KR20150085456A

KR20150085456A - Ncapg2 유래 펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20150085456A
Application number: KR1020140089159A
Authority: KR
Inventors: 김경태; 이병일; 김재형
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2015-07-23
Also published as: KR101727435B1; KR20160056312A; KR20160116310A; KR101699664B1

Abstract

본 발명은 NCAPG2 단백질 또는 그로부터 유래한 펩티드의 용도에 관한 것으로서, 상기 단백질 또는 펩티드는 항암제를 포함하여 세포분열을 저해하는 약물에 이용될 수 있으며, 항암제의 스크리닝 방법에도 이용될 수 있다.

Description

NCAPG2 유래 펩티드 및 그의 용도 {Peptides derived from NCAPG2 and their use}

본 발명은 NCAPG2 단백질, 그로부터 유래한 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 NCAPG2는 미세소관의 동원체 결합에 관여하는 것으로 알려진 PLK1(polo-like kinase 1)의 기능과 관련되어 있으며, 세포분열에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명은 상기 NCAPG2 또는 이의 펩티드의 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 NCAPG2를 이용한 항암제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

체세포분열(mitosis)은 모든 세포의 구성성분이 두 개의 신규 세포로 분리되는 분열을 의미한다. 체세포분열이 시작되면, 염색체의 응축, 방추극체의 분리 및 양극으로의 이동, 중앙에서의 염색체 정렬, 그리고 최종적으로 모든 세포 성분들의 분리가 일어난다. 세포가 분열하기 시작할 때, 염색체는 효과적인 양-방향으로의 분리를 위해 특정 구조를 형성해야 하며, 이러한 체세포분열 특이적 염색체 구조는 주로 세 개의 다중 단백질 복합체, 두 개의 콘덴신(Condensin) 및 코헤신(Cohesin) 복합체에 좌우된다. 코헤신 복합체는 그 자매 염색분체와 함께 결합되어 있으며, 콘덴신 복합체는 염색체 내부를 두껍고 짧게 만드는 역할을 한다. 각 콘덴신 복합체는 두 개의 ATP효소(ATPase) 서브유닛 이형이합체(subunit heterodimer), 염색체 구조 유지 복합체(Structural Maintenance of Chromosomes, SMC 2 & SMC 4) 및 세 개의 비-SMC 조절 서브유닛(non-SMC regulatory subunits)으로 이루어져 있다. 이러한 세 조절 성분들의 고유 합이 각 콘덴신 복합체를 정의하게 되는데, 예를 들면 NCAP-D2, NCAP-G 및 NCAP-H은 콘덴신 복합체 I의, 그리고 NCAP-D3, NCAP-G2 및 NCAP-H2은 콘덴신 복합체 II의 구성요소이다. SMC 2 및 4 이형이합체는 그 ATP효소 활성을 이용하는 체세포분열 DNA 응축을 위한 가교체(crosslinker)이다. NCAP-H 및 NCAP-H2은 SMC 이형이합체와 기타 두 조절 서브유닛들을 연결하는 클레신(kleisin) 단백질이며, NCAPG, NCAPG2, NCAD2 및 NCAPD3은 가변적 골격에 해당하는 HEAT 반복 도메인을 포함하는 각 콘덴신 복합체에 대한 조절 서브유닛이다. 콘덴신 복합체 I은 휴지기(interphase) 동안 사이토졸(cytosol) 내에 위치하다 핵막 붕괴 직후 오로라 키나아제 B(aurora kinase B)에 의해 염색체 내로 함입(incorporation)되며, 세포질분열(cytokinesis) 과정까지 염색체 암(chromosome arm)에 머무른다. 반면, 콘덴신 복합체 II는 휴지기때조차 핵 내에 머무르면서 세포분열 동안 염색체 응축을 일으키며, 단백질 포스파타제 2A(protein phosphatase 2A, PP2A) 촉매 활성비의존적 기능에 의해 콘덴신 복합체 II의 염색체 내 함입이 이루어진다. 염색체 데카테네이션(decatenation), 크로마틴 재배치(chromatin remodeling), 복합체 I 응축을 포함하는 기타 여러 작용이 세포질분열 까지의 염색체 응축이 유지되도록 한다. 또한, 효모균종에 존재하는 콘덴신 복합체 I은 진핵세포 염색체 응축을 위한 고전적 콘덴신 복합체이다. 콘덴신 II는 염색체 경직(chromosome rigidity) 뿐 아니라, 염색체 분열(segregation), DNA 수선(DNA repair), 세포사멸(apoptosis), 자매 염색분체 분해(sister chromatid resolution), 유전자 발현 조절 및 히스톤 조절(histone modulation) 등의 다양한 세포 작용을 조절한다. 흥미롭게도, 모든 선충류 콘덴신 복합체 II 성분의 동형 접합성 변이체(homozygous mutants)는 비정상적 크기 또는 불균질한 핵 분포를 나타낸다. 인간 세포에서는, 콘덴신 복합체 II의 임의의 성분 결손이 염색체 정렬 또는 분열에서의 결함을 야기한다. 또한, NCAPD3는 주로 중심체(centrosome) 분열에 영향을 주며, NCAPG2 결손은 중기판(metaphase plate) 내 염색체 정렬 불량을 자주 발생시킨다. 염색체 분열 작용과 관련하여, 최근 보고에서는 NCAPD3가 PLK1의 염색체 암으로의 이동에 기여하는 것으로 공지하였다. 그러나, 염색체 분열과 관련된 기타 성분 작용에 대해서는 명백히 밝혀지지 않았다.

염색체 분열(chromosome segregation)은 보전된 유전 정보를 각각의 딸 세포로 전달하기 위한 가장 중요한 과정이라 할 수 있다. 염색체 분열의 첫 번째 단계는 미세소관(microtubule)의 동원체(kinetochore)로 알려진 염색체 상에 부착되는 것이다. 동원체는 자매 염색분체가 결합된 염색체의 중심절(centromere)에 대응되는 단백질 복합 조립체(protein complex assembly)이다. 미세소관-동원체 결합은 정확한 양방향으로의 상호작용을 위해 정교한 조절이 필요하다. 이러한 과정은 오로라 B 및/또는 PP2A 포스파타제 등의 키나아제(kinases) 및 포스파타제(phosphatases)에 의한 미세 인산화 구배를 통해 이러한 키나아제/포스파타제 기질 활성화의 적정 시간 및 위치화를 조절하여 이루어진다. 추가로, 이러한 상호작용의 안정화에 앞서 미세소관의 동원체 부착 과정의 초기 단계는 PLK1에 의해 좌우된다. 이에, PLK1의 작용이 염색체 분열 및 염색체 안정성(integrity)에 필수적인 것으로 제시된 바 있다. PLK1은 체세포분열 동안 미세소관 이동에 따라 염색체, 동원체 및 중앙체로부터 다양하게 위치하게 된다. PLK1은 중기판(metaphase plate)에서의 염색체 정렬이 완료될 때까지 전중기(prometaphase)로부터 중기(metaphase)에 이르도록 동원체에 위치한다. 각 동원체가 미세소관에 의해 제대로 부착되지 않은 경우에는, 후기(anaphase)가 시작되는 것을 대기시키기 위해 동원체에 위치하는 PLK1이 BubR1을 인산화시킨다. 이러한 PLK1의 동원체로의 위치화(localization)와 관련하여 동원체 내 일부 단백질들이 보고된 바 있으나, 미세소관 의존적 공간 재배열에 관여하는 기질에 대해서는 여전히 연구가 필요하다.

이에, 본 발명자는 체세포분열 차단 및 세포 사멸 유도를 통해 항암효과를 포함한 약리효과를 나타낼 수 있는 신규한 약물 타겟을 개발하고자 예의 연구한 결과, 콘덴신 복합체 II의 서브유닛 단밸질인 NCAPG2가, 체세포분열 동안 미세소관의 동원체 결합에 관여하는 것으로 알려진 PLK1(polo-like kinase 1)과 결합함으로써 PLK1의 동원체 내 위치화(localization) 및 기질 인산화 활성에 영향을 주는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 NCAPG2 단백질로부터 유래한 신규한 펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 NCAPG2 단백질 또는 그로부터 유래한 펩티드를 이용하거나 이를 타겟으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 또는 펩티드를 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NCAPG2 단백질은 사람의 NCAPG2 단백질일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 NCAPG2 단백질; 이로부터 유래하는 펩티드; 상기 NCAPG2 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단백질, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 억제시키는 억제인자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NCAPG2 유래 펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있으며, 상기 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제인자는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 펩티드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함하는 생체 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제인자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 서열일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 805번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열은 서열번호 9 (Forward primer : 5'-CAC TTC TGC AGA CGC CGG GTG GGA AG -3') 및 서열번호 10 (Reverse primer : 5'-CT TCC CAC CCG GCG TCT GCA GAA GTG -3')의 프라이머 서열일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제인자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질에서 1010번째 아미노산(Thr1010)의 인산화 저해제일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암 효과를 나타내는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 NCAPG2 단백질을 이용한 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 스크리닝 방법은, a) NCAPG2 단백질 또는 이로부터 유래하는 펩티드를 발현하는 세포 또는 동물을 준비하는 단계; b) 상기 단백질, 펩티드 또는 이를 코딩하는 염기서열에 특이적으로 작용하는 후보 물질을 상기 a) 단계의 세포 또는 동물에 처리하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 세포 또는 동물로부터 상기 NCAPG2 단백질 또는 이로부터 유래하는 펩티드와 PLK1 (polo-like kinase 1)의 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 펩티드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함하는 생체 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보 물질은, 예를 들어, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 항체, 앱타머(aptamers) 및 스피겔머(spiegelmers)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c) 단계의 결합을 측정하는 방법은 편광 형광법 및 면역침전법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 NCAPG2 또는 이로부터 유래한 신규한 펩티드는 세포분열을 저해하는 타겟으로 기능할 수 있다. 따라서 이를 이용한 NCAPG2 활성 저해제 등의 약물은 암세포의 세포주기 차단(cell cycle arrest) 및 세포 사망 유도를 통해 항암 효과를 나타낼 수 있다. 나아가 이를 이용한 항암제 스크리닝 방법은 효과적인 항암제의 개발에 이용될 수 있다.

