KR20150100342A - 섭식장애 진단을 위한 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 섭식 장애 진단을 위한 신규 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터의 특정 영역의 메칠화 패턴에 따른 특성을 이용하는, 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN) 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 섭식장애 진단을 위한 신규 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자 프로모터의 특정 영역의 메칠화 패턴에 따른 특성을 이용하는, 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN) 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.
섭식장애에 대한 빈도는 연구자와 대상 인구에 따라 다양하지만 점차 증가하고 있으며 특히 여성의 경우 자신의 섭식행동을 밝히지 않음으로 실제 빈도는 연구에서 나타난 것보다 훨씬 높다고 한다(Fogel & Woods, 1995; Williamson, Cubic, & Gleaves, 1993).
섭식장애는 젊은 여성들에게 가장 흔한 정신장애이며 만성적으로 지속되고 정동장애와 같은 다른 정신장애와 공병률이 높다. 또한 신체적으로 심각한 의학적 손상을 초래하며 빈번한 자살 시도가 나타나기도 한다는 점에서 매우 심각한 장애이다(Stice,2001a).
섭식장애 관련 변인으로는 생물학적 요소, 유전적 영향, 아동기 경험, 개인의 체중 경력과 가족 체중 경력, 정신병리의 가족 경력, 성과 사회 문화적 맥락, 여성 청소년 발달(신체적 성숙, 친밀한 관계의 발달, 자기감의 발달), 다이어트, 개인의 성격 특징들, 가족적 요인, 사회-문화적 요인, 대중매체의 역할 등 다양하고 광범위하다(김정내, 하정희, 2006).
그러나 아직까지 섭식장애에 대한 정확한 원인이 밝혀지지 않았으며, 섭식장애자들의 심리적인 문제를 잘 이해할 수 있는 명확한 결론이 없는 상태이다. 또한 많은 연구들이 일관성 있는 결과를 나타내고 있지 못한 실정이다(Friedman & Brownell, 1995).
우리나라의 경우, 섭식장애에 관한 연구 자료가 부족하여 많은 연구가 이루어지지 않았으나, 최근 외모를 중시하는 가치관의 확대로 인해 청소년 및 성인 여성의 섭식 병리는 날로 심각해지고 있다. 이러한 식습관은 심리 정서적 위협은 물론 신체적인 건강까지 위협하고 있으므로 이에 대한 대책 마련이 시급하다고 볼 수 있다(성미혜, 2005).
그 중에서도, 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN)은 사회적 기능 손상, 반복적이고 강박적인 행동, 그리고 높은 불안으로 나타나는 유전 환경성 질환이다. AN에 취약하게 만드는 원인으로는 유전자, 부정적 정서성(불안) 등의 발달 특성, 사회적 능력의 부재, 출산 전후나 소아 청소년기의 역경 등 환경적 요인, 그리고 유전과 환경의 상호작용 등이 있다. 단식은 뇌의 가소성을 감소시킬 확률이 높고, 이 기제는 질환을 지속시키는 원인이 될 수 있다. 단식의 2차적 영향은 사회적 정보 처리능력, 감정조절, 그리고 인지적 융통성을 더욱 더 손실시켜 질병을 지속시키는 원인이 된다고 설명하는 새로운 AN 유지 모델(maintenance model)도 있다(Schmidt and Treasure, 2006; Treasure and Schmidt, 2013).
그러므로, 이러한 섭식장애의 심리적 기제의 이해와 효율적인 섭식장애 진단 및 치료를 위해, 섭식장애와 관련된 정확한 진단 및 예측을 가능하게 하는 도구가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 섭식장애, 더욱 구체적으로는 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN)을 가진 환자의 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 특정 부위가 과메칠화되는 새로운 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
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본 발명은 섭식장애와 관련한 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 특정 부위 과메칠화 사실의 발견에 기초한 것으로
본 발명의 목적은 상기 유전자 프로모터의 특정 CpG 부위를 함유하는, 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마커용 조성물의 다양한 용도를 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 신규 기능 및 이의 이용을 제공한다.
본 발명은 일 구체예로, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역을 함유하는, 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물을 제공한다. 이 때, 상기 섭식장애는 신경성 식욕 부진증(anorexia nervosa, AN)인 것이 바람직하다.
상기 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역은 서열번호 3으로 표시되는 서열 중 +1 bp ~ +582 bp 부분을 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 부위를 포함한다. 효과적으로는 2이상의 부위를 조합하여 사용한다.
특히, 상기 CpG 1 부위를 포함시키는 것이 섭식장애 진단에 유용하다. 그러므로, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47 중에서, CpG 1을 포함하는 2이상의 부위를 사용하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 CpG 1 및 CpG 34 부위를 포함한다.
또한, 본 발명은 다른 구체예로서 상기 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물, 바람직하게는 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47 중에서, CpG 1을 포함하는 2이상의 부위를 함유하는 조성물을 포함하는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터의 특정 영역이 섭식장애를 가진 대상체에 있어서 과메칠화되어 있는 사실에 기초하는 바, 상기 조성물 및 키트를 이용하여, 즉 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47 중 1이상의 부위의 메칠화 수준을 측정함으로써 섭식장애 진단에 활용할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또 다른 구체예로서 다음의 단계를 포함하는, 섭식장애, 가장 바람직하게는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다:
환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 메칠화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 메칠화의 수준을 정상 대조군 시료의 메칠화 수준과 비교하는 단계.
사용할 수 있는 생물학적 시료는 옥시토신 수용체 단백질을 포함하고 있는 것이면 제한은 없으나, 바람직하게는 구강 세포를 사용하는 것이 진단에 효과적일 뿐만 아니라 사용이 편리하다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 메칠화 수준은 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중, +1 bp ~ +582 bp 부분, 더욱 바람직하게는 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 포함하는 부위에 대해 측정한다. 공지의 방법을 임의로 사용할 수 있으며, 예를 들면 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱을 이용하여 메칠화 수준을 측정할 수 있다.
