KR20150101692A - 관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법 - Google Patents

관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 유기용매에 용해하여 분산용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 기판 표면에 코팅함으로써 관능기를 갖는 폴리머 코팅층이 형성되는 단계; 상기 코팅층에 단백질을 부착시키는 단계; 를 포함하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 표적 단백질 검출 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법을 이용하는 경우, 표면위에 도팅(dotting)하는 간편한 방법만으로도 단백질을 고정화 시킬 수 있으며, 시간이 절약된다.

Description

관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법 {Proteins Immobilization Method Using Polymer Based Funtional Group}
본 발명은 관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법에 관한 것이다.
무기물과 유기물을 결합하는데 현재까지 가장 많이 사용되어온 기술은 실란 커플링 에이전트(Silane coupling agent)를 이용한 방법이다. 이 방법은 단백질을 고정화하고자 하는 기판 표면에 플라즈마(plasma)처리 등의 과정을 거쳐 수산기를 형성시키고, 그 위에 실란 커플링 에이전트를 반응시킨다. 그 후 글루타르알데히드 등의 각각의 실란과 맞는 가교제(crosslinker)를 결합시키고, 그 가교제가 가지고 있는 관능기와 단백질의 아민기가 결합함으로써 단백질을 표면에 고정화시키는 방법이다(비특허문헌 1). 그러나 이러한 방법은 여러 단계의 전처리 과정이 필요하고, 단백질을 고정화하기 위해 여러 단계의 과정을 거쳐야 하기 때문에 장시간이 소요된다. 또한 재질의 표면이 수산기를 형성할 수 없는 경우나, 전처리를 통해서도 수산기가 형성되지 않는 경우에는 단백질을 고정화 할 수 없으며, 많은 세정 단계를 거쳐야 하는바 오류의 발생확률이 높아질 수 있다는 단점을 가지고 있다.
한편, 취수원에서 안전한 상수공급을 위해 다수의 항목에 대해서 분석을 하고 있지만, 이 중, 신규미량오염물질에 대한 분석은 아직까지 크로마토그래피 등의 방법을 통해 검출하고 있다. 그러나 이러한 분석 방법은 시료채취에서 분석까지 반나절 이상의 시간을 필요로 하며 만약 취수원에서 신규미량오염물질이 발생하였을 때에는 이에 대한 즉각적인 조치가 어렵다.
이를 위해서 신규미량오염물질을 현장에서 즉각적으로 검출할 수 있는 센서기술이 필요한 실정이다.
(비특허문헌 1) Simone Karrasch et al., Covalent Binding of Biological Samples to Solid Supports for Scanning Probe Microscopy in Buffer Solution, Biophysical Journal Volume 65 December 1993 2437-2446.
본 발명의 목적은 신규미량오염물질을 현장에서 즉각적으로 검출하기 위한 방법으로, 아민그룹과 결합이 가능한 관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 관능기 기반 폴리머를 포함하는 키트를 제공하기 위한 것이다.
취수원에서 안전한 상수공급을 위해 다수의 항목에 대해서 분석을 하고 있지만, 아직 신규미량오염물질(Estrogen, PCBs, Geosmin)에 대한 분석은 크로마토그래피 등의 방법을 통해 검출하고 있다. 그러나 상기 크로마토그래피 등의 활용 방법은 시료채취에서 분석까지 반나절 이상의 시간을 필요로 하며, 만약 취수원에서 신규미량오염물질이 발생한 경우에는 즉각적인 조치가 어렵다. 이를 위해서 신규미량오염물질을 현장에서 즉각적으로 검출할 수 있는 센서기술이 필요한 실정이며, 이 중 오염물질을 미량까지 정확하게 측정할 수 있도록 항원/항체반응을 이용한 센서기술의 연구가 활발히 진행 중에 있다. 항원/항체반응을 이용한 센서의 경우 항체를 얼마나 많이 어떻게 칩 표면에 붙일 수 있는가가 센서를 개발하는데 있어서 가장 중요한 부분을 차지한다. 어떻게 항체를 많이, 정확하게 부착하였는가가 센서의 궁극적인 측정농도와 민감도에 큰 영향을 줄 수 있기 때문이다.
