KR20150102242A - 도라지 분류용 프라이머 세트, 그를 이용한 도라지 분류방법, 및 그를 이용한 도라지 분류키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 도라지 분류용 프라이머 세트, 그를 이용한 도라지 분류방법, 및 도라지 분류 키트를 제공한다. 본 발명은 도라지를 분류, 특히 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있어, 육종 등에 활용할 수 있다는 장점을 갖는다.

Description

도라지 분류용 프라이머 세트, 그를 이용한 도라지 분류방법, 및 그를 이용한 도라지 분류키트{Primer set for classifing balloon flower, Classification method for balloon flower using the same, and Classification kit for balloon flower using the same}

본 발명은 도라지 분류용 프라이머 세트, 그를 이용한 도라지 분류방법, 및 그를 이용한 도라지 분류키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있는 도라지 분류용 프라이머 세트, 도라지 분류방법, 및 도라지 분류키트에 관한 것이다.

도라지는 초롱꽃과에 속하는 식물이며, 특성검정 및 화색고정을 확인한 후 국립농업과학원 농업유전자원센터와 같은 기관에 품종등록을 하고 있다.

국내에서 도라지는 많이 소비되고 있으나, 품종개량과 재배법의 개선을 위한 연구가 많이 이루어지고 있지 않다.

이와 같은 도라지의 품종개량, 품종보호, 육종 연구 등을 위해, 유전적으로 유연 관계가 있는 도라지를 분류할 수 있는 분자유전학적 기술 개발이 필요한 실정이다.

그러나, 기존의 도라지 관련 연구로는 한국과 중국산 도라지의 유전적 다양성과 동정을 위한 ISSR 마커 관련 연구, 청도라지와 백도라지의 구분을 위한 SCAR 마커 관련 연구, 도라지 구별을 위한 RAPD 마커 관련 연구가 알려져 있을 뿐, 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류하기 위한 연구는 수행된 예가 많지 않다.

한편, 단편증폭다형성서열(CAPS; Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) 분석은 유전적 마커 분석을 위한 기술로, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)와 같이 보다 빠른 분석을 위해 PCR을 이용하는 방법이다. 이 방법은 개체(품종)간 유전적 차이에 의해 제한효소 처리 위치를 만들거나 없애게 되고, 이와 같은 차이는 소화(digestion)에 의해 생성된 DNA 절편의 길이로부터 알 수 있다는 논리에 근거한다. 즉, 제한효소처리에 의한 DNA 배열차를 검출하는 방법이라 할 수 있다. CAPS 분석에서, PCR 증폭은 개체(품종)에 따라 변형된 제한위치를 통과하여 이루어지고, 증폭 산물은 제한 효소에 의해 소화된다. 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리될 때, 소화된 PCR산물은 지속적으로 특징적인 밴드 패턴을 나타내며, 이와 같은 패턴을 분석하여, 유전적 유연관계가 큰 품종을 동일한 군으로 분류할 수 있다.

S, Soonshik. 2009. ISSR Markers of Authentication for Korean and Chinese Platycodon grandiflorum. Korean J. Oriental Physiology & Pathology 23(1):214~218. K, Ohseong., M, Kyuhuh. 2010. Genetic Diversity and Identification of Korean and Chinese Platycodon grandiflorum Using ISSR Markers. Department of Molecular Biology, Dongeui University C, Geonpark, K, HwanBang et al. 2007. Development of SCAR Marker for Discriminating between Violet Flowered Lines and White Flowered Lines in Chinese Bellflower (Platycodon grandiflorum A.). Korean J. Medicinal Crop Sci. 15(1) : 1~5.

본 발명이 해결하려는 하나의 과제는 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있는 도라지 분류용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하려는 또 하나의 과제는 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있는 도라지 분류방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하려는 또 하나의 과제는 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있는 도라지 분류 키트를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 도라지 분류용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 도라지의 단편증폭다형성서열(CAPS)의 증폭을 위한 것일 수 있다.

상기 단편증폭다형성서열은 서열번호 6의 염기서열을 갖는 CAPS 마커에 포함되는 것일 수 있다.