이 때, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 메칠화 수준이 정상 대조군 시료에서의 메틸화 수준보다 높게 나타나는 경우에 섭식장애를 가지고 있다는 정보를 제공할 수 있다.
뿐만 아니라, 과메칠화 부위에 따라 조금씩 상이한 증상에 대한 정보도 제공할 수 있다. 예를 들어, (i) CpG 1에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI), 자폐증(특히, 의사소통력 결핍), 우울증 및 섭식장애 정신병리와 양성적인 관계를 가짐, (ii) CpG 34에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI), 섭식장애 정신병리 및 불안증과 양성적인 관계를 가짐, (iii) CpG 35에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI) 및 불안증와 양성적인 관계를 가짐; 및 (iv) CpG 47에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI)와 양성적인 관계를 가진다는 사항 중 1 이상의 정보 제공이 가능하다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체 예로서 다음 단계를 포함하는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 후보 물질의 존재하에, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 메칠화시키는 단계; 및
(b) 후보물질이 없이 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 메칠화시킨 경우에 비하여, 상기 부위들의 메칠화가 억제되는 경우의 후보물질을 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 치료용 물질로 선택하는 단계.
이 때에도 역시 상기 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자 프로모터 영역의 메칠화 부위는 CpG 1을 포함하는 2 이상의 조합으로 메칠화시키는 것이 바람직하다. 그 밖의 자세한 사항은 앞의 기재를 참고한다.
이처럼, 본 발명은 섭식장애, 바람직하게는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)와 관련한 옥시토신 수용체 유전자 프로모터 신규 용도, 구체적으로는 프로모터 특정 부위에서의 과메칠화 수준과의 연관성에 기초하는 모든 다양한 용도를 포함한다.
본 발명은 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 특정 부위 메칠화가 섭식장애와 깊은 관련이 있다는 새로운 기능을 제공함으로써, 섭식장애, 더욱 바람직하게는 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN) 환자의 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 평균 메칠화 수준에 대한 프로파일을 나타낸 것이다[위 그림: 엑손 1(검은색 박스) 및 MT2 영역( 화이트 박스), 아래 그래프: 대조군(검은 막대) 및 AN 환자군(회색 막대)].
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"섭식장애"란 자신의 신체상(image)에 대한 불만족으로 체중감소를 위해 음식을 거절하거나(신경성 식욕부진증;anorexia nervosa), 먹고 토하는 행동을 반복하는(신경성 폭식증;bulimia nervosa) 행동장애를 말한다(American Psychiatric Association, 1994). 본 발명의 일 실시예에서는 주로 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)을 다루었다.
"식이 행동(eating behavior)"은 생명을 유지하고 삶을 영위하는 데에 필수적인 생물학적 기능으로 음식과 관련된 태도와 느낌, 행동을 말한다.
"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 섭식장애 예후를 예측 또는 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 신경성 식욕 부진증(anorexia nervosa, AN) 예후 진단에 유용하다.
"진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 섭식장애 환자를 정상인과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 개체에 비하여 섭식장애를 가진 대상에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 섭식 장애 진단 마커는 옥시토신 수용체 유전자 프로모터로 섭식 장애 환자에서 과메칠화되어 그 발현이 감소한다.
'마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물 (예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터 (예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
"예후(Prognosis)"란 질병의 경과와 결과의 예측을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 섭식장애, 바람직하게는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)의 발병, 진행 등을 예측하는 것을 포함한다. 본 발명에서는 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 메칠화 특성 측정은 신경성 식욕부진증을 예측하는데 유용한 예후 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다. 본 발명에서 사용하는 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"후생학 또는 후성유전학(Epigenetics)"이란 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현의 양상이 변하여 자손에게 유전되는 것을 말한다. 주로 4가지 염기서열의 변화(소실, 치환, 증폭 등)에 의한 비정상적인 유전 정보가 축적되어 그 기능이 증폭 혹은 소실되어 질환 발생에 영향을 미친다는 개념의 연구가 주를 이루어 왔으나 이것만으로 질환의 발생이나 진행 과정을 설명하기는 부족하였다. 최근 들어 돌연변이 없이 유전자의 발현양상만을 조절하는 후생학이 질환 관련 연구의 새로운 분야로 발전해 나가고 있다. 후생적 변화는 DNA 메틸화(methylation), 히스톤 변환(histone modification)과 게놈 임프린팅(genomic imprinting) 등의 과정을 통해 일어난다.
"대상체"는 인간을 포함한 모든 포유동물을 포함할 수 있다. "대상체"는 또한 애완동물 (예를 들어, 개, 고양이, 말)뿐만 아니라 다른 동물들 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소)도 포함할 수 있다. 본 발명에서는 인간이 바람직하다.
"치료"는 임상적 결과를 포함한 유익하거나 바람직한 결과를 수득하기 위한 방법이다. 질환, 장애 또는 상태를 "치료하는" 또는 "완화하는"은 장애를 치료하지 않는 경우에 비해서 상태 또는 장애 또는 질병의 정도 또는 원치 않는 임상적 증상 또는 둘 다를 완화시키거나, 진행의 과정을 느리게 또는 연장시키는 것을 의미한다. 본 명세서에 기술된 방법의 목적에 따라서, 유용하거나 바람직한 임상적 결과에는 검출 가능한 것이든 아니든 간에 하나 또는 그 이상의 증상의 경감 또는 개선, 장애 정도의 감소, 장애의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 장애 진행의 지연 또는 둔화, 장애의 개선 또는 완화, 및 관해 (부분적 또는 완전)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 치료하는 것은 반드시 1회 용량의 투여에 의해서 일어나지는 않으며, 종종 일련의 용량을 투여한 후에 일어난다. 따라서, 치료학적 유효량, 완화시키기에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 상태를 치료하기에 충분한 양을 1 회 또는 그 이상 투여로 투여할 수 있다. 본 발명에서는 섭식장애, 바람직하게는 신경성 식욕 부진증(Anorexia Nervosa, AN)의 치료를 의미한다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는" 이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
진단 대상
본 발명이 진단 및 치료 대상으로 하는 섭식장애(eating disorder)는 최근에 주목받기 시작한 새로운 정신병리 현상으로서 진단적 특성의 결정이 명백히 이루어진 것은 1980년 DSM-Ⅲ에서 부터이며 1987년 DSM-Ⅲ-R을 거쳐, 1994년 DSM-Ⅳ에 이르고 있다.