이에 따라, 본 발명은 센서 및 여러 산업 분야에서 항체를 포함한 단백질을 표면에 고정화해야 하는 경우 보다 빠른 시간 안에 편리하게 고정화 할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 유기용매에 용해하여 분산용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 기판 표면에 코팅함으로써 관능기를 갖는 폴리머 코팅층이 형성되는 단계; 상기 코팅층에 단백질을 부착시키는 단계;를 포함하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “관능기”는 단백질 고정화를 위해 단백질의 아민기와 공유결합이 가능한 기능원자단을 갖는 유기화합물을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서 이러한 관능기는 포르밀기(formyl), 티올기(thiol), 이소시아네이트기(isocyanate), 설포릴 클로라이드기(sulforyl chloride) 및 클로로카보닐기(chlorocarbonyl) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있으며, 아민 그룹과 결합 가능한 관능기를 모두 포함할 수 있다 (도 1).
본 명세서에서 사용되는 상기 기판의 종류는 바람직하게는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄, 화합물 반도체 및 실리콘 등이 있을 수 있으며, 바람직하게는 유리를 이용할 수 있고, 표면에 수산기를 요구하지 않기 때문에 당업계에 통상적으로 사용되는 단백질 고정화를 위한 고체 기판이면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 제시하고자 하는 방법은 아민과 결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리스티렌(polystylene)기반의 폴리머(polymer)를 기판 표면에 코팅하는 것이다. 이로써, 수산기가 존재하지 않는 표면에서도 충분히 활용이 가능하고, 동시에 단백질의 아민그룹과 반응할 수 있는 관능기를 표면에 형성시킴으로 단백질의 고정화도 가능하다. 이는 종래 방법보다 고정화에 필요한 단계를 줄일 수 있어서 많은 시간을 필요로 하지 않고, 한 번의 처리로 단백질의 고정이 가능하기 때문에 간편하다.
또한 종래 방법의 경우 4시간 이상에서 길게는 12시간이 소요되는 반면 본 발명에서 제시한 방법은 30분 이내의 시간만이 소요되기 때문에 동일한 단백질 고정화 효율을 나타내기까지 필요한 시간을 3시간 이상 줄일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 이소시아네이트 관능기는 아민그룹과 반응할 수 있는 여러 관능기중에 한 가지를 대상으로 수행한 연구결과에 기인한다. 하지만, 아민그룹과 반응할 수 있는 여러 관능기와 이를 갖는 폴리머를 이용한다면 본 발명과 유사한 기능을 수행할 수 있다. 이러한 관능기는 포르밀기(formyl), 티올기(thiol), 이소시아네이트기(isocyanate), 설포릴 클로라이드기(sulforyl chloride) 및 클로로카보닐기(chlorocarbonyl) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있으며, 아민 그룹과 결합 가능한 관능기를 모두 포함할 수 있다 (도 1).