상기 도라지 분류용 프라이머 세트는 도라지 유전적 유연관계 분석을 위한 도라지 분류용 프라이머 세트일 수 있다.

상기 도라지는 표 2에 기재된 21개 도라지 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 도라지는 구례 도라지, 영동 도라지, 고성 도라지, 평창 도라지, 단양 도라지, 청도 도라지, 상촌 도라지, 진안 도라지, 금산 도라지, 영양 도라지, 목포 도라지, 심원 도라지, 연화 도라지, 아산 도라지, 대산 도라지, 순창 도라지, 예천 도라지, 지동 도라지, 김천 도라지, 장성 도라지, 및 안성 도라지 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머세트를 이용하여 도라지를 분류하는 도라지 분류 방법을 제공한다.

상기 도라지 분류 방법은 (A) 도라지 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 시료처리단계; 및 (B) 상기 절단 산물을 전기영동하여 얻어지는 패턴을 분석하는 패턴분석단계를 포함할 수 있다.

상기 패턴 분석은 표준 도라지 품종의 패턴과 비교 분석하는 것일 수 있다.

상기 표준 도라지 품종은 표 2에 기재된 21개 도라지 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 표준 도라지 품종의 패턴은 표준 도라지 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭한 증폭산물을 제한효소로 절단하여 얻어진 절단산물을 전기영동하여 얻어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트, 제한효소, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 도라지 분류 키트를 제공한다.

상기 제한효소는 표 1에 기재된 제한 효소일 수 있다.

상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다.

본 발명은 도라지를 분류, 특히 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있어, 육종 등에 활용할 수 있다는 효과를 갖는다. 또한, 도라지 품종을 구별할 수 있다는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예인 도라지 분류방법을 설명하기 위한 도이다.
도 2는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 설명하기 위한 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다. 또한, "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

"프라이머세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의한 프라이머세트는 표 1에 기재된 프라이머쌍을 포함할 수 있다.

[표 1] 프라이머

표 1에서, 프라이머쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 한 쌍으로 이루어지며, F는 정방향, R은 역방향을 의미한다.

이와 같은 프라이머 세트는 도라지의 단편증폭다형성서열(CAPS)의 증폭을 위한 것으로, 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭된 CAPS가 제한효소에 의해 처리되고, 소화된 PCR산물은 특징적인 밴드 패턴을 나타내게 된다. 이와 같은 패턴을 분석하여, 유전적 유연관계가 큰 품종을 동일한 군으로 분류할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 실시예는 도라지 분류용일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예는 도라지 유연관계 분석을 위하여 사용할 수 있다.

분류의 대상이 되는 도라지 품종은 이로써 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 표 2에 기재된 도라지 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

표 2에서 등록번호는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 등록된 도라지 품종의 등록번호를 의미하고, 분류기호는 본 명세서 중 사용한 약호이며, 명칭은 품종명을 지칭한다.

[표 2] 도라지

프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있음은 물론이다.

프라이머쌍에 의해 증폭의 대상이 되는 염기서열이 CAPS 마커일 수 있으며, CAPS 마커는 하기 표 3에 기재된 contig로부터 디자인될 수 있다. CAPS 마커는 도 2에 도시된 바와 같이, CAPS를 가질 수 있다. 즉, 품종별로 존재하는 SNP에 따라, 제한효소에 의해 절단되거나 절단되지 않을 수 있다. 도 2는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 설명하기 위한 염기서열을 나타낸 도이다. 도에서 밑줄 부분이 제한효소절단부위로 품종에 따라 절단(cut)되거나 절단(uncut)되지 않는 것을 표시한 것이고, 상자 표시는 프라이머 서열의 해당 위치를 나타낸다. 이와 같은, CAPS 마커는 표 4에 기재된 염기서열을 가질 수 있다. 표 4에 기재된 염기서열은 cDNA서열일 수 있다.

[표 3] Contig

[표 4] 마커 서열

또한, 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트를 이용하여 본 발명의 도라지 분류 방법을 실시할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 도라지 분류 방법의 일 실시예에 대하여 보다 상세히 설명한다.

