and XhoI (Fig. 4).

② pGEX-scFv(V② pGEX-scFv (V LL -V-V HH )-Hinge-C) -Hinge-C HH 33

재조합된 scFv(VL-VH)-Hinge-CH3를 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 처리하여 회수한 후 같은 제한효소로 처리된 발현벡터 pGEX-4T-1 벡터에 클로닝하였다(도 5).
Recombinant scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 was recovered by treating with restriction enzymes BamHI and Xho I and cloned into the expression vector pGEX-4T-1 vector treated with the same restriction enzyme (FIG.

(2) scFv(V(2) scFv (V HH -V-V LL )-Hinge-C) -Hinge-C HH 3 컨스트럭트 제작3 Constructed production

① pET26b-scFv(V① pET26b-scFv (V HH -V-V LL )-Hinge-C) -Hinge-C HH 3 3

합성된 scFv(VH-VL) 유전자 단편은 제한효소 BamHI 및 HindIII을 처리하여 agarose gel 전기영동 후 회수하여 준비하였다. 합성된 Hinge-CH3 유전자 단편은 제한효소 HindIII 및 XhoI으로 처리하여 아가로스 겔 전기영동 후 회수하여 준비하였다. 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 처리된 대장균 발현 벡터 pET26b 벡터에 클로닝 하였다(도 6).
The synthesized scFv (V H -V L ) gene fragment was digested with restriction enzymes BamHI and HindIII and recovered after agarose gel electrophoresis. The synthesized hinge-C H 3 gene fragment was digested with restriction enzymes HindIII and XhoI and recovered after agarose gel electrophoresis. And cloned into E. coli expression vector pET26b vector treated with restriction enzymes BamHI and XhoI (FIG. 6).

② pGEX-scFv(V② pGEX-scFv (V HH -V-V LL )-Hinge-C) -Hinge-C HH 3 3

재조합된 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3를 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 처리하여 회수한 후 같은 제한효소로 처리된 발현벡터 pGEX-4T-1 벡터에 클로닝하였다(도 7).
Was cloned into the expression vector pGEX-4T-1 vector treated with restriction enzyme, such as a recombinant scFv (V H -V L), and then recovered by processing the -Hinge-C H 3 by restriction enzymes BamHI and XhoI (Figure 7).

2. 미생물 형질전환체 제작2. Production of microorganism transformants

제작된 총 4 종류의 Minibody 컨스트럭트는 각각 E. coli BL21(DE3) competent cell에 42℃에서 30초간 heat shock 처리 후 3분간 얼음물에 방치한다. 1 ㎖의 LB 액체배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한 후 LB 고체배지에 도말하였다. 37℃에서 16시간 배양하여 콜로니를 획득하였고 DNA를 추출하여 형질전환여부를 확인하였다. pET26b-scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 및 pET26b-scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트 경우 Kanamycin(50 ㎍/㎖)이 포함된 고체배지를, pGEX-scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 및 pGEX-scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 경우 Ampicillin(100 ㎍/㎖)이 포함된 고체배지를 사용하였다.
All four minibody constructs were incubated in E. coli BL21 (DE3) competent cells for 30 min at 42 ℃ for 3 min and left in ice water for 3 min. 1 ml of LB liquid medium was added and incubated at 37 ° C for 1 hour and then plated on LB solid medium. After culturing at 37 ° C for 16 hours, colonies were obtained and DNA was extracted to confirm the transformation. For pET26b-scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 and pET26b-scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 constructs, solid medium containing kanamycin (50 μg / , pGEX-scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 and pGEX-scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 constructs containing ampicillin (100 μg / Medium was used.