상기 이소시아네이트는 1,5-나프탈렌 디이소시아네이트, 벤질 이소시아네이트, 2,4-톨루엔 디이소시아네이트(TDI), 2,6-톨루엔 디이소시아네이트, 2,4'-디페닐메탄 디이소시아네이트(MDI), 2,2'-디페닐메탄 디이소시아네이트, 4,4'-디페닐메탄 디이소시아네이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상; 분자내에 이소시아네이트기를 2이상 보유한 크루드-MDI 및 이들의 올리고머; 또는 우레탄, 알로파네이트, 우레아, 뷰렛, 카보다이이미드, 우레톤이민, 이소시안우레이트기 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 디페닐메탄 디이소시아네이트일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 이소시아네이트기를 갖고 있는 폴리스티렌 기반의 폴리머라면 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 용매는 클로로포름, 테트라클로로에틸렌, 카본테트라클로라이드, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 톨루엔 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머는 전체 용액 총 중량에 대해 1~20 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2~10 중량%, 가장 바람직하게는 5 중량%로 포함될 수 있다. 상기 폴리머가 1 중량% 미만으로 포함되는 경우 기판 표면이 고르지 못하게 형성되기 때문에 단백질 고정화 효율이 떨어지며, 20 중량%를 초과하는 경우 필요 이상의 폴리머를 과량으로 사용하게 되어 경제적인 관점에서 효율적이지 못하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단백질은 항체 또는 항원일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 단백질은 형광물질이 부착되어 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 형광물질은 플루오르세인(fluorescein) 계열의 TRITC (Tetramethylrhodamine-5-(and 6)-isothiocyanate), FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate), DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), 피렌, 프로피디움 요오드화물 및 RITC(Rhodamine isothiocyanate)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 유기용매에 용해하여 분산용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 기판 표면에 코팅함으로써 관능기를 갖는 폴리머 코팅층이 형성되는 단계; 상기 코팅층에 표적 단백질이 결합하는 단계; 상기 단백질에 형광물질을 갖는 항체를 부착시키는 단계; 및 형광신호를 분석하는 단계; 를 포함하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 표적 단백질 검출 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 단백질"이란, 존재하고 있는지 여부를 검출하고자 하는 단백질로서, 구체적으로 상기 관능기를 갖는 폴리머 코팅층을 갖는 기판에 특이적으로 결합하여 검출될 수 있는 단백질이며, 상기 단백질의 종류는 당업계에서 통상적으로 알려진 단백질이라면 제한없이 사용 가능하다. 구체적으로 상기 표적 단백질은 항원일 수 있으며, 바람직하게는 환경오염물질일 수 있다. 상기 환경오염물질은 환경 에스트로겐(Estrogen), PCBs, 지오스민(Geosmin), DDT, 프로게스테론(Progesterone), 비스페놀A 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 취수원에서 검출되는 신규한 미량의 환경오염물질을 모두 포함할 수 있다.
표적 단백질을 검출하기 위하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 간접경합방법(indirect-competitive assay format), 직접경합방법(direct-competitive assay format), 또는 샌드위치 방법(sandwich assay format)에 의하여 검출을 행할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
예를 들어, 본 발명의 표적 단백질 검출 방법은 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 유기용매에 용해하여 분산용액을 제조하는 단계; 상기 용액을 기판 표면에 코팅함으로써 관능기를 갖는 폴리머 코팅층이 형성되는 단계; 상기 코팅층에 바이오리셉터를 부착시키는 단계; 상기 바이오리셉터에 표적 항원이 결합하는 단계; 상기 항원에 형광물질을 갖는 항체를 부착시키는 단계; 형광신호를 분석하는 단계; 를 포함하는 샌드위치 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 여기에서 상기 바이오리셉터는 단백질, 항원 또는 항체일 수 있다.
또한 본 발명은 기판; 상기 기판 위에 형성된, 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 포함하는 코팅층; 및 상기 코팅층에 부착된 단백질;을 포함하는 키트를 제공한다.
상기 관능기는 이소시아네이트기, 설포닐 클로라이드기, 클로로카보닐기, 티올기, 포르밀기 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있으며, 아민과 결합이 가능한 관능기를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 고정화 방법을 이용하여 제조한 키트를 이용하면 항체의 고정 뿐만 아니라 다양한 분야에서 이루어지고 있는 무기물과 유기물의 결합에도 폭넓게 적용이 가능할 것이다.
본 발명에 따른 아민그룹과 결합이 가능한 관능기 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법을 사용하는 경우, 기판 표면에 단백질과 결합이 가능한 관능기를 갖고 있는 폴리머 층이 형성된다. 이렇게 형성된 관능기 코팅층은 단백질의 아민그룹과 쉽게 반응하여 우레아 결합(urea bond)를 형성하여 고정화 되기 때문에 표면위에 도팅(dotting)하는 간편한 방법만으로도 단백질을 고정화시킬 수 있으며, 시간이 절약된다.