구체적으로, 도 1에 도시된 (A) 시료처리단계, 와 (B) 패턴분석단계를 포함하는 방법에 의해 도라지를 분류할 수 있다.

(A) 시료처리단계는 도라지 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계이고, (B) 패턴분석단계는 절단 산물을 전기영동하여 얻어지는 패턴을 분석하는 단계일 수 있다.

도라지 시료의 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, CTAB 방법, 시판되는 wizard prep 키트(Promega 사) 등을 이용할 수 있다. 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이 때, 표적 서열은 CAPS 마커일 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산서열기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 방법일 수 있다. 이 중 PCR은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에서 일반적이며, 상용의 키트를 이용할 수 있다.

제한효소는 표 1에 기재된 것일 수 있다.

패턴 분석은 표준 도라지 품종의 패턴과 비교 분석하는 것일 수 있으며, 표준 도라지 품종은 표 2에 기재된 21개 도라지 품종 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 표준 도라지 품종의 패턴은 표준 도라지 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭산물을 제한효소로 절단하여 얻어진 절단산물을 전기영동하여 얻어진 것일 수 있다.

이와 같이 절단한 후, 전기영동하여 얻어진 패턴은 유전적으로 유연관계가 있는 개체(품종)에 따라 특징적인 패턴을 나타내므로, 이를 기준으로 도라지를 분류할 수 있다.

즉, 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편을 겔 전기영동 장치를 이용하여 분리하였을 때 나타나는 밴드 패턴을 분석함으로써, 도라지 분류가 가능하다.

또한, 본 발명의 일 실시예인 프라이머세트는 도라지 분류 키트에 포함될 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 도라지 분류 키트의 일 실시예에 대하여 보다 상세히 설명한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 도라지 분류 키트의 일 실시예는 본 발명의 일 실시예인 프라이머 세트, 제한효소, 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다.

제한효소는 표 1에 기재된 제한효소일 수 있다.

또한, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다.

또한, 도라지 분류 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 키트 사용법, 예를 들어, PCR 완충액 제조방법, 반응 조건 등을 설명하는 기록매체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예인 도라지 분류용 프라이머 세트, 도라지 분류 방법 및 도라지 분류 키트에서 각각 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 서로 동일성 범위에서 적용된다.

이하에서는 구체예를 통해, 본 발명의 일 실시예인 도라지 분류용 프라이머세트, 도라지 분류키트, 도라지 분류방법에 대해 보다 상세히 설명한다.

구체예에서 사용한 도라지는 표 2에 기재된 것이다. 이와 같은 도라지는 별도의 언급이 없는 한, 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 분양받아, 안동대학교 원예육종학과 분자육종실험실이 보유하고 있는 것을 재분양 한 것이다.

<구체예 A> 도라지 분류용 프라이머세트

A-1. RNA 추출

RNA 추출은 유전적 거리를 최대한 벌리기 위해 지역적으로 가장 거리가 떨어진 곳에서 수집된 도라지 계통(품종)이 선발되어 활용되었다. 이를 위하여 표 2에 정리되어 있는 도라지 계통 중 도라지 4(강원도, 평창), 도라지 16(전라남도, 순창), 도라지 17(경상북도, 예천)이 사용되었다. Stainless bead가 든 2ml 튜브에 정식한지 한 달 된 도라지 어린 잎을 채취하여 액체질소(LN2)로 급속냉동 시킨다. Vortex를 이용하여 곱게 마쇄한 후 RNeasy Plant Mini Kit (cat No. 74904, QIAGEN, Valencia, CA, USA)을 이용하였으며, 실험방법은 제조회사에서 제공한 사용자 설명서의 내용을 준수하였다. 획득된 RNA는 최종 농도 250ng/L, 최종 볼륨 50L로 조정하여, 섭씨 영하 20도에 냉동 보관한다.