이러한 섭식장애는 다양하며 일관성 없는 섭식행동이 핵심으로, 크게 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa)과 신경성 폭식증(bulimia nervosa)으로 나누어 볼 수 있다(이규은 외, 1998). 신경성 식욕부진증은 최소한의 정상체중 유지를 거부하는 것이 주요 특징이며 신경성 폭식증은 반복되는 폭식과 그에 따르는 부적절한 보상행동(자기 유발성 구토, 하제, 이뇨제, 기타 약물의 남용, 단식, 지나친 운동을 포함)을 특징으로 한다. 두 장애 모두 체형과 체중이 자기 평가에 지나친 영향을 미친다는 것이 공통점이다(American Psychiatric Association, 1994).
본 발명에서 진단 및 치료 대상으로 하는 질환은 섭식장애로서, 가장 바람직하게는 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN)이다.
신경성 식욕부진증(anorexia nervosa)에 대한 DSM-Ⅳ의 기준은 다음과 같다.
-연령과 신장에 비하여 체중의 최소한의 정상수준이나 그 이상으로 유지하기를 거부한다.
-저체중임에도 불구하고 체중 증가와 비만에 대한 극심한 두려움이 있다.
-체중과 체형을 왜곡하여 체험하고 체중과 체형이 자기평가에 지나친 영향을 미치며, 현재 나타내고 있는 체중 미달의 심각함을 부정한다.
-월경이 시작된 여성에서 무월경, 즉 적어도 3회 연속적으로 월경주기가 없다.
신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN)를 지닌 사람, 그 중에서도 특히 여성들은 체중 증가에 대한 공포를 지니고 있는데, 자기 몸매에 대한 걱정에 휩싸여 있으며 실제로는 매우 말랐음에도 불구하고 스스로를 뚱뚱하다고 인식한다. 신경성 식욕부진증의 중요한 측면은 신체상의 손상이다. 이들은 자신이 매우 야위었는데도 뚱뚱하다고 느낀다. 이들에게 있어서 빈곤한 자아상, 특히 신체에 대한 부정적 태도는 필수적이다. 이러한 인지적 왜곡은 실제적인 지각 왜곡을 수반하며 자신의 신체치수를 과대평가하는 경향이 있다(Williamson, Cubic, & Gleaves, 1993). 신경성 식욕부진증의 빈도는 최근 수십 년간 증가하는 추세이다,
청소년과 젊은 성인 여성에게서 신경성 식욕 부진증의 유병률은 대략 0.5~1%인 것으로 알려져 있고, 평균 발병 연령은 17세이며, 40세 이상의 여성에게는 거의 발생하지 않는다. 이 장애의 90% 이상이 여성에게서 발생한다는 점에서, 많은 학자들은 사회문화적 영향이 많기 때문으로 보고 있다. 신경성 식욕부진증의 장애가 심할 경우에는 환자의 체중을 회복하고 수분과 전해질의 불균형을 교정하기 위해 환자를 입원시켜야 하는 경우도 있고, 심한 경우에는 죽음에 이르게 되는 무서운 질병이다.
한편, 상기 신경성 식욕부진증 환자 중 일부는 의사소통력 결핍, 사회적 정보처리 능력 결핍, 신경 인지적 이상 등의 자폐적 증상을 보이기도 한다. 즉, 자폐증과 AN이 어느 정도 동반 발생한다.
즉, 신경성 식욕부진증 환자의 사회적 정보 처리능력과 감정 조절능력 결핍이 옥시토신 의존회로에 생긴 문제점에 의해 발생할 수 있고, 이 문제점은 자폐성이 높은 신경성 식욕부진증 환자들에게 더 크게 나타날 수 있다.
본 발명은 옥시토신 수용체(Oxytocin, OXTR) 유전자의 메칠화(methylation)와 상기 섭식장애와의 새로운 연관성의 발견에 기초한다.
본 발명자들은 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)을 가진 환자에서 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역에서 특정 CpG 부위가 과메칠화됨을 발견하였다. 즉, 섭식장애와 OXTR 유전자의 특정 메칠화 부위 및 관련성에 대해 최초로 규명하였다.
그러므로, 본 발명은 옥시토신 수용체 유전자의 특정 부위에서의 메칠화가 섭식장애, 예를 들어 "신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)" 과 깊은 관련이 있다는 사실에 기초하여, AN 등을 포함하는 섭식장애의 진단 및 치료에 이용될 수 있는 옥시토신 수용체 유전자 특정 부위의 신규한 마커 용도에 관한 것이다.
옥시토신 수용체의 신규기능
"옥시토신"은 강력한 자궁수축제로서, 임상적으로 분만 유도에 사용되며, 수유 개시와 유지를 강화하는 것으로 알려져 있다(Gimpl, G. et al., Physiol. Rev. 81 (2001) 629-683 및 Ruis H. et al., British Medical Journal 283 (1981) 340-342).
옥시토신은 사회적 정보처리, 불안, 스트레스, 식사 등 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN)과 연관된 많은 신경 회로에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 옥시토신 회로가 AN 환자들에게서는 비정상적으로 기능한다는 연구결과가 있고(Maguire et al., In press), AN의 단식 주기 동안에 옥시토신의 뇌척수액 농도가 감소하며(Chiodera et al., 1991; Demitrack et al., 1990; Lawson et al., 2011b) AN 환자들의 야간 혈청 옥시토신 농도 역시 일반인에 비해 낮게 나타난다는 보고가 있다(Lawson et al., 2011a). 또한, AN의 급성기에는 식후 옥시토신 분비가 증가하고 회복 후에는 감소한다는 보도 있다(Lawson et al., 2012b).