3. Minibody 단백질 제조3. Minibody protein production

(1) Minibody 단백질 발현(1) Minibody protein expression

네 종의 대장균 형질전환체를 각각 1L의 LB 액체배지를 이용하여 37℃에서 200 rpm으로 진탕배양하였다. 흡관도 600 ㎚에서 OD(optical density)가 0.5 일 때 최종농도 0.4 mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도(induction)하였다. IPTG 첨가 후 12시간동안 20℃에서 진탕배양한 후 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하여 단백질 발현 확인 및 정제에 사용하였다.
Four Escherichia coli transformants were cultured with 1 L of LB liquid medium at 37 DEG C with shaking at 200 rpm. Protein expression was induced by adding IPTG to a final concentration of 0.4 mM at an OD of 600 at an optical density of 0.5. After addition of IPTG, the cells were incubated for 12 hours at 20 ° C with shaking, and then centrifuged at 6,000 rpm for 10 minutes to collect the cells and used for protein expression confirmation and purification.

(2) Minibody 단백질 정제(2) Purification of Minibody Protein

① 6X Histidine tag① 6X Histidine tag

준비된 각각의 대장균 균체를 100 ㎖의 1X PBS(Phosphate buffered saline) 버퍼로 현탁하여 Sonication한 후 20,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액과 펠렛으로 구분하여 회수하여 SDS-PAGE 전기영동에 사용하였다. 상등액은 Ni-NTA 레진을 이용하여 순수정제를 수행하였다. 정제 시 washing 버퍼는 50 mM Imidazole이 포함된 1X PBS 버퍼를 사용하였으며, elution 버퍼는 400 mM Imidazole이 포함된 1X PBS 버퍼를 사용하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 확인하였고, CH3에 대한 항체(CH3 domain secondary antibody A567H (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA))를 사용한 Western blot을 수행하여 순수 정제된 단백질이 Minibody 임을 확인하였다. 단백질 농도는 BCA(Bicinchoninic acid) assay 법을 이용하여 결정하였다.
Each prepared E. coli bacterium was suspended in 100 ml of 1X PBS buffer (Phosphate Buffered Saline), sonicated, centrifuged at 20,000 rpm for 20 minutes, recovered and separated into supernatant and pellet, and used for SDS-PAGE electrophoresis. The supernatant was purified using Ni-NTA resin. For purification, washing buffer was 1 × PBS buffer containing 50 mM Imidazole and 1 × PBS buffer containing 400 mM Imidazole was used for elution buffer. The purified protein is purified pure by performing SDS-PAGE was confirmed by electrophoresis, Western blot using an antibody (C H 3 domain secondary antibody A567H (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)) of the C H 3 protein Was confirmed to be a minibody. Protein concentration was determined by BCA (Bicinchoninic acid) assay method.

② Glutathione S-transferase (GST) tag② Glutathione S-transferase (GST) tag

준비된 각각의 대장균 균체를 100 ㎖의 Lysis 버퍼(NaH2PO4, pH 8.5, 500 mM NaCl, 10% Glycerol)에 현탁하여 Sonication한 후 20,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 글루타치온 레진(Glutathione resin)을 이용하여 정제를 수행하였다. 정제 시 washing 버퍼는 Lysis 버퍼와 동일한 버퍼를 사용하였으며, elution 버퍼는 30 mM GSH를 첨가하여 사용하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 확인하였다.
Each of the prepared E. coli cells was suspended in 100 ml of Lysis buffer (NaH 2 PO 4 , pH 8.5, 500 mM NaCl, 10% Glycerol) and subjected to sonication, followed by centrifugation at 20,000 rpm for 20 minutes. The supernatant was recovered and purified using glutathione resin. For purification, washing buffer was the same buffer as Lysis buffer, and elution buffer was added with 30 mM GSH. Purified proteins were identified by SDS-PAGE electrophoresis.

4. Minibody의 항원결합능 측정 4. Measurement of antigen binding ability of minibody

정제된 각각의 Minibody 단백질의 항원(EGFR) 결합능을 측정하기 위해 enzyme-linked immuosorbent assay(ELISA)와 유세포 분석기(Flow cytometer)를 이용한 FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 법을 수행하였다.
Fluorescence-activated cell sorting (FACS) was performed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and flow cytometer to measure the binding (EGFR) binding capacity of each purified minibody protein.