A-2. mRNA 정제 및 cDNA 라이브러리 작성

mRNA 정제 및 cDNA 라이브러리 작성은 Zhong et al.(2011)(Silin Zhong, Je-Gun Joung, Yi Zheng, Yun-ru Chen, Bao Liu, Ying Shao, Jenny Z. Xiang, Zhangjun Fei, and James J. Giovannoni (2011) High-Throughput Illumina Strand-Specific RNA Sequencing Library Preparation. Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.prot5652)에 명시되어진 방법을 참고하여 진행하였다. Total RNA에서 Oligo(dT)25 Dynabeads (Invitrogen 610-05)를 사용하여 mRNA 분리 및 정제를 하였다. Oligo(dT)25 Dynabeads (Invitrogen 610-05)를 샘플 RNA양과 샘플 수에 맞게 준비한 후, on ice 상태에서 storage solution을 모두 제거한다. Oligo(dT)25 Dynabeads를 200ul 1xBinding buffer A (1% beta-ME)과 자석을 활용하여 세척한다. 50ul 2x Binding Buffer A(1% beta-ME)로 처리된 Oligo(dT)25 Dynabeads에 50ul의 total RNA 첨가 후, 잘 섞는다. 섭씨 65도에서 1분, 상온에서 10분간 incubation하면서 inverting 해준다. 그 후 가볍게 튜브를 spin down하여 모든 solution을 제거한다. 샘플당 150ul의 wash buffer(1% beta-ME)를 넣고 세척을 실시한다. 튜브에 50ul TE(1% beta-ME)를 넣고 섭씨 70도에서 1분간 처리 후, 얼음 위에 둔다. 샘플당 50ul 2xBinding buffer A(1% beta-ME)를 추가한 후, 섭씨 65도에서 1분간, 상온에서 10분간 incubation하면서 가끔씩 inverting을 해준다. 가볍게 spin down하고, 모든 solution을 제거한다. 150ul Wash buffer(w/o 1% beta-ME)를 이용한 세척을 3회 반복한다. 정제된 mRNA의 절편화 과정을 위해, 10ul Superscript Buffer mixture(5x first strand buffer 4ul, hexamer(1ug/ul) 0.5ul, oligo dT VN(100ng/ul) 0.5ul, water 5ul)를 이용하여 beads를 재현탁한다. 섭씨 94도에서 5분간 처리과정을 통해 mRNA Fragmentation을 진행한 후, 얼음 위에 둔다. 가볍게 spin down하고, mRNA가 있는 solution을 새 튜브로 이동시킨다.