이러한 사실들은 AN 환자의 옥시토신이 비정상적인 특성을 보이고 비정상적으로 기능할 수 있음을 의미하고, 옥시토신 분비의 이상은 섭식장애 정신병리의 강도나 음식과 관련된 이미지에 대한 반응과도 연관성이 있을 수 있음을 시사한다.
본 발명은 이러한 옥시토신 및 섭식장애의 관련성에 기초하여, 옥시토신 수용체 유전자를 이용하는, 섭식장애를 보다 정확히 진단할 수 있는 마커에 관한 것이다. 즉, 옥시토신 수용체 유전자 프로모터의 새로운 기능에 관한 것이다.
"옥시토신 수용체(oxytosin receptor, OXTR)"는 옥시토신에 대한 특이적인 수용체를 총칭하는 용어로서, cDNA클로닝에 의하면 사람의 경우 389개의 아미노산으로 구성되며, 당사슬을 제외한 분자량은 42,819이다. 세포막을 7회 관통하는 7회 막관통형 수용체에 속하며 로돕신과 유사한 2차구조로 3개소의 당사슬수식부위(Asn-X-Thr/Ser)가 있다. 특히 바소프레신 수용체(V1a, V1b, V2)로 상동성이 크다.
본 발명의 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자는 모든 동물 유래, 바람직하게는 인간 유래의 옥시토신으로부터 수득할 수 있다. 상기 옥시토신은 야생형(wild type)의 옥시토신 단백질을 포함하여, 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 옥시토신 단백질의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 옥시토신 단백질 또는 옥시토신 폴리펩티드란 폴리펩티드 단편, 이의 화학적으로 변형된 유도체 뿐만 아니라 그것의 핵산 및 또는 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 옥시토신의 서열은 공지되어 있으므로 화학적 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963)하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 서열을 얻을 수 있다.
본 발명의 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자는 공지된 인간 유래 유전자가 코딩하는 단백질과 기능적 동등물인 경우를 모두 포함한다. '기능적 동등물'이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 원래 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 본 발명의 일 실시 예에서 사용한 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자는 서열번호 3으로 표시하였다.
본 발명은 일 관점에서 상기 옥시토신 수용체(oxytosin receptor, OXTR) 유전자 프로모터의 섭식장애 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다. 가장 바람직하게는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)의 경우의 예후 진단에 매우 유용하다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 AN 등의 섭식장애 예후 진단 마커는, 섭식장애의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 변화하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.
본 발명은 옥시토신 수용체 (oxytosin receptor, OXTR) 유전자 내, 특히, 첫번째 엑손 및 MT2 영역을 포함하고 있는 프로모터 영역을 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시 예에서는 서열번호 3의 서열 중 +1 bp ~ +582 bp의 OXTR 유전자 프로모터 영역을 이용하였고, 여기서 상기 +1 bp는 서열번호 3의 염기서열에서 1101번째의 염기이고, +582 bp은 서열번호 3의 염기서열에서 1682번째 염기이다.
바람직하게는 OXTR 유전자 프로모터 영역의 메틸화 수준, 더욱 바람직하게는 특정 CpG 부위인 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47 부위의 메칠화 수준 확인을 통해 섭식장애 예후를 예측하여 진단할 수 있다. 상기 메칠화 수준이 정상적인 경우보다 높게 나타나는 경우 섭식장애를 가지고 있다고 결정할 수 있는 것이다.
이 때, 본 발명에서 상기 특정 CpG 부위는 개별적으로, 또는 조합된 세트로 사용될 수 있다. 이는 전체적인 발현 패턴 또는 메칠화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시킬 수 있다. 바람직하게는 상기 부위들의 2이상의 조합, 가장 바람직하게는 5~6개의 조합으로 측정할 수 있다. 또는, 함께 메칠화된 부위의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, AN 등의 섭식장애로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다.
특히, 상기 CpG 1 부위를 포함시키는 것이 섭식장애 진단에 유용한다. 그러므로, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47 중에서, CpG 1을 포함하는 2이상의 부위를 사용하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 CpG 1 및 CpG 34 부위를 포함한다.
동일한 관점에서, 본 발명은 OXTR 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 섭식장애, 바람직하게는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 예후 진단용 조성물에 관한 것이다. 이 때, 상기 'OXTR 유전자 발현 수준 측정'이란, 메칠화, mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 것을 모두 포함한다. 바람직하게는 메칠화 수준을 측정한다. 더욱 바람직하게는 OXTR 유전자 프로모터의 +1 bp ~ +582 bp 영역, 가장 바람직하게는 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47 부위 중 1이상의 부위의 메칠화 수준을 측정한다.
DNA 메칠화(Methylation) 수준 측정
"DNA 메칠화(Methylation)"란 DNMT(DNA methyl transferase)에 의해 CpG의 5탄소 부위에 메칠기(CH3)가 결합된 것으로, 프로모터 CpG 섬에서 일어나는데, 이러한 DNA 메칠화는 세포 주기 또는 세포자살(apoptosis)을 조절하고, DNA를 복구하며, 세포 부착 및 세포간의 상호작용에 관여한다.
CpG 섬은 C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75% 이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop.,5:309, 1995). 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생성 변화가 자주 일어나는 부위이다.
특히, 본 발명의 OXTR 프로모터 CpG 섬이 메칠화되면, 이러한 메칠화는 코딩 서열의 돌연변이와 같은 방식으로 상기 유전자의 발현과 기능을 억제하게 되고, 이에 의하여 AN 섭식장애의 발달, 재발, 진행이 촉진되게 된다.
그러므로, 구체적인 일례로서, 상기 유전자의 프로모터 메칠화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 임상샘플로부터 샘플 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 OXTR 유전자 프로모터의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 프로모터의 메칠화 여부를 결정하는 단계.
사용할 수 있는 임상 샘플인 생물학적 시료는 옥시토신 수용체 단백질을 포함하고 있는 것이면 제한은 없으나, 바람직하게는 구강 세포와 혈액세포를 사용하는 것이 진단에 효과적일 뿐만 아니라 사용이 편리하다.