(1) ELISA를 이용한 항원결합능 측정 (1) Measurement of antigen binding ability by ELISA

96 wells ELISA plate에 sEGFR을 100 ng/well 농도로 넣어주고, 이를 4℃ 에서 밤새 반응하였다. 상층액을 제거하고, sigma에서 구입한 Blocking solution을 희석 한 후, 200 ㎕씩 각 well에 분주하여 4℃ 에서 밤새 blocking 하였다. 제작된 Minibody 또는 Cetuxiamb을 각각 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 1시간 반응 한 후, PBST로 3회간 washing 하였다. Mouse anti-human IgG, CH3 domain secondary antibody A567H(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 1:100으로 희석하여 100 ㎕씩 각 well에 분주하고 실온에서 1시간 반응하였다. PBST로 3회 washing하고, 2차 항체 IgG antimouse HRP(Koma biotech)를 1:3,000 희석하여 100 ㎕씩 well에 분주 한 후 실온에서 1시간 반응하였다. 상층액을 제거하고, PBST로 3회 washing 후 TMB 발색시약을 100 ㎕씩 분주 하였다. 발색된 well에 1 M의 H2SO4를 100 ㎕ 넣어 반응을 중지 시키고, plate는 Microplate reader를 이용해 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
SEGFR was added to the 96-well ELISA plate at a concentration of 100 ng / well and reacted overnight at 4 ° C. The supernatant was removed, and the Blocking solution purchased from Sigma was diluted, and then 200 μl of each was dispensed into each well and blocked overnight at 4 ° C. The prepared Minibody or Cetuxiamb was dispensed in 100 μl each, reacted at room temperature for 1 hour, and then washed with PBST for 3 times. Mouse anti-human IgG, C H 3 domain secondary antibody A567H (Thermo Scientific, Rockford, Ill., USA) was diluted 1: 100 and 100 ㎕ was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour. The cells were washed three times with PBST, diluted 1: 3000 with secondary antibody IgG antimouse HRP (Koma biotech), and dispensed into 100 μl of each well. The cells were reacted at room temperature for 1 hour. The supernatant was removed, and after washing three times with PBST, 100 μl of TMB coloring reagent was dispensed. 100 μl of 1 M H 2 SO 4 was added to the developed wells to stop the reaction. The plate was measured for absorbance at 450 nm using a microplate reader.

(2) (2) FACSFACS 를 이용한 항원 Antigen 결합능Cohesion 측정 Measure

EGFR이 세포표면에 고발현된 A431 cell을 배양한 후 0.25% trypsin/EDTA 처리하여 단일세포로 떼어낸 후 PBS 10 ㎖을 넣고 1500 rpm에서 3분간 원심분리 한 뒤 상층액은 버려서 washing을 진행하였다. 펠렛은 10 ㎖ PBS로 다시 현탁하여 세포수를 측정 하였다. Counting한 cell은 5X106cell/㎖의 농도로 희석한 후 100 ㎕ 씩 5 ㎖ tube에 담았다. Cell이 담겨진 tube에 정제된 단백질을 100 ㎕ 넣고 4℃에서 1시간 반응 시켰으며, 반응 후 3 ㎖ PBS를 넣고 1500 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 washing을 진행하였다. 다음 anti-Fc-FITC(sigma)항체를 PBS로 1:100희석하여 100 ㎕씩 넣은 후 다시 4℃에서 30분간 반응 시켰으며, 반응 후 3 ㎖ PBS를 넣고 1500 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 버리고 펠렛은 300 ㎕ PBS로 현탁하여 FACS로 측정하였다. Positive control로 세툭시맙을 사용하였다.
After A431 cells expressing EGFR on the cell surface were cultured, the cells were treated with 0.25% trypsin / EDTA and removed with a single cell. 10 ml of PBS was added and centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes, and the supernatant was discarded and washed. The pellet was resuspended in 10 ml PBS and the number of cells was measured. Counting cells were diluted to a concentration of 5 × 10 6 cells / ml, and then 100 μl each was added to a 5 ml tube. 100 μl of the purified protein was added to the tube containing the cell and reacted at 4 ° C for 1 hour. After the reaction, 3 ml of PBS was added and centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes to remove the supernatant. The following anti-Fc-FITC (Sigma) antibody was diluted 1: 100 with PBS and 100 μl each was added. The reaction was continued for 30 minutes at 4 ° C. After the reaction, 3 ml of PBS was added and centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes, And the pellet was suspended in 300 [mu] l PBS and measured by FACS. Cetuximab was used as a positive control.