Purified mRNA에 Superscript III RT kit (Invitrogen)을 사용하여, cDNA 를 작성하였다. 제조사의 지침에 따라 reverse transcription mix (TDW 5.88ul, dNTP(10mM) 1ul, Actinomycin D 0.12ul, DTT(100mM) 2ul, RNase Inhibitor 0.5ul, Superscript III 0.5ul)를 첨가하여, 섭씨 25도에서 10분, 섭씨 50도에서 50분간 처리한다. 처리 직후, 36ul RNA Clean XP beads (Agencourt A66514)를 넣고 잘 섞은 후, 15분간 얼음 위에서 incubation한다. 자석 위에서 75% 에탄올을 이용하여 두 번 washing을 진행하고, 2분간 건조시킨 후, 10ul의 3차증류수로 RNA/cDNA hybrids를 획득한다. 그 다음에, Invitrogen사의 second strand reaction mixture (TDW 2.4ul, dUTP(10mM)+dATP(10mM), dCTP(10mM), dGTP(10mM), 10x Blue Buffer 1.5ul, RNase H(5U/ul) 0.1ul, DNA pol I (10U/ul) 0.5ul)를 얼음 위에서 준비한다. 5ul의 mixture을 elution된 RNA/cDNA hybrid에 첨가 후, 섭씨 16도에서 2시간 30분간 incubation한다. 1.8 volume 의 AMPure XP beads(Agencourt A63881)를 넣고, 15분간 incubation 하고, 섭씨 75도 에탄올로 두 번 washing한 후, 섭씨 10도의 3차증류수로 elution한다. 작성된 cDNA의 end - repair과정을 위해, End-repair Mix (Enzymatics, Y914-LC-L)가 사용되었다. 제조사의 지침에 따라 TDW 2.75ul, dNTP mix(10mM, 0.5ul), 10x End-Repair Buffer 1.5ul, End-Repair Enzyme LC 0.25ul를 만들어, 각 샘플당 5ul 씩 elution된 dsDNA에 넣고 잘 섞어준 후, 섭씨 20도에서 30분간 incubation한다. End-repair 과정 직후에, AMPure XP beads (Agencourt A63881)를 사용하여 washing 과정을 거친다. dA-Tailing 과정을 위하여, Klenow 3'-5' exo-(Enzymatics P701-LC-L)이 사용된다. 제조사의 지침에 따라 dA-Tailing Mastermix(TDW 2.5ul, dATP mix(10mM) 0.5ul, 10x Blue Buffer 1.5ul, Klenow exo- 0.5ul)를 준비한다. cDNA 샘플에 각각 5ul dA-Tailing mastermix를 넣고 잘 섞어준 후, 섭씨 37도에서 30분간 incubation한다. dA-Tailing 과정 직후에, 또 다시 AMPure XP beads (Agencourt A63881)를 사용하여 washing 과정을 거친다. Barcode adapter ligation을 위하여 T4 DNAligaseEnzymatics L603-HC-L)를 사용하여Ligation Master mix(10x ligation buffer 2ul, Truseq adapter(5uM) 0.5ul, T4 DNA Ligase 1ul, TDW 6.5ul)를 준비한다. cDNA에 각 샘플당 10ul ligation mastermix를 넣고 섞어준다. 섭씨 37도에서 30분간 처리 후, 얼음 위에서 15분간 처리한다. Size selection와 Uracil DNA Glycosylase (UDG) digestion을 위하여 1.4 volume의 AMPure XP beads(Agencourt A63881)을 각 샘플에 첨가하고, 상온에서 10분간 incubation 후, 75% 에탄올로 2회 washing한다. 10ul TE(w/o 1% beta-ME)로 elution한 뒤, 4.5ul TE 와 0.5ul UDG (Enzymatics G501L)를 섞어서 각 샘플에 넣고, 섭씨 37도에서 15분간 처리한다. 이후 1.4 volume의 AMPure XP beads(Agencourt A63881)를 각 샘플에 넣고, 10분간 상온에 둔다. 75% 에탄올로 두 번 washing한 후, 15ul TDW로 elution한다. PCR enrichment 과정을 위해, PCR reaction(UDG digested DNA 5ul, Index Primer(10uM) 1ul, 5x Buffer 10ul, 10mM, dNTP 0.5ul, TDW 33ul, Phusion HF (New England Biolabs) 0.5ul)을 준비한다. PCR 조건은 섭씨 98도에서 2분간 초기 변성시키고, 섭씨 98도에서 30초(denaturing), 섭씨 65도에서 30초(annealing), 섭씨 72도에서 20초(extension) 과정을 12회 반복 후 섭씨 72도에서 2분간 반응시킨다. cDNA library 작성의 확인을 위하여 각 샘플당 4ul씩 1.2% agarose gel에 전기영동하여 200-300bp 사이에 밴드의 존재 여부를 확인한다. 1.2 volume의 AMPure XP beads(Agencourt A63881)을 넣고, 75% 에탄올로 두 번 washing한 후, 20ul TE로 elution한다. 이 후 Qubit dsDNA HS assay kit (Invitrogen Q32851)를 이용해서, 라이브러리를 정량한다. 정량된 라이브러리는 라이브러리당 20ug씩 섞은 후, 1.4 volume의 AMPure XP beads(Agencourt A63881)를 넣고, 10ul TE로 Elution한다.