본 발명의 일 실시예에서는 임상 샘플로서 구강 점막 세포를 이용하였고, 첫번째 엑손 및 MT2 영역을 포함하고 있는 +1 bp ~ +582 bp 의 OXTR 유전자 프로모터 영역을 이용하였다. 특히, CpG 섬을 포함하는 단편으로서 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
DNA 메칠화 수준의 측정은 공지의 다양한 방법을 이용할 수 있다.
예를 들어, 상기 메칠화 측정방법은 PCR, 메칠화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메칠화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메칠화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에는 바이설파이트 시퀀싱을 이용하였다.
메칠화 특이 PCR (methylation specific PCR) 방법
게놈 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메칠화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아있고, 비메칠화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메칠화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메칠화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 파이로 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메칠화된 경우에는 메칠화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메칠화인 경우에는 비메칠화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메칠화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.
실시간 메칠화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)
실시간 메칠화 특이 PCR은 메칠화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 게놈 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메칠화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메칠화 특이 PCR은 메칠화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메칠화 정도를 정량 분석할 수 있다.
파이로시퀀싱
파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 게놈 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메칠화 정도를 메칠화 지수로 나타낼 수 있다.
메칠화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩
메칠화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메칠화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메칠화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메칠화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 게놈 DNA를 메칠화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메칠화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 프로모터 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메칠화 여부를 측정할 수 있다.
또한, 정량 PCR 방법으로도 메칠화 여부를 측정할 수 있으며, 메칠화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메칠화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메칠화 여부를 측정할 수 있다.
차별적 메틸화의 검출-바이설파이트 시퀀싱 방법
메칠화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메칠화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메칠화 및 비메칠화 핵산을 구별하여 메칠화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메칠화 및 비메칠화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다.
이처럼, 본 발명은 상기와 같은 방법 등을 이용하여 OXTR 유전자 프로모터의 DNA 메틸화 수준을 측정함으로써 과메틸화된 경우 섭식장애, 가장 바람직하게는 AN의 예후를 나타내는 것으로 진단하는 용도를 제공할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 메칠화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메칠화의 수준을 정상 대조군 시료의 메칠화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다. 특히, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역은 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 섭식장애 진단을 위한 정보로서, 다음과 같은 사항 중 1 이상을 포함하는, 메칠화 부위에 따른 섭식장애의 구체적 증상에 대한 정보를 이용할 수도 있다:
(i) CpG 1에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI), 자폐증, 우울증 및 섭식장애 정신병리와 양성적인 관계를 가짐,
(ii) CpG 34에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI), 섭식장애 정신병리 및 불안증과 양성적인 관계를 가짐,
(iii) CpG 35에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI) 및 불안증과 양성적인 관계를 가짐; 및
(iv) CpG 47에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI)와 양성적인 관계를 가짐.
본 발명의 구체적인 다른 양태에서는 섭식장애, 가장 바람직하게는 AN 진단용 키트 또는 AN 예후 진단용 키트에 관한 것이다.
즉, 앞서 설명한 섭식장애 진단용 조성물을 포함하는 섭식 장애, 예를 들어 AN 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 일 구체예로서, 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메칠화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
다른 유사한 관점에서, 본 발명의 구체적인 또 다른 양태에서는 섭식장애, 바람직하게는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 치료용 물질의 스크리닝 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 일 구체예로,
(a) 후보 물질의 존재하에, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 메칠화시키는 단계; 및
(b) 후보물질이 없이 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 메칠화시킨 경우에 비하여, 상기 부위들의 메칠화가 억제되는 경우의 후보물질을 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝한 섭식장애 치료용 물질을 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 섭식장애 치료방법을 포함한다. 바람직하게는 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN) 치료에 관한 것이다. 상기 조성물은 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 약학 조성물로 제형화 될 수 있다. 이는 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 투여방법, 표적 세포, 발현정도 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 메틸화와 관련하는 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다.
이처럼, 본 발명은 이처럼, 신경성 식욕부진증(Anorexia Nervosa, AN)을 포함하는 섭식 장애 환자에게서 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 메틸화 증가 및 발현 감소 프로파일 특성을 보여 주었고, 이러한 결과는 신경성 식욕부진증 진단 마커로서의 상기 유전자들의 용도를 활용하여, 섭식장애 진단 및 치료제를 개발 또는 스크리닝하기 위한 표적으로서, 본 발명에 의해 특성이 규명된 상기 특성을 이용할 수 있음을 시사한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
1. 참여자
실험군의 특징을 표 1에 기재하였다.
51 여성(15명의 AN 환자 및 36명의 건강한 대학생)을 모집하였다. AN 환자군은 서울 백병원의 섭식장애 클리닉 (Eating Disorders Clinic)으로부터 모집하였고 대조군은 여자대학교에서 광고를 통해 모집하였다.
AN의 진단은 정신장애 4판[First MB SR, Gibbon M, Williams JBW (2002) Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis I Disorders, Research Version (SCID-I). New York, NY: Biometrics Research: New York State Psychiatric Institute]의 진단적 및 통계적 매뉴얼으로부터 상담을 통해 이루어졌다.
환자들의 배제 기준은 다음과 같다: 활성물질 사용 장애(active substance use disorder), 정신 이상(psychotic disorder)(정신분열증, 조울증이 포함된 정신분열, 별도의 언급이 없는 한 정신 이상), 및 자폐증 또는 아스페르거 증후군의 진단.
대조군에 대한 주요 포함 기준은, 의학적 또는 정신적 질환의 이력이 없는 건강한 여성으로 최소 18세 이상으로 삼았다. 모든 대상들은 비흡연자, 이성애자, 비출산자였고 어떠한 약물도 복용하지 않았다(피임약 포함). 건강한 대조군은 그들의 생리 주기의 여포기(약 4~12일) 동안 테스트를 받았다. 환자들은 아무도 생리(menstruating)를 하지 않았다. 이 실험의 프로토콜에 대하여 서울 백병원의 기관 임상시험심사위원회의 승인을 받았다(IIT-2012-096). 모든 참여자들의 동의를 얻었다.