도 1은 꼬마선충(C. elegans)에서 RNAi 공급(feeding) 방법을 통한 capg-2 녹다운(knockdown)이 염색체 분리(chromosomal segregation)에 미치는 영향을 확인한 결과로서,
a는 대조군(control) 및 capg-2 RNAi 공급(capg-2 siRNA 또는 RNAi) 꼬마선충에서 체세포분열을 분석한 현미경 영상(DIC)과 GFP::히스톤 H2B 염색을 통해 염색체를 가시화하여 분석한 영상이며,
b는 꼬마선충의 대조군 및 capg-2 RNAi 처리군에 방추사 극성 저해제인 노코다졸(nocodazole) 또는 탁솔(Taxol)을 처리한 후 배아세포 체세포분열을 확인한 영상이며,
c는 꼬마선충의 대조군 및 capg-2 RNAi 처리군을 대상으로 노코다졸을 처리한 후 배아세포 생존율을 정량분석한 결과 그래프이며,
d는 꼬마선충의 대조군 및 capg-2 RNAi 처리군을 대상으로 타임 랩스 이미지 분석(Time lapse images)을 수행한 결과 영상이며,
e는 꼬마선충의 대조군 및 capg-2 RNAi 처리군을 대상으로 염색체 정렬 및 미세소관 부착을 확인한 결과 영상이다.
도 2는 인간 세포의 염색체 분리를 위해 NCAPG2가 미세소관 동원체 결합에 미치는 영향을 분석한 결과로서,
a는 대조군(control) 및 NCAPG2 siRNA로 형질전이시킨(NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 항-CREST(CREST) 및 항-튜불린(tubulin) 항체를 이용한 염색을 통해 동원체 및 미세소관을 가시화한 분석 영상이며,
b는 중심체 FISH 신호 분석(centromere FISH signals) 및 DAPI 염색(staining) 분석을 수행한 결과 영상이며,
c는 대조군(control) 또는 NCAPG2 siRNA로 형질전이시킨(NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 염색체를 계수하여 분석한 그래프 결과이다.
도 3은 NCAPG2가 동원체 내 PLK1-BubR1 결합에 미치는 영향을 확인한 결과로서,
a는 대조군(control) 및 NCAPG2 siRNA로 형질전이시킨(NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 CREST(CREST) 및/또는 BubR1(BubR1) 면역염색을 수행하여 동원체 내 BubR1 위치화를 분석한 결과이며,
b는 대조군(control) 및 NCAPG2 siRNA로 형질전이시킨(NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 여러 시험 항체들로 면역 블럿 분석(immunoblotting)을 수행한 결과이며,
c는 대조군(control) 및 NCAPG2 siRNA로 형질전이시킨(NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 PLK1(plk1) 및/또는 BubR1(BubR1) 면역염색을 수행하여 위치 및 형광 강도를 분석한 영상 및 그래프 결과이다.
도 4는 세포주기가 진행되는 동안 NCAPG2의 위치를 CREST 및/또는 NCAPG2에 대한 면역염색을 통해 확인한 결과 영상이다.
도 5는 세포주기가 진행되는 동안 PLK1의 위치를 CREST 및/또는 PLK1에 대한 면역염색을 통해 확인한 결과 영상이다.
도 6은 NCAPG2가 PLK1의 동원체 내 위치화에 미치는 영향을 확인한 결과로서,
a는 NCAPG2 및/또는 CREST 면역염색 및 형광강도 분석을 통해 전중기(prometaphase) 세포에서의 NCAPG2의 염색체 위치화를 확인한 결과이며,
b는 NCAPG2 및/또는 CREST 면역염색 및 형광강도 분석을 통해 전중기(prometaphase) 세포에서의 NCAPG2의 PLK1과의 동원체 내 공-위치화(co-localization)를 조사한 결과이며,
c는 대조군(control) 및 NCAPG2 siRNA로 발현 제어를 유도하였을 때 (NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 PLK1 및/또는 CREST 면역염색을 수행하여 PLK1의 동원체 내 위치화를 분석한 결과이며,
d는 대조군(control) 및 NCAPG2 siRNA로 NCAPG2의 발현을 억제시켰을 때(NCAPG2 siRNA) 인간세포를 대상으로 PLK1의 CREST와의 공위치화 계수(colocalization coefficient)를 산출한 결과이며,
e는 대조군(control) 및 capg-2 RNAi 공급(capg-2 siRNA) 꼬마선충을 대상으로 PLK1-GFP 융합 단백질 발현 분석을 통해 PLK1의 위치를 확인한 결과이며,
f는 대조군(control) 및 capg-2 RNAi 공급(capg-2 siRNA) 꼬마선충을 대상으로 PLK1-GFP 융합 단백질 발현 분석을 통해 형광 강도를 정량화한 결과이다.
도 7은 NCAPG2가 PLK1과 직접적으로 결합하는지를 확인한 결과로서,
a는 GST-PLK1과 Flag-NCAPG2을 발현시켜 각 비드(bead)를 이용한 풀다운 분석(pull down) 후 면역블럿을 수행한 결과이며,
b는 Flag-NCAPG2 발현세포에 대한 면역침전분석을 통해 내생(endogenous) PLK1의 NCAPG2와의 결합을 확인한 결과이며,
c는 면역침전분석을 위해 제작된 PLK1 삭제 변이체들의 서열에 대한 도식도이며,
d는 상기 각 변이체들로 발현된 세포들을 대상으로 면역침전분석을 통해 내생(endogenous) PLK1의 NCAPG2와의 결합을 확인한 결과이다.
도 8은 NCAPG2의 1010T 및 805T가 PLK1의 PBD 도메인과의 결합에 중요함을 확인한 결과로서,
a는 각 NCAPG2의 삭제 변이체(NCAPG2(1-543), NCAPG2(1-713) 및 NCAPG2(1-1143))를 발현시킨 세포들을 대상으로 면역침전분석을 통해 PLK1과의 결합을 확인한 결과이며,
b는 포유동물로부터 꼬마선충(C.elegans) 속의 NCAPG2 대응 서열들을 대상으로 C-말단 영역에서 PLK1의 PBD와 결합가능한 모티프(motif) 서열을 확인한 결과이며,
c는 1010T가 비인산화된 합성 7-mer 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLSTLI¹⁰¹² : 서열번호 8)(1010T)와 인산화된 합성 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLS-pT-LI¹⁰¹²)(1010pT)를 대상으로 형광 편광 인비트로 결합 분석(fluorescence polarization in vitro binding assay)을 수행하여 PLK1의 PBD와의 결합을 확인한 결과이며,
d는 Flag 표지된 NCAPG2 또는 NCAPG2의 1010번째 트레오닌(T)를 알라닌(A)으로 치환시킨 변이체 NCAPG2(T1010A)를 발현시킨 세포들을 대상으로 면역분석을 통해 PLK1과의 결합을 확인한 결과이다.
e는 1010번째 트레오닌(T)이 인산화된 NCAPG2의 생체 내 위치를 나타낸다. NCAPG2 pT1010 항체는 VLSpTL-함유 펩티드를 항원으로 사용하여 토끼에서 제작하였다. 인산화된 T1010-NCAPG2를 웨스턴 블랏팅과 공초점 현미경으로 관찰하였다.
f는 Flag 표지된 NCAPG2 또는 NCAPG2의 805번째 트레오닌(T)를 알라닌(A)으로 치환시킨 변이체 NCAPG2(T805A)로 이들을 발현시킨 세포들에서 면역침전 분석을 통해 PLK1과의 결합을 확인한 결과이다.
도 9는 5-mer 인산화펩티드(phosphopeptide) VLS-pT-L과 PLK1의 복합체 내 펩티드 결정 구조를 해상도 1.8 에서 확인한 결과로서,
a는 결합된 펩티드 결정의 전체 구조를, b는 결합된 펩티드 결정의 입체구조(stereo view)를, c는 상기 펩티드 외 다른 유사 펩타이들과의 비교분석을 위해 겹침구조(superimposed view)를, d는 펩티드의 1010T의 결합모드를 나타낸 각각의 구조 모식도이다.
도 10은 NCAPG2의 T1010이 PLK1의 동원체 내 위치화에 미치는 영향을 확인한 결과로서,
a는 NCAPG2 siRNA로 형질전이시킨(NCAPG2 siRNA) 후 렌티-바이러스 siRNA 내성 백본(backbone)의 NCAPG2 야생형(wild type)((NCAPG2^R ^- ^Wt) 또는 T1010A 변이체(NCAPG2^R-T1010A) 서열을 결합시켜 제작한 발현 벡터를 발현시킨 세포를 대상으로 재합성 분석을 통해 PLK1의 동원체 내 위치화를 확인한 결과이며,
b는 상기 결과의 형광 강도를 정량화한 그래프이다.
도 11은 암 세포주 및 조직에서 NCAPG2의 발현을 확인한 결과와 함께 Expression Atlas data base를 이용하여 NCAPG2의 발현과 PLK1의 발현 양상을 살펴보고 상관성이 있는 암종의 발현양상을 도표화한 것으로서,
a는 정상세포나 immortalize된 세포에 비해 유방암 세포주에서 NCAPG2의 발현을 확인한 결과이고,
b 및 d는 유방암 환자의 조직 또는 세포주에서, e는 사람 대장암 조직, 방광암 조직 및 세포주에서 NCAPG2의 발현을 확인한 결과이며,
c는 Expression Atlas data base에서도 다양한 암종에서 NCAPG2와 PLK1의 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 12는 HuR-7 사람 간암 세포에 NCAPG2의 1010번째 트레오닌(T)을 포함하는 펩티드(NG2 The1010: VLSTL)와 인산화된 1010번째 트레오닌(T)을 포함하는 펩티드(NG2 The1010: VLSpTL)를 처리할 경우 암 세포의 생존율을 감소시키고 체세포분열 이상을 초래한다는 것을 보여주는 결과이다. 세포 생존 및 핵 모양은 Opera Phenix system(PerkinElmer)로 관찰하였다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명자들은 후생동물(metazoan)인 꼬마선충(C. elegans)을 이용하여 체세포분열(mitosis)에서의 NCAPG2의 기능을 확인하였다. 박테리아 공급 RNAi 방법(bacteria feeding RNAi method)을 이용한 capg-2(꼬마선충의 NCAPG2 상동 단백질) 발현 억제(knockdown)를 유도한 germ cells(배세포) 및 배아세포(embryos) 둘 모두에서 염색체 분리 결함이 발생됨을 확인하였다. 또한, 단독으로는 체세포분열에 영향을 미치지 못하는 탁솔(Taxol) 또는 노코다졸(nocodazole) 등의 미세소관 저해제(microtuble inhibitors) 함유 액상 배지에 배양시킨 성충(adult worms)을 대상으로 capg-2 RNAi 공급의 영향을 확인한 결과, 상기 배아의 체세포분열이 capg-2 RNAi 단독처리된 것들과 비교하여 더 현저한 결함을 야기하는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 capg-2 RNAi 공급을 통한 capg-2 발현저해는 회수된 성충으로부터의 자손(progeny) 생존율(survival ratio)을 저하시키고 중기판(metaphase plate)에서의 염색체 정렬(chromosome alignment)을 불완전하게 만드며, 방추사의 염색체로의 부착을 약하게 만드는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해 꼬마선충의 배아세포에서 capg-2가 방추사의 염색체 부착과 연관되어 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, NCAPG2-특이적 siRNA로 형질전이된 인간세포에 Eg5 방추사 운동 단백질(spindle motor protein)을 저해하여 방추사 양극성을 차단하는 것으로 알려진 키네신 저해제(kinesin inhibitor)인 모나스트롤(monastrol)을 함께 처리한 결과, 미세소관-염색체 결합이 저해됨을 확인하였다. 꼬마 선충에서와 같이 미세소관 저해제(microtuble inhibitors) 처리를 NCAPG2 발현 억제와 동시에 하게 되면 염색체 분리의 결함을 야기하여 염색체가 다중화되고, 이러한 다중화로 염색체 수가 150 이상인 세포 분포(cell population)가 NCAPG2 발현 고갈에 의해 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 결과들로부터 NCAPG2가 원생동물 및 인간 둘 다에서 미세소관 동원체 결합에 관여하며 염색체 분리에서 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 동원체 내 미세소관 염색체 부착을 조절하는 조절 단백질 중 하나인 BubR1의 활성화를 조사한 결과, NCAPG2 발현이 차단되는 경우, 동원체 내 아령-형상의 BubR1의 위치화는 저해되거나 약해지거나 소실되었고, 동원체 내 BubR1의 정상적 위치화 뿐 아니라 동원체 내 PLK1의 위치화도 현저히 감소하며, PLK1에 의한 BubR1의 Ser676에서의 인산화도 감소하는 것을 확인하였다. 이로써 NCAPG2가 BubR1의 위치화 및 인산화를 위한 PLK1의 위치화에 관여하는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, NCAPG2 siRNA-처리를 통한 NCAPG2의 발현 저해는 인간세포 및 꼬마선충 모델 모두에서 PLK1의 동원체 내 위치화를 약화시켰으며, 이로써 NCAPG2가 PLK1의 동원체 내 위치화의 중대한 견인체(critical tractor)로 작용하며 미세소관 동원체 결합에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 이러한 NCAPG2의 PLK1의 동원체 내 위치화 유도는 직접적 결합(direct binding)에 의해 이루어지는 것을 확인하였으며, PLK1와 NCAPG2 결합 부위를 조사한 결과, PLK1의 폴로 박스 도메인(Polo box domain, PBD)과 NCAPG2의 C-말단 영역(714-1143 잔기(residues))이 결합함을 확인하였다. 또한, PLK1의 PBD는 체세포분열에서의 정상적인 작용을 위해 인산화된 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine) 잔기가 뒤에 오는 엄격하게 보존된 세린 잔기(S-pS/T 모티프(motif))와 결합하는 경향이 있음이 공지되어 있으므로, NCAPG2의 C 말단 영역 내 S-pS/T 모티프를 조사한 결과, NCAPG2의 Thr1010 부위가 포유동물로부터 꼬마선충(C.elegans) 속에 이르기까지 엄격히 보존되어 있음을 확인하였다(도 8b). 또한, Thr1010을 알라닌(alanine)으로 치환한 결과 PLK1과의 결합이 현저히 감소하며, 비인산화된 7-mer 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLSTLI¹⁰¹² : 서열번호 8)와는 대조적으로 인산화된 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLS-pT-LI¹⁰¹²)는 69.91±15.95 nM의 Kd 값으로 PLK1의 PBD와 강하게 결합하는 것을 확인함에 따라 NCAPG2의 1010T 위치가 PLK1과의 결합에 중요함을 알게 되었다.