A-3. 프라이머 세트 디자인

도라지 4, 도라지 16, 도라지 17의 RNA Seq 정보를 denovo assembly를 통해 3종의 도라지의 전사체의 contig를 작성하고 서로 alignment를 통해 SNP를 동정하였다. 이에 필요한 모든 생물정보학 분석은 CLC Assembly Cell (CLC Bio, Denmark)을 이용하였다. CAPS marker의 작성은 동정된 SNP를 기반으로 Sol Genomics Network (http://solgenomics.net)에서 제공하는 CAPS design tool을 이용하여 CAPS Marker를 design 했으며, 해당제한효소에 의한 절단 부위 및 길이를 고려하여 Primer를 설계하였다.

작성된 contig는 표 3에 기재된 바와 같다. SNP는 도 2에 실선과 점선으로 도시된 바와 같으며, 도 2에서 박스 표시된 부분이 프라이머에 해당한다. 또한, CAPS 마커는 표 4와 도 2에 도시된 바와 같다.

구체적으로, 설계된 프라이머와 제한효소는 표 1에 기재된 바와 같다. 특정 Contig에서 우선 SNP 존재 지점에서의 특정 제한효소 절단 부위 유무를 확인하였다. 프라이머 제작은 SNP 위치에서 5'과 3' 양방향으로 각각 100-200bp 정도 떨어진 부위를 지정하여 프라이머로 제작하였다. 프라이머로 사용된 DNA oligomer는 Bioneer사(한국)에 의뢰하여 합성하였으며, Koster에 의해 개발된 cyanoethyl phosphoramidite를 이용하여 phosphodiester 결합을 연결하는 'phosphite triester'방법을 적용하여 합성하였다. 또한, CAPS 마커는 RNA seq 결과를 바탕으로 제작되었기 때문에, genomic DNA를 사용한 PCR 및 제한효소 처리에 의한 결과는 예측과 달라질 수 있는 점을 고려하여 이후의 실험이 진행되었다.

이와 같은 방법에 의해 제조된 표 1에 기재된 프라이머쌍을 포함하도록 하여 도라지분류용 프라이머 세트 내지 도라지분류키트를 제조할 수 있다.

<구체예 B> 도라지 분류방법

B-1. 게놈 DNA 추출

표 2에 기재된 도라지 DNA추출은 생육 중 4-5엽기에 Stainless bead가 든 2ml 튜브에 어린 잎을 채취하여 액체질소(LN2)로 급속냉동을 시킨다. Vortex를 이용하여 곱게 마쇄한 다음, 0.2% Sodium bisulfite가 든 CTAB Buffer를 300ul를 넣어준 후 잘 섞어준다. 섭씨 65도 Water bath에서 30분 처리 후, Chloroform 150ul를 첨가 후 잘 섞어준다. 이후 섭씨 4도에서 15분간 원심분리하여 층 분리를 유도한다. 층 분리된 상층액 200ul을 새 튜브로 옮기고, Pre-chilling된 100% Isopropanol 200ul을 첨가한 후, 천천히 Inverting 시켜준다. 30초간 원심분리하여 DNA Pellet만 남기고, 튜브에 든 액체를 제거해준다. 70% Ethanol 750ul를 넣어준 후, 이전과 동일하게 Inverting 후 30초간 원심분리 한다. 이후 튜브의 액체를 완전히 제거한 후DNA Pellet만 남은 튜브에 DNase-free water 100ul를 넣어 녹인 후 섭씨 영하 20도에 냉동보관한다.

B-2. 증폭(PCR)

PCR은 gDNA 1ul, 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl, 2mM MgSO₄, 0.1% 0.2mM each dNTP, 0.4mM forward와 reverse Primer, 5units Taq polymerase(TaKaRa, Otsu, Shiga, Janpan), 총 25ul 맞춰주었다. PCR 반응을 위해 T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)을 이용하였으며, PCR 조건은 섭씨 94도에서 10분간 초기 변성시키고, 섭씨 94도에서 1분(denaturing), 표 1의 어닐링 온도에서 1분(annealing), 섭씨 72도에서 1분(extension) 과정을 35회 반복 후 섭씨 72도에서 10분간 반응시켰다.