2. 섭식 장애 검사 자기 보고서 설문지 (Eating Disorder Examination self-report version Questionnaire, EDE-Q)
섭식장애검사 자기보고설문지 (Eating Disorder Examination Questionnaire, EDE-Q)(Fairburn and Beglin, 1994)를 이용하였다.
섭식장애 검사 설문지는 지난 28일간 섭식장애의 주된 행동적 특성을 평가한다. 설문지는 강제 선택 평가 척도의 문제당 7점씩 36문제로 구성되어 있다. 이 검사는 체중과 체형과 식사에 대한 걱정과 식습관 억제를 측정한다. 우리는 높은 내적 일관성과 좋은 2주 간격의 신뢰도를 보이는 EDE-Q 12판의 표준화된 한국어판을 사용했다(Heo et al., 2004a).
3. 자폐증 지수 검사 (Autism-Spectrum Quotient, AQ) (Baron-Cohen et al., 2001)
자폐증 지수검사는 50개의 문항으로 구성된 자기 기입식 설문지로 정상적인 지능을 가진 성인이 사회적 기술, 주의 전환하기(attention switching), 세부 사항에 대한 주의(attention to detail), 소통력, 그리고 상상력의 다섯 가지 부척도에 대한 자폐증 지수를 측정하는 검사이다.
4. 다른 측정수단
각 피험자의 우울과 불안은 각각 Beck Depression Inventory Depression(BDI; (Beck et al., 1961)와 Spielberger State 및 Trait Anxiety Inventory (STAI) (Spielberger et al., 1983)의 한국어판을 이용하여 측정되었다.
Beck Depression Inventory (BDI)는 우울증의 정도를 확인하는 하나의 지표로서, Beck의 표준 지시절차는 검사자가 응답자에게 각 문항의 진술문들을 읽어주고 그 중에서 자신을 가장 잘 나타내는 하나를 고르도록 해서 그것을 검사자가 기록하는 것으로 구성되어 있다.
Spielberger 등(1970)이 개발한 상태-특성불안 검사(State-Trait Anxiety Inventory: STAI)는 상태불안, 특성불안으로 나누어 분류하여 불안 정도를 측정하는 도구로서, 상태불안은 긴장감, 염려, 그리고 과도한 자율신경계 활동으로 특징 지워지는 일시적인 정서 상태이고, 특성불안은 불안을 경험하는 빈도에 있어서 비교적 안정적인 개인차가 있으며 상황을 위협적으로 지각하는 비교적 영속적인 성격적 경향성을 의미한다.
5. 통계학적 분석
AN 및 건강한 대조군(healthy control, HC) 사이의 임상적 및 인구통계학적 데이터를 paired t-tests를 이용하여 비교하였다. OXTR 유전자의 메칠화 상태 및 임상적 변수(BMI, 섭식장애 정신병리학, 및 다른 임상적 변수들) 사이의 관계를 평가하기 위한 피어슨 상관분석(Pearsons correlation analysis) 후, 선형 회귀분석을 각 CpG 부위에 대하여 수행하여 OXTR 유전자의 메칠화에 영향을 끼치는 요소들을 선별하였다.
P-values < 0.05일 때 유의미한 것으로 two-tailed tests를 이용하였다. 테스트가 중복 사용된 경우에는 Bonferroni 보정을 적용하였다. SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석을 수행하였다.
실시예 1: 메칠화 상태의 분석
PureLink Genomic kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 DNA Buccal Swabs (Isohelix, Kent, UK)로 수집한 구강 세포로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 말초혈액 단핵세포의 동종성 문제(homogeneity issue)를 피하기 위해 메칠레이션 분석용으로 구강세포를 사용하고 뇌 조직으로 그들의 공통적인 오리진의 장점을 취하였다.
정제된 게놈 DNA (200 ng)를 EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 프로토콜에 따라 바이설파이트(bisulfite)으로 처리하였다. 염색체의 GRCh37.p11 코디네이트(도 1)상에서 염색체의 8,810,652 ~ 8,811,310 핵산 위치에 상응하는 OXTR 유전자의(서열번호 3) 영역을, 바이설파이트-처리된DNA를 주형으로 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭시켰다.
PCR 프라이머들을 Methyl Primer Express software v1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고안하였다:
PCR primer 1: 5'- TAAATTTATTTGTTAAGGTTTTGGG- 3'(서열번호 1)
PCR primer 2: 5'- TTCCCAAACCCTAACATAAAC -3'(서열번호 2)
그리고, PCR을 하기와 같은 반응 조건 하에서 수행하였다: 1 사이클: 95C 하 15 min, 40 사이클: 95C 하 45 s, 55C 하 45 s, 이어서 72C 하1.5 min 및 최종 확장을 72C 하 10 min의 조건 하에서 수행하였다.
659-bp 길이의 PCR 산물을 1.5% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 수집하고 pDrive vector (Qiagen)로 클론화한 후 E. coli EC100 (Epicentre, Charlotte, NC, USA)내로 전기천공법에 의해 형질전환시켰다.
각 CpG 부위의 메칠레이션 상태를, 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems)를 이용하여, 각 E. coli 콜로니로부터 정제된 플라스미드 DNA의 핵산 서열화에 의해 측정하였다. 각 대상 당 최소 15 클론들을 서열화하고 이들의 핵산서열을 BISMA software로 정리하였다. 바이설파이트 전환율 > 95% 의 서열을 포함시키고, 동일 게놈 주형으로부터 클론적으로 증폭된 서열은 최종 정렬에서 배제시켰다. BISMA 디폴트값을 모든 다른 파라미터에 대해 적용하였다. 각각의 CpG 부위에서의 개인별 메칠레이션 수준은, 퀄러티 조절 필터링(n 10)을 거친 핵산 서열을 이용하여, 각 위치(locus)에서 분석된 CpG 부위의 전체 수로 메칠화된 CpG 부위의 수를 나눔으로써 결정하였다
이러한 값들을 AN 및 대조군에 대한 평균 메칠화 수준 계산에 이용하였다. 각 CpG 부위에서의 평균 메칠화 수준을 AN 및 대조군 사이에서 Student t-tests로 비교하였다. p값이 < 0.01이면 CpG 부위는 유의하게 상이한 수준으로 메칠화되었다고 간주하였고, AN 및 대조군 간 평균 메틸화 수준의 차이는 > 20%이었다. 메칠화 수준 > 65%인 CpG 부위는 높게 메칠화된 것으로 간주하였다.