도 1은 아민그룹과 반응할 수 있는 다양한 관능기를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법의 원리이다.
도 3은 본 발명의 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법의 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 관능기를 갖는 폴리머의 부착 여부 및 단백질 고정화 여부를 확인한 FT-IR 그래프이다.
도 5는 종래의 이소시아네이트 실란 및 APTES를 이용한 단백질 고정화 효율 및 본 발명의 일 실시예에 따른 이소시아네이트 및 설포닐기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 효율을 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 관능기를 갖는 폴리머의 농도에 따른 기판 표면 형태를 나타낸다. 관능기를 갖는 폴리머를 전체 용액의 1 중량%, 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%로 첨가했으며, 기판 표면의 형태 및 두께는 AFM (Atomic Force Microscope)으로 분석하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 고정에 필요한 최적시간(좌) 및 온도(우)에 대한 그래프이다 (좌: 단백질을 고정한 이후 최초 1시간까지는 15분 간격으로 형광세기를 측정하였으며, 1시간 후에는 30분에 한번씩 형광세기를 측정하였음; 우: 저온(4 ℃), 중온(25 ℃), 고온(50 ℃)으로 온도를 설정하여 단백질 고정화 효율을 관찰함).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 환경오염물질-항체 고정화 효율을 비교한 그래프이다 (BLANK: 단백질을 부착하지 않은 경우; BSA: 대조군 단백질을 부착한 경우; PCB-antibody 및 Estrogen-antibody: 환경오염물질-항체를 부착한 경우).
도 9는 기판 재질에 따른 단백질 고정화 효율을 비교한 그래프이다 (Slide glass: 본 발명의 일 실시예에 따른 관능기를 갖는 폴리머 용액을 슬라이드 글래스에 코팅함; paper: 본 발명의 일 실시예에 따른 관능기를 갖는 폴리머 용액을 페이퍼에 코팅함; APTES-Slide glass: APTES를 슬라이드 글래스에 처리함; APTES-Paper: APTES를 페이퍼에 처리함).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 이소시아네이트기의 수분 저항성을 실험한 그래프이다 (Blocking: 이소시아네이트기에 수분 블로킹을 하고 단백질 고정화 효율을 관찰; Usual: 수분 블로킹을 하지 않고 실험; n=5: 실험을 5회 반복).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 이소시아네이트기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화
실시예 1-1. 이소시아네이트 폴리머를 이용한 표면처리 및 단백질 고정화
본 연구에서는 단백질의 아민그룹(NH2)과 결합이 가능한 관능기 중에서 이소시아네이트를 갖고 있는 폴리스티렌 기반의 폴리머(Isocyanate, polymer-bound (473658-5G), sigma Aldrich 사에서 구입)를 이용하였다. 상기 이소시아네이트 폴리머는 다이클로로 메탄에 용액 총 중량에 대해5중량%로 용해시켰다. 상기 용액을 단백질을 고정화 하고자 하는 기판의 표면에 딥코팅(dipping) 방법으로 코팅하였다. 기판으로는 마이크로스코프 슬라이드(microscope slides) 글라스를 사용하였다. 슬라이드 글라스는 먼저 세척(cleaning)해 두었다. 이는 슬라이드 글라스의 제조 및 유통 보관상에서 발생할 수 있는 유막이나 협잡물을 제거하기 위한 과정으로, 에탄올, NaOH 1M, Hcl 1M 용액에 슬라이드 글라스를 1시간 정도 담구고 세척한 후, D.I water로 린싱(rinsing)하여 건조 보관하였다. 딥코팅 과정은 5분씩 디핑(dipping) 하였으며, 용매를 증발시키기 위해서 외부공기와의 접촉을 피할 수 있도록 진공데시케이터를 사용하였다. 단백질 닷팅(dotting)은 BSA-FITC를 이용하였다. 단백질 고정화를 위해 1시간 이상의 충분한 반응시간을 주었다. 이에 따라 기판 표면에 단백질과 결합이 가능한 관능기를 갖고 있는 폴리스티렌층이 형성되었다. 이렇게 형성된 관능기 코팅층은 단백질의 아민그룹과 쉽게 반응하여 우레아 결합(urea bond)을 형성하여 고정화 되기 때문에 표면 위에 도팅(dotting)하는 가장 기본적인 방법만으로도 단백질을 고정화 시킬 수 있었다. 이후, PBST를 이용하여 기판을 3회 세척(washing)하고 나서 마이크로어레이 스캐너를 이용해 형광세기를 측정하였다 (도 2 및 도 3).