실험결과Experiment result

1. One. MinibodyMinibody 컨스트럭트의Constructed 생산능Production capacity 비교 compare

scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 컨스트럭트 및 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 대장균 형질전환체의 발현 확인결과, 6X Histidine tag이 연결된 형태의 약 44 kDa의 단백질(도 8 및 도 9)과 GST tag이 연결된 약 70 kDa의 단백질을 확인하였다(도 10B 및 도 11B). Expression of Escherichia coli transformants in scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 construct and scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 constructs revealed that 6X Histidine tag was ligated (Fig. 8 and Fig. 9) and a protein of about 70 kDa to which a GST tag was linked (Fig. 10B and Fig. 11B).

Ni-NTA 레진 또는 글루타치온 레진 (glutathione resin)을 이용하여 순수정제를 수행하였으며, 정제된 단백질을 CH3 domain secondary antibody A567H를 이용한 Western blot을 수행하여 Minibody임을 증명하였다 (도 8 및 도 9). Ni-NTA resin or glutathione resin. The purified protein was subjected to Western blotting using C H 3 domain secondary antibody A567H (FIG. 8 and FIG. 9).

scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 컨스트럭트 및 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트의 대장균 내 대량발현시 최종 생산능 변화를 비교한 결과, 순수 정제된 scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 단백질보다 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 단백질의 양이 2배 이상 증가된 것으로 관찰되었다(도 10A 및 도 11A). 이러한 결과는 GST가 tagging된 단백질의 경우에서도 마찬가지로 순수 정제된 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 단백질의 양이 3배 이상 증가된 것으로 관찰되었다(도 10B 및 도 11B). As a result of comparing the changes in the final productivity of the scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 construct and the scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 construct in a large amount of E. coli, It was observed that the amount of scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 protein was more than 2 times higher than that of pure purified scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 protein 11A). These results also showed that the amount of pure purified scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 protein was increased three-fold or more even in the case of GST-tagged proteins (FIGS. 10B and 11B).

이 결과로부터 scFv(VH-VL)의 배열순서가 scFv(VL-VH)의 배열순서의 컨스트럭트보다 Minibody의 대장균내 발현 위치(cytoplasmic, periplasmic 발현)와 tagging 종류 (His tag, GST tag) 및 위치 (C-말단, N-말단)에 상관없이 solubility를 향상시켜 최종 생산능을 증가시킨 것을 알 수 있다. 따라서 scFV내 도메인의 배열순서는 미생물호스트를 이용하는 항체 절편의 생산에 중요한 요인이 되는 것을 확인하였다.
From this result, it can be concluded that the order of arrangement of scFv (V H -V L ) is higher than that of the sequence of scFv (V L -V H ) in terms of the expression position (cytoplasmic, periplasmic expression) GST tag) and position (C-terminus, N-terminus), thereby increasing solubility and increasing final productivity. Therefore, it has been confirmed that the order of the domains in the scFV is an important factor in the production of antibody fragments using microbial hosts.

2. 2. MinibodyMinibody 컨스트럭트의Constructed 항원  antigen 결합능Cohesion 비교 compare

pET26b-scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 컨스트럭트와 pET26b-scFv(VH-VL)-Hinge-CH3 컨스트럭트로부터 Ni-NTA 레진을 이용하여 정제된 단백질을 Minibody의 항원 결합능 비교를 위해 사용하였다. Using the Ni-NTA resin from the pET26b-scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 construct and the pET26b-scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 construct, Were used for comparison of antigen binding ability of Minibody.