SNP database (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)에 등록된 SNP와 오버랩되는 CpG 부위는 혼동인자로서 최종 통계적 분석으로부터 배제하였다.
실시예 2: 인구 통계적 특성
참가자들의 인구 통계적 특성은 표 2에 제시하였다.
AN 집단과 대조군의 나이와 지능 평균은 비슷했다. 반면에, 예상했던 대로 체질량 지수(BMI)(kg/m2)와 EDE-Q 점수에는 유의미한 차이가 있었다. AN 집단은 BDI, STAI, 그리고 AQ의 부척도 중 사회적 기술, 세부사항에 대한 주의, 그리고 소통력에서 더 높은 점수를 보였다. AN 집단과 HC 집단은 주의전환과 상상력 부척도에서는 차이를 보이지 않았다.
실시예 3 : AN 및 HC 그룹에서 OXTR 프로모터 영역에서의 상이한 메틸화
첫번째 엑손 및 MT2 영역을 포함하고 있는 +1 bp ~ +582 bp 의 OXTR 유전자 영역 내에서 CpG 부위의 메칠화 상태를 바이설파이트 시퀀싱을 이용하여 분석하였다(Fig.1).
AN 및 HC 그룹의 구강 세포에서 CpG 부위의 메칠화 패턴을 비교하였다. AN 및 HC 그룹에 대한 CpG 부위에서의 평균 메칠화 수준을 도 1에 도시하였다
HC 대조군에서 엑손 1(CpG 1 ~ CpG 39)에서의 모든 CpG 부위는 경미하게 상승된 메칠화된 CpG 35 (24.3%)를 나타내는 등 낮은 수준의 메칠화 (평균 메칠화 수준<30%)를 보였고, (24.3%), MT2 영역의 인트론 부분인 CpG 부위 45~48는 중간 정도의 메칠화 수준을 보였다 (30.1~50.0%).
AN 및 대조군 간 현저히 상이한 메칠화 패턴을 가지는 6개의 CpG 부위를 발견하였다(P < 0.01) (평균 메칠화 수준 > 20%). 특히, CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47는 AN 그룹에서 높게 메칠화 되었다(평균 메칠화 수준≥65%). HC 그룹에서 평균 메칠화 수준이 최소 25% 더 낮았다 (표 3).
추가적인 통계학적 분석을 위해 이러한 5개의 높게 메칠화된 CpG 부위를 이용하였다.
실시예 4 : OXTR 프로모터의 메칠화 수준 및 섭식장애 정신병리의 심각성 간의 관계
높게 메칠화된 5개의 CpG 부위 및 연령, BMI, EDE-Q, AQ, BDI, 및 STAI 을 포함한 임상적 특징 사이의 연관성을 알아보고자 하였다(표 4)
모든 환자들에 걸쳐, 모든 CpG 부위에서 개별적인 메칠화 수준은 음성적으로 BMI (all p-values < 0.05)와 관계성을 가졌다. EDE-Q 및 AQ (alpha = 0.05/6)로 다형 테스트함으로써 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 상관분석에 적용하였다.
식이제한 요소 및 전체 점수(global scores)는 CpG 1 (r = 0.499, p < 0.001 in the restraint subscale; r = 0.382, p = 0.006 in the global subscale)에서의 메칠화 수준과 양성적인 상관관계를 보였다.
자폐증 특징에 대한 대화 요소 및 전체 점수도 CpG 1 (r = 0.414, p = 0.003 in the communication subscale; r = 0.406, p = 0.004 in the total subscale)에서의 메칠화 수준과 양성적인 상관관계를 나타내었다.
우울증 요소에서 우울 상태도 CpG 1 (r = 0.425, p = 0.004) 및 CpG 35 (r = 0.514, p < 0.001)에서의 메칠화 수준과 양성적인 상관관계를 나타냈고, 불안 요소에서의 불안도 CpG 35 (r = 0.433, p < 0.001 for state anxiety; r = 0.428, p = 0.003 for trait anxiety)에서의 메칠화 수준과 양성적 상관관계를 보였다.
CpG 부위에서의 메칠화 수준 및 오직 AN 군 또는 HC군 에서의 임상적 가변요소 사이에서는 아무런 상관관계가 관찰되지 않았다.
독립 변수로서 연령, BMI, EDE-Q global, AQ total, BDI, 및 STAI를 이용하고, 종속 변수로서 CpG 부위 후보군을 이용하여 메칠화 수준으로 다중 회귀 분석을 수행함으로써 메칠화 수준에 대한 기여도를 확인하였다 (표 5).
이러한 요소들을 조절할 때, BMI 및 섭식장애 정신병리학은 CpG 1 에서의 메칠화 수준(ß = -0.756, p < 0.001 in BMI; ß = 0.436, p = 0.002 in EDE-Q global)의 주요 결정요인이었다.
CpG 34에서는, BMI, 섭식장애 정신병리 및 불안증이 에서의 메칠화 수준(ß = -0.845, p < 0.001 in BMI; ß = 0.368, p = 0.008 in EDE-Q global; ß = -0.803, p < 0.001 in anxiety)의 주요 결정요인이었다.