실시예 1-2. 이소시아네이트 폴리머 장착 및 단백질 고정화 여부 확인
이소시아네이트 폴리머가 표면에 잘 코팅되었는지 유무 및 단백질이 코팅으로 형성된 이소시아네이트와 화학적 결합을 통해 안정적으로 고정되었는지를 알아보기 위해 FT-IR을 사용하여 화학결합을 확인하였다. 표면에 이소시아네이트 폴리머를 코팅하였을 때 파수(wavenumber) 2270과 2800~3000에서 피크(peak)를 보였다. 2270은 이소시아네이트이며, 2800~3000은 용매인 다이클로로메탄에서 기인한다. 이를 통해서 표면에 이소시아네이트 폴리머가 표면에 잘 고정된 것을 확인할 수 있었다. 그 후, 단백질을 표면에 고정한 후 표면을 측정 하였다. 단백질의 경우, 아민그룹을 갖고 있는 아미노산을 이용하여 아민과 이소시아네이트 결합을 확인하였다. 그 결과 우레아 결합(urea bond)으로 인해 형성된 C=O bond로 인해서 1720에서 피크가 형성되고, 3100에서 H-N bond에 의해서 피크가 형성되어 이소시아네이트와 아민이 화학적으로 결합함을 확인하였다 (도 4).
실시예 2. 설포닐 기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화
단백질의 아민그룹(NH2)과 결합이 가능한 관능기 중에서 설포닐 기를 갖고 있는 폴리스티렌 기반의 폴리머(Sigma aldrich사에서 Sulfonyl chloride 구입, polymer bound (516228-5G)를 다이클로로 메탄에 5중량%로 녹였다. 이 용액을 단백질을 고정화 하고자 하는 기판의 표면에 딥코팅(dipping) 방법으로 코팅하였다. 이에 따라 기판 표면에 단백질과 결합이 가능한 관능기를 갖고 있는 폴리스티렌층이 형성되었다. 이렇게 형성된 관능기 코팅층은 단백질의 아민그룹과 쉽게 반응하여 우레아 결합(urea bond)을 형성하여 고정화 되기 때문에 표면 위에 도팅(dotting)하는 가장 기본적인 방법만으로도 단백질을 고정화 시킬 수 있다.
실시예 3. 단백질 고정화 효율 비교
실시예 3-1. 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 효율 비교
상기 실시예 1-1 및 2의 단백질 고정화 방법의 효율과 종래의 실란 커플링 에이전트를 이용한 단백질 고정화 방법의 효율을 비교하였다. 이를 위하여 형광다이(FITC)가 컨쥬게이션(conjugation)되어 있는 단백질(BSA, Sigma aldrich사에서 구입, A9771-50mg)을 동일한 농도로 각각의 방법으로 전처리한 기판에 고정화하였다. 그 후, 표면의 형광세기를 측정하여 단백질의 고정화 효율을 비교하였다. 대조군으로는 이소시아네이트 실란(Gelest 사에서 구입, SII6455.0-100G) 및 APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane, Tokyo chemical industry co. (TCI)사에서 구입, 213-048-4)를 이용하여 기판에 전처리하고 종래 실란 커플링 방법(비특허문헌 1 참조)을 이용한 단백질 고정화를 실시하였다. 단백질로는 BSA-FITC 를 이용해 도팅한 후 형광세기를 측정하였다. 그 결과, 종래 방법과 비교하여 본 발명의 이소시아네이트 및 설포닐 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법을 사용한 경우, 종래 실란 커플링 에이전트를 이용한 방법에 비해 단백질 고정화 효율에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 특히 이소시아네이트를 이용한 경우, 대조군인 이소시아네이트 실란 및 APTES를 이용한 단백질 고정화 효율보다 우수한 것으로 나타났다 (도 5).