본 발명의 일실시예에 따르면, NCAPG2 siRNA 로 NCAPG2의 발현을 누락시킨 후, 렌티-바이러스 siRNA 내성의 NCAPG2 야생형(wild type)((NCAPG2^R ^- ^Wt) 또는 T1010A 변이체(NCAPG2^R-T1010A) 발현 벡터 도입하여 재구성시킨 결과, 야생형 NCAPG2가 재합성되면 동원체 내 PLK1의 위치화가 다시 회복되는 반면, T1010A 변이체의 경우에는 동원체 내 PLK1을 회복시킬 수 없는 것을 확인하였다. 또한, 웨스턴 블럿 분석에서 노코다졸 처리 후 약해진 BubR1의 인산화된 쉬프트 밴드(shift band)가 야생형 NCAPG2의 재합성으로 회복된 반면, T1010A 변이체에 의해서는 회복되지 않는 것을 확인하였다. 이로써 NCAPG2의 T1010이 PLK1과의 결합을 통한 PLK1의 위치화 및 기질 인산화 등의 활성에도 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

위와 같이 NCAPG2는 세포분열과 관련된 PLK1의 기능에 중요한 역할을 하므로 세포분열과 관련된 질병의 치료제 또는 그 타겟으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 과량의 NCAPG2를 투여하여 인위적으로 PLK1과 결합시킬 경우 PLK1이 더 이상 체세포분열 과정에서 기능하지 못하게 됨에 따라 암 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하였다(도 12).

따라서 본 발명의 NCAPG2 단백질; 이로부터 유래하는 펩티드; 상기 NCAPG2 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 항암제를 포함하는 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NCAPG2 유래 펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있으며, 상기 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 NCAPG2 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제한되지 않으며, 상기 단백질 또는 펩티드를 발현할 수 있는 어떠한 서열을 갖는 것도 포함될 수 있다.

또한, 정상적인 상태에서 NCAPG2는 PLK1에 결합하여 PLK1이 정상적인 체세포분열 과정을 진행시킬 수 있도록 하는 역할을 하므로, 상기 NCAPG2 단백질; 이로부터 유래하는 펩티드; 상기 NCAPG2 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 억제시키는 억제인자 역시 항암제를 포함하는 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제인자는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 펩티드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함하는 생체 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 기술상식으로부터 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제인자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 서열일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 805번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열은 서열번호 9 (Forward primer : 5'-CAC TTC TGC AGA CGC CGG GTG GGA AG -3') 및 서열번호 10 (Reverse primer : 5'-CT TCC CAC CCG GCG TCT GCA GAA GTG -3')의 프라이머 서열일 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 인산화된 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLS-pT-LI¹⁰¹²)는 PLK1의 PBD와 강하게 결합하지만, 비인산화된 7-mer 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLSTLI¹⁰¹² : 서열번호 8)는 대조적으로 결합이 저해되었고(도 8c), 상기 NCAPG2 단백질의 1010번째 아미노산(Thr1010)의 인산화는 NCAPG2 및 PLK1의 기능에 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었으므로(도 8e), 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 억제인자는 NCAPG2 단백질의 1010번째 아미노산(Thr1010)의 인산화 저해제일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 인산화 저해제는 NCAPG2가 PLK1의 PBD와 결합하는 것을 저해할 수 있다. 따라서 발암 관련 단백질인 PLK1의 활성을 억제함으로써 항암 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인산화 저해제는 NCAPG2 단백질에서 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 부위 지정 돌연변이 유발 서열은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 서열일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있으며, 예를 들면 근육내, 정맥내, 복강내 또는 피하 주사를 위한 멸균 주사용액 형태 등을 포함하는 다양한 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 그 투여 형태에 따라 약학적 조성물의 제형화에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면 본 발명의 치료용 조성물이 주사제의 형태로 제조되는 경우에는 담체의 예로 물, 식염수, 포도당 수용액, 유사 당수용액, 알코올, 글리콜, 에테르(예: 폴리에틸렌글리콜 200), 오일, 지방산, 지방산에스테르, 글리세라이드, 계면활성제, 현탁제, 유화제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 단독으로 또는 미세소관 저해제(microtubule inhibitors)인 탁솔(Taxol) 또는 노코다졸(nocodazole), 및 키네신 저해제(kinesin inhibitor)인 모나스트롤 등의 다른 활성 약물과 결합하거나 적당한 조합의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 인산화 저해제를 포함하는 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 형태의 비경구적 투여 방법을 통해 1일 1회 또는 수회로 분배되어 투여될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 투여량 또는 방법은 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여기간에 따라 적절히 조절 또는 선택하여 수행될 수 있다. 또한, 일부 경우에 있어서, 상기 언급된 범위 보다 적은 투여량 수치가 보다 적합할 수 있고, 해로운 부작용을 일으키지 않으면서도 보다 많은 투여량이 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 NCAPG2 단백질 또는 그 펩티드는 PLK1과의 결합을 통하여 항암 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명은 신규한 항암 물질의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다.