CpG 35 및 47에서는, BMI가 CpG 35에서의 메칠화 수준 (ß = -0.575, p = 0.001) 및 CpG 47 에서의 메칠화 수준 (ß = -0.469, p = 0.015)의 주요 결정 요인이었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Inje University
<120> The Use of a Promotor of Oxytocin Receptor Gene for Diagnosing
Eating Disorders
<130> PN1402-041
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcr primer 1
<400> 1
taaatttatt tgttaaggtt ttggg 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcr primer 2
<400> 2
ttcccaaacc ctaacataaa c 21
<210> 3
<211> 1800
<212> DNA
<213> OXTR gene promoter region sequence
<400> 3
ggtgttttac ctgctaggat tgaaccctca gattgcacag attatacagt ttcagaaaac 60
cagagggaca ggacctcaga cattagctat cttgaccagt gctctcattt tacatatgag 120
gagactgagg cccaaagaga aggggcttgc ccaaggtcac ttcattctca cctgagtcgt 180
ctgtaacttt aatctgtaat tttcgaggcc gataggtact attgactaat attgattaat 240
actgcctgcc accccttggc aatgctgtca agattcccag ccccattctg gaatgattac 300
tcagctagaa ccctgggatc caggtgctgt aaggttggcc cctgggatat ctcggcatgg 360
ggctgtaatt gtggattaag gaaacccagt ccttggctaa ctcaagtctc tccacataat 420
aaaaagacgg agaagtgaaa tgtcaggagg aaatacacat ttaatgcatt ttaaagagcc 480
ctgtttattt ttgaatcctg gccttttttt ctgacttaat tcttggccac tgtaaattac 540
ttcaaaaaat gattttagaa tagagaaggg gcagggaggc tgagaagctg tctttaacat 600
tttatcttcc tttggcatca tttagaattt taattccgaa gcgcgacaag gaggcagaaa 660
cggctcttgg gcgcagacaa gcagaatcac tttaaatgaa gacagtgttg tgcttcagaa 720
tttcctctaa aactaccgaa aaaataacgc ctctcccagc actgcttaga atagaggcca 780
tttctaattc ctcattaacg ggaataggaa caaaagtatt ccaaagcaaa gacttatttg 840
agttcactgc taaagccgct acatcaagct ggaggtgtgg ggggagagaa aagcctgaaa 900
attaacatca tttttgggaa ataatcagtt taaatgcttt tgtaacttca tcactatcta 960
cccggggaag aacattatta ttcaagcctc ctatgtgtct cggagtcaag agcttctaaa 1020
ccaagaaagg aagaaacggg cgggttattg acgagttccc tccctctcgc agttttaaac 1080
cactgcaaaa taaacccatt tgttaaggct ctgggaccaa cgctgggcga accagctccg 1140
ctccggaggg gtctgcgcgg ctggcctcgc ccgcccccta gcggacccgt gcgatagtgc 1200
agcctcagcc ccagcgcaca gcgccgcatc cagacgctgt ccgcgcgcgc agcctgggag 1260
gcgctcctcg ctcgcctcct gtacccatcc agcgaccagc caggctgcgg cgaggggatt 1320
ccaaccgagg ctccagtgag agacctcagc ttagcatcac attaggtgca gccggcaggc 1380
catcccaact cgggccggga gcgcacgcgt cactggggcc gtcagtcgcc gtgcaacttc 1440
cccgggggga gtcaacttta ggttcgcctg cggactcggt gcaggtagct gggtgctaag 1500
caggggtgga cgggatggct agggccggtg gagccatcgg gacccgagtg gaggtggtgg 1560
ggtgcctcgc actccttgtt cctggaggag ctcggggtgt tccgagagat tgtaaagtga 1620
cttctcggga ttgagactca gagtccttga ttatctgggt ccaaagcgca agtcaggggt 1680
tccagaactt tcgaggctgc cgggctgggg aggagccccg cgggaggtgt ctatgccagg 1740
gtctgggaac agcgcttggg catcttgggc tttgaggcag gggttccccc agcagggact 1800
1800
Claims (17)
- 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역을 함유하는, 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 섭식장애는 신경성 식용 부진증(anorexia nervosa, AN)인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역은 서열번호 3으로 표시되는 서열 중 +1 bp(서열번호 3의 염기서열에서 1101번째 염기) ~ +582 bp(서열번호 3의 염기서열에서 1682번째 염기) 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 섭식장애 예후 진단을 위한 마커용 조성물. - 제1항에 있어서,
옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물. - 제4항에 있어서,
옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 1 및 CpG 34 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역은 섭식장애를 가진 대상체에 있어서 과메칠화되어 있는 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 마커용 조성물. - 제3항 또는 제4항에 따른 조성물을 포함하는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 진단용 키트.
- 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 메칠화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 메칠화의 수준을 정상 대조군 시료의 메칠화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제8항에 있어서,
상기 섭식장애는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN)인 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제8항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 구강 세포인 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제8항에 있어서,
옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역은 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제8항에 있어서,
상기 메칠화 수준은 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제8항에 있어서,
상기 섭식장애 진단을 위한 정보는 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 메칠화 수준이 정상 대조군 시료에서의 메칠화 수준보다 높게 나타나는 경우 섭식 장애를 가지고 있다고 결정하는 것을 포함하는, 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제 12항에 있어서, 상기 섭식장애 진단을 위한 정보는 다음과 같은 사항 중 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법:
(i) CpG 1에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI), 자폐증, 우울증 및 섭식장애 정신병리와 양성적인 관계를 가짐,
(ii) CpG 34에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI), 섭식장애 정신병리 및 불안증과 양성적인 관계를 가짐,
(iii) CpG 35에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI) 및 불안증와 양성적인 관계를 가짐; 및
(iv) CpG 47에서의 과메칠화는 체질량 지수(BMI)와 양성적인 관계를 가짐. - 제14항에 있어서,
상기 자폐증은 의사소통력 결핍을 특징으로 하는 섭식장애 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 다음 단계를 포함하는 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 후보 물질의 존재 하에, 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 메칠화시키는 단계; 및
(b) 후보물질이 없이 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자의 프로모터 영역의 CpG 1, CpG 34, CpG 35, CpG 46, 및 CpG 47으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 부위를 메칠화시킨 경우에 비하여, 상기 부위들의 메칠화가 억제되는 경우의 후보물질을 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN) 치료용 물질로 선택하는 단계. - 제16항에 있어서,
상기 옥시토신 수용체(OXTR) 유전자 프로모터 영역의 메칠화 부위는 CpG 1을 포함하는 2 이상의 조합으로 메칠화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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