실시예 3-2. 관능기 함유 폴리머의 농도별 효율
관능기 함유 폴리머의 코팅 농도별 효율을 스크리닝하기 위해 1 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%로 폴리머를 함유하도록 농도를 조절하였다. 상기 실시예 1-1의 방법으로 표면을 처리한 후, 표면의 형태를 AFM (Atomic Force Microscope)을 통해 측정하였다. 측정 결과, 1 중량% 및 10 중량% 이상에서는 표면이 고르지 못하게 형성되었고, 5 중량%에는 코팅층 표면이 평평하게 형성되어 있음을 확인하였다. 따라서 5 중량%가 최적의 코팅농도임을 확인하였다(도 6).
실시예 3-3. 단백질 고정을 위한 시간 및 온도 조건 비교
단백질 고정에 필요한 최적시간 및 온도에 대해 실험하였다. 실시예 1-1의 방법으로 기판 표면을 처리하고 시간 및 온도에 따른 단백질 고정화 효율을 비교하였다. 최초 1시간까지는 15분 간격으로 비교하였고, 1시간 후에는 30분에 한번씩 형광세기를 측정하였다. 결과적으로 4시간일 때 최대 형광세기를 보였으며, 그 후에는 형광세기가 포화되어 단백질 고정까지 필요한 최적시간은 4시간인 것을 확인하였다. 종래 기술의 경우 단백질 고정화 시간이 길게는 12시간이 소요되는데, 본 발명에서 제시한 방법을 이용하는 경우, 단백질 고정화 효율을 나타내기까지 필요한 시간을 줄일 수 있었다.
한편, 온도 조건을 달리하여 단백질 고정화 효율을 비교하였다. 그 결과, 저온(4 ℃), 중온(25 ℃), 고온(50 ℃) 모두 4시간에서 형광세기가 포화되었고 각 온도별로 큰 차이를 보이지 않아, 단백질 고정화에 대한 온도의 영향은 적은 것으로 사료되었다(도 7).
실시예 3-4. 신규미량오염물질 -항체 고정화 효율 비교
단백질로 BSA 및 신규미량오염물질-항체를 이용하여 단백질 고정화 효율을 비교하였다. 이를 위하여 대조군으로 형광다이(FITC)가 컨쥬게이션(conjugation)되어 있는 단백질(BSA)을 동일한 농도로 실시예 1-1의 방법으로 표면 처리한 기판에 고정화하였다. 또한 실험군으로 FITC가 컨쥬게이션 되어 있는 Estrogen-antibody(Abcam 사에서 구입, #ab54122) 및 PCB-antibody(Fitzgerald 사에서 구입, #10R-P115A)를 실시예 1-1의 방법으로 전처리한 기판에 고정화하였다. 그 후, 표면의 형광세기를 측정하여 단백질의 고정화 효율을 비교하였다. 그 결과, 신규미량오염물질-항체의 고정화 효율 역시 BSA를 사용한 것과 유사하게 높은 효율을 보였다(도 8).
실시예 3-5. 수산기가 없는 표면에서의 단백질 고정화 효율 비교
종래기술인 실란을 사용한 단백질 고정화 방법의 단점으로는 표면에 수산기가 반드시 존재하여야 활용이 가능하다는 것이다. 이와 달리 본 발명은 표면에 수산기가 없어도 단백질의 고정화가 가능한바, 이를 비교하기 위해 수산기가 없는 종이(paper)를 기판으로 하여 단백질 고정화 효율을 비교하였다.