a) NCAPG2 단백질 또는 이로부터 유래하는 펩티드를 발현하는 세포 또는 동물을 준비하는 단계;

b) 상기 단백질, 펩티드 또는 이를 코딩하는 염기서열에 특이적으로 작용하는 후보 물질을 상기 a) 단계의 세포 또는 동물에 처리하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계의 세포 또는 동물로부터 상기 NCAPG2 단백질 또는 이로부터 유래하는 펩티드와 PLK1(polo-like kinase 1)의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NCAPG2 단백질 또는 그 펩티드를 발현하는 세포는 상기 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 이 경우 상기 펩티드가 세포 내에서 일시적, 또는 영구적으로 발현될 수 있도록 발현벡터를 세포 내로 주입 또는 감염(infection)시킬 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 구성될 수 있다. 상기 발현벡터는 포유류 세포 또는 그 밖의 표적 세포 유형의 복제 및 발현에 이용되는, 당해 분야에 공지된 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 후보 물질은 상기 펩티드의 발현을 저해하거나 활성을 저해할 수 있는 물질이라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 예를 들어, 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 펩티드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함하는 생체 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 후보 물질은 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 항체, 앱타머(aptamers) 및 스피겔머(spiegelmers)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 c) 단계에서 펩티드와 PLK1의 결합을 측정함으로써, 발암 단백질로 알려진 PLK1의 활성 여부를 확인할 수 있다. 즉, 상기 후보 물질을 처리하여 펩티드와 PLK1의 결합을 저해시키게 되면, 그 후보 물질은 항암제로서 사용될 수 있음을 자명한 것이다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c) 단계의 결합을 측정하는 방법은 통상의 단백질 발현 분석 방법, 예를 들면 RT-PCR, qRT-PCR, 웨스턴 블럿, 형광 표지 등의 방법을 사용할 수 있으며, PLK1과의 결합 여부는 인비트로 풀다운 분석(pull down), 면역침전법(immunoprecipitation) 등의 통상의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 꼬마선충 균주 및 RNA 간섭

꼬마선충(C. elegans)은 표준 배양 방법(Brenner, S. Genetics 77, 71-94 (1974))으로 NGM 플레이트 상에 20℃에서 배양하였다. capg-2 RNAi 클론은 Dr. J. Ahringer의 박테리아-공급(bacteria-feeding) RNAi 라이브러리(library)로부터 입수된 것으로 J. Lee 박사(서울대학교)에 의해 제공되었다. 야생형(wild type) N2 선충 균주는 capg-2 RNAi를 노코다졸(Nocodazole)과 처리하였을 때 배아 치사율(embryo lethality)을 측정하는데 사용하였다. RW10006(HIS-72::GFP), XA3501(GFP::HIS-11 및 GFP::TBB-2), JG479(NPP-1::GFP, mCherry::HIS-58 및 GFP::TBB-2) 및 SA127(GFP::PLK-1)은 capg-2 발현억제가 체세포분열에 미치는 효과를 확인하는데 사용하였다. JG479는 XA3501과 OCF3(NPP-1::GFP 및 mCherry::HIS-58)을 교배(crossing)시켜 만들었다. HIS-72는 히스톤(histone) 3이며, TBB-2는 β-튜불린(tubulin)이다. HIS-11과 HIS-58은 모두 히스톤 2B이다 (www.wormbase.org). capg-2 RNA 간섭을 위해, L4 선충(worms)을 상기 RNAi 플레이트에 옮겨 F1 배아(embryos)를 관찰하였다. 빈 RNAi 벡터(L4440)를 포함하는 HT115 E. coli 균주를 대조군으로 사용하였다. capg-2 RNAi를 단독으로 또는 미세소관 저해제와 함께 처리하였을 때의 배아의 생존비를 비교하기 위해, 선충들(L4 worms)을 capg-2 RNAi 투여 후 또는 대조군 플레이트 상에 12시간 동안 배양한 후 미세소관 저해제를 함유하거나 함유하지 않은 액상 내에서 12시간 동안 배양시켰다. 다음으로, 선충들을 NGM 접시 상에서 회수하여 3개의 성충들을 NGM 접시로 옮겼다. 12시간 동안 산란 후 선충들을 제거하였으며 다음날 사멸 배아들을 계수하였다. 이때, 각 경우마다 3개 플레이트로 시험하였으며, 모든 시험은 3배수로 반복하여 동일한 경향을 확인하였다. 96웰 플레이트를 이용한 액상 배양은 E. coli (OP50)와 콜레스테롤을 포함하였으며, 배양 부피는 100 μl 이었다. 각각의 경우 사용된 미세소관 저해제는 20 μg/ml이고, 대조군은 1% DMSO이다. 꼬마 선충 배아의 이미지는 Imager A2 compound microscope (Carl Zeiss) 또는 LSM700 confocal microscope (Carl Zeiss) 를 사용하여 관찰하였다.

실시예 2. 실험 조건

ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 MDA-MB-231 및 HEK293 세포들을 10% 우태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Media) 배지(Invitrogen, Carlsbad, USA)에서 5% CO₂ 대기 및 37℃ 조건으로 배양하였다. NCAPG2에 대한 siRNA는 5’-GCU UCA UAG GGU CAU UUA UTT-3’(서열번호 1) 및 5’-GAA GAA UGA UGC UGA AAC ATT-3’(서열번호 2)를 사용하여 합성하였다(ST Pharm. Co. LTD, Gyeonggi do, Korea). siRNA 또는 발현 벡터는 Amaxa Nucleofector system(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)을 사용하여 제조사 설명에 따라 세포 내로 도입하였다. 세포를 특정 주기(phase)로 동기화(synchronising)시키기 위해, 50 ng/ml 노코다졸(Nocodazole, Sigma-Aldrich) 또는 100 μM 모나스톨(Monastrol, Sigma-Aldrich)이 사용되었다.

실시예 3. 면역형광 및 생세포 타임 랩스 이미징

세포를 커버유리(coverlips)상에서 성장시켜, PHEM 버퍼(60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA 및 2 mM MgCl₂, pH6.9 with KOH)로 두 번 헹구고, PHEM 버퍼에 녹인 0.5% 트리톤 X-100(TritonX-100)로 4℃에서 1분간 침투(permeabilized)시켰으며, PHEM 버퍼에 녹인 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 4℃에서 20분간 고정시켰다. 상기 고정된 세포들을 항체 블로킹 용액(0.1 M PIPES, 1 mM MgSO₄, 1 mM EGTA, 1.83% L-lysine, 1% BSA 및 0.1% NaN₃, pH7.2 with KOH)으로 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 1차 항체를 이용하여 밤새 반응시킨 후 100 ng/ml DAPI가 결합된 2차 항체를 3시간 동안 반응시켰다. 상기 시료 상에 안티페이드 시약(prolong gold anti fade reagent; Invitrogen, Carlsbad, USA)을 올린 후 공초점 현미경(Confocal Microscope, Zeiss 510 Meta, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 이미지 분석을 수행하였다. 생세포(live cell) 이미징은 매 15초 마다 72시간 동안 수행되었으며, 0.5초 노출(exposures)은 LSM500 META Confocal Microscope(Carl Zeiss) 상의 2 x NA0.75 objective를 이용하였다.

실시예 4. 염색체 계수

노코다졸(50 ng/ml) 전처리를 수행하거나 수행하지 않은 세포들을 대상으로 콜세미드(Colcemid, 0.1 /ml)를 처리하여 4시간 후 회수하였다. 회수된 세포들을 고장액(hypertonic solution, 0.075 M KCl)으로 배양시키고 고정하였다(메탄올/아세트산, 3:1). 팽창된 세포들을 유리 슬라이드 상에 펼쳤으며, 상기 슬라이드를 대상으로 실온 건조, DAPI(100 ng/ml) 염색, 그리고 공초점 현미경 하의 시각화를 수행하였다.

실시예 5. 벡터 및 부위 지정 돌연변이 제작

NCAPG2 발현 벡터는 각각 Kpn1/Xho1, EcoRV/Xho1, 및 Sma1/Xho1 제한효소 부위를 갖는 pcDNA3.1, pCMV-3 Flag-1, 및 pLL3.7 벡터를 이용하여 제작하였다. siRNA-내성(resistant) NCAPG2 돌연변이체(Lenti-NCAPG2^R)를 제조하기 위해, 부위-지정 돌연변이생성 키트(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 돌연변이체들을 만들었다(forward primer: 5’ GAA GAA GAC TAC CTG AAG CTT CAC AGA GTG ATT TAT CAG CAA ATT ATC CAG ACC TAC CTG-3’(서열번호 3), 및 reverse primer : 5’-CAG GTA GGT CTG GAT AAT TTG CTG ATA AAT CAC TCT GTG AAG CTT CAG GTA GTC TTC TTC-3’(서열번호 4)). 또한, NCAPG2^T1010A 돌연변이는 5’- GGG GTG TAC TTT CTG CTC TGA TCG CTG G -3’(forward primer, 서열번호 5) 및 5’- CCA GCG ATC AGA GCA GAA GAT ACA CCC C -3’(reverse primer, 서열번호 6)를 이용하여 부위-지정 돌연변이생성 키트(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene)를 통해 제작하였으며, 이를 Flag-NCAPG2 또는 렌티-siR-NCAPG2 벡터에 도입시켜 수득하였다. 또한, NCAPG2^T805A돌연변이는, 5'-CAC TTC TGC AGA CGC CGG GTG GGA AG -3'(forward primer, 서열번호 9) 및 5'-CT TCC CAC CCG GCG TCT GCA GAA GTG -3'(reverse primer, 서열번호 10)를 이용하여 부위-지정 돌연변이생성 키트(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene)를 통해 제작하였으며, 이를 Flag-NCAPG2 벡터로 도입시켜 수득하였다. Flag-Plk1, Flag-Plk1(1-400), Flag-Plk1(400-603), 및 Flag-Plk1^FAA 벡터 또한 상기 방법에 따라 제조하였다.