ELISA를 이용한 항원결합능 측정결과, scFv(VH-VL)-Hinge-CH3가 흡광도(450 ㎚)에서 단백질 1 ㎎당 3.15를, scFv(VL-VH)-Hinge-CH3가 단백질 1 ㎎당 1.59로 측정되었다. 따라서 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3의 구조는 scFv(VL-VH)-Hinge-CH3 구조보다 1.98배 높게 항원결합능을 증가된 것을 알 수 있었다(도 12). Using ELISA results measuring antigen binding capacity, scFv (V H -V L) -Hinge-C H 3 , the absorbance (450 ㎚) 3.15 glycoprotein 1 ㎎, scFv (V L -V H) -Hinge-C H 3 in Was measured as 1.59 per 1 mg of protein. Therefore, it was found that the structure of scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 was 1.98-fold higher than that of scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 structure (FIG. 12) .

제작된 두 종류의 Minibody가 세포주에서 발현되고 있는 EGFR과 결합하는지 최종적으로 확인하고, 구조적 차이가 결합능에도 영향을 미치는지를 알아보기 위해서 A431 세포를 이용하여 FACS를 수행하였다. 그 결과, 생산된 두 종류의 Minibody는 A431 세포주에 결합하는 것을 확인하였다. 또한 세툭시맙을 positive control로 하여 상대값을 환산하였을 때, scFv(VH-VL)-Hinge-CH3가 99.2%이고 scFv(VL-VH)-Hinge-CH3가 85.2%로서 scFv(VH-VL)-Hinge-CH3의 구조가 세포주에서도 결합능이 뛰어난 것으로 관찰되었다(도 13).
Finally, we examined whether the two minibodies produced in the cell line bind to the EGFR expressed in the cell line. To determine whether the structural differences affect the binding capacity, FACS was performed using A431 cells. As a result, it was confirmed that the two kinds of minibody produced bind to A431 cell line. When cetuximab was used as a positive control, scFv (V H -V L ) -Hinge-C H 3 was 99.2% and scFv (V L -V H ) -Hinge-C H 3 was 85.2 % as in the cell structure of the scFv (V H -V L) -Hinge -C H 3 was observed to have superior binding capacity (Fig. 13).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> SINIL PHARM LTD. <120> A New Antibody Fragment Derived from Cetuximab <130> DP-2014-0128 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain nt sequence <400> 1 gatattctgc tgacccagag cccggtgatc ctgagtgttt ccccgggcga acgtgtgtca 60 ttttcgtgtc gcgcgagcca gtctattggt accaatatcc actggtatca gcaacgtacg 120 aacggctctc cgcgcctgct gattaaatac gccagtgaat ccatttcagg catcccgagc 180 cgcttttcgg gcagcggttc tggcaccgat ttcacgctga gtattaactc cgtggaatca 240 gaagatatcg cagactatta ctgccagcaa aacaataact ggccgaccac gtttggtgct 300 ggcaccaaac tggaactgaa a 321 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain aa sequence <400> 2 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domain nt sequence <400> 3 caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60 acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120 ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180 accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240 aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300 tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcg 357 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH domain aa sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 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His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <110> SINIL PHARM LTD. <120> A New Antibody Fragment Derived from Cetuximab <130> DP-2014-0128 <160> 10 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain nt sequence <400> 1 gatattctgc tgacccagag cccggtgatc ctgagtgttt ccccgggcga acgtgtgtca 60 ttttcgtgtc gcgcgagcca gtctattggt accaatatcc actggtatca gcaacgtacg 120 aacggctctc cgcgcctgct gattaaatac gccagtgaat ccatttcagg catcccgagc 180 cgcttttcgg gcagcggttc tggcaccgat ttcacgctga gtattaactc cgtggaatca 240 gaagatatcg cagactatta ctgccagcaa aacaataact ggccgaccac gtttggtgct 300 ggcaccaaac tggaactgaa a 321 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain aa sequence <400> 2 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly   1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn              20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile          35 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Gln Pro Glu          35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe      50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly  65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr                  85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys             100 105