기판으로 슬라이드 글라스 대신 종이를 이용하여 실시예1-1의 방법을 사용해 기판 표면을 처리하고, 단백질 고정화 여부를 확인하였다. 대조군으로는 종래 기술인 APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane , Tokyo chemical industry co.(TCI)사에서 구입, 213-048-4)를 이용한 단백질 고정화 방법을 사용하였다. 그 결과, 수산기가 요구되지 않는 본 발명의 방법을 사용하는 경우 종이상에서도 단백질 고정화 효율이 좋은 것으로 나타났다. 반면 종래기술인 APTES의 경우, 수산기가 없는 종이 상에는 단백질 고정화가 이루어지지 않는 것으로 나타났다(도 9).
실시예 4. 이소시아네이트 폴리머 기판의 수분 저항성 평가
이소시아네이트는 대기중의 수증기와 반응하여 쉽게 변질되기 때문에, 수분에 대한 저항성 평가를 수행했다. 수분이 없는 질소 대기 하에서 이소시아네이트 10 g에 4.8g(0.055 mol)의 메틸에틸케톤을 첨가하였다. 80 ℃에서 이소시아네이트와 메틸에틸케톤을 혼합하여 이소시아네이트기가 블로킹되었다. 상기 블로킹 이소시아네이트를 실시예 1-1의 방법을 사용하여 단백질 고정화하였고, 다섯번의 단백질 고정화 실험을 반복하여 평균을 산출하였다.
그 결과 수분에 대한 블로킹을 한 표면과 그렇지 않은 표면 모두 형광세기에 큰 차이를 보이지 않았다(도 10). 이는 본 발명의 이소시아네이트 폴리머로 전처리된 기판에 대기중 수분에 의한 변성이 생각보다 많이 일어나지 않았기 때문이다. 이는 본 발명의 이소시아네이트 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법이 어느 정도 수분에 대한 저항성을 갖춘 것이라 생각된다.

Claims (11)

  1. 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 유기용매에 용해하여 분산용액을 제조하는 단계;
    상기 용액을 기판 표면에 코팅함으로써 관능기를 갖는 폴리머 코팅층이 형성되는 단계; 및
    상기 코팅층에 단백질을 부착시키는 단계;
    를 포함하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 관능기는 이소시아네이트기, 설포닐 클로라이드기, 클로로카보닐기, 티올기, 포르밀기 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 용매는 클로로포름, 테트라클로로에틸렌, 카본테트라클로라이드, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 톨루엔 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이소시아네이트 기반 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 항원 또는 항체인 것을 특징으로 하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 형광물질이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 단백질 고정화 방법.
  6. 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 유기용매에 용해하여 분산용액을 제조하는 단계;
    상기 용액을 기판 표면에 코팅함으로써 관능기를 갖는 폴리머 코팅층이 형성되는 단계;
    상기 코팅층에 표적 단백질이 결합하는 단계;
    상기 단백질에 형광물질을 갖는 항체를 부착시키는 단계; 및
    형광신호를 분석하는 단계;
    를 포함하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 표적 단백질 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단백질은 항원인 것을 특징으로 하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 표적 단백질 검출 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단백질은 환경오염물질인 것을 특징으로 하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 표적 단백질 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 환경오염물질은 환경 에스트로겐(Estrogen), PCBs, 지오스민(Geosmin), DDT, 프로게스테론(Progesterone), 비스페놀A 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 관능기를 갖는 폴리머를 이용한 표적 단백질 검출 방법.
  10. 기판;
    상기 기판 위에 형성된, 아민그룹과 공유결합이 가능한 관능기를 갖는 폴리머를 포함하는 코팅층; 및
    상기 코팅층에 부착된 단백질;
    을 포함하는 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 관능기는 이소시아네이트기, 설포닐 클로라이드기, 클로로카보닐기, 티올기, 포르밀기 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
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