실시예 6. 면역침전 및 면역 블롯팅

NCAPG2 결합 단백질의 면역침전분석을 위해, 세포들을 TAP 버퍼(25 mM Tris (pH 7.4), 140 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM β-Glycerophosphate, 10% Glycerol, 0.2% protease inhibitor cocktail)로 용해하여, 항-토끼 IgG 항체, 항-NCAPG2 항체, 항-flag M2 친화성 겔(Affinity Gel)(anti-flag tagging beads, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 또는 글루타티온 세파로즈(Glutathione Sepharose^TM 4B, GST-beads, GE Health care Lunar, Madison, WI)와 함께 4℃에서 반응시켰다. 침전물을 TAP 버퍼로 4℃에서 3회 세척하였으며, 20 μl의 2X 샘플버퍼(2X Sample buffer, 125 mM Tris(pH 6.8), 200 mM DTT, 4% SDS, 20% Glycerol, 0.004% Bromophenol Blue)로 재현탁시킨 후 100ㅀC에서 5분간 반응시켜 단백질을 변성시켰다.

면역 블롯팅(immuno blottings)을 이용한 단백질 검출을 위해, 검체들을 면역침전으로부터 수득된 단백질 복합체 또는 지시 조건으로부터 회수된 전체 세포 용해물로 준비하였다. 전체 세포는 용해 버퍼(20 mM Tris, 5 mM EDTA, 10 mM Na₄P₂O₇, 100 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 1% Np-40, 0.2% Protease Inhibitor Cocktail, and 1 mM PMSF)로 회수하여 10,000 rpm 및 4℃에서 10 분간 원심분리를 수행하였다. 단백질 농도는 BCA^TM protein assay kit(Pierce, Rockford, USA)를 이용하여 결정하였다. 단백질 추출물을 5X 샘플 버퍼(50 mM Tris(pH6.8), 100 mM DTT, 2% SDS, 0.1% Bromophenol Blue, and 10% G glycerol)에 현탁시킨 후 5분 간 가열하여 8-12% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동 분석을 수행하였다. 분리된 단백질들을 Trans-Blot Nitrocellulose Membrane(Schleicher&Schuell, Keene, NH, USA)으로 이동시킨 후, 상기 막(membrane)을 5% 탈지유 함유 TBST 버퍼(10 mM Tris, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20)로 블록킹(blocking)하고 다양한 일차 항체들과 반응시켰다. 다음 단백질들의 일차 항체들은 시판중인 것을 사용하였으며, 구체적으로 Histon H3 pS10 항체(Abcam, Cambridge, UK), NCAPG2 항체(Novus Biological, Littleton, USA), PLK1 항체(Novus Biological, Littleton, USA), BubR1 항체(BD Biosciences, SanDiego, CA), β-actin 항체(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 및 CREST 항체(ImmunoVision, Springdale, AR, USA)를 사용하였다. BubR1 p670 및 p676 항체들은 공지된 방법에 따라 준비하였다. 단백질 발현 검출을 위해 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce Rockford, IL, USA)를 사용하여 화학발광 신호를 활성화시킨 후 HRP(horse radish peroxidase) 표지 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA)와 반응시켰다.

실시예 7. PLK1 - PBD 의 발현 및 정제

인간 PLK1-PBD(371-594)를 PCR로 증폭시킨 후 EcoRI 및 XhoI 제한효소 위치를 사용하여 pGEX6p-1 벡터로 클로닝(cloning)하였다. 단백질은 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS 세포(Novagen)를 이용하여 다음과 같이 과발현시켰다. 세포들을 3L의 Terrific Broth 배지에 넣고 37℃에서 OD600이 0.6이 될 때까지 배양시켰으며, 0.1 mM 이소프로필 b-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 20℃에서 반응시켜 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 유도 후 20℃에서 20시간 동안 추가 배양시킨 다음 3000 g 및 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 정제 방법은 공지의 방법(Cheng et al.,2003)과 유사하다. 간략히 설명하면, 세포 펠렛(pellet)을 빙냉(ice-cold) HBS buffer(10 mM HEPES pH7.5, 200 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.01%(v/v) 1-thioglycerol)로 현탁시킨 후 초음파분쇄를 통해 균질화하였다. 초음파분쇄 후, 세포 파쇄물을 원심분리하고 상등액을 GST 세파로즈 수지(Sepharose resin, GE Health care)에 적용시켰다. 다량의 HBS 버퍼를 이용한 세척 후, 20 mM의 환원된 글루타티온(reduced glutathione) 함유 HBS 버퍼를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 융합된 GST를 제거하기 위해 PreScission protease(GE Health care)를 단백질에 처리하였으며, 절단 산물(cleavage product)을 희석시켜 GST 세파로즈 수지에 재통과시켰다. 통과된 수득물을 회수하여 이를 HBS 버퍼로 평형화(equilibration)시킨 Superdex 75 prepgrade column(GEHealthcare)에 적용시켰다. 이로써 수득된 정제된 단백질을 6 mg/ml로 농축시켰으며, 이를 대상으로 형광 편광 결합 분석(fluorescence polarization binding assay) 또는 결정 스크리닝 분석(crystal screening)을 수행하였다.

실시예 8. 1010 pT 펩티드와의 복합체 내에서 PLK1 - PBD 의 결정화 및 구조 분석

결정화(crystallization)를 수행하기에 앞서, 정제된 PLK1-PBD 및 5 mer 1010pT 펩티드(Ac-VLSpTL-NH2; 최종 농도 5 mM)를 혼합시켜 얼음 상에 저장하였다. 펩티드와의 복합체 내 PLK1-PBD의 결정은 싯팅드롭 증기 확산법(sitting drop vapor diffusion method)에 의해 수득되었다. 200 mM 요오드화칼륨(potassiumiodide), 100 mM MES(pH6.5) 및 25%(v/v) PEG4000의 저장 용액(reservoir solution) 내에서 결정들을 성장시켰다.

X-선 회절분석(X-ray diffraction) 결과는 Pohang Light Source(Korea) 사의 ADSC Q315r CCD 검출기(detector)를 사용하여 얻었다. 강도(intensity) 결과는 HKL2000 프로그램(Otwinowski and Minor, 1997)을 사용하여 진행 및 기준화하였다. 구조는 프로그램(McCoy et al., 2007)을 사용한 분자치환법(molecular replacement)에 의해 결정하였으며, 모델(model)은 Phenix and CNS 프로그램(Adams et al., 2010; Brunger et al.,1998)을 사용하여 개선하였다. 수동 모델 구성(manual model building)은 Coot 프로그램(Emsley and Cotwan, 2004)을 사용하여 수행하였다.

실시예 9. PLK1 - PBD 에 대한 형광 편광 결합 분석

형광 편광 결합 분석(fluorescence polarization binding assay)을 위해, FITC-표지된 1010pT(GVLSpTLI) 또는 1010(GVLSTLI : 서열번호 8) 펩티드를 정제된 PLK1-PBD와 혼합하여 10 mM HEPES pH7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.0025% (v/v) Tween 20 함유 버퍼 내에서 반응시켰다. 최종 단백질 농도는 0 내지 4 μM 범위였으며, 최종 펩티드 농도는 2 nM이었다. 형광 편광 분석은 96-웰 포맷 접시(96-well format plate) 내에 펩티드 및 단백질 혼합한 후 30분 간 VERSAmax microplate reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 수행되었다. 결합 곡선(binding curves)은 Graphpad Prism(GraphPad Software, USA)을 사용하여 조정되었다.

기탁 코드(Accession code). PLK1:1010pT 펩티드 복합체의 PBD에 대한 좌표(coordinate)는 기탁 코드 4O9W로 Protein Data Bank에 기탁하였다.

실시예 10. 다양한 암세포에서 NCAPG2 발현 및 억제

암 세포주 또는 조직에서 NCAPG2의 발현을 확인하기 위하여 정상세포(HMEC; human mammary epithelial cell)와 immortalized만 된 세포주(MCF10A), 인지된 각 유방암 세포주를 배양 후 각 세포주에서 RNA를 추출하고 RT-PCR을 실시하였다. 유방암 환자들의 조직에서도 각각 암화된 부위와 주변 정상 조직에서 NCAPG2의 발현을 확인하기 위하여 RNA를 추출하고 RT-PCR을 실행하였다. 이와 함께 Expression Atlas data base를 이용하여 NCAPG2의 발현과 PLK1의 발현 양상을 살펴보고 상관성이 있는 암종의 발현양상을 도표화하였다.

실험결과 1. 염색체 분리를 위한 미세소관 동원체 부착에서 NCAPG2의 기능

NCAPG2는 상대적으로 덜 연구된 콘덴신 II 서브유닛임에도 불구하고, 다른 콘덴신 서브유닛처럼 중요한 작용을 수행할 것이라고 예측되어 왔다. 따라서 본 발명에서는 간단한 후생동물(metazoan)인 꼬마선충(C. elegans)을 이용하여 체세포분열(mitosis)에서의 NCAPG2의 기능을 처음으로 분석하였다. 꼬마선충은 NCAPG2 상동 유전자(homologous gene) capg-2를 가지므로, 박테리아 공급 RNAi 방법(bacteria feeding RNAi method)을 이용한 capg-2 녹다운(knockdown)을 수행하였다. 그 결과, RNAi 공급은 공지된 바와 유사하게 생식세포(germ cells) 및 배아세포(embryos) 둘 모두의 염색체 분리 결함을 야기하였다(도 1a 및 도 1b).

정확한 염색체 분리를 위해선 양극 방추사가 적정 방향화가 이뤄진 동원체로 부착되는 것이 필수적이다. 따라서 본 발명자들은 탁솔(Taxol) 및 노코다졸(nocodazole)과 같은 미세소관 저해제(microtuble inhibitors)와 capg-2 기능의 관계를 확인하였다. 그 결과, 탁솔 또는 노코다졸 함유 액상 배지에서 배양된 성충(adult worms)으로부터 얻어진 배아의 체세포분열에서는 어떠한 결함도 확인되지 않았다. 그러나 초기 배아세포의 체세포분열에서는 미세소관 저해제의 처리가 capg-2 RNAi 단독처리된 것들과 비교하여 더 현저한 결함을 야기하는 것을 확인하였다(도 1b).