B-3. 제한효소 처리

PCR Product 총 볼륨 25ul 중 10ul를 전기영동하여 PCR 증폭 여부를 확인하고, PCR Product 15ul에 표 1에 기재된 제한효소 2ul, 버퍼 2ul, 3차 증류수 2ul를 각각 넣어 혼합한 후, 표 1에 기재된 처리온도에서 1시간 처리하였다.

B-4. 전기영동

genomic DNA는 예상 단편 길이를 고려하여 agarose gel을 표 1에 기재된 농도로 제조하였으며, gel은 전기영동 후 EtBr로 염색하고, Gel Doc 2000 (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)을 통해 PCR 증폭 및 Genotyping을 실시하였다. 도 3에 전기영동 결과를 나타내었다.

B-5. 패턴 분석

프라이머쌍에 따라 얻어진 전기영동 결과(도 3)를 분석하여, 동일 패턴을 나타내는 도라지 품종(계통)을 분류하였다.

도 3은 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용한 전기영동 결과이다.

도 3에서 정수인 01~21은 표 2의 도라지를 나타내는 일련번호, M은 1Kb DNA ladder를 나타내며, 하나의 영문 대문자는 프라이머쌍에 의해 분류된 그룹을 표시하기 위한 것이다.

도 3에서 보는 바와 같이, PS10 CAPS 마커 분석에 의해, 21종의 도라지는 Genotyping이 6그룹으로 분류되었고, 각각의 그룹에 5품종, 1품종, 5품종, 8품종, 1품종, 1품종이 속함을 알 수 있다.

이와 같은 패턴을 표준 도라지 품종의 패턴으로 하여, 미지의 도라지 시료에 대하여 구체예 B의 B-1. 내지 B-4.와 동일한 방법으로 얻어진 패턴을 대비함으로써, 도라지 시료를 분류할 수 있음을 알 수 있다. 이에 해당하지 않는 도라지는 별도 종으로 분류할 수 있으며, 이와 같은 종은 유전적 유연관계가 먼 것으로 판단하여 육종 등에 활용할 수 있음은 물론이다.

이와 같은 결과로부터, 본 발명의 프라이머세트에 의해 유전적으로 유연관계가 있는 도라지를 분류할 수 있음을 알 수 있다.