Claims (14)

하기 서열식(I)을 포함하는, EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질:
서열식 (I)
VH-X-VL-Hinge-CH3
상기 식에서,
VL은 서열목록 제2서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 서열목록 제4서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인이고;
X는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커이고;
Hinge는 서열목록 제8서열을 포함하는 힌지부위(hinge region)이고;
CH3은 서열목록 제10서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 나타낸다.
A protein capable of binding to EGFR (Epidermal growth factor receptor) comprising the following sequence formula (I):
Sequence formula (I)
V H -XV L -Hinge-C H 3
In this formula,
V L is a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 2;
V H is a heavy chain variable domain comprising SEQ ID NO: 4;
X is a linker having an amino acid sequence of 1 to 50;
The hinge is a hinge region comprising the sequence of SEQ ID NO: 8;
C H 3 represents a heavy chain constant domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 10.
제 1 항에 있어서, 상기 X는 서열목록 제6서열의 링커인 것을 특징으로 하는 단백질.
2. The protein of claim 1, wherein X is a linker of Sequence Listing 6.
제 1 항의 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
A nucleic acid molecule encoding the protein of claim 1.
하기 서열식(Ⅱ)을 포함하는, EGFR(Epidermal growth factor receptor)과 결합 가능한 단백질을 코딩하는 핵산분자:
서열식 (Ⅱ)
nVH-nX-nVL-nHinge-nCH3
상기 식에서,
nVL은 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열목록 제1서열을 포함하는 핵산분자이고;
nVH는 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열목록 제3서열을 포함하는 핵산분자이고;
nX는 1 내지 50의 아미노산 서열을 갖는 링커를 코딩하는 핵산분자이고;
nHinge는 힌지부위(hinge region)를 코딩하는 서열목록 제7서열을 포함하는 핵산분자이고;
nCH3은 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열목록 제9서열을 포함하는 핵산분자를 나타낸다.
A nucleic acid molecule encoding a protein capable of binding to EGFR (Epidermal Growth Factor receptor) comprising the following sequence formula (II):
Sequence formula (II)
nV H -nX-nV L -nHinge-nC H 3
In this formula,
nV L is a nucleic acid molecule comprising a first sequence listing sequence encoding a light chain variable domain;
nV H is a nucleic acid molecule comprising a third sequence of Sequence Listing that codes for a heavy chain variable domain;
nX is a nucleic acid molecule encoding a linker having an amino acid sequence of 1 to 50;
nHinge is a nucleic acid molecule comprising a sequence of SEQ ID NO: 7 that codes for a hinge region;
nC H 3 represents a nucleic acid molecule comprising SEQ ID NO: 9 sequence encoding a heavy chain constant domain.
제 4 항에 있어서, 상기 nX는 서열목록 제5서열인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
5. The nucleic acid molecule of claim 4, wherein nX is a sequence of SEQ ID NO: 5.
제 3 항 또는 제 4 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
A recombinant vector comprising the nucleic acid molecule of claim 3 or 4.
제 6 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pET 또는 pGEX 발현벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
7. The recombinant vector according to claim 6, wherein the recombinant vector is a pET or pGEX expression vector.
제 7 항에 있어서, 상기 pET 발현벡터는 pET26b(+)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
8. The recombinant vector according to claim 7, wherein the pET expression vector is pET26b (+).
제 7 항에 있어서, 상기 pGEX 발현벡터는 pGEX-4T-1인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
8. The recombinant vector according to claim 7, wherein the pGEX expression vector is pGEX-4T-1.
제 6 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
A transformant transformed with the recombinant vector of claim 6.
제 10 항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
11. The transformant according to claim 10, wherein the transformant is Escherichia coli.
제 10 항의 형질전환체를 배양하여 제 1 항의 단백질을 제조하는 방법.
A method for producing the protein of claim 1 by culturing the transformant of claim 10.
제 1 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the protein of claim 1 as an active ingredient.
제 1 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.A cancer diagnostic composition comprising the protein of claim 1 as an active ingredient.
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