또한, capg-2 RNAi 공급 후 순차적인 미세소관 저해제 처리를 수행하여 회수된 성충으로부터 자손(progeny)의 생존율(survival ratio)을 시험한 결과, capg-2 RNAi 단독 처리군과 비교하여 생존율이 더 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 1c). 이러한 capg-2 RNAi와 미세소관 저해제의 조합된 효과는 체세포분열에서의 capg-2의 기능이 미세소관과 밀접히 관련되어 있음을 제시한다.

다음으로, capg-2 결핍의 경우 체세포분열의 시작점(starting point) 결함을 확인하기 위해 시간에 따른 배아세포의 첫 분열(first cleavage)을 관찰하였다. 그 결과, capg-2 결핍의 경우 대조군과 비교하여 염색체 응축은 여전히 일어난 반면, 중기판(metaphase plate)에서의 염색체 정렬(chromosome alignment)은 불완전한 것을 확인하였다(도 1d). 그러나 방추사의 미세소관의 염색체로의 부착은 육안으로 명확하게 확인하기가 어려웠다. 흥미롭게도, capg-2 결핍 배아세포의 경우 중기의 염색체 정렬이 없이도 염색체의 복제가 일어나 염색체가 갑자기 증대되는 현상을 확인할 수 있었다(도 1d). 또한, capg-2 RNAi 공급에 의해 방추사의 염색체로의 부착이 약해지거나 방향에 문제가 생기면서 중기판에서의 염색체 정렬이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다(도 1e). 이러한 결과를 통해 꼬마선충의 배아세포에서 capg-2가 방추사의 염색체 부착과 연관되어 있음을 알 수 있다.

미세소관 염색체 결합의 역학 분석을 통해 NCAPG2의 기능을 좀 더 확인하기 위해, 인간세포에서 Eg5 방추사 운동 단백질(spindle motor protein)을 저해하여 방추사 양극성을 차단하는 것으로 알려진 키네신 저해제(kinesin inhibitor), 모나스트롤(monastrol)과 함께 처리 후의 결과를 분석하였다. 꼬마선충에서와 같이, 미세소관-염색체 결합은 NCAPG2-특이적 siRNA로 발현억제된 인간세포에서 모나스트톨에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 2a). 이러한 미세소관 동원체 결합의 결함은 염색체 분리의 결함을 야기하므로, 염색체가 다중화된다. 중심절(centromere) FISH 결과는 NCAPG2 특이적 siRNA로 발현을 감소 시켰을 때 세포가 대조군인 GFP siRNA-주입 세포와는 다르게 다중화된 중심절을 가짐을 보여준다(도 2b).

이러한 결과를 확증하기 위해, 비이클(vehicle) 또는 노코다졸 처리와 함께 NCAPG2 녹다운된 세포들의 중기 전개 염색체(metaphase spread chromosome) 수를 계수하였다. 그 결과, 염색체 수가 150 이상인 세포 분포(cell population)가 NCAPG2 발현 고갈에 의해 증가되는 것을 확인하였으며, 꼬마선충에서 미세소관 저해제에 의해 증가된 체세포분열 결함과 유사하게 노코다졸 처리에 의해 그 수가 더욱 증가되는 것을 확인하였다(도 2c). 이러한 결과들로부터 NCAPG2가 원생동물 및 인간 둘 다에서 미세소관 동원체 결합에 관여하며 염색체 분리에서 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

실험결과 2. NCAPG2 결핍에 따른 동원체 내 BubR1 인산화의 감소

미세소관-염색체 결합에 대한 NCAPG2 기능을 좀 더 확인하기 위해, 동원체 내 미세소관 염색체 부착을 조절하는 조절 단백질 중 하나인 BubR1의 활성화를 조사하였다.

우선, 동원체 내 BubR1의 위치화는 항-CREST 염색법을 사용하여, 대조군 또는 NCAPG2 siRNA 처리군 세포들을 대상으로 분석하였다. 그 결과, NCAPG2 발현이 차단되는 경우, 동원체 내 아령-형상의 BubR1의 위치화는 저해되거나, 약해지거나 소실되었다(도 3a).

동원체 내 BubR1의 활성화는 PLK1에 의해 좌우되는데, PLK1은 동원체에서의 BubR1을 인산화시켜 적정 염색체 미세소관 결합을 유도한다. 따라서 NCAPG2 고갈 유도 후 PLK1과 BubR1의 공위치화(colocalization)를 분석하였으며, 그 결과 동원체 내 BubR1의 정상적 위치화가 NCAPG2 발현 감소에 의해 저해되는 것을 확인하였을 뿐 아니라, 흥미롭게도 동원체 내 PLK1의 위치화도 NCAPG2 siRNA에 의해 현저히 감소한 것을 확인하였다(도 3c). 또한, PLK1과 관련된 것으로 공지된 BubR1의 Ser676에서의 인산화도 NCAPG2 결핍에 의해 감소하였다(도 3b). 이러한 결과들을 통해 NCAPG2가 BubR1의 위치화 및 인산화를 위한 PLK1의 위치화에 관여하는 것을 알 수 있었다.

실험결과 3. NCAPG2 가 전중기에서 PLK1 의 동원체 내 위치화에 미치는 영향

상기 BubR1의 위치화 결함이 동원체 내 PLK1의 소실로 인한 것인지를 확인하기 위해, NCAPG2가 PLK1의 동원체 내 위치화에 관여하는지를 시험하였다.

우선, PLK1의 위치화를 시험하기 전에, 체세포분열 동안의 NCAPG2의 위치화를 확인하였다. 그 결과, 간기(interphase) 동안에는 NCAPG2가 핵 내 위치하면서 넓게 퍼지다가, 체세포분열이 시작되면, 전중기(prometaphase) 동안 동원체 마커(marker)인 CREST가 포함된 염색체 중심에 강하게 점적되는 것(spotted)을 확인하였다(도 4 및 도 6a). 또한, 중기 동안에는 오정렬된 동원체(misaligned kinetochore)를 제외하고 NCAPG2의 동원체 위치화가 사라지며, 이후 과정에서는 NCAPG2가 중앙체(midbody) 외부인 방추사 중간대(spindle midzone)로 이동하는 것을 확인하였다(도 4). 이로써 NCAPG2의 위치화는 전중기 이후 미세소관과 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있었다.

또한, NCAPG2의 PLK1과의 동원체 내 공-위치화(co-localization)를 조사한 결과, NCAPG2는 오직 전중기에만 PLK1과 동원체 내 공위치화를 나타내고, 중기에는 정렬되지 않은 염색체에 잔류하는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6b). 한편, 중기판에서의 염색체 정렬이 완료된 후에는, NCAPG2 및 PLK1은 둘 다 미세소관과 강하게 결합하는 단백질임에도 불구하고 상호 배타적으로 염색되는 패턴을 나타내었다(도 5).

이러한 NCAPG2와 PLK1의 전중기 특이적 결합이 PLK1의 동원체 내 위치화에 영향을 주는지를 시험하기 위해, 대조군 또는 NCAPG2 siRNA-처리군 세포들을 대상으로 항 PLK1 면역염색된 유사색 영상의 형광 강도를 항 CREST 면역염색된 유사색 영상(pseudo color images)의 강도에 대비하여 측정하였다. 그 결과, siRNA에 의해 NCAPG2 발현이 저해되는 경우, PLK1의 CREST와의 위치화 계수(localization coefficient)는 대조군으로부터 얻어진 계수 보다 현저히 낮음을 확인하였다(도 6c 및 6d).

또한, 상기 결과와 같은 NGAPG2와 PLK1 위치화 간의 연관성을 확증하기 위해, 인비보(in vivo) 꼬마선충 모델(model)을 대상으로 추가 시험을 수행하였다. 꼬마선충 내 PLK1의 상동 단백질(homolog)인 PLK-1은 중기 동안 전동원체 염색체(holocentric chromosome)와 중심체(centrosomes) 둘 다에서 발현되는 것이 공지되어 있다. 시험 결과, GFP::PLK-1이 공지된 바와 같이 대조군 내 전동원체 염색체 전체에 위치한 반면, capg-2 녹다운된 배아세포 내 염색체에서는 이러한 위치화가 매우 약한 것을 확인하였다(도 6e).

또한, capg-2 RNAi 처리군 또는 대조군을 대상으로 중기에서의 염색체 및 중심체 내 GFP::PLK-1의 형광을 정량화하기 위해, 염색체 내 GFP::PLK-1 강도를 중심체의 것과 비교한 결과, 대조군 배아세포 대비 capg-2 고갈 배아세포에서 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 6f). 이러한 결과는, 인간 세포의 동원체 구조가 꼬마선충의 것과 다름에도 불구하고, 인간 세포에서의 상대적 형광 계수 결과와 일치하는 것이다. 한편, PLK1의 세포질분열(cytokinesis) 동안의 중간대 및 중앙체로의 위치화는 NCAPG2 발현 고갈에 의해 영향 받지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 NCAPG2가 PLK1의 동원체 내 위치화의 중대한 견인체(critical tractor)로 작용하며 미세소관 동원체 결합에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 제시한다.

실험결과 4. PBD 도메인을 통한 PLK1 과 NCAPG2 의 결합

NCAPG2가 PLK1의 동원체 내 위치화를 유도하는 것을 확인하였으므로, NCAPG2가 PLK1과 물리적으로 결합하는지를 시험하였다. 구체적으로, GST-PLK1과 Flag-NCAPG2을 발현시켜 각 비드(bead)로의 풀다운 분석(pull down)을 수행한 결과, 두 단백질 간의 결합을 확인하였으며(도 7a), 내생(endogenous) PLK1도 노코다졸 처리 조건 하에서 Flag-NCAPG2와의 면역-침전 분석 시 검출되는 것을 확인하였다(도 7b).