<110> Andong National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for classifing balloon flower, Classification method for balloon flower using thd same, and Classification kit for balloon flower using the same <130> GP14012 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PS10 <400> 1 ccacttgtgc aattgcgc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PS10 <400> 2 gagattttga tccacaat 18 <210> 3 <211> 765 <212> DNA <213> Platycodon grandiflorum <400> 3 caacaacggg accacaaagt gaagcgaaat catcgctcct catagtgtaa aatgtgctaa 60 ggaacataat cctggttcta gtagtagtag ccacaaaccg gagaattgcc cgtttgtatc 120 cacctttgcc cttagattca taaggcacct taaccgtgtc tttaccggca aacgcctcca 180 ctatcattga cccttcacaa gagttgctag catctcccac agcaaacgag agctggtagg 240 ttgtcccaac cttggttcgg gccacttgtg caattgcgct ttctttacca gcaacaagct 300 caacggctcg ttttccttgt ggaactgaga agtgatcgga atctatgtac ttgacggctt 360 tgagggattc gatcatccat gccgggaggg gagagtgatc atcttcaatg tttgggggta 420 ctaggactcc ccaagatgta ttggggaaaa catatggacc ttcttcaaag tcaccatttt 480 tcaataagtt ctgattagta gcttttggag ggtacagagc tttaatggca atggaatcga 540 tgagcggccc acaagcagga tcctcctcaa ctcctggatt gtggatcaaa atctccacca 600 cattatacat tgcctgaaat gcccacgcgt acgagtccca tccattacta ctatacaacg 660 tctgcatcgg caacacgcca gagtccggtg caacggacac gttcagctgt tcctcttggg 720 cacaagtacg ggcagcgcta aacgtgatgg aatagtacat tcctt 765 <210> 4 <211> 765 <212> DNA <213> Platycodon grandiflorum <400> 4 caacaacggg accacaaagt gaagcgaaat catcgctcct catagtgtaa aatgtgctaa 60 ggaacataat cctggtccta gtagtagtag ccacaaaccg gagaattgcc cgtttgtatc 120 cacctttgcc cttagattca taaggcacct taaccgtgtc tttaccggca aacgcctcca 180 ctatcattga cccttcacaa gagttgctag catctcccac agcaaacgag agctggtagg 240 ttgtcccaac cttggttcgg gccacttgtg caattgcgct ttctttaccg gcaacaagct 300 caacggctcg ttttccttgt ggaactgaga agtgatcgga atctatgtac ttgacggctt 360 tgagggattc gatcatccat gccgggaggg gagagtgatc atcttcaatg tttgggggta 420 ctaggactcc ccatgatgta ttggggaaaa catatggacc ttcttcaaag tcaccatttt 480 tcaataagtt ctgattagtg gcttttggag ggtacagagc tttaatggct atggaatcga 540 tgagcggtcc acaagcagga tcctcctcaa ctcctggatt gtggatcaaa atctccacca 600 cattatacat tgcctgaaat gcccacgcgt acgagtccca tccattacta ctatacaacg 660 tctgcatcgg caacacgcca gagtccggtg caacggacac gttcagctgt tcctcttggg 720 cacaagtacg ggcagcgcta aacgtgatgg aatagtacat tcctt 765 <210> 5 <211> 501 <212> DNA <213> Platycodon grandiflorum <400> 5 gtcaacaacg ggaccacaaa gtgaagcgaa atcatcgctc ctcatagtgt aaaatgtgct 60 aaggaacata atcctggtcc tagtagtagt agccacaaac cggagaattg cccgtttgta 120 tccacctttg cccttagatt cataaggcac cttaaccgtg tctttaccgg caaacgcctc 180 cactatcatt gacccttcac aagagttgct agcatctccc acagcaaacg agagctggta 240 ggttgtccca accttggttc gggccacttg tgcaattgcg ctttctttac cggcaacaag 300 ctcaacggct cgttttcctt gtggaactga gaagtgatcg gaatctatgt acttgacggc 360 tttgagggat tcgatcatcc atgccgggag gggagagtga tcatcttcaa tgtttggggg 420 tactaggact ccccatgatg tattggggaa aacatatgga ccttcttcaa agtcaccatt 480 tttcaataag ttctgattag t 501 <210> 6 <211> 334 <212> DNA <213> Platycodon grandiflorum <400> 6 ccacttgtgc aattgcgctt tctttaccag caacaagctc aacggctcgt tttccttgtg 60 gaactgagaa gtgatcggaa tctatgtact tgacggcttt gagggattcg atcatccatg 120 ccgggagggg agagtgatca tcttcaatgt ttgggggtac taggactccc caagatgtat 180 tggggaaaac atatggacct tcttcaaagt caccattttt caataagttc tgattagtag 240 cttttggagg gtacagagct ttaatggcaa tggaatcgat gagcggccca caagcaggat 300 cctcctcaac tcctggattg tggatcaaaa tctc 334

Claims (7)

1. 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 도라지 분류용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 도라지의 단편증폭다형성서열(CAPS)의 증폭을 위한 것인 도라지 분류용 프라이머 세트.
3. 제1항에 있어서, 상기 도라지 분류용 프라이머 세트는 도라지 유전적 유연관계 분석을 위한 도라지 분류용 프라이머 세트인 프라이머 세트.
4. 제1항의 프라이머세트를 이용하여 도라지를 분류하는 도라지 분류 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 도라지 분류 방법은
   (A) 도라지 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 시료처리단계; 및
   (B) 상기 절단 산물을 전기영동하여 얻어지는 패턴을 분석하는 패턴분석단계를 포함하는 도라지 분류 방법.
6. 제1항의 프라이머 세트, 제한효소, 및 증폭반응수행시약을 포함하는 도라지 분류 키트.
7. 제6항에 있어서, 상기 제한효소는 표 1에 기재된 제한 효소이며, 상기 증폭반응 수행시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 도라지 분류 키트.

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