또한, PLK1의 NCAPG2 결합 부위를 조사하기 위해, Flag-PLK1의 다양한 삭제 변이체(deletion mutants)를 제조하여 Flag 비드를 사용한 풀다운 분석을 수행하였다(도 7c). 그 결과, 폴로 박스 도메인(Polo box domain, PBD)이 NCAPG2와의 결합을 담당하는 것을 확인하였으며, 기질 결합 인식에 문제를 가지는 FAA 변이 PBD 도메인은 NCAPG2와 공침되지 않는 것을 확인하였다(도 7d). 또한, 정제된 PLK1 및 NCAPG2를 이용한 인비트로 인산화효소 분석(in vitro kinase assay) 결과로부터 NCAPG2가 PLK1에 의해 직접적으로 인산화되는 것을 확인하였다.

실험결과 5. NCAPG2 1010T 의 기능

NCAPG2가 PLK1의 PBD에 결합하는 것을 확인함에 따라, NCAPG2의 PLK1 결합 부위도 조사하였다. 풀다운 분석 결과, PLK1이 전장 NCAPG2와만 강하게 결합하는 것을 확인하였으며, 이로써 PLK1의 PBD 도메인이 NCAPG2의 C-말단 영역(714-1143 잔기)과 결합함을 알 수 있었다(도 8a).

또한, PLK1의 PBD는 체세포분열에서의 정상적인 작용을 위해 인산화된 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine) 잔기가 뒤에 오는 엄격하게 보존된 세린 잔기(S-pS/T 모티프(motif))와 결합하는 경향이 있음이 공지되어 있다. 따라서 NCAPG2의 C 말단 영역 내 S-pS/T 모티프를 조사한 결과, NCAPG2의 Thr1010 부위가 포유동물로부터 꼬마선충(C. elegans) 속에 이르기까지 엄격히 보존되어 있음을 확인하였다(도 8b). 또한, Thr1010을 알라닌(alanine)으로 치환한 결과, PLK1과의 결합이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 8d). 따라서, 이러한 비-인산화 변이에 의한 결합력(binding affinity)의 감소 결과를 통해 인산화 의존적 결합의 가능성을 알 수 있었다.

따라서, 이러한 결합이 직접적이며 인산화 의존적 경향을 갖는지 시험하기 위해, 합성 펩티드를 사용한 형광 편광 인비트로 결합 분석(fluorescence polarization in vitro binding assay)을 수행하였다. 그 결과, 비인산화된 7-mer 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLSTLI¹⁰¹² : 서열번호 8)와는 대조적으로, 인산화된 펩티드(¹⁰⁰⁶GVLS-pT-LI¹⁰¹²)는 69.91±15.95 nM의 Kd 값으로 PLK1의 PBD와 강하게 결합하는 것을 확인하였다(도 8c). 또한, 체세포분열 과정 동안 1010번째 트레오닌(T)이 인산화된 NCAPG2의 염색체 및 동원체 상 위치를 확인하였다(도 8e). 세포 분열기 초기 염색체상에 위치하다가 핵분열 후기가 되면 발현이 감소되고 말기에는 중앙체 주변에만 염색되어 보인다.

또한, Flag 표지된 NCAPG2와 NCAPG2의 1010번째 트레오닌(T)을 알라닌(A)으로 치환시킨 변이체 NCAPG2(T1010A)를 대상으로 PLK1과의 풀다운 분석을 수행한 결과, T1010A 변이체의 경우 PLK1과의 결합이 저해되는 것을 확인하였다.

또한, 5-mer 인산화펩티드(phosphopeptide) VLS-pT-L과의 복합체 내 PLK1의 PBD의 결정 구조를 해상도 1.8 에서 확인한 결과, PBD 구조는 공지된 바(Elia et al., 2003; Cheng et al., 2003; Garcia-Alvarez et al., 2006; Yun et al., 2009)와 같이 전형적인 구조를 나타내었다(도 9a). 두 개의 PBs로부터의 여러 역평행(antiparallel) b-시트들(sheets)은 기질 결합을 가능하게 하는 셸로우 캐비티(shallow cavity)를 형성한다(도 9b). PLK1의 PBD에 대한 펩티드의 결합 모드(binding mode)는 다른 PBD:인산화펩티드 복합체들과 매우 유사하였다(도 9c). 즉, 기질 펩티드의 전체 구조(overall conformation)는 보존되어 있으며, 특히 Ser-pThe 모티프는 엄격히 보존된 구조임을 알 수 있다. 다른 PBD:인산화펩티드 구조와 마찬가지로, 인산화트레오닌 잔기(phoshpothreonine residue)(pT1010)는 His538 및 Lys540과 수소결합을 형성한다(Llia et al., 2003; Chen et al., 2003; Garcia-Alvarez et al., 2006; 도 9d). 또한, 중심체 위치화 및 인산화효소 활성에 영향을 주지 않는 기질 결합에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지(Lee et al., 1998 PNAS; Liu et al., 2004 JBC)된 Trp414는 기질 펩티드의 세린 잔기와 직접적 또는 물-매개 방식으로 다중 수소 결합을 형성한다(도 9d). 또한, PBD-Cdc25C 경향의 펩티드 구조와 유사하게, 인산화트레오닌 잔기 근처에서 발견되는 많은 물 분자들은 수소 결합 네트워크을 형성하여 결합력을 강화한다(Garcia-Alvarez et al., 2006; 도 9d). 한 물분자는 Trp414과 수소원자와의 수소결합 네트워크에 매개하며, 다른 물분자는 Phe534의 카보닐 산소(carbonyl oxygen)와 기질 펩티드 내 인삼염의 산소 원자와의 수소결합을 형성한다(도 9d). 추가로, Asp416, His489 및 Leu491도 수소결합 형성에 관여하며, Lys413, Val415, Tyr485 및 Leu490은 1010pT 펩티드와의 소수성 접촉(hydrophobic contacts)을 형성한다(도 9d). 흥미롭게도, 두 개의 PBD를 연결하여 인산화펩티드 결합에 관여하는 것으로 알려진 CL 루프(loop)(residue 493-507; referred in Garcia-Alvarez et al., 2006)의 경우 본 발명의 구조에서는 부분적으로 문제가 있는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명의 구조에서는 499와 507 잔기들 사이의 9개의 잔기가 소실되어 있는 것을 확인하였다.

NCAPG2 1010T 위치가 PLK1 결합에 중요함을 알게 됨에 따라, NCAPG2 siRNA 형질전이(transfection) 후의 재합성 실험(reconstitution experiments)을 수행하였다. 재합성 실험을 위해, 렌티-바이러스 siRNA 내성의 NCAPG2 야생형(wild type)((NCAPG2^R-Wt) 또는 T1010A 변이체(NCAPG2^R-T1010A) 발현 벡터를 합성하였다. 그 결과, NCAPG2의 발현이 고갈되는 경우, 상기에서 살펴본 바와 같이 PLK1의 동원체 내 위치화가 사라지나, 야생형 NCAPG2가 재합성되면 동원체 내 PLK1의 위치화가 다시 회복되는 것을 확인하였으며, 반면 T1010A 변이체의 경우에는 동원체 내 PLK1을 회복시킬 수 없었다(도 10a). 이러한 T1010A NCAPG2 변이체 재합성이 PLK1의 동원체 내 위치화 회복에 성공적이지 못한 결과는, 동원체 내 PLK1 염색의 항-CREST 염색 대비 상대적인 형광 강도를 측정한 결과로부터도 확인되었다(도 10b). 또한, 웨스턴 블럿 분석에서 노코다졸 처리 후 약해진 BubR1의 인산화된 쉬프트 밴드(shift band)가 야생형 NCAPG2의 재합성으로 회복된 반면, T1010A 변이체에 의해서는 회복되지 않는 것을 확인하였다(도 10c). 이러한 결과는 NCAPG2 T1010 및 이를 포함하는 영역이 PLK1의 동원체로의 결합에 매우 중요할 수 있음을 제시한다.

또한, Flag 표지된 NCAPG2와 NCAPG2의 805번째 트레오닌(T)을 알라닌(A)으로 치환시킨 변이체 NCAPG2(T805A)를 대상으로 PLK1과의 풀다운 분석을 수행한 결과, 상기 NCAPG2 T1010A 변이체의 경우에서와 마찬가지로 PLK1과의 결합이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 8f).

실험결과 6. 다양한 암세포에서 NCAPG2 발현 및 억제

도 11은 암 세포주에서 NCAPG2의 발현을 확인한 결과와 암 조직에서 각각 암화된 부위와 주변 정상 조직에서 NCAPG2의 발현을 확인한 결과이다.

도 11에서 보이는 것처럼, 정상세포나 immortalize된 세포에 비해 유방암 세포주에서 현저하게 NCAPG2의 발현이 증가하였고 (도 11a), 유방암 환자의 조직에서도 정상조직에 비해 암조직에서 발현이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 11b 및 d). 또한, 사람 대장암 조직, 방광암 조직 및 세포주에서도 NCAPG2의 발현을 확인할 수 있었다(도 11e). NCAPG2의 발현은 표시된 각각 세포주나 조직에서 RNA를 추출하여 RT-PCR 방법을 통해 확인하였다. 이러한 결과를 통해 NCAPG2가 다양한 조직의 암화과정에서 발현의 증가를 보임을 확인할 수 있었다.

이와 함께 Expression Atlas data base를 이용하여 NCAPG2의 발현과 PLK1의 발현 양상을 살펴보고 상관성이 있는 암종의 발현양상을 도표화하였다(도 11c). Expression Atlas data base에서도 다양한 암종에서 NCAPG2와 PLK1의 발현 양상이 증가하는 경우가 많았고 발현양상이 같이 가는 경우들이 많음을 확인할 수 있었다 .

실험결과 7. NCAPG2 의 항암 효과

도 12는 HuR-7 사람 간암 세포에 NCAPG2의 1010번째 트레오닌(T)을 포함하는 펩티드(NG2 The1010: VLSTL) (서열번호 11)와 이의 인산화 펩티드(NG2 pThe1010: VLSpTL)를 처리할 경우 암 세포의 생존율을 감소시키고 체세포분열 이상을 초래한다는 것을 보여주는 결과이다. FITC로 표지된 NG2 The1010과, NG2 pThe1010을 간암세포에 처리하여 FITC가 보이는 형광 정도를 통해 세포에 각각의 펩티드가 들어간 것을 확인하였고 세포의 수가 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 위 NCAPG2 펩티드가 PLK1의 기능을 저해하여 암 세포의 증식을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 즉, NCAPG2는 PLK1에 결합하여 PLK1이 정상적인 체세포분열 과정을 진행시킬 수 있도록 하는 역할을 하지만, 과량의 NCAPG2의 PLK1결함 부위 펩티드를 투여하여 인위적으로 PLK1과 결합시키게 되면 PLK1의 정상적 기질 결합을 방해함으로써 더 이상 체세포분열 과정에서 기능하지 못하게 된다. 따라서 본 발명의 NCAPG2 또는 그 펩티드는 그 자체로 항암제의 기능을 할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Screening method of anticancer agent using NCAPG2 peptide <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for NCAPG2 <400> 1 gcuucauagg gucauuuaut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for NCAPG2 <400> 2 gaagaaugau gcugaaacat t 21 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siR-NCAPG2 forward primer for Site-Directed Mutagenesis <400> 3 gaagaagact acctgaagct tcacagagtg atttatcagc aaattatcca gacctacctg 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siR-NCAPG2 reverse primer for Site-Directed Mutagenesis <400> 4 caggtaggtc tggataattt gctgataaat cactctgtga agcttcaggt agtcttcttc 60 60 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCAPG2T1010A forward primer <400> 5 ggggtgtact ttctgctctg atcgctgg 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCAPG2T1010A reverse primer <400> 6 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Cys Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Glu Ser Gly Glu Ile Lys Asp 195 200 205 Met Leu Leu Glu Cys Phe Ile Asn Ile Asn Tyr Ile Lys Lys Glu Glu 210 215 220 Gly Arg Arg Phe Leu Ser Cys Leu Phe Asn Trp Asn Ile Asn Phe Ile 225 230 235 240 Lys Met Ile His Gly Thr Ile Lys Asn Gln Leu Gln Gly Leu Gln Lys 245 250 255 Ser Leu Met Val Tyr Ile Ala Glu Ile Tyr Phe Arg Ala Trp Lys Lys 260 265 270 Ala Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ala Ile Glu Asn Asp Cys Ile Gln Asp 275 280 285 Phe Met Phe His Gly Ile His Leu Pro Arg Arg Ser Pro Val His Ser 290 295 300 Lys Val Arg Glu Val Leu Ser Tyr Phe His His Gln Lys Lys Val Arg 305 310 315 320 Gln Gly Val Glu Glu Met Leu Tyr Arg Leu Tyr Lys Pro Ile Leu Trp 325 330 335 Arg Gly Leu Lys Ala Arg Asn Ser Glu Val Arg Ser Asn Ala Ala Leu 340 345 350 Leu Phe Val Glu Ala Phe Pro Ile Arg Asp Pro Asn Leu His Ala Ile 355 360 365 Glu Met Asp Ser Glu Ile Gln Lys Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Ser Leu 370 375 380 Leu Glu Asp Pro Tyr Pro Met Val Arg Ser Thr Gly Ile Leu Gly Val 385 390 395 400 Cys Lys Ile Thr Ser Lys Tyr Trp Glu Met Met Pro Pro Thr Ile Leu 405 410 415 Ile Asp Leu Leu Lys Lys Val Thr Gly Glu Leu Ala Phe Asp Thr Ser 420 425 430 Ser Ala Asp Val Arg Cys Ser Val Phe Lys Cys Leu Pro Met Ile Leu 435 440 445 Asp Asn Lys Leu Ser His Pro Leu Leu Glu Gln Leu Leu Pro Ala Leu 450 455 460 Arg Tyr Ser Leu His Asp Asn Ser Glu Lys Val Arg Val Ala Phe Val 465 470 475 480 Asp Met Leu Leu Lys Ile Lys Ala Val Arg Ala Ala Lys Phe Trp Lys 485 490 495 Ile Cys Pro Met Glu His Ile Leu Val Arg Leu Glu Thr Asp Ser Arg 500 505 510 Pro Val Ser Arg Arg Leu Val Ser Leu Ile Phe Asn Ser Phe Leu Pro 515 520 525 Val Asn Gln Pro Glu Glu Val Trp Cys Glu Arg Cys Val Thr Leu Val 530 535 540 Gln Met Asn His Ala Ala Ala Arg Arg Phe Tyr Gln Tyr Ala His Glu 545 550 555 560 His Thr Ala Cys Thr Asn Ile Ala Lys Leu Ile His Val Ile Arg His 565 570 575 Cys Leu Asn Ala Cys Ile Gln Arg Ala Val Arg Glu Pro Pro Glu Asp 580 585 590 Glu Glu Glu Glu Asp Gly Arg Glu Lys Glu Asn Val Thr Val Leu Asp 595 600 605 Lys Thr Leu Ser Val Asn Asp Val Ala Cys Met Ala Gly Leu Leu Glu 610 615 620 Ile Ile Val Ile Leu Trp Lys Ser Ile Asp Arg Ser Met Glu Asn Asn 625 630 635 640 Lys Glu Ala Lys Leu Tyr Thr Ile Asn Lys Phe Ala Ser Val Leu Pro 645 650 655 Glu Tyr Leu Lys Val Phe Lys Asp Asp Arg Cys Lys Ile Pro Leu Phe 660 665 670 Met Leu Met Ser Phe Met Pro Ala Ser Ala Val Pro Pro Phe Ser Cys 675 680 685 Gly Val Ile Ser Thr Leu Arg Ser Arg Glu Glu Gly Ala Val Asp Lys 690 695 700 Ser Tyr Cys Thr Leu Leu Asp Cys Leu Cys Ser Trp Gly Gln Val Gly 705 710 715 720 His Ile Leu Glu Leu Val Asp Asn Trp Leu Pro Thr Glu His Ala Gln 725 730 735 Ala Lys Ser Asn Thr Ala Ser Lys Gly Arg Val Gln Ile His Asp Thr 740 745 750 Arg Pro Val Lys Pro Glu Leu Ala Leu Val Tyr Ile Glu Tyr Leu Leu 755 760 765 Thr His Pro Lys Asn Arg Glu Cys Leu Leu Ser Ala Pro Arg Lys Lys 770 775 780 Leu Asn His Leu Leu Lys Ala Leu Glu Thr Ser Lys Ala Asp Leu Glu 785 790 795 800 Ser Leu Leu Gln Thr Pro Gly Gly Lys Pro Arg Gly Phe Ser Glu Ala 805 810 815 Ala Ala Pro Arg Ala Phe Gly Leu His Cys Arg Leu Ser Ile His Leu 820 825 830 Gln His Lys Phe Cys Ser Glu Gly Lys Val Tyr Leu Ser Met Leu Glu 835 840 845 Asp Thr Gly Phe Trp Leu Glu Ser Lys Ile Leu Ser Phe Ile Gln Asp 850 855 860 Gln Glu Glu Asp Tyr Leu Lys Leu His Arg Val Ile Tyr Gln Gln Ile 865 870 875 880 Ile Gln Thr Tyr Leu Thr Val Cys Lys Asp Val Val Met Val Gly Leu 885 890 895 Gly Asp His Gln Phe Gln Met Gln Leu Leu Gln Arg Ser Leu Gly Ile 900 905 910 Met Gln Thr Val Lys Gly Phe Phe Tyr Val Ser Leu Leu Leu Asp Ile 915 920 925 Leu Lys Glu Ile Thr Gly Ser Ser Leu Ile Gln Lys Thr Asp Ser Asp 930 935 940 Glu Glu Val Ala Met Leu Leu Asp Thr Val Gln Lys Val Phe Gln Lys 945 950 955 960 Met Leu Glu Cys Ile Ala Arg Ser Phe Arg Lys Gln Pro Glu Glu Gly 965 970 975 Leu Arg Leu Leu Tyr Ser Val Gln Arg Pro Leu His Glu Phe Ile Thr 980 985 990 Ala Val Gln Ser Arg His Thr Asp Thr Pro Val His Arg Gly Val Leu 995 1000 1005 Ser Thr Leu Ile Ala Gly Pro Val Val Glu Ile Ser His Gln Leu Arg 1010 1015 1020 Lys Val Ser 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5

Claims

서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질에서 1010번째 아미노산을 포함하는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질에서 805번째 아미노산을 포함하는 펩티드.
NCAPG2 단백질; 이로부터 유래하는 펩티드; 상기 NCAPG2 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단백질, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 억제시키는 억제인자를 유효성분으로 포함하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 펩티드는 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 억제인자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 805번째 아미노산 또는 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 1010번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 프라이머 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 805번째 아미노산에 대한 부위지정 돌연변이 유발서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 프라이머 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 억제인자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 NCAPG2 단백질의 1010번째 아미노산(Thr1010)의 인산화 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 억제인자는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 펩티드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함하는 생체 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 암세포 성장억제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
a) NCAPG2 단백질 또는 이로부터 유래하는 펩티드를 발현하는 세포 또는 동물을 준비하는 단계;
b) 상기 단백질, 펩티드 또는 이를 코딩하는 염기서열에 특이적으로 작용하는 후보 물질을 상기 a) 단계의 세포 또는 동물에 처리하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 세포 또는 동물로부터 상기 NCAPG2 단백질 또는 이로부터 유래하는 펩티드와 PLK1(polo-like kinase 1)의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법.
제12항에 있어서, 상기 펩티드는 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 후보 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 펩티드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질을 포함하는 생체 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 후보 물질은 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 항체, 앱타머(aptamers) 및 스피겔머(spiegelmers)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 c) 단계의 결합을 측정하는 방법은 면역침전법 또는 편광형광법인 것을 특징으로 하는